Лекция 5. (Репликация)

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
– мультиферментный комплекс (ДНК-репликазная
система), которая включает около 20 основных ферментов и белковых
факторов
– единица процесса репликации участка генома, который
находится под контролем одной точки инициации (начала) репликации
– точка инициации репликации
– набор белков и ферментов, обеспечивающих
процесс репликации
– одноцепочечная материнская ДНК, на основе которой
синтезируется дочерняя цепь
– РНК-праймер, синтезируется на основе ДНК, служит для
инициации роста дочерней цепи ДНК
– процесс матричного синтеза молекулы ДНК, ведущий к
ее самовоспроизведению (удвоению).
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
(от лат. replicatio - повторение)
Комплементарность
(от лат. replicatio - повторение)
Матричность
Потребность в затравке
для синтеза новых цепей – одноцепочечная ДНК.
– 3'-гидроксильный конец двуцепочечной ДНК,
причем он должен быть спарен с матрицей.
для синтеза новых цепей – одноцепочечная ДНК.
– 3'-гидроксильный конец двуцепочечной ДНК,
причем он должен быть спарен с матрицей.
Источником энергии в реакциях полимеризации мононуклеотидов
является энергия, освобождаемая всеми четырьмя типами
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, участвующих в синтезе ДНК.
Образующийся пирофосфат под действием пирофосфатазы также
расщепляется на две молекулы ортофосфата, давая дополнительную
энергию для биосинтеза ДНК.
(от лат. replicatio - повторение)
Полуконсервативность
.
Две цепи исходной молекулы
ДНК расходятся.
Каждая цепь служит матрицей
для образования новой цепи.
В результате каждая новая
клетка получает гибридную
молекулу ДНК, состоящую из
одной старой и одной новой
цепи.
.
Молекула ДНК служит
матрицей для образования
новой молекулы ДНК.
В результате одна из
образующихся клеток получает
исходную молекулу ДНК, а
другая – вновь
синтезированную.
.
ДНК распадается на
фрагменты, используемые в
качестве матриц для
построения фрагментов двух
новых молекул ДНК, которые
затем соединяются между
собой.
Мэтью Мезельсон Франклин Сталь
E. coli выращенные на среде, содержащей
тяжелый изотоп азота – 15N, обладали
«
» ДНК.
E. coli выращенные на среде, содержащей
легкий изотоп азота – 14N, обладали
«
» ДНК.
Бактерии с «тяжелой» ДНК перенесли на
среду, содержащую 14N.
Спустя одно поколение
после переноса E. coli
плотность ДНК была
между 15NДНК и 14N-ДНК.
Спустя два поколения 1/2
бактериальных клеток
содержала ДНК с легким
изотопом азота, а другая 1/2
– такую же, как и в
предыдущем поколении, ДНК
промежуточной плотности.
Через три поколения на
среде с 14N в ¾ клеток
содержалась легкая ДНК, а
¼ часть клеток сохраняла
ДНК промежуточной
плотности.
Т. о., соотношение между
числом генераций и
распределением плотности
ДНК точно соответствовало
.
Старая цепь
Новая цепь
(от лат. replicatio - повторение)
Униполярность
Антипараллельность
(от лат. replicatio - повторение)
Прерывистость
1960 г.
гипотетическая модель непрерывной
антипараллельной репликации.
1963 г.
модель непрерывной параллельной
репликации.
1968 г.
модель прерывистой антипараллельной
репликации.
Суть : неизвестный фактор денатурирует концы линейной
молекулы, 3'-ОН-концы загибаются и служат затравками для
работы ДНК-полимеразы. Фермент осуществляет денатурацию
матричной ДНК по мере продвижения и синтеза дочерних цепей.
На выходе - дочерние молекулы, которые короче на загнутый
конец, т.к. эндонуклеаза вносит разрыв в материнскую цепь
В модели допускалось наличие фермента,
способного вести синтез в направлении 3' → 5'.
Такой фермент не найден и сегодня.
Синтез ДНК идет короткими фрагментами, которые сшиваются
ДНК-лигазами.
Размер фрагментов Оказаки видоспецифичен: для фагов 1000-2000 нукл.,
E. сoli - 1000 нукл., для эукариот - 200-400 нукл.
У некоторых фагов и вирусов прерывистый синтез идет по обеим цепям. У
бактерий и высших организмов одна цепь образуется непрерывно, а другая прерывисто (лидирующая и запаздывающая цепи).
