Раздел 9. Аффинная модификация биополимеров
реклама
CH3 N Физическая химия биополимеров Лаврик О.И. НГУ-2012 O 9. Аффинная модификация биополимеров. Фотоаффинная модификация как метод изучения сложных ферментативных систем Часть, обеспечивающая специфичное нековалентное связывание реагента с биополимером Аффинный реагент Реакционноспособная группа, за счет которой происходит ковалентное присоединение реагента к акцептору в биополимере Схема классической модификации Белок-мишень содержит лиганд– связывающий центр Образование комплекса между меченым реагентом и белком-мишенью Образование ковалентной связи между реакционноспособной группой реагента и белком-мишенью Идентификация модифицированной части белка Светлые овалы обозначают аффинную часть реагента; темные кружочки – реакционноcпособную группу реагента, а звездочки – метку, например, радиоактивную. Кинетические закономерности аффинной модификации E+X EX EX EZ где EX – комплекс E с X; EZ – продукт модификации; k – константа скорости превращения E в Z. Обычно концентрация EX считается квазиравновесной, т.е. принимается, что по ходу всего процесса концентрации E, X и EX связаны соотношением: [E][X] = Kx [EX] [E] + [EX] + [EZ] = E0 [X] + [EX] + [EZ] = X0 d[EZ] = k[EX] dt Если реагент находится в большом избытке по отношению к биополимеру, т.е. Х0>>Е0, то [X]≈Х0 на протяжении всего процесса. E 0 - [EZ] [EX] = Kx 1 X0 и d[EZ] = dt k (E 0 - [EZ]) = kкаж(E0-[EZ]) Kx 1 X0 Это уравнение скорости псевдопервого порядка с кажущейся константой скорости kкаж. Начальная скорость реакции Vmax v0= 1 Kx X0 где Vmax=kЕ0 – максимальная скорость аффинной модификации, достигаемая при насыщающих концентрациях реагента. Величины kкаж и v0 – гиперболические функции Х0. Измерив начальную скорость или kкаж при разных концентрациях реагента, с помощью линейной анаморфозы можно определить k и Kx 1 k каж 1 Kx k kX 0 Основные критерии аффинной модификации 1) Модификация проходит по определенным группам в каждой молекуле биополимера или в каждой субъединице в самом активном центре или вблизи него и может сопровождаться потерей биополимером (ферментом) свойственной им активности; 2) Начальная скорость модификации v0 изменяется в зависимости от начальной концентрации реагента X0 по гиперболическому закону, достигая предельного значения при достаточно высоких концентрациях реагента; 3) Сродство реагента к биополимеру (ферменту), характеризуемое константой диссоциации комплекса биополимер-реагент Кx , может быть определено из зависимости v0 от X0. Оно должно быть таким же, как и сродство реагента, проявляемое им в случае, когда он выступает как конкурент по отношению к природному лиганду при исследовании обратимого связывания последнего; 4) Природный лиганд защищает биополимер от аффинной модификации, т.е. тормозит процесс аффинной модификации. Из зависимости v0 от концентрации реагента и природного лиганда можно определить величину константу диссоциации комплекса биополимер-природный лиганд (KY). Если речь идет об аффинной модификации односубстратного фермента, то можно определить величину константы Михаэлиса для субстрата KM. Эта величина может быть больше KY или равна ей. Если наряду с реагентом X в реакционной смеси присутствует нереакционноспособный конкурент Y (природный лиганд) Условие материального баланса для фермента следует заменить на [E] + [EX] + [EY] + [EZ] = E0 Для взаимодействия этого лиганда с полимером условие материального баланса и квазиравновесия: [EY] + [Y] = Y0 [E][Y] = Ky [EY] где Ky – константа диссоциации комплекса нереакционноспособного конкурента. Если конкурент взят в количестве, намного превышающем количество биополимера, то [Y]≈Y0 . В этом случае кинетическое уравнение остается уравнением псевдопервого порядка с кажущейся константой скорости k kкаж = Y K x 1 1 0 X 0 K y и ke E0 v0 = Y0 K x 1 1 X0 K y Линейная зависимость Лайнуивера– Берка для 1/kкаж как функции 1/X0. 