Документ 4842667
реклама
Генетические задачи решаются легко только тогда, когда они предварительно уже решены другими. Поэтому необходимо предостеречь тех, кто впервые приступает к генетическому анализу, от уныния и пессимизма, если их первые попытки окажутся неудачными. Александр Сергеевич Серебровский Методы детекции ДНК. Принципы создания биочипов. – предпосылки разработки биочипов; – макроматрицы как первые биочипы; – современные биочипы и их классификация. Предпосылки возникновения биочипов Исследование локусов ДНК, обладающих полиморфизмом нуклеотидной последовательности Одним из вариантов технологий исследования локусов, обладающих полиморфизмом нуклеотидной последовательности, является исследование с помощью метода гибридизации на фильтре. Использование этого метода возможно лишь при условии, что установлены нуклеотидные последовательности всех встречающихся аллелей исследуемого локуса. На основе этих данных для каждого аллеля создают комплементарный его нуклеотидной последовательности аллель-специфичный зонд. Эти зонды используют для выявления аллелей исследуемого локуса при проведении реакции гибридизации (называемой дот-блот гибридизацией). Технология исследования полиморфизма нуклеиновых последовательностей ДНК с помощью дот-блот гибридизации была реализована в коммерческом наборе для криминалистического ДНК-анализа AmpliType® PM+DQA1 PCR Amplification and typing Kit производства корпорации Perkin-Elmer, USA. С помощью этого набора можно было проводить одновременное исследование шести полиморфных локусов ДНК: HLA DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 и GC. В компонент набора входили аллель-специфичные зонды, иммобилизованные в определенных местах нейлоновой мембраны. На первом этапе проводят амплификацию изучаемых полиморфных последовательностей образца ДНК методом ПЦР. Один из праймеров каждой пары, используемых для исследования локусов связан с биотиновой меткой. В результате амплификации синтезируются фрагменты ДНК изучаемых последовательностей, одна из цепей которых содержит биотиновую метку. Схема исследования полиморфизма нуклеиновых последовательностей ДНК с помощью набора AmpliType® PM+DQA1 PCR Amplification and typing Kit 5' 3' 3' 5' Исследуемый образец ДНК Денатурация, отжиг праймеров 5' 3' 3' 5' Амплификация изучаемых полиморфных последовательностей ДНК Денатурация, отжиг праймеров, достраивание Бесцветный раствор Окрашенный преципитат Гибридизация, детекция (окраска) Ферментный коньюгат стрептовидин-пероксидаза Продукт ПЦР с биотиновой меткой Аллель-специфичный зонд, иммобилизованный на нейлоновой мембране (фильтре) 1 2 3 4 C 1.1 1.3 All but 1.3 4.1 4.2 4.3 Схема исследования полиморфизма нуклеиновых последовательностей ДНК с помощью набора AmpliType® PM+DQA1 PCR Amplification and typing Kit Установление аллелей проводят путем оценки окраски аллель-специфичных зондов. Анализ результатов гибридизации проводят пока мембраны находятся во влажном состоянии, и начинают изучение тех мембран, которые использовались для гибридизации с ДНК контролей реакции амплификации и контролей выделения ДНК. Данные считаются достоверными, если: А) в отрицательных контролях реакций амплификации и контролях выделения ДНК отсутствовали амплифицированные фрагменты, т.е. окрашенные зонды; Б) профиль ДНК, выявленный в положительном контроле реакции амплификации, соответствовал генотипу контрольной ДНК (HLA DQA1 1.1, 4.1 LDLR BB, Gypa AB, HBGG AA, D7S8 AB, GC BB). После оценки контролей проводят анализ мембран, использовавшихся для гибридизации с исследуемыми пробами. Для анализа используют только те мембраны, у которых окрашены контрольные зонды, обозначенные как «С». В дальнейшем, при сравнении окраски остальных зондов с окраской зонда «С» учитывают те, интенсивность окраски которых выше чем у «С». Окрашенные зонды локусов LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 и GC соответствуют аллелям этих локусов. А при установлении аллелей локуса HLA DQA1 используют следующую схему: Окрашенный зонд 1 означает присутствие аллелей 1.1, 1.2, 1.3; Окрашенный зонд 2 означает присутствие только аллеля 2; Окрашенный зонд 3 означает присутствие только аллеля 3; Окрашенный зонд 4 означает присутствие