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
Биогенез ДНК требует слаженной работы комплекса
1.
катализируют
отдельные этапы синтеза ДНК
2.
регулируют процесс
репликации и каталитическую активность
ферментов.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
А) ДНК-топоизомераза образует
ковалентную связь с одной из
фосфатных групп ДНК
Б) в результате разрыва
фосфодиэфирной связи в одной
полинуклеотидной цепи вокруг
соответствующей ей связи другой
цепи осуществляется вращение,
которое снимает напряжение,
вызванное расхождением двух
цепей ДНК в области
репликационной вилки
В) после снятия напряжения в
спирали ДНК происходит
спонтанное отделение ДНКтопоизомеразы и восстановление
фосфодиэфирной связи в цепи
ДНК.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
.
Хеликазы используют энергию
гидролиза АТФ или ГТФ.
Движутся вдоль цепи
нуклеиновой кислоты в
направлении (5'->3' или 3'->5'),
характерном для данного
фермента.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
удерживают матричные цепи ДНК в репликативной вилке в
одноцепочечном состоянии и защищают одноцепочечную ДНК от
действия нуклеаз
Содержат кластер
положительно заряженных
аминокислотных остатков,
связываются только с
одноцепочечной ДНК
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
обеспечивают соединение нуклеотидов в растущей цепи ДНК за счет
образования фосфодиэфирных связей, участвуют в редактировании и
репарации ДНК
5’ → 3’ полимеразная активность
5’ → 3’ экзонуклеазная активность
3’ → 5’ экзонуклеазная активность
:
1) связывание ДНК-полимеразы с матрицейзатравкой ДНК
2) связывание с комплексом полимераза-ДНК
подходящего dNTF, комплементарного
первому остатку матрицы
3) нуклеофильная атака, приводящая к
образованию фосфодиэфирной связи;
4) освобождение пирофосфата
ДНК-полимераза
присоединяет очередной
нуклеотид к ОН-группе
только в 3'-положении
предшествующего
нуклеотида.
Поэтому цепь постепенно
удлиняется на ее 3'-конце.
Механизм (3’→5’) экзонуклеазной активности формально
аналогичен механизму полимеразной реакции и состоит в
нуклеофильной атаке гидроксильного иона ОН- на
(3’,5’)-фосфодиэфирную связь при участии 2-валентных
катионов металлов (Mg2+ , Mn2+ или Zn2+ ), которые связываются
с консервативными кислыми остатками аминокислот Asp (или
Gly) в экзонуклеазном активном центре фермента.
ДНК-полимеразы
типы
Участие в
синтезе ДНК
Прокариоты
5 типов:
I – V тип
обе цепи ДНК
синтезируются
Эукариоты
9 типов:
альфа, бета, дельта,
эпсилон, гамма, дзета
и т.д.
– инициация,
(и эпсилон?) –
элонгация ведущей и
отстающей цепей
Полимеразные домены ДНК-полимеразы
прокариот и эукариот содержат
(например, А, В
и С главного семейства В эукариотических
ДНК-полимераз).
Эти три участки являются элементами
полости, с которой связывается
включающийся dNTF
в активном полимеразном центре.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
Заделывает бреши
формируя
фосфодиэфирные
связи между
нуклеотидами
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
синтезирует РНКовый
дочерней цепи ДНК
(затравку) для образования
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
– единица процесса репликации участка генома, который
находится под контролем одной точки инициации (начала) репликации
– точка инициации репликации
– область окончания окончания репликации
Хромосома E. coli (4,2 млн. нуклеотидов)
– один репликон
У эукариот ДНК закрепляется белками в нескольких местах
на ядерной мембране. На каждом отдельном участке
работает
. Сколько участков, столько и
Организм
Количество
репликонов
Средний размер
репликона,
тыс.п.н.
Скорость
движения
репликативной
вилки, п.н./сек.
1
4200
50000
500
40
3600
3500
40
2600
15000
200
500
У эукариот время репликации составляет, в среднем, 7-12
часов
Скорость репликации регулируется изменением числа
точек ее инициации (числом активируемых репликонов)
Это число варьирует в зависимости от стадии онтогенеза ,
типа клеток и стадии гистогенеза, условий существования
клеток
К примеру, в сперматогониях человека приходится на
хромосому в среднем 40 точек инициации, а в
сперматоцитах – 5-6 таких точек (длительность
периода s, соответственно, 15 и 100 часов).