Тема: Разработка диагностического набора, основанного на

14.604.21.0068
<Номер постера>
Федеральная целевая программа
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического
комплекса России на 2014—2020 годы»
Науки о жизни
Тема: Разработка диагностического набора, основанного на принципе конкурентного иммуноферментного
анализа, для определения уровня аутоантител к β1-адренорецептору у больных с идиопатическими нарушениями
ритма и проводимости сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии
Соглашение № 14.604.21.0068
на период 2014- 2016 гг.
Руководитель проекта: руководитель отдела
Голицын Сергей Павлович
Получатель субсидии: Федеральное государственное бюджетное учреждение "РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КОМПЛЕКС" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Цели и задачи проекта
1. Разработать высокочувствительный метод определения уровня аутоантител к β1-адренорецептору и создать лабораторный прототип
соответствующего диагностического набора.
2. Определить уровень аутоантител к β1-адренорецептору у больных с идиопатическими нарушениями ритма и проводимости сердца и
при наличии сердечно-сосудистой патологии и сопоставить его с данными лабораторно-инструментального обследования.
Исследование воспалительного поражения миокарда аутоиммунного генеза является актуальной проблемой современной аритмологии. Особенно важна задача мониторинга аутоантител к
β1-адренорецептору. Несмотря на множество попыток, до сих пор в мире не удалось создать доступных коммерческих наборов для подобного диагностикума.
Ожидаемые результаты проекта
•
•
•
•
Будет создан лабораторный прототип диагностического набора для определения уровня аутоантител к β1-адренорецептору в крови пациентов методом конкурентного ИФА с
использованием иммобилизованных клеток, экспрессирующих рекомбинантный β1-адренорецептор, в качестве твердофазного носителя антигена в его природной конформации.
Будет разработана методика определения уровня аутоантител к β1-адренорецептору в образцах плазмы или сыворотки крови пациентов и составлен проект инструкции по применению
диагностического набора.
Будут получены результаты изучения эффективности лабораторного прототипа диагностического набора для диагностики аутоиммунных изменений у больных с идиопатическими
нарушениями ритма и проводимости сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии.
Будет установлен характер связи между наличием аутоантител к β1-адренорецептору и развитием определенных сердечно-сосудистых патологий.
Предлагаемый диагностический набор основан на принципе конкурентного иммуноферментного анализа "третьего поколения", считающегося золотым стандартом для определения
аутоантител к поверхностным белкам клеток человека. Несколькими группами ученых активно разрабатываются подходы к созданию диагностических наборов для определения
аутоантител-агонистов к β1-адренорецептору как методом конкурентного ИФА третьего поколения, так и путем совершенствования стандартного ИФА на основе пептидных антигенов.
Перспективы практического использования
Создаваемый диагностический набор сможет быть использован в специализированных медицинских учреждениях для определения аутоиммунных изменений у больных с нарушениями
ритма и проводимости сердца.
Подтверждение роли аутоиммунных механизмов в развитии нарушений ритма сердца и других сердечно-сосудистых патологий у определенных категорий больных может стать
обоснованием применения терапевтической иммунокоррекции (иммуносорбция аутоантител, иммуномодулирующая терапия) как составной части противоаритмического лечения, а
периодический мониторинг уровня аутоантител к β1-адренорецептору позволит оценивать эффективность лечения у конкретного больного.
Разработка актуального, инновационного диагностического метода определения аутоантител к β1-адренорецептору может характеризоваться экономическим эффектом до нескольких сотен
млн. руб. в год.
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
•
Создание прототипа диагностического набора, проведение измерений уровня аутоантител к
β1-адренорецептору и анализ полученной информации запланированы на последующих этапах работы
Nhe I
BstB I
Sal I
BamH I
pMC4IPW-mHC2367
6.8 kb
Sal I
Sma I
BamH I
Bgl II
BsrG I
Afl II
Nsi I
Nhe I
BstB I
pMC4IHW-mLC2367
6.7 kb
Sma I
Bgl II
BsrG I
Afl II
Nsi I
Xho I Xba I
BstE II
Acc65 I
Pst I
Xho I Xba I
180
Xho I Xba I
Pst I
160
140
Nhe I
BstB I
Sal I
Nhe I
BstB I
Sal I
120
100
80
BamH I
60
pMC4IPW-hHC2367
6.8 kb
Nsi I
40
Sma I
BamH I
Bgl II
BsrG I
Afl II
pMC4IHW-hLC2367
6.7 kb
Sma I
Bgl II
BsrG I
Afl II
Nsi I
Концентрация иммуноглобулинов, нг/мл
EcoR V
Xho I Xba I
BGH
pA
•
Mouse VL Human CL
BGH
pA
•
Mouse VL Mouse CL
BGH
pA
•
Human CH
Mouse VH
BGH
pA
•
Mouse CH
20
350
300
250
200
150
100
50
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
Доля генов легких цепей
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
Доля генов легких цепей
Nhe I
BstB I
Sma I
Acc65 I
Пептид β8
3.0
Sal I
3.5
2.5
Sal I
Пептид β8
4.0
WPRE
Xba I
Оптическая плотность
•
Mouse VH
Концентрация иммуноглобулинов, нг/мл
•
Синтезированы оптимизированные гены тяжелой и легкой цепей мышиного и химерного
(мышь/человек) моноклонального антитела 23-6-7 к β1-адренорецептору. Правильность синтеза
подтверждена секвенированием.
