"Дендритные клетки в проблеме иммунотерапии онкологических

ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ В ПРОБЛЕМЕ
ИММУНОТЕРАПИИ
ОНКОЛОГИЧЕСКИХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ.
В.А. Козлов, Е.Р. Черных, С.В. Сенников
ФГБУ НИИ клинической иммунологии
СО РАМН, г. Новосибирск
ФРИДЕНШТЕЙН А.Я. (1924-1997 гг)
МАКСИМОВ А.А. (1874-1928 гг)
Ральф Ма́рвин Штейнман (Стейнман) (1943- 2011)
Ralph Marvin Steinman
Нобелевская премия по физиологии и
медицине (2011 г., посмертно) - за а
открытие дендритных клеток и изучение
их
значения
для
приобретённого
иммунитета (for his discovery of the
dendritic cell and its role in adaptive
immunity).
В 1973 г. Ральф Штейнман впервые
описал дендритные клетки и собственно
ввёл в научный обиход сам этот термин,
исследовал
процессы
активации
иммунной
системы
—
то
есть
приобретенного
иммунитета,
отвечающего за полное уничтожение
инфекционных агентов.
Илья Ильич Мечников (1845 —
1916)
Нобелевская премия по физиологии и
медицине (1908 г.)
Формулировка нобелевского комитета:
“в знак признания работ по иммунитету”
Суть открытия: описание одного из двух
главных
механизмов
иммунитета:
клеточного (фагоцитоз), лежащего в
основе индивидуальной невосприимчивости к инфекционным процессам
ПОЛИПОТЕНТНАЯ СТВОЛОВАЯ КРОВЕТВОРНАЯ КЛЕТКА
МОНОЦИТ
МАКРОФАГ
ДЕНДРИТНАЯ КЛЕТКА
В ОСНОВЕ ОДИНАКОВЫХ ФУНКЦИЙ (ФАГОЦИТОЗ,
ПРЕЗЕНТАЦИЯ
АНТИГЕНОВ,
ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ,
РЕГУЛЯТОРНАЯ АКТИВНОСТЬ, ПРОДУКЦИЯ ЦИТОКИНОВ ) ОБЕИХ ПОПУЛЯЦИЙ КЛЕТОК ЛЕЖИТ ФАГОЦИТОЗ, ОТКРЫТЫЙ И.И. МЕЧНИКОВЫМ
Human plasmacytoid DCs. Optical microscopy (A), transmission electron microscopy (B),
and scanning electron microscopy (C) images showing the typical morphology of human
pDCs. (D) Scanning electron microscopy image showing the dramatic morphological
changes ...
Мacrophage.
Scanning electron microscopy image showing the dramatic morphological changes ...
СУБПОПУЛЯЦИИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК
-
мДК (миэлоидные или обыкновенные) экспрессируют на высоком уровне
антигены МНС II-го класса и интегрин CD11c на клеточной поверхности,
а также такие молекулы адгезии, как LFA-1 (CD11a), LFA-3 (CD58),
ICAM-1 (CD54), ICAV-2 (CD50), ICAM-3 (CD102), а также костимулирующие молекулы: CD86 (на ранних стадиях созревания) и СD80 (и CD83) - в
зрелой стадии
-
пДК (плазмацитоидные) слабо экспрессируют антигены МНС II-го
класса, экспрессируют
IL-3R (CD123), исключительно типа II с-тип
BDCA-2 (CD303) (включается в процесс презентации Аг Т-клетках)
-
фДК (фолликулярные) из миндалин экпрессируют CD21, CD23, CD35 и
маркёры клеточного цикла DRC-1, Ki-M4 или DR53. Располагаются
зародышевых центрах лимфатических узлов, презентируют Аг Вклеткам, поддерживают иммунологическую память
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АКТИВНОСТИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК (ДК) ПРИ
ОПУХОЛЕВОМ РОСТЕ
ДК САМИ ОБЛАДАЮТ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬЮ ПРОТИВ ОПУХО –
ЛЕВЫХ КЛЕТОК
2. ФОРМИРУЮТ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ИММУНИТЕТ (ИНДУЦИРУЮТ: НАКОПЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ, ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ Т
ЛИМФОЦИТОВ;
СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛООБРАЗУЮЩИХ
КЛЕТОК
3. пДК СТИМУЛИРУЮТ СОЗРЕВАНИЕ мДК И ИХ ПРОТИВООПУХО –
ЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ
4. ИНДУЦИРУЮТ СОСТОЯНИЕ НЕОТВЕЧАЕМОСТИ (ТОЛЕРАНТНО –
СТИ) ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРОТИВ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
1.
ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ И ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК.
ВСЁ ЗАВИСИТ ОТ ИНДУЦИРУЮЩЕГО СИГНАЛА.
ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ – ЭТО НЕ ПРОСТО АКТИВАЦИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
Сферы потенциального клинического использования клеточных
технологий.
Стволовые клетки
 Ишемическая болезнь сердца
 ишемия нижних конечностей
 церебральный инсульт
 травмы спинного и головного
мозга
 Болезнь Альцгеймера и
Паркинсона
 цирроз печени
 заболевания почек
 заболевания костей и
суставов
 ожоги и трофические язвы
Клетки иммунной
системы
 Злокачественные опухоли
 Хронические вирусные
инфекции (гепатит, ВИЧ)
 Аллергические заболевания
 Аутоиммунная патология
(ревматоидный артрит,
рассеянный склероз,
сахарный диабет и др.)
 Иммунологическое бесплодие
Вакцины на основе дендритных клеток (ДК)
Обоснование
• ДК – являются наиболее
профессиональными АПК
• ДК эффективно активируют
CD4 и CD8 Т-лимфоциты,
причем как примированные,
так и наивные Т-клетки
• ДК способны преодолевать
толерантность к опухолевым
антигенам и индуцировать
противоопухолевый
иммунный ответ
Актуальность
По данным ВОЗ в 2008 году от рака умерло 7,6 миллиона
человек, что соответствует 13% от числа всех смертей в мире.
Соотношение числа заболевших к умершим составляет 1 к 0,6.
2017 год объявлен ВОЗ ориентировочным годом
победы над раком.
Клинические испытания
В настоящее время в мире ведется более 300
клинических испытаний по использованию вакцин на
основе дендритных клеток для лечения
онкологических заболеваний, из которых 232 в США и
только 3 в России (согласно данным U.S. National
Institutes of Health (clinicaltrials.gov)).
Основные варианты антигенов, используемые для
сенсибилизации дендритных клеток
- Антигенные детерминанты (рекомбинантные белки, пептиды,
лизат опухолевых клеток),
- РНК (тотальная, матричная, антиген-связанная),
- ДНК (кодирующая антигены, эпитопы опухолевых
антигенов)
Методы оценки эффективности стимуляции
противоопухолевого иммунного ответа in vitro:
- оценка цитотоксической активности мононуклеарных клеток
(цитотоксический тест, уровень перфорина и гранзима В),
- оценка модуляции активности мононуклеарных клеток
(продукция цитокинов IFNγ и IL-4, пролиферативная
активность).
Схема предлагаемого решения
+ ГМ-КСФ
+ ИЛ-4
Незрелые дендритные клетки
Выделение предшественников
дендритных клеток
+ ФНО-а
Обработка
дендритных
клеток ОЛ или
ДНКконструкцией
Подготовка
опухолевого лизата
(ОЛ)
Выделение
опухолевых
клеток
+ МНК
+ ИЛ-12
+ ИЛ-18
Зрелые антиген-активированные
дендритные клетки
Оценка эффективности стимуляции
противоопухолевого антиген-специфического
иммунного ответа мононуклеарными
клетками периферической крови in vitro
ДК-вакцины в лечении
злокачественных глиом
головного мозга
ИФНα-индуцированные ДК
СD14+
моноциты
Индукция
дифференцировки
sm DC
Im DC
GM-CSF+IFNα
Частичнозрелые ДК
1-2 cут
3 сут
CD14+
Дозревание
IL-1,IL-6, PGE2,TNF-a
Цитотоксический ответ мононуклеарных клеток (МНК) больных раком
яичника, сокультивированных с дендритными клетками (ДК), нагруженных
лизатом опухолевых клеток, против аутологичных опухолевых клеток.
Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала.
Различия достоверны при р≤ 0,05. Критерий Wilcoxon.
Цитотоксический ответ мононуклеарных клеток (МНК) больных колоректальным раком,
сокультивированных с дендритными клетками (ДК), нагруженных лизатом
аутологичных опухолевых клеток, против аутологичных опухолевых клеток. (n=13).
Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала.
Различия достоверны при р≤ 0,05. Критерий Wilcoxon.
Цитотоксический ответ мононуклеарных клеток (МНК) больных колоректальным раком,
сокультивированных с дендритными клетками (ДК), трансфецированных плазмидой
pCI-UB-poly, против аутологичных опухолевых клеток. (n=15).
Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала.
Различия достоверны при р≤ 0,05. Критерий Wilcoxon.
Цитотоксический ответ мононуклеарных клеток (МНК) больных раком молочной
железы, сокультивированных с дендритными клетками (ДК), нагруженных лизатом
аутологичных опухолевых клеток, против аутологичных опухолевых клеток. (n=22).
Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала.
Различия достоверны при р≤ 0,05. Критерий Wilcoxon.
Цитотоксический ответ мононуклеарных клеток (МНК) больных раком молочной
железы, сокультивированных с дендритными клетками (ДК), трансфецированных
плазмидой (U), против аутологичных опухолевых клеток. (n=36).
Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала.
Различия достоверны при р≤ 0,05. Критерий Wilcoxon.
ТАКИМ ОБРАЗОМ,
В
ИНСТИТУТЕ РАЗРАБОТАНЫ И ГОТОВЫ К
КЛИНИЧЕСКИМ ИССЕДОВАНИЯМ СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ
АКТИВИРОВАННЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК, СЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫХ
ОПУХОЛЕВЫМИ АНТИГЕНАМИ, ПРОТИВ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ,
КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА, РАКА ПРОСТАТЫ И ЯИЧНИКА.
МЫ ЖДЁМ ДОЛГОЖДАННОГО ЗАКОНА О КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ,
БОЛЬНЫЕ ЖДУТ НАШИХ ВАКЦИН ???
Схема лечения больных
злокачественными глиомами
Пациент
МНК крови
Клетки опухоли
Моноциты
Дендритные
клетки
Нагрузка
Опухолевый
антиген
Криоконсервация ДК
Генерация ЦТЛ в
культуре in vitro
ДК-вакцины
4 - 6 п/к инъекций
раз / 2 недели
1
Апробация ДК при злокачественных
глиомах головного мозга
Общая группа - 118 чел
Контрольная
группа (80)
•Удаление опухоли
•Радиотерапия
Основная
группа (38)
•Удаление опухоли
•Радиотерапия
•Иммунотерапия
Генерация иммунного ответа в процессе ДК-терапии
Реакция ГЗТ к ОАА
*
64
60
40
*
28
20
0
3
8
6
имп/мин х 10
% больных (ГЗТ+)
80
4
Пролиферативный ответ
на ОАА
*
2
0
0
0
3
6
Количество вакцинаций
0
3
6
Количество вакцинаций
Функциональная активность IFNαиндуцированных ДК
Способность ДК стимулировать
пролиферацию в СКЛ
Способность ДК стимулировать
пролиферацию на ОАА
20
0
ДК
имн/мин x 103
16
0
АГ
12
ДК+АГ
8
*
IL-2
4
ДК+АГ+IL-2
0
доноры
ЗОГМ
*
0
5
10
15
20
25
имп/мин х 103
30
Индекс качества жизни (бaллы)
Показатели уровня качества жизни больных
по шкале Карновского
100
80
группа сравнения
*
основная группа
86
60
66
55,8
56,2
40
20
0
До операции
Через 1год
Эффективность ДК-вакцин
Кривые выживаемости у больных глиобластомой
(Grade IV)
1,0
Мe ИТ(+) = 14 мес
Мe ИТ(-) = 9 мес
0,8
0,6
P=0,003
0,4
1,0
ИТ(+); n=15
0,2
0
ИТ(-); n=39
0
4
8
12
16
20
24 мес
*Выживаемость с момента хирургического удаления опухоли
Эффективность ДК-вакцин
Кривые выживаемости у больных злокачественной
глиобластомой головного мозга (Grade III)
1,0
0,8
0,6
P=0,00001
1,0
ИТ(+); n=20
0,4
ИТ(-); n=52
0,2
0
0
4
8
12
16
20
24 мес
*Выживаемость с момента хирургического удаления опухоли
Изменение свойств IFNa-индуцированных дендритных клеток
при онкологических и инфекционных заболеваниях
Патология
Глиобластома
Продукция Th1
цитокинов
N
Злокачественные лимфомы
↓
Продукция Th2/
цитокинов
Аллостимуляторная активность
Th1стимулирующая
активность
Th2стимулирующая
активность
Цитототоксическая
активность
N
N
N
N
↓
↑
↓
N
↑
↓
Вирусные
гепатиты с
исходом в
цирроз печени
N
↑
↓
↓
↑
-
Туберкулез
легких
↓
↑
↓
↓
N
-
НАШИ
ИССЛЕДОВАНИЯ
СВИДЕТЕЛЬСТВУЮТ
ТАКЖЕ
О
НЕОБХОДИМОСТИ ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ СТИМУЛЯЦИИ ДЕНДРИТНЫХ
КЛЕТОК ЦИТОКИНАМИ ПРИ ПРИГОТОВЛЕНИИ ВАКЦИН
С ЦЕЛЬЮ
ПОВЫШЕНИЯ ИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ В СИЛУ
СНИЖЕНИЯ ЕЁ УРОВНЯ У БОЛЬНЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ВИДАМИ РАКА.