1 k каж Y0 1 K x 1 k kX 0 K y В серии экспериментов с постоянным значением Y0 и изменяющимся значением X0 точки ложатся на прямую, пересекающую ось ординат при значении 1/kкаж = 1/k. Значение Kx определяется из экспериментов в отсутствие нереакционноспособного конкурента Y. Природный субстрат Y превращается в продукт реакции где Q – продукт (продукты) превращения Y. Для описания ферментативного превращения Y обычно используют квазиравновесное приближение: d[Y] dt = k’1[E][Y] – (k’-1+ k’2)[EY] = 0 [E][Y] k ,-1 k ,2 (KM)Y и, следовательно, , [EY] k1 где (KM)M – константа Михаэлиса для субстрата Y. В этом случае в выражение: ke E0 v0 = Kx 1 X0 1 Y0 K y вместо KY следует подставить (KM)Y. Эта величина может существенно превышать KY=k’-1/k’1, если k’-1 того же порядка или меньше, чем k’2. Особые случаи Аффинная модификация одноцентрового фермента может проходить по нескольким группам, локализованным в самом активном центре или вблизи него. В случае более сложных ферментов и механизмов превращения реагента зависимость начальной скорости модификации от концентрации реагента может иметь насыщающий характер, но не быть гиперболической. Эта зависимость может проходить через максимум или иметь точки перегиба. Возможны ситуации, когда не наблюдается защитного эффекта природного лиганда от модификации или он резко занижен. Для многосубстратных ферментов могут появиться новые критерии, сформулированные на основе кинетического анализа более сложных схем аффинной модификации. Например, в случае функциональных димеров можно наблюдать взаимодействие аффинного реагента с двумя активными центрами. Ковалентное присоединение белков к ДНК, содержащим АР-сайт АР-сайт АР-сайт АР-сайт NaBH4 Идентификация Ku80 из клеток хронической миелоидной лейкемии человека как белка, ковалентно присоединенного к ДНК-дуплексу, содержащему апуриновый/апиримидиновый (АР-) сайт белок белок Ku 80 + белок ДНК-дуплекс, экстракт содержащий AP-сайт, биотин и радиоактивную метку 1) Адсорбция NaBH4 2) Отмывка стабильный комплекс ДНК–БЕЛОК Модифицированный белок 1) Элюция с сорбента трипсин Радиоавтограф геля PARP1 Окраска белков кумасси R-250 Ku 80 2) Электрофорез Сорбент c иммобилизованным стрептавидином Масс-cпектрометрия (MALDI-TOF-MS) Идентификация белка (Mascot/Profound) Роль Ku-антигена Функции Ku-антигена: • Репарация разрывов ДНК двойных • V(D)J-рекомбинация • Репликация ДНК • Регуляция транскрипции • Сохранение теломерных концов • Апоптоз • Адгезия клеток Ku-антиген как онкобелок или как белок-супрессор развития рака Репарация двойных разрывов ДНК связывание концов ДНК сближение концов ДНК сшивание концов ДНК Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 2946 – 2974 Ст рукт ура Ku70/80, связанного с ДНК Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 2946 – 2974 1. Метод аффинной модификации, основанный на использовании реакционноспособных структур ДНК, имитирующих промежуточные интермедиаты процессов репарации, позволяет изучать функционирование ансамблей белков репарации. 2. Аффинная модификация в сочетании с MALDI-MS при использовании на уровне экстрактов клеток и ядер позволяет открывать новые белковые факторы, участвующие в этих процессах. 3. Разработанные методы идентификации белков репарации в экстрактах клеток позволяют оценивать статус систем репарации. Преимущества фотоаффинной модификации при исследовании многокомпонентных комплексов, например, репликативного комплекса Возможность изучения быстро протекающих изменений в области контакта участников процесса: ферментов, ДНКматрицы и dNTP при помощи быстрого фотохимического мечения фермента фотоактивируемыми аналогами dNTP или праймера, которое можно осуществить за миллисекунды, используя импульсное облучение. Фотоактивируемые группы позволяют определить взаимное расположение отдельных субъединиц всех участников репликации относительно ДНК и друг друга и исследовать динамику функционирования таких систем. В случае фотореагентов, содержащих арилазидогруппы, существует возможность вариации длины линкера и типа арилазидогруппы, что способствует повышению эффективности и селективности модификации биополимера. Фотореакционноспособные аналоги dNTP O R HN O -O O P O P O- O O P O- O O H O O N H 4Li+ H HO O H N H Cl F F N3 O O R1 O F N O N O N O OH H R: O N O OP O P O P O OOO- OH HN R1= N H N3 H N HN FABO-dCTP R1 F N3 FABG-dCTP FAB-4-dUTP