Н.В. Алпатьева, И.Н. Анисимова. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ

реклама
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЕНЕТИЧЕСКОГО
РАЗНООБРАЗИЯ ЯЧМЕНЯ В
ВИРе
Н.В. Алпатьева, И.Н. Анисимова
отдел генетики ГНУ ВИР Россельхозакадемии
Молекулярные исследования генетического разнообразия
культурных растений в отделе генетики ВИР
I.
Структурирование генетического разнообразия, сохраняемого в коллекциях ВИР
(зерновые, бобовые, масличные)
II.
Молекулярный скрининг с целью выявления носителей генов, контролирующих
хозяйственно ценные признаки (устойчивость к болезням, ЦМС-Rf и др.)
III. Анализ изменчивости генов, кодирующих хозяйственно ценные признаки
(анализ аллельного полиморфизма на молекулярном уровне, разработка
молекулярных маркеров для проведения скрининга)
I.
Генотипирование и структурирование генетического
разнообразия
Молекулярные маркеры, используемые для генотипирования и
структурирования генетического разнообразия ячменя и овса:
RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA
ISSR – Intersimple Sequence Repeat Polymorphic DNA
SSR – Simple Sequence Repeats
RAMP – Random Amplified Microsatellite Polymorphism
STS – Sequence-Tagged Sites
DArT – Diversity Arrays Technology
SNP – Single Nucleotide Po;lymorphism
EST based markers
М1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12
13
14 15 16
17 18
19
Hou et al., 2005;
Fernandez et al., 2002 и др.
Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных с помощью праймера
ISSR15:
М – маркер молекулярного веса; 1-19 – местные образцы ячменя из Дагестана
Фрагмент базы данных: 0 – отсутствие фрагмента, а 1 – его наличие
Генотипирование и структурирование генетического
разнообразия перспективного для селекции материала с
помощью RAPD и ISSR маркеров
Объект исследований - коллекция ВНИИ
растениеводства имени Н.И. Вавилова, а также
материалы экспедиционных сборов в
республике Дагестан (более 250 образцов)
Работа поддержана РФФИ ( грант 12-04-96503)
Кладограмма степени сходства
образцов Дагестанского ячменя
Р.А. Абдуллаев, Н.В. Алпатьева, О.Н. Ковалева,
Е.Е. Радченко, Б.А. Баташева, не опубликовано
Отделы генетики и генетических ресурсов
овса, ржи, ячменя ВИР
Дагестанская опытная станция ВИР
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ СТАРОДАВНИХ
ЯЧМЕНЕЙ АЛТАЙСКОГО КРАЯ
Н. В. Алпатьева, М. А. Жук, О. Н. Ковалева, И. Г. Чухина, И. Н. Анисимова
отделы генетики, агроботаники и in-situ сохранения, генетических
ресурсов овса, ржи, ячменя ВИР
Гипотезы о путях формирования генофонда алтайских ячменей:
1)
2)
3)
4)
Из европейской части с переселенцами
Из Средней Азии
Из Китая
Из ближайших земледельческих районов Восточной Сибири
Структурирование молекулярно-генетического разнообразия стародавних сортов из
районов предполагаемой миграции культур – эффективный инструмент
филогеографического анализа (D. Saisho, M.D. Purugganan Molecular Phylogeography of
Domesticated Barley Traces Expansion of Agriculture in the Old World // Genetics, 2007,
V. 177, 1764-1776)
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 11-04-01207-а)
Изучение стародавних форм ячменя,
собранных на территории Русского Алтая, с
помощью RAPD и ISSR маркеров
Материал:
54 образца (первая половина
XX века):
33 - с территории русского
Алтая
8 - из Китая
5 -из Тувы
2 - из Казахстана
6 - из европейской части
Группы образцов,
выделившиеся по результатам
кластерного анализа
I - многорядные ячмени, в
основном алтайского
происхождения;
II - двурядные ячмени
разного происхождения;
III - многорядные китайские
ячмени (пленчатые, и
голозерные)
Цель работы - выявить пути
формирования местного
разнообразия культурных ячменей
Результаты исследования выявили генетическую неоднородность ряда
стародавних образцов
Электрофореграмма продуктов амплификации с праймером ISSR-15
Факторы, оказавшие влияние на пути распространения культуры ячменя (D.