В
ЦЕЛОМ,
ДАННАЯ
УСТАНОВКА
ДОЛЖНА
КАСАТЬСЯ
ВСЕХ
АУТОЛОГИЧНЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ С РАЗЛИЧНЫМИ
ЗАБОЛЕВАНИЯМИ С ЦЕЛЬЮ ИХ ТЕРАПЕВТИЧЕСГОГО ПРИМЕНЕНИЯ.
НАДО ВСЕГДА ПОМНИТЬ, ЧТО КЛЕТКИ ТО ЖЕ “БОЛЕЮТ”, И ЧТО ИХ
НАДО ТО ЖЕ “ЛЕЧИТЬ”
Факторы, влияющие на функциональное состояние
дендритных клеток при онкологическом процессе
- опухолевая прогрессия (прямое и непрямое супрессивное
влияние на ДК),
- опухолевое микроокружение (строма, иммунные клетки,
цитокины, метастазы),
- заболевания (инфекции, хронические воспалительные
процессы),
- медикаментозное, гормональное и физическое воздействие,
- психоэмоцональный стресс заболевания и терапии,
- возрастные изменения иммунной защиты,
СТРАТЕГИЯ КОМПЛЕКСНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ
ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ.
ОНКОЛОГИЯ:
- Введение активированных дендритных клеток
- Иньекция активированных макрофагов М1
- Ведение цитотоксических лимфоцитов
- Иньекция антител против иммуносупрессорных клеток
- Аспирин с целью подавления индукции супрессорных клеток
Заключение
Использование различных подходов клеточной
терапии на основе антиген-активированных
дендритных клеток, позволяет в комплексе с базовой
терапией у части онкологических больных привести к
стабилизации онкопроцесса и увеличить
выживаемость.
Дендритноклеточные вакцины в лечении
вирусных заболеваний
Длительность межрецидивного периода
в ходе ИТ
ДК-вакцины, нагруженные HBs-антигеном у
больных хроническим вирусным гепатитом В
позволяют:
- индуцировать антигенспецифический иммунный
ответ
- добиться прекращения репликации вируса
у 25% пациентов)
- добиться нормализации биохимических
показателей
у 50% пациентов
*
100
*
80
60
40
20
0
до лечения
5
индекс влияния
- стимулировать антигенспецифический иммунный
ответ
- увеличить продолжительность межрецидивного
периода
- сократить число рецидивов
дни наблюдения
ДК-вакцины у больных рецедивирующей
герпесвирусной инфекцией позволяют:
после 1
курса
после 2
курса
Динамика антигенспецифического ответа на
НВs-Ag в процессе терапии
*
4
*
3
2
1
0
до лечения
после 1 курсв
после 2 курса
через 6 мес наблюдения
Спаси
Коллектив
ФГБУ «НИИКИ»СО РАМН
Благодарит за
внимание!
ДНК – конструкции
- Колоректальный рак (Нуклеотидная последовательность, кодирующая
эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов CEA
карциноэмбриональный антиген), EpCAM (молекула адгезии
эпителиальных клеток), MUC 4 (муцин 4), клонирована в плазмиду pCIUB, которая содержит последовательность убиквитина, направляющего
белок в протеасому (pCI-UB-POLYEPI);
- Рак молочной железы (плазмида U - универсальная конструкция, содержит
минимальный набор ЦТЛ и Тх пептидов белка Her2/neu; плазмида А аллельспецифическая конструкция, содержит Тх и HLA-A0201-связанные
ЦТЛ пептидные эпитопы различных опухоль-ассоциированных антигенов
рака молочной железы)
Функциональная активность IFNαиндуцированных ДК
Влияние ДК на продукцию Th1/Th2 цитокинов в СКЛ
600
+ДК доноров
Индекс влияния
500
+ДК больных
400
300
*
*
200
100
0
IFN- 
IL-13
IL-5