Перспективы развития молекулярно

Перспективы развития молекулярногенетических методов исследований для
диагностики туберкулеза
• НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ:
М.А.Владимирский, Н.С.Смирнова, Л.К.Шипина,
М.Б.Лапенкова
• НИИ биофизики РАН(г.Пущино): В.Н.Морозов,
А. Михеев
• ЗАО «Синтол»: Я.И.Алексеев, Ю.С.Аляпкина,
К. Благодатских
Перспективы развития: настоящее и
будущее
Будущее вытекает из настоящего
• 1. Разработка и внедрение высокотехнологичного, в
том числе российского, оборудования : отечественная
станция для автоматического выделения ДНК – 96
образцов
• 2. Российский картридж для автоматического
определения лекарственной устойчивости к двум
препаратам : изониазиду и рифампицину
• 3. Российский секвенатор – «Нанофор»
• 4. Расширение объемов применения количественной
ПЦР для выявления ДНК МБТ в мокроте больных
ВИЧ-инфекцией
• 5. Новые технологии анализа лекарственной
чувствительности МБТ и контроля за
внутригоспитальной туберкулезной инфекцией
Новые молекулярно-генетические технологии
 Технология будущего: таргентное (селективное)
секвенирование генома МБТ:
ПЦР-амплификация всех участков ДНК в генах МБТ с
обнаруживаемыми ДНК мутациями, ответственными за
лекарственную устойчивость, с последующим
секвенированием.
 ПЦР в реальном времени - настоящее :
лекарственная чувствительность - расширение спектра
исследуемых лекарственных препаратов (2-й ряд);
тест-система видовой дифференциации с идентификацией
M.bovis (BCG) ; тест-система для быстрого определения
пекинского штамма (Beijing) – тест-системы ЗАО «Синтол»
 Технология ПЦР для быстрого определения и
дифференцирования живых и мертвых микобактерий
 Микобактериофаги : новый старый путь
ПЦР в реальном времени для быстрого определения и
дифференцирования живых и мертвых микобактерий
• Evaluation of Propidium Monoazide Real-Time PCR for Early Detection of Viable
Mycobacterium tuberculosis in Clinical Respiratory Specimens.-Young Jin Kim et al. Ann
Lab Med 2014;34:203-209
• Цель: контроль возбудителя в динамике лечения: негативация
роста в культуре при сохранении положительного мазка
• Принцип метода: обработка микобактерий
связывающимся с ДНК красителем : пропидиум
моноазид;
• фиксация красителя с ДНК с помощью галогеновой
лампы 650 ватт, 5 минут;
• количественное измерение ДНК МБТ – ПЦР в реальном
времени;
• ПЦР не проходит в точках фиксации красителя с
ДНК мертвых МБТ: пороговый уровень флуоресценции Ct
существенно сдвигается
Обработка: живые и мертвые
ПЦР: живые и мертвые
МИКОБАКТЕРИОФАГИ: определение роста МБТ в культуре,
лекарственная чувствительность, измерение антибактериального
эффекта, комбинации препаратов.
• Быстрое (48 часов) определение МБТ в мокроте.A Multi-Center Study to Evaluate the
Performance of Phage Amplified Biologically Assay for Detecting TB in Sputum in the Pulmonary TB
Patients.-C. Zhu et al. .PLoS ONE 6(9),2011.
• Репортерные флуоресцентные фаги: определение роста МБТ в жидкой культуре , ускорение
детекции более чем в 2 раза по сравнению с Bactec. Reporter Phage and Breath Tests: Emerging
Phenotypic Assays for Diagnosing Active Tuberculosis, Antibiotic Resistance, and Treatment Efficacy.Paras J. Journal of Infectious Diseases 2011;204:S1142–50
• Микобактериофаги: новая фенотипическая (культуральная) тестсистема для быстрого и одновременного определения лекарственной
чувствительности микобактерий туберкулеза (МБТ) в клинических штаммах к
противотуберкулезным препаратам 1-й, 2-й, 3-й линиям. Use of
Mycobacteriophage Quantitative PCR on MGIT Broths for a Rapid Tuberculosis
Antibiogram.S. Foongladda et al., J.Clin.Microb. 2014 v.52 n. 5 p. 1523–1528.