аллелей 4.1, 4.2, 4.3; Окрашенный зонд 1.1 означает присутствие только аллеля 1.1; Окрашенный зонд 1.3 означает присутствие только аллеля 1.3 (зонда специфичного для аллеля 1.2 нет) Окрашенный зонд 1.2, 1.3 и 4 означает присутствие аллелей 1.2, 1.3, 4.1, 4.2, 4,3. Окрашенный зонд All but 1.3 означает присутствие любого аллеля, за исключением 1.3. Этот зонд необходим для отличия генотипа 1.2, 1.3 от 1.3, 1.3. Окрашенный зонд 4.1 означает присутствие только аллеля 4.1. Окрашенный зонд 4.2, 4.3 означант присутствие аллелей 4.2 и 4.3, которые данным набором не идентифицируются. После установления всех аллелей проводят экспертный анализ и вероятностно-статистическую оценку идентификационной значимости полученных результатов. Предпосылки возникновения биочипов Макроматрицы ДНК и белков иммобилизованных на фильтре, или фиксированных в лунках планшет, были известны достаточно давно. Однако первая работа по ДНКовым микрочипам и одна из первых по белковым микрочипам в современном формате были опубликованы лабораторией Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ) под руководством А.Д. Мирзабекова. Этот принципиальный скачок был предложен для использования в новом методе секвенирования ДНК гибридизацией. Андрей Дарьевич Мирзабеков, академик РАН, член Европейской академии СССР, США и другие страны приняли государственные программы установления полной последовательности всех 3 миллиардов нуклеотидов генома человека. Широко дискутировался вопрос, должна ли эта задача решаться масштабированием существующих подходов или должны быть разработаны новые, более эффективные методы. В связи с временными ограничениями, ученые пошли по пути существенного улучшения и гигантского масштабирования уже существующего метода, основанного на считывании одного нуклеотида за другим с конца коротких фрагментов ДНК. Этот метод в химическом и ферментативном варианте был предложен В. Гилбертом и Ф. Сенгером, которые и разделили Нобелевскую премию. В развитии химического метода большую роль сыграли академики Е.Д. Свердлов и А.Д. Мирзабеков. В своей Нобелевской речи В. Гилберт отметил, что "идея метода пришла только после второго визита А. Мирзабекова" в его лабораторию. Предпосылки возникновения биочипов Биологические микрочипы являются одним из наиболее быстро развивающихся экспериментальных направлений современной биологии. Существует два основных типа биочипов. Первый тип - это микроматрицы различных соединений, главным образом биополимеров, иммобилизованных на поверхности стекла, в микрокаплях геля, в микрокапиллярах. Другим типом биочипов являются миниатюризованные "микролаборатории". Эффективность биочипов обусловлена возможностью параллельного проведения огромного количества специфических реакций и взаимодействий молекул биополимеров, таких как ДНК, белки, полисахариды, друг с другом и низкомолекулярными лигандами. Можно в достаточно простых параллельных экспериментах собрать и обработать на отдельных элементах биочипа огромное количество биологической информации. В этом заключается фундаментальное информационное сходство биочипов с электронными микрочипами. Однако между ними имеется и ряд принципиальных различий: главное из которых заключается в том, что один элемент биочипа производит одну выборку примерно из триллиона возможных вариантов, в отличие от элемента электронного чипа, где происходит двоичная выборка: ДА или НЕТ. Предпосылки возникновения биочипов Принцип действия ячейки ДНК или олигонуклеотидного биочипа, основан на комплементарных взаимодействиях оснований аденина (А) с тимином (Т) и гуанина (G) с цитозином (С) в двух нитях ДНК. Если последовательность оснований в одной нити ДНК (или олигонуклеотида) полностью комплементарна последовательности другой нити, то образуется стабильная совершенная двухнитевая спираль - дуплекс. Однако присутствие в дуплексе даже одной неправильной пары, например G-G, предотвращает образование дуплекса. При иммобилизации в одном из элементов микрочипа специфической одноцепочечной ДНК (20-мерный олигонуклеотид), то при добавлении к микрочипу меченных флюоресцентными красителями фрагментов ДНК, например генома человека, будет происходить их высокоспецифичное взаимодействие. Заданный олигонуклеотидный