Lister et al. 2012):
1) Обеспеченность населения дикорастущими ресурсами
2) Адаптация растений к новым климатическим условиям, прежде всего, длине
светового дня (гены PPd, Eam)
•
В селекции ячменя, адаптированного к условиям короткого вегетационного
периода, при продвижении культуры в северные широты, широко использовались
мутации eam (early maturity )
•
Eam8 = Praematurum-a.8 (Mat-a.8) ячменя - ортолог гена EARLY FLOWERING3
(ELF3) Arabidopsis thaliana, регулирующего чувствительность к фотопериоду (Faure
et al., 2012). Белковый продукт гена ELF3 (695 аа) – циркадный регулятор
транскрипции
•
Известно 87 мутантов по гену Eam8 и идентифицировано 20 рецессивных
аллелей, отличающихся делециями, инверсиями и заменами нуклеотидов как в
смысловой области гена, так и в интронах (Zakhrabekova et al., 2012)
Скороспелые нечувствительные к фотопериоду сорта Maja и Maria индуцированные мутанты, а сорта Kinai 5, Kagoshima Gold и Русский ранний –
естественные формы ячменя.
МУТАЦИЯ eam8 У ОБРАЗЦА ЯЧМЕНЯ К-14891 ИЗ ДАГЕСТАНА
Р. А. Абдуллаев, И. А. Звейнек, Н. В. Алпатьева, Е. Е. Радченко
отделы генетики и генетических ресурсов овса, ржи, ячменя ВИР
Работа поддержана РФФИ ( грант 12-04-96503)
МУТАЦИЯ eam8 У ОБРАЗЦА ЯЧМЕНЯ К-14891 ИЗ ДАГЕСТАНА
Фенотипический скрининг
При 10 часовом фотопериоде, низкой дневной (10°С) и высокой ночной (20°С)
температуре ген eam8 (eak) плейотропно влияет на гены, контролирующие желтую
окраску проростков ячменя (Yasuda et al., 1965).
Молекулярный скрининг
M 1 2 3 4 5 6 7
8 9 10 11 12
M 13 14 15 16
580 пн
Электрофореграммы фрагмента гена eam8 у образцов: 1, 2 – Mona; 3, 4 –
Mari; 5, 6 – Белогорский; 7, 8 – Kinai 5; 9, 10 – Bankuti Korai, 11, 12 – к-14891;
13, 14 – к-16377; 15, 16 – к-17429; М – маркер молекулярного веса.
Материал
к-14891, к-16377, к-17429 - скороспелые староместные образцы, собранные в горных
районах Дагестана
сорта Mona, Mari, Kinai 5 (генотип eam8eam8)
сорт Белогорский (Eam8Eam8)
скороспелый сорт Bankuti Korai
Bonus_JN180296.1
k-17429
k-16377
Bonus_mat-a.11
k-14891
1302
1302
1302
1302
1302
gtctgattggattggaaaacctagagtagattacaggcatgctgctgggcttagcaacagtgtcagccttagactagcctctgttagtct
gtctgattggattggaaaacctagagtagattacaggcatgctgctgggcttagcaacagtgtcagccttagactagcctctgttagtct
gtctgattggattggaaaacctagagtagattacaggcatgctgctgggcttagcaacagtgtcagccttagactagcctctgttagtct
gtctgattggattggaaaacctagagtagattacaggcatgctgctgggcttagcaacagtgtcagccttagactagcctctgttagtct
gtctgattggattggaaaacctagagtagattacaggcatgctgctgggcttagcaacagtgtcagccttagactagcctctgttagtct