• Актуальность: относительно ускоренная импортная культуральная
(фенотипическая) тест-система MGIT (Bactec) для определения МБТ и
анализа их лекарственной чувствительности является слишком
дорогостоящей
• Вторая проблема - недостаточная чувствительность молекулярногенетических методов определения лекарственной устойчивости в
отношении ряда резервных препаратов: 65-75% для этамбутола и
аминогликозидов.
Принцип метода и протокол исследования
Способ решения задачи : использование быстро
размножающегося в микобактериях штамма
микобактериофагов D29 с количественным измерением ДНК
фага с помощью ПЦР в реальном времени. Время исследования –
4 дня
• Принцип метода :после первичного получения культуры МБТ проводится
краткосрочное (2-3 дня) ее культивирование с антибиотиками и 24 часа - с
микобактериофагом. На 4-й день измеряется количество ДНК фага в осадке
образца.
• Культивирование: 200 мкл жидкой культуры в 1 мл (общий объем) среды
Миддлбрук 7Н9 с 10% OADC в 24 –луночном планшете в CO2 инкубаторе при
370 C -48 часов или в пробирках с закрытой крышках плюс тестируемый
препарат (критическая концентрация) ; сравнение с контрольной пробой.
Внести 50 мкл фага; инкубирование 24 часа.
• Выделить ДНК фага: центрифугировать 8000 g 5 мин.; к осадку добавить 200
мкл деиониз. воды, прогреть при 950 C 30 мин; 5 мкл ДНК анализировать в
количественной ПЦР в реальном времени
• Прирост порогового цикла (Ct ) более чем на 2 цикла в опытной пробирке,
содержащей антибиотик, по сравнению с контрольной свидетельствует о
чувствительности культуры
Пример определения лекарственной
чувствительности по результатам ПЦР-анализа
культура № 3436: чувствительна к стрептомицину, рифампицину,
этамбутолу; устойчива к изониазиду; №3436 -пороговые циклы
:контроль 14,5 ; стрептом. – 20,9 (+6,4); изониазид -14,6 (
устойчив.); рифампицин – 19,5 (+5,0); этамбутол – 27,6(+13);
№5659 –
устойчива
ко всем
препаратам
Пороговые
циклы
значимо не
отличаются
от контроля
Сравнительные исследования по 8-ми препаратам:
фаговый метод и золотой стандарт
Антибиотики
Лекарств.
чувствит.
Cр.
∆ Ct
Число и
результаты
анализов
Число
штаммов
% совпадений с
традиционным методом
Левенштейн-Йенсена
стрептомицин
Чувст.
4,4
9
62
92,6
Уст.
0,13
53
Чувст.
6,3
14
62
97
Уст.
0,04
48
Чувст.
6,2
28
62
85
Уст.
- 0,17
34
Чувст.
6,87
32
62
89
Уст.
0,3
30
Чувст.
7,15
38
49
92
Уст.
0,99
11
Чувст.
7,5
41
49
86
Уст.
1,18
7
Чувст.
8,0
33
42
79
Уст.
0,74
6,45
9
32
40
90
изониазид
рифампицин
этамбутол
амикацин
капреомицин
канамицин
моксифлоксацин Чувст.
Уст.