элемент биочипа специфически свяжет только одну комплементарную последовательность из 420 = 1.09 х 1012 всех возможных последовательностей этой длины в ДНК. В результате флюоресцентное свечение будет наблюдается только на этом комплементарном элементе биочипа. Предпосылки возникновения биочипов В поисках новых подходов к секвенированию ДНК группой российских ученых из Института молекулярной биологии, а также независимо двумя другими группами в Англии и Сербии было предложено в 1988 г секвенирование гибридизацией. В этом методе секвенирование проводится не отдельными нуклеотидами, а словами в составе полного "словаря" нуклеотидных слов определенной величины. Такой словарь может содержать все возможные 4096 гексануклеотидов, т.е. шестибуквенных генетических слов. С этого момента становится очевидным необходимость использования и, соответственно, создания микрочипов. «Для нас стала очевидной необходимость создания микрочипов, и в следующем году появилась первая статья, описывающая приготовление и свойства предложенных нами гелевых микрочипов. Позднее нами были созданы полные микрочипные гексануклеотидные словари. С этого момента наша группа сконцентрировалась на развитии биочипов: создании ДНКовых, белковых и клеточных биочипов, на развитии технологий их производства и на их применении в фундаментальных исследованиях и их различных приложениях в медицине, биотехнологии и др. областях.» Предпосылки возникновения биочипов Секвенирование 50-нуклеотидного фрагмента ДНК гибридизацией с полным олигонуклеотидным микрочипом, содержащим все 4096 гексамеров. Гексамеры микрочипа, образующие при гибридизации с флуоресцентно меченым фрагментом ДНК совершенные дуплексы, интенсивно светятся. Такие соседствующие гексамеры перекрываются на пять нуклеотидов, что позволяет однозначно восстановить нуклеотидную последовательность ДНК. Для приведенного случая идентификация всех гексамеров, комплементарных ДНК, и перекрывание соседних гексамеров на пять нуклеотидов позволяет полностью восстановить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. В действительности метод в данном варианте работает только в части случаев, его широкому применению должно предшествовать решение ряда экспериментальных проблем. Как рождался российский биочип Основа нынешней технологии производства биочипов была независимо разработана в конце 80-х годов тремя группами исследователей из Югославии, России и Британии. История создания «русского биочипа» связана с отечественно командой под руководством директора ИМБ академика РАН Андрея Дарьевича Мирзабекова (ушедшего из жизни в 2003г.). Югославскую группу вскоре пригласили работать в США, но довести теоретические замыслы до реализации она не сумела и распалась. Британские ученые продали технологию фирме, производящей диагностическое оборудование, но там ее также не реализовали. В начале 90-х годов академик Мирзабеков собрал в Москве круглый стол с участием ведущих зарубежных специалистов, которым был показан работающий биочип. Его увидел, в том числе, и Чарльз Кантор, один из руководителей международной программы «Геном человека». После того, как г-н Кантор поверил в идею, началась «гонка» международных компаний и институтов за лидерство на зарождающемся рынке биочипов. В середине 90-х годов, когда в России наступил экономический кризис и науку почти перестали финансировать, академика Мирзабекова пригласили в Аргоннскую национальную лабораторию (Чикаго, США). В ответ на предложение он заявил, что будет работать там только при условии создания совместной исследовательской группы, включающей американских специалистов, а также российских сотрудников из его лаборатории в ИМБ, насчитывающей в то время 30 человек. Как рождался российский биочип Сначала американские коллеги не соглашались, но в конце концов приняли поставленное условие. В течение 5-6 лет, когда исследования в области биочипов проводились совместно, финансирование этой группы обошлось в несколько миллионов долларов. Проект контролировал Департамент энергетики США, в свое время курировавший разработку атомной бомбы. США не нравились два аспекта сотрудничества с российскими учеными. Во-первых, они хотели, чтобы российские специалисты работали в США на