Сконструирован высокоэффективный двухкассетный экспрессионный вектор pDC. Эффективность
вектора продемонстрирована на модельных генах зеленого и красного флуоресцентных белков.
Изготовлены плазмидные конструкции pDC-mAB2367 и pDC-hAB2367 для продукции,
соответственно, мышиного и химерного рекомбинантного
антитела к β1-адренорецептору в
клетках
млекопитающих.
Правильность
сборки
проверена
рестрикционным
анализом.
Функциональная активность плазмидных конструкций подтверждена методом транзитной
трансфекции культуры клеток НЕК293.
Продемонстрировано эффективное связывание мышиного и химерного рекомбинантных антител с
пептидом β8, представляющим собой фрагмент второй внеклеточной петли β1-адренорецептора
человека.
Синтезирован оптимизированный ген β1-адренорецептора человека (ADRB1opt) и изготовлена
плазмидная
конструкция
pMC4IPW-ADRB1opt
для
экспрессии
рекомбинантного
β1-адренорецептора
в
клетках
млекопитающих.
Экспонирование
рекомбинантного
β1-адренорецептора на поверхности клеток, трансфицированных плазмидой pMC4IPW-ADRB1opt,
показано при помощи окрашивания клеток рекомбинантными антителами с последующим
цитофлуориметрическим анализом.
Разработана методика определения содержания β1-адренорецептора на поверхности клеток
млекопитающих методом радиолигандного анализа. По материалам разработки подана заявка на
патент: "РАДИОЛИГАНДНЫЙ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ РЕЦЕПТОРНОЙ АКТИВНОСТИ
β-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ НА ПОВЕРХНОСТИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА".
Подобраны оптимальные условия и разработана методика иммобилизации клеток млекопитающих
на планшете для ИФА путем фиксации 0,02%-ным глутаровым альдегидом. Потери клеток на
стадии иммуноферментного анализа составляют менее 6% при сохранности антигена около 70%.
Продолжено формирование трех основных групп больных с желудочковыми нарушениями ритма
сердца и двух групп сравнения. К настоящему моменту в исследование включено 109 человек.
Всем пациентам проведено клинико-инструментальное обследование согласно протоколу.
pDC-mAB2367
11.7 kb
Xho I
Xba I
BamH I
Acc65 I
Оптическая плотность
•
2.0
1.5
1.0
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.5
0.0
Nsi I
0
Nhe I
Sma I
Afl II BsrG I Bgl II
BstB I
0.0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
10
20
30
40
50
60
70
Концентрация hAB2367, нг/мл
0.6
Концентрация mAB2367, нг/мл
Группа Диагноз
1
2
3
4
5
Всего
Идиопатические нарушения
ритма сердца
Ишемическая болезнь сердца с
желудочковыми нарушениями
ритма сердца
Дилатационная кардиомиопатия
воспалительного генеза с
желудочковыми нарушениями
ритма сердца
Ишемическая болезнь сердца без
нарушений ритма сердца
Здоровые добровольцы
Мужчины
Женщины
Всего
Целевое
значение
23
32
55
40
19
2
21
40
10
5
15
40
4
1
5
15
6
7
13
15
62
47
109
150
Партнеры проекта
Индустриальный партнер: ООО «БионА Фарма» (дочернее предприятие ОАО «Научно-Производственная Корпорация БИОРАН») - внебюджетное
финансирование, получение калибровочного стандарта в виде химерных (мышь/человек) рекомбинантных антител к β1-адренорецептору.
Соисполнители: ООО «МонА» - синтез двухкассетного плазмидного вектора, получение рекомбинантных антител к β1-адренорецептору;
Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова – разработка метода радиолигандного анализа, мониторинг
стабильности экспрессии рекомбинантного β1-адренорецептора клетками-продуцентами.
14.604.21.0068
<Номер постера>