k асс

Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях
2. Комплексы биополимеров с лигандами.
Специфические взаимодействия. Методы
определения констант равновесия
Простейшая модель взаимодействия
биополимера с лигандом
(модель двух состояний)
P+L
kасс
PL (P – полимер, L – лиганд, PL – комплекс)
kдисс
kасс – константа скорости ассоциации, [M]-1[t] -1
kдисс – константа скорости диссоциации, [t]-1
Касс = kасс/ kдисс термодинамическая константа ассоциации, [М]-1
Кдисс = 1/Касс = kдисс/ kасс термодинамическая константа диссоциации, [М]
(Кдисс или КD характеризует сродство лиганда к полимеру)
КD ?
[P]?
[L]?
Pt=[P]+[PL]
Lt=[L]+[PL]
[PL]?
t<1/kдисс - высокопрочный комплекс PL
Примеры методов разделения комплекса и свободного лиганда:
– гельфильтрация (t разделения [мин]),
– фильтрование через нитроцеллюлозные мембраны
(миллипоровые фильтры) (t разделения [сек]).
Радиоактивный лиганд: фильтр с задержанным комплексом PL
помещается в счетчик радиоактивности.
Метод равновесного диализа
1
PP
+CL1
L?
2
CL2L
?
Метод равновесного диализа
В равновесии концентрация лиганда в ячейке,
свободной от полимера, равна концентрации
свободного лиганда в ячейке, содержащей полимер:
CL1=CL2
Количество связанного лиганда:
nPL = n0 – n1 – n2,
где n0 – общее количество лиганда, n1 и n2 – количество
свободного лиганда в первой и второй ячейках, nPL – количество
комплекса.
Условия:
Величина nPL не должна представлять собой малую разность
двух больших величин, то есть не должно быть большого
избытка лиганда над биополимером и должна быть
достаточно высокой степень комплексообразования. При
большом избытке лиганда заведомо относительное
изменение количества свободного лиганда будет невелико.
При малой степени комплексообразования также величины
n1+n2 в сумме будут близки к n0.
Метод равновесного диализа
Условия:
Разность Pt-[PL] не должна быть мала по сравнению с Pt и [PL],
т.е. заметная часть биополимера также должна остаться в
несвязанном состоянии.
Данные условия выполняются, если:
CP~CL~KD
– Если n1+n2 ~ n0, то необходимо повышать концентрацию
обоих компонентов.
– Если, наоборот, слишком малая часть биополимера оказалась
вне комплекса, то концентрацию следует уменьшать.
Метод равновесного диализа
Выражение для константы диссоциации через
найденные экспериментально величины n1, n2 и
заданные величины n0 и Pt запишется в виде:
КD = n1(Pt-[PL])/(n0-n1-n2)
[PL] = (n0-n1-n2)/V
где V – объем ячейки
Определение KD в случае, когда у свободного биополимера или
лиганда какое-либо измеряемое физическое свойство (Ф)
достаточно изменяется при комплексообразовании:
Для полимера: Ф = αРФР + αPLФPL
Для лиганда: Ф = αLФL + αPLФPL
где αР, αPL, αL – соответствующие мольные доли
ФР или ФL находят измерением в отсутствие второго партнера.
ФPL – находят путем измерения при избытке второго партнера:
проводят серию измерений при возрастающей концентрации второго
партнера до тех пор, пока зависимость измеряемой величины от
концентрации этого партнера не выйдет на плато.
Если обозначить значение измеряемой величины в
отсутствие второго партнера через Ф0, а предельное
значение через Ф∞,
то для величины αPL нетрудно получить выражение:
Ф - Ф0
αPL =
Ф∞- Ф0
Концентрация комплекса PL находится как:
PtαPL,если измеряется характеристика полимера,
LtαPL, если измеряется характеристика лиганда.
Метод флуоресцентного титрования
Исследование комплексообразования
биополимер-лиганд методом ЯМР
Низкомолекулярные лиганды, как правило, имеют
характерные линии в спектрах ЯМР и в ряде случаев
удается выбрать линии, не налагающиеся полностью
на линии биополимера. При образовании комплекса
может произойти смещение линии поглощения, т.е.
изменение величины химического сдвига. В случае не
очень прочных комплексов невозможно наблюдать
раздельно линии для свободного и связанного
лиганда.