постоянной основе и под контролем - тогда плоды их трудов полностью принадлежали бы США. Американская сторона даже уговаривали исследователей остаться в США и получить гражданство. Мирзабеков же и часть его коллег, напротив, хотели работать «вахтовым» методом. Во-вторых, американцы были недовольны тем, что руководит проектом не их соотечественник, а иностранный ученый, который половину своего времени проводит в России. В результате группа раскололась: часть исследователей осталась в США, другая под руководством Мирзабекова вернулась в Россию. Базовый патент на биочипы, объединяющий в одном пакете несколько технологий, разработанных в Аргоннской лаборатории, принадлежал России. Однако право использовать данный патент купили Motorola и НР. По соглашению с руководством Аргоннской национальной лаборатории, 50% доходов от патентов поступало ей, 50% - в Московский институт молекулярной биологии. Как рождался российский биочип Компаниям, выкупившим технологию у ученых, не нравилось, что выплаты за пользование патентом увеличивались в геометрической прогрессии. Если до коммерческого запуска проекта они платили только за использование технологии, то впоследствии прибавились еще и выплаты процентов от доходов. После этого Motorola и НР зарегистрировали свой патент на модифицированную технологию. Специалисты из ИМБ хотели подать в суд, но, возможно, в силу особенностей менталитета разбирательства не состоялось. Вместо этого группой академика Мирзабекова была разработана и запатентована более совершенная технология биочипов. В настоящее время Институтом молекулярной биологии (ИМБ) им. Энгельгардта основана компания "Биочип-ИМБ" (Biochip-IMB), руководителем которой стал Виктор Барский. Классификация биочипов В обычном варианте чипы представляют собой серию коротких олиroнуклеотидных последовательностей (различных по своему составу), зафиксированных на твердой поверхности (стекле), так что на 1 см2 поверхности можно разместить до 10.000 таких последовательностей, причем позиция каждого из них четко определена и хорошо идентифицируется в автоматическом режиме. В настоящее время разработаны и уже используются три типа чипов (microarrays). Классификация биочипов 1. Гuбридизационные чипы (hybridization arrays). В основе использования этих чипов лежит принцип аллель-специфической гибридизации. Олигонуклеотидные последовательности, комплементарные двум различным аллелям SNP, фиксируются на твердой поверхности химическими способами. Флуоресцентномеченный ПЦР-продукт, содержащий SNP, гибридизуется на чипе. В дальнейшем, гибридизационный паттерн визуализируется с помощью микроскопа и анализируется специальными компьютерными программами. 2. Чипы с фиксацией олигонуклеотидов на агарозной матрице. В основе этого метода также лежит принцип гибридизации, однако при данном варианте чипов олигонуклеотиды фиксируются на специальной агарозной подложке при помощи электрического тока. Взаимодействие анализируемых проб с олигонуклеотидами происходит под действием электрического поля, которое направляет отрицательно заряженные фрагменты ДНК к положительно заряженному чипу с иммобилизированными на нем последовательностями олигонуклеотидов. При этом концентрация исследуемого образца повышается локально в непосредственной близости от чипа, что позволяет повысить скорость гибридизации и сократить время анализа. Классификация биочипов 3. Чипы с ферментным процессингом (arrayed primer ехtепsion). В отличие от двух предыдущих методов в основе использования этого типа чипов лежит совмещение метода гибридизации и полимеразной реакции. Олигонуклеотиды, соответствующие области ДНК, примыкающей к SNP, фиксируются на чипе. Продукт ПЦР, содержащий SNP, сначала гибридизуют с олигонуклеотидами, а затем проводят реакцию с использованием ДНК-полимеразы и меченных различными флюорохромами дидезоксинуклеотидов. В этой реакции каждый олигонуклеотид, зафиксированный на подложке, становится праймером для полимеразной реакuии. Начинается полимеразная реакция и заканчивается присоединением к праймеру единственного меченого дидезоксинуклеотида, соответствующего нуклеотиду в матрице. Цвет флуоресuенции свидетельствует о том, какой из четырех нуклеотидов вступил в реакцию с олигопраймером. Таким образом, этот метод не только позволяет быстро улавливать наличие SNР, но и позволяет определить его нуклеотидную природу [Gut, 2001]. 