«ТБ-фаг-ЛЧ»
лекарственная чувствительность после культивирования
в пробирках системы MGIT (Bactec)
№ п/п
9
10
11
12
16
К
1-ый
Sm
17,3
24,1
18,6
17,2
15,5
Ihn
Rmp
Emb
цикл
фаг
MGIT
цикл
фаг
MGIT
цикл
фаг
MGIT
цикл
фаг
MGIT
16,26
23,14
24,16
17,51
22,88
R
R
S
R
S
R
R
S
R
S
16,53
22,44
26,6
17,03
22,16
R
R
S
R
S
R
R
S
R
S
17,5
23,48
26,64
17,89
24,24
R
R
S
R
S
R
R
S
R
S
17,45
23,06
25,37
20,17
20,16
R
R
S
S
S
R
R
S
S
S
2-ой ряд
Амикац
ин
Капреом
ицин
Канами
цин
Моксиф
локсаци
н
Этиона
мид
Линезоли
д
цикл
фаг
MGIT
цикл
фаг
MGIT
цикл
фаг
MGIT
цикл
фаг
MGIT
цикл
фаг
MGIT
цикл
фаг
MGIT
26,2
31,2
24,59
22,39
24,08
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
23,3
29,4
22,31
24,16
23,7
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
24
29,11
23,09
18,61
23,6
S
S
S
R
S
S
S
S
R
S
17,8
28,87
24,4
17,16
21,6
R
S
S
R
S
R
S
S
R
S
22,3
20,99
21,31
19,1
24,39
S
R
S
R
S
S
R
R
S
S
22,1
28,23
23,42
22,74
23,31
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
• Уровень совпадений – 96%
•
•
•
•
Прототип набора реагентов «ТБ-фаг-ЛЧ» для
ускоренного определения лекарственной
чувствительности
Сухая среда 7Н9, отечественный реагент –
биодобавка (аналог OADC), препарат
микобактериофага, реагенты для определения ДНК
фага методом ПЦР в реальном времени, пробирки для
культивирования .
Один набор предполагает возможность исследования
20 культур, полученных после первичного
культивирования в системе Бактек
Набор может быть рассчитан на определение
чувствительности каждой культуры к 5 или к 10
препаратам
Примерная себестоимость одного теста : одной
культуры к одному препарату – в пределах 140 руб.
Микобактериофаги. Культуральная система .
Возможности выбора препаратов
• Клинические штаммы МБТ при наличии
лекарственной чувствительности различны по ∆ Ct,
что коррелирует с минимальной ингибирующей
концентрацией.
• Технология позволяет оценить эффект комбинации
препаратов.
Определение МБТ в воздушной среде и
поверхностях госпитальных палат
• Нанофильтр растворяется в 200 мкл воды, выделяют ДНК
традиционным методом и проводят количественную ПЦР
с помощью набора реагентов «Амплитуб-РВ» («Синтол»)
• Ингибирования ПЦР не происходит
• Рассчитывается число геномных копий по однокопийному
гену
• Результаты анализа при определении ДНК МБТ в
больничных палатах коррелируют с пребыванием в палате
пациента, выделяющего МБТ
• При массивном бактериовыделении ДНК МБТ
обнаруживаются , в том числе, на поверхности постели и
прикроватной тумбочке
• Число геномных копий в воздухе – в пределах 100, на
поверхности пола – более 600
Технология определения и контроля
внутрибольничной туберкулезной инфекции
нанофильтры и определение ДНК МБТ в воздухе
• Нанофильтр, заключенный между
двумя префильтрами в составе
вкладыша-насадки на пылесос
Фильтрация воздуха в госпитальной
палате туберкулезной больницы
ПЦР-анализ загрязненности МБ в госпитальной
палате
Тип образца
Характеристика
образца
2
3
4.
Число геномных
копий
IS6110/образце
Число
геномных
копий regX
/образце
FAM - IS6110
ROX- regX
27,2
28,8
8,02x104
30,35
31,94
8,12x103
2,6 · 103
воздух
постель
воздух
постель
тумбочка
31,8
30,25
34,67
=50
32,02
34, 76
33,17
37,94
=50
34,85
287
221
282
0
2720
92
112
42
0
352
пол
воздух
постель
тумбочка
32,30
36,4
37,12
37,96
34,05
38,0
=50
=50
1830
295
78
14
612
4
0
0
пол
32,0
35,06
3411
252
воздух
тумб.
пол
37,36
37,2
36,58
=50
=50
=50
230
216
551
0
0
0
Суспензия BCG 104
BCG
Воздух камеры
1.
Пороговые циклы, полученные для
каждой мишени, в соответствующих
каналах детекции
2,29 · 104
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