Так как современные приборы работают на
частотах порядка 108 с-1, а смещение сигналов в
результате комплексообразования имеет порядок
миллионных долей, т.е. 10-7, время жизни комплекса
порядка 10-2 с уже не допускает раздельной
регистрации двух состояний.

Lb
Lf
Определение Касс в координатах Скечерда
Lb (bound) – связанный в комплекс лиганд
Lf (free) – свободный лиганд
Lb
Касс=
L f (Pt - L b )
Lb
= PtКасс- КассLb
Lf
Если полимер имеет несколько одинаковых и невзаимодействующих
центров связывания n (например, в случае, когда белок состоит из
нескольких идентичных субъединиц):
Lb
= nPtКасс - КассLb
Lf
При предельном количестве связанного лиганда (Lb∞) выражение
можно записать в виде:
Lb
= Касс(Lb∞ - Lb)
Lf
Вместо величин Lb, Lb∞ можно использовать любое свойство
системы, пропорциональное концентрации комплекса.
В случае реакций, катализируемых ферментами (Е), процесс
превращения лиганда-субстрата (S), происходит в комплексе
фермент-субстрат (ES), и выражение для скорости превращения
субстрата можно написать в виде:
v
= Касс(v∞ - v)
Sf
Если лиганд в избытке, то концентрация свободного лиганда равна
полной концентрации лиганда Pt, и можно записать:
Lb
= Касс(Lb∞ - Lb) или Lb= K асс L b L 0 или для ферментативной реакции
L0
1 K асс L 0
v
S
v
= Касс(v∞ - v) или v =
1
1
K асс S
Релаксационные методы.
Метод температурного скачка
Равновесные
условия
нагрев
Неравновесные
условия
релаксация
Равновесные
условия
Δx=Δx0exp{-(Касс([P]+[L])+Кдисс)t}
где Δx0 – предельное изменение измеряемого свойства при
переходе от начального положения равновесия к конечному,
Δx – текущая величина.
Из экспоненциальной зависимости легко определяется
величина Касс([P]+[L])+ Кдисс, если провести измерение при
нескольких (минимум двух) значениях концентраций
компонентов, то константы диссоциации и ассоциации легко
находятся.
Комплексы биополимер-два лиганда
P + L1
P + L2
PL1 (K1)
PL2 (K2)
PL1 + L2
PL2 + L1
PL1L2 (K2΄)
PL1L2 (K1 ́)
Должно выполняться соотношение:
K1 K2΄= K1 ́K2
K1 ́/K1= K2΄/K2 = α
Из соотношений:
Pt = [P] + [PL1] + [PL2] + [PL1L2]
[PL1 ]
[PL1 L 2 ]
[PL 2 ]
= K1,
= K2,
= αK1K2
[P][L 1 ][L 2 ]
[P][L 1 ]
[P][L 2 ]
находится выражение для концентрации несвязанного с
лигандами биополимера через полную концентрацию и
концентрацию свободных лигандов, а также выражение для всех
трех комплексов биополимера с лигандами:
Pt
[P] =
1  K1[L1 ]  K 2 [L 2 ]  K1K 2 [L1 ][L 2 ]
K1[L1 ]Pt
[PL1] =
1  K1[L1 ]  K 2 [L 2 ]  K1K 2 [L1 ][L 2 ]
K 2 [L 2 ]Pt
[PL2] =
1  K1[L1 ]  K 2 [L 2 ]  K1K 2 [L1 ][L 2 ]
K1K 2 [L1 ][L 2 ]Pt
[PL1L2] =
1  K1[L1 ]  K 2 [L 2 ]  K1K 2 [L1 ][L 2 ]