1391
1391
1391
1391
1391
Bonus_JN180296.1
k-17429
k-16377
Bonus_mat-a.11
k-14891
1392
1392
1392
1392
1392
tagcagtgtggatgagtttttagttgagacacgactgggcaatttcttcatttctaattgtatatatac----------gactgcttact
tagcagtgtggatgagtttttagttgagacacgactgggcaatttcttcatttctaattgtatatatac----------gactgcttact
tagcagtgtggatgagtttttagttgagacacgactgggcaatttcttcatttctaattgtatatataccactggtttgaactgcttact
tagcagtgtggatgagtttttagttgagacacgactgggcaatttcttcatttctaattgtatatatac----------gactgcttact
tagcagtgtggatgagtttttagttgagacacgactgggcaatttcttcatttctaattgtatatatac----------gactgcttact
1471
1471
1481
1471
1471
Bonus_JN180296.1
k-17429
k-16377
Bonus_mat-a.11
k-14891
1472
1472
1482
1472
1472
cacttgtaccttcttcttgtAGATTGGTGGGATCGACAGACCTCTCTTTCCATCATTTTGCGTGCCTTCAAACGAACCCGTGCCTTTGCC
cacttgtaccttcttcttgtAGATTGGTGGGATCGACAGACCTCTCTTTCCATCATTTTGCGTGCCTTCAAACGAACCCGTGCCTTTGCC
cacttgtaccttcttcttgtAGATTGGTGGGATCGACAGACCTCTCTTTCCATCATTTTGCGTGCCTTCAAACGAACCCGTGCCTTTGCC
cacttgtaccttcttcttgtAGATTGGTGGGATCGACAGACCTCTCTTTCCATCATTTTGCGTGCCTTCAAACGAACCCGTGCCTTTGCC
cacttgtaccttcttcttgtAGATTGGTGGGATCGACAGACCTCTCTTTCCATCATTTTGCGTGCCTTCAAACGAACCCGTGCCTTTGCC
1561
1561
1571
1561
1561
Bonus_JN180296.1
k-17429
k-16377
Bonus_mat-a.11
k-14891
1562
1562
1572
1562
1562
ACAACACATCAATACCAACTCAAGTGGGCATGCTACCTCTGGGAGGCTTTCCACACAGCTTAAGAGCAAGGATGCCTATGCTGCCGGATC
ACAACACATCAATACCAACTCAAGTGGGCATGCTACCTCTGGGAGGCTTTCCACACAGCTTAAGAGCAAGGATGCCTATGCTGCCGGATC
ACAACACATCAATACCAACTCAAGTGGGCATGCTACCTCTGGGAGGCTTTCCACACAGCTTAAGAGCAAGGATGCCTATGCTGCCGGATC
ACAACACATCAATACCAACTCAAGTGGGCATGCTACCTCTGGGAGGCTTTCCACACAGCTTAAGAGCAAGGATGCCTATGCTGCCGGATC
ACAACACATCAATACCAACTCAAGTGGGCATGCTACCTCTGGGAGGCTTTCCACACAGCTTAAGAGCAAGGATGCCTATGCTGCCGGATC
1651
1651
1661
1651
1651
Bonus_JN180296.1
k-17429
k-16377
Bonus_mat-a.11
k-14891
1652
1652
1662
1652
1652
GACTGCTGAGTGTACTAGTTCACACGGCAGAGACAACAACGCCAAGAATTCTTCTGGGAACAAGTTGACTAACGATGATGATTTTACGGT
GACTGCTGAGTGTACTAGTTCACACGGCAGAGACAACAACGCCAAGAATTCTTCTGGGAACAAGTTGACTAACGATGATGATTTTACGGT
GACTGCTGAGTGTACTAGTTCACACGGCAGAGACAACAACGCCAAGAATTCTTCTGGGAACAAGTTGACTAACGATGATGATTTTACGGT
GACTGCTGAGTGTACTAGTTCACACGGCAGAGACAACAACGCCAAGAATTCTTCTGGGAACAAGTTGACTAACGATGATGATTTTACGGT
GACTGCTGAGTGTACTAGTTCACACGGCAGAGACAACAACGCCAAGAATTCTTCTGGGAACAAGTTGACTAACGATGATGATTT-ACGGT
1741
1741
1751
1741
1740
Bonus_JN180296.1
k-17429
k-16377
Bonus_mat-a.11
k-14891
1742
1742
1752
1742
1741
TCCTTCCGTCTTCTGCTCTGGAGTGCGTCCTCGTTCTAACCATGAGGAAGCGAGGATCCAAGAGAATTCCACACACTTACCAGCTACAAG