3’ 5’ N dG dC A dA dC d 5’ 3’ 5’ dd 3’ ? G dd C dd T dd Использование биочипов Важный вклад в развитие чиповой технологии обнаружения мутauий и однонуклеотидных замен внесли российские ученые под руководством академика А.Д. Мирзабекова. Трехмерный чип изготавливается из полиакриламидного геля и крепится к поверхности стекла в соответствии с технологией БИОЧИП (американский патент- МAGIChip (Мiсro-Аrrау of Gel-Immobilizеd Compounds 011 а Cllip) (Tillib, Mirzabekov, 2001). Разработанная технология позволяет размещать на одном трехмерном чипе тысячи рaзличных зондов (помимо олигонуклеотидов - РНК, различные белки, клеточные рецепторы, лиганды), автоматически считывать результаты при помощи специального устройства, представляющего собой комбинацию флуоресцентного микроскопа, совмещенного с ССD-камерой, термостатируемым столиком и компьютером с соответствующим программным обеспечением [Fоtiп et al., 1998; Vasiliskov et аl., 1999; Strishkov et al., 2000]. Применение флуоресцентной метки для ДНК-зондов и лазерного сканирования результатов гибридизации меченых зондов с фрагментами исследуемой ДНК существенно повышает эффективность данного метода. В настоящее время разработаны и широко применяются биочипы для идентификации точечных мутаций в Р-глобиновом гене (диагностика талассемии), генетических полиморфизмов в гене рецепторов - МOR (диагностика наследственной предрасположенности к наркомании), для быстрой идентификации генов, кодирующих токсины у некоторых патогенных микроорганизмов и т.д., и более 30 мутаций генов определяющих появление антибиотикорезистентных штаммов туберкулезной палочки, созданы специальные микрочипы для обнаружения хромосомных перестроек при злокачественных болезнях крови. Использование биочипов • Существенные сложности в применении биочипов возникают при анализе мутаций в коротких тандемных повторах. Пока (2008-2009) эта проблема, к сожалению, остается нерешенной. • Необходимо отметить, что разработана техника, позволяющая проводить широкомасштабные исследования однонуклеотидных замен (SNP), при этом производство российских биочипов значительно экономичней продукции коммерческой фирмы Amphimetrix, где стоимость только одного чипа однократного применения составляет около 200 долларов. • Нет сомнения в том, что методам чиповой технологии принадлежит будущее, когда поиск мутаций в крупных генах, анализ их мутационных спектров и популяционных паттернов SNP приобретет массовый характер. Уже сейчас чиповая технология используется для поисков мутаций гена CFTR (муковисцидоз), генов обратной транскриптазы и протеазы HJVl, Р-глобинового гена,, p53, BRCAl (рак молочной железы) и др. Общий принцип работы Технологически биочип представляет собой матрицу, состоящую из сотен и тысяч ячеек. В каждой из ячеек закреплен олигонуклеотид. Длина олигонуклеотидов во всех ячейках одинаковая, отличаются они лишь последовательностью нуклеиновых кислот. Исследуемая ДНК режется на кусочки и проходит предварительную обработку, которая заключается в том, что к каждому из кусочков прикрепляется флуоресцентная метка. Таким образом получается набор из огромного числа маркированных олигонуклеотидов, являющихся составными частями исходной ДНК. Далее исследуемый образец наносится на все ячейки чипа, а затем, спустя некоторое время, смывается. Если в наборе имеется олигонуклеотид, комплементарный закрепленному в ячейке, то между ними, образуется связь, и при промывании он не будет удален, в отличие от олигонуклеотидов, которым не нашлось комплемента. После промывки чип помещается в специальный флуоресцентный микроскоп, где по световому сигналу, «метящему» ячейки с образовавшейся парой цепей, определяется состав проб: носителем этой информации оказываются интенсивность и цвет излучения. «Светящиеся» ячейки однозначно кодируют олигонуклеотиды исходной пробы: зная олигонуклеотиды, которые были изначально помещены в данные ячейки, и учитывая однозначность образования пар, можно сделать вывод о составе фрагмента исследуемой ДНК. Метод детекции ДНК с помощью наномотора Ученые из Аризоны