TCCTTCCGTCTTCTGCTCTGGAGTGCGTCCTCGTTCTAACCATGAGGAAGCGAGGATCCAAGAGAATTCCACACACTTACCAGCTACAAG
TCCTTCCGTCTTCTGCTCTGGAGTGCGTCCTCGTTCTAACCATGAGGAAGCGAGGATCCAAGAGAATTCCACACACTTACCAGCTACAAG
TCCTTCCGTCTTCTGCTC-GGAGTGCGTCCTCGTTCTAACCATGAGGAAGCGAGGATCCAAGAGAATTCCACACACTTACCAGCTACAAG
TCCTTCCGTCTTCTGCTCCGGAGTGCGTCCTCGTTCTAACCATGAGGAAGCGAGGATCCAAGAGAATTCCACACACTTACCAGCTACAAG
1831
1831
1841
1830
1830
Bonus_JN180296.1
k-17429
k-16377
Bonus_mat-a.11
k-14891
1832
1832
1842
1831
1831
TCCATATAAGAGTGGGCCTACGGTGTCCAAACCAACTGCAAAATTTCCCA
TCCATATAAGAGTGGGCCTACGGTGTCCAAACCAACTGCAAAATTTCCCA
TCCATATAAGGGTGGGCCTACGGTGTCCAAACCAACTGCAAAATTTCCCA
TCCATATAAGAGTGGGCCTACGGTGTCCAAACCAACTGCAAAATTTCCCA
TCCATATAAGAGTGGGCCTACGGTGTCCAAACCAACTGCAAAATTTCCCA
1881
1881
1891
1880
1880
Нуклеотидные последовательности ампликонов местных дагестанских сортов к-14891, к-16377 и к-17429, фрагмента
гена Eam8 сорта Bonus (GenBank: JN180296.1) и рецессивной аллели eam8 у индуцированного мутанта mat-a.11
сорта Bonus (Zakhrabekova et al., 2012). Прописными буквами обозначен фрагмент интрона, заглавными – экзона.
Bonus_AEZ53982.1
k-17429
k-16377
Bonus_mat-a.11
k-14891
85
85
85
85
85
IGGIDR
......
......
......
......
PLFPSFCVPS
..........
..........
..........
..........
NEPVPLPQHI
..........
..........
..........
..........
NTNSSGHATS
..........
..........
..........
..........
GRLS
....
....
....
....
124
124
124
124
124
Bonus_AEZ53982.1
k-17429
k-16377
Bonus_mat-a.11
k-14891
125
125
125
125
125
TQLKSK
......
......
......
......
DAYAAGSTAE
..........
..........
..........
..........
CTSSHGRDNN
..........
..........
..........
..........
AKNSSGNKLT
..........
..........
..........
..........
NDDD
....
....
....
....
164
164
164
164
164
Bonus_AEZ53982.1
k-17429
k-16377
Bonus_mat-a.11
k-14891
165
165
165
165
165
FTVPSV
......
......
......
LRFLPS
FCSGVRPRSN
..........
..........
...ECVLVLT
SAPECVLVLT
HEEARIQENS
..........
..........
MRKRGSKRIP
MRKRGSKRIP
THLPATSPYK
..........
..........
HTYQLQVHIR
HTYQLQVHIR
SGPT
....
G...
V.LR
V.LR
204
204
204
204
204
Bonus_AEZ53982.1
k-17429
k-16377
Bonus_mat-a.11
k-14891
205
205
205
205
205
VSKPTA
......
......
CPNQLQ
CPNQLQ
KFP
...
...
N..
N..
213
213
213
213
213
Предполагаемые аминокислотные последовательности ампликонов образцов к-14891, к-16377 и к-17429 из
коллекции ВИР, фрагмента белка, кодируемого геном Eam8 сорта Bonus (GenBank: AEZ53982.1) и
рецессивной аллелью eam8 индуцированного мутанта mat-a.11 (Zakhrabekova et al., 2012).
СПАСИБО за внимание!
Скачать