разработали способ, позволяющий избирательно детектировать ДНК, содержащуюся в пробе в зептомолярных количествах (10-21). Необходимое для устройство состоит Структура F1-АТФазы детектирования из трех основных частей: 1. молекулярный наномотор F1-AТФаза – компонент сложного ферментативного комплекса, отвечающего в организме за синтез АТФ. Эти молекулы связаны с авидином и прикреплены к подложке, покрытой Ni-NTA, при помощи шестигистинового тэга; 2. золотые наночастицы, к которым также присоединен авидин; 3. молекула ДНК, на обоих концах Схема наномотора которой имеется по молекуле биотина. Этапы сборки наномотора Биотин способен прочно связываться с авидином – таким образом, при наличии всех трех компонентов в системе собираются наноустройства. А затем начинается самое интересное: если к готовой, полностью собранной системе добавить Mg2+ и AТФ, ротор компонента F1-АТФазы начнет вращаться, вращая и золотую наночастицу, прочно прикрепленную к наномотору при помощи ДНК. Результат в виде мерцания можно наблюдать в микроскоп, отличая таким образом целевое связывание от фона, вызванного неспецифичным связыванием частиц золота с подложкой. Специфичность работы При нанесении молекул F1-АТФазы на подложку исследователи подобрали концентрацию молекул так, чтобы они располагались друг от друга на достаточном расстоянии: чтобы одна молекула ДНК не могла связаться обоими концами с двумя соседними молекулами F1-АТФазы, и чтобы собранные устройства не мешали друг другу во время вращения наночастиц золота. Описанные наноустройства будут работать только в том случае, если в системе имеется биотинилированная с двух концов ДНК, способная связать F1АТФазу и золотую частицу в единое целое. Одна дибиотинилированная ДНК соответствует одной молекуле определяемой ДНК. Чтобы этого добиться, необходимо изготовить два олигонуклеотидных зонда, один из которых связан с биотином со стороны 3’-конца, другой – с 5’-конца. Эти зонды комплементарны определяемому фрагменту ДНК и вместе полностью покрывают его. После добавления зондов к образцу смесь нагревают, чтобы разрушить двуцепочечные структуры ДНК, а затем охлаждают, чтобы двойные спирали вновь сформировались, но теперь уже между ДНК-мишенью и зондами. Затем к смеси добавляют ДНК-лигазу, сшивающую фрагменты ДНК в местах разрывов двуцепочечной ДНК. Если последовательность ДНК полностью комплементарна двум зондам, то в результате работы лигазы образуется двуцепочечная ДНК без разрывов, и последующее добавление ДНК-полимеразы не приводит ни к каким изменениям. Если зонды не полностью комплементарны целевой ДНК, то после добавления ДНК-полимеразы, которая обладает также экзонуклеазной активностью, полимераза синтезирует новую цепь ДНК, начиная с места разрыва и разрушая при этом один из зондов. В результате формируется ДНК, биотинилированная лишь с одной стороны – и, разумеется, сигнал в виде крутящихся золотых наночастиц от такой ДНК получен не будет. Таким образом, метод позволяет распознавать точечные замены в молекулах ДНК, что часто как раз и требуется при анализе генетических заболеваний, обнаружении патогенов и онкогенов Система детекции экспрессии генов на основе самоорганизующихся ДНК-наноструктур Исследователи из Аризонского Института Биотехнологии (Arizona State University’s Biodesign Institute) разработали первую в мире систему детекции экспрессии генов, основанную на самоорганизующихся ДНК-наноструктурах. Результаты, опубликованные в январе 2008 года в журнале Science, могут получить широкое применение в сфере микрочиповых технологий и анализа генной экспрессии в отдельно взятой клетке. «В качестве наноструктурного ”строительного материала” мы использовали наиболее известную в современной биологии молекулу – ДНК», объяснил Гао Ян (Hao Yan), работающий в лаборатории Биофизики Клетки Аризонского Института Биотехнологии. Гао Ян возглавил группу исследователей, чья работа была направлена на разработку метода, позволяющего с помощью ДНК выявить продукты экспрессии отдельных генов в клетке, то есть молекулы РНК. «Это первая успешная попытка практического применения мощного метода, который до настоящего времени был в основном предметом фундаментальной науки», говорит один из исследователей, Стюарт Линдсей (Stuart Lindsay), «в последнее время мы добились существенного прогресса в конструировании геометрических и топологических наноструктур, основанных на свойстве самоорганизации ДНК, изначально продемонстрированном Недом Симаном (Ned Seeman), Эриком Уинфри (Erik Winfree) и их коллегами». Система детекции экспрессии генов на основе самоорганизующихся ДНК-наноструктур Идея создания определенным образом пространственно организованных ДНК-наноматриц пришла из работ Пола Ротмунда (Paul Rothemund), который создал метод «ДНКоригами» (в оригинале: scaffolded DNA origami). Это метод, в котором длинные одноцепочечные нити вирусной ДНК могут быть определенным образом уложены и скреплены с помощью так называемых «вспомогательных нитей» в регулярные наноструктуры. Метод ДНК-оригами Система детекции экспрессии генов на основе самоорганизующихся ДНК-наноструктур С высокой точностью контролируя положение каждого азотистого основания в синтетической ДНК, исследователи запрограммировали одноцепочечную ДНК М13 формировать в растворе наноцилиндры, содержащие пробы для гибридизации с анализируемой РНК. Два фрагмента пробы находятся на поверхности цилиндров, и, когда РНК связывается с их свободными концами, образуется жесткая структура. Ядерно-силовая микроскопия позволяет получить изображения проб с молекулярным разрешением. Места гибридизации образуют выпуклости на цилиндрах, которые выглядят на фотографии как светлые полосы. «Однако потенциал ДНК-нанотехнологий для биологических исследований был недооценен. Если мы внимательно посмотрим на процесс самоорганизации молекул ДНК, то увидим, что в нескольких микролитрах раствора могут одновременно формироваться миллионы ДНКнаноструктур. Важно то, что они остаются растворимыми, а также что они биосовместимы», говорит Ян. С помощью ДНК-микрочиповая технология (DNA chip- или DNA-microarray technology) можно одновременно анализировать тысячи генов, определяя их мутации и обнаруживая причины различных патологий. Однако в случае микрочипа фрагменты ДНК фиксируются на твердой стеклянной или кремниевой подложке, гидрогеле. В результате этого очень сложно точно контролировать расстояние между пробами, что приводит к увеличению времени гибридизации проб с анализируемыми образцами РНК или ДНК, повышению вероятности нежелательной кросс-гибридизации и, как результат, к снижению точности метода. Система детекции экспрессии генов на основе самоорганизующихся ДНК-наноструктур В случае ДНК-наноматрицы она одновременно является и носителем пробы, и самой пробой. Это позволяет добиться как более высокой разрешающей способности метода, так и более высокой точности анализа. Исследователи синтезировали одноцепочечную геномную ДНК, М13, которая формировала наноразмерные цилиндры, содержащие пробы отдельных интересующих исследователей генов. Такой структуры можно добиться, контролируя при синтезе ДНК последовательность азотистых оснований в молекуле. Фактически, Гао Ян и коллеги использовали основной закон образования пар нуклеотидов в двуцепочечной молекуле ДНК: аденин формирует ковалентные связи с тимином, а гуанин – с цитозином. При попадании одноцепочечной молекулы с определенной последовательностью нуклеотидов в раствор, она предсказуемым образом «сворачивается», образуя внутренние связи. М13 практически в 100% случаев образует идентичную цилиндрическую структуру. Гао Ян с коллегами разработали на данный момент систему для детекции экспрессии трех генов. Каждая проба может быть отличена от другой с помощью структурных «опознавательных знаков», поэтому исследователи смешали все три пробы в одном растворе, получив, таким образом, единую систему для выявления нескольких РНК-продуктов. Для выявления гибридизации исследователи использовали ядерно-силовую микроскопию (от англ. atomic force microscopy (AFM)), позволяющую получить изображения отдельных молекул в растворе. Система детекции экспрессии генов на основе самоорганизующихся ДНК-наноструктур ДНК-наноматрицы. Слева – ДНК наноматрицы после гибридизации с исследуемой РНК. Размер поля: 1500 х 1500 нм. Справа – фотография с более высоким разрешением, на которой видны «опознавательные знаки», позволяющие отличить одну матрицу от другой (светлые точки).