FAP-8-dUTP N3 N O R1 N3 O 2N O O2N O O O R1 NAB-4-dUTP N3 NAB-12-dUTP N FABC-dUTP N3 F O FABC-dCTP N3 FAB-dCTP N3 O2N O F HN NH O O C F N F H N R1 FAP-dCTP O N3 N Cl F NH R1 N3 NAB-dCTP Схема фотоаффинной модификации + ДНК белок комплекс белок-ДНК белок, ковалент но присоединенный к ДНК Механизм фотолиза тетрафторазидобензоил(FAB)-замещенных аналогов dNTP Репликативный белок А человека (RPA) RPA – основной эукариотический SSB-белок, как и прокариотические SSB, играет ключевую роль в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК. Структура: стабильный гетеротример, состоящий из трех субъединиц с молекулярными массами 70, 32 и 14 кДа. Основная функция – стабилизация одноцепочечных участков ДНК. Кроме того, RPA обладает способностью к расплетению двуспиральной структуры ДНК. Эта функция естественно связана с его способностью удерживать однонитчатые участки ДНК в расплетенном состоянии. Домены RPA, связывающие одноцепочечные участки ДНК Структура тримера RPA человека Bochkareva E. et al. (2002) EMBO J., 21, 1855-1863 Фотоаффинная модификация димера RPA70/RPA32 Фотореакционноспособными ДНК-структурами с различной длиной одноцепочечного участка Длина матрицы (нт) кДа УФ-индуцированная «сшивка» Разделение в ПААГ Lavrik O.I. et al. (1999) Nucleic Acids Res., 27, 4235-4240 Субъединичный контакт с 3’-концом праймера ДНК-структур с различной длиной одноцепочечного участка Конформация глобулы при связывании с участком 8нт Конформация глобулы при связывании с участком 13нт Вытянутая конформация при связывании с участком 30нт Полярность связывания RPA с ДНК Фотоактивируемый 5’-конец запирающего праймера Фотоактивируемый 3’-конец запирающего праймера Длина Бреши 9нт 30нт Конформация глобулы при связывании с участком 8нт Длина Бреши 9нт 30нт Вытянутая конформация при связывании с участком 30нт Kolpashchikov D.M.,Khodyreva S.N., Khlimankov D.Yu., Wold M.S., Favre A., Lavrik O.I. (2001) Nucleic Acids Res., 29, 373-379 Фотоаффинная модификация белков клеточных экстрактов Фотоактивируемые аналоги dNTP являются эффективными субстратами ДНК-полимераз и могут быть использованы для ферментативного синтеза фотореакционноспособных ДНК-субстратов, либо интермедиатов процессов метаболизма ДНК, в частности репликации и репарации ДНК, с последующей фотоаффинной модификацией ферментов-участников этих процессов метаболизма ДНК. Ферментативный синтез фотоактивируемой ДНК фотоактивируемы й аналог dNTP ДНК-полимераза фот оакт ивируемая ДНК Репарация оснований ДНК Активные формы кислорода метилирование, дезаминирование ДНКгликозилаза Х Рентгеновское излучение (одноцепочечный разрыв) Спонтанный гидролиз гликозидной связи (АР-сайт) PARP1 XRCC1 PNK APE1 XRCC1 Pol +dGTP PCNA Pol /ε +4dNTP FEN1 ДНКлигаза III +ATP ДНКлигаза I +ATP Взаимодействие APE1, Pol и PARP1 с ДНК-интермедиатом репарации оснований Апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (APE1) стимулирует синтез ДНК, катализируемый ДНКполимеразой (Pol ) и повышает его точность. Pol и APE1 осуществляют эффективный и точный синтез ДНК при репарации длинных брешей. Поли(ADP-рибозо)полимераза -1 (PARP1) координирует пути репарации. Sukhanova M.V. et al., DNA Repair, 2007, 6, 615-625 Sukhanova M.V. et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33, 1222-1229 DNA Repair, 2004,3, 581-591 Идентификация белков репарации оснований в клеточном экстракте Повреждение в ДНК 32Р X G * +dCTP Фот оакт ивируемый нуклеот ид 32Р Белок, ковалент но присоединенный к ДНК 32Р 5’ P C* G hν 5’ P Фермент ы клет очного экст ракт а удаляют повреждение в ДНК и вст раивают фот оакт ивируемый нуклеот ид УФ-облучение индуцирует ковалент ное присоединение специфических белков из экст ракт а C G Идент ификация белков, ковалент но присоединенных к ДНК Из тысяч клеточных белков только шесть формировали аддукты с таким ДНКинтермедиатом репарации оснований. Наряду с известными компонентами системы репарации выявлены новые участники этого процесса: PARP1 и HMGB1. Lavrik O.I. et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 25541-25548 Идентификация белков репарации оснований в экстракте из клеток эмбриональных фибробластов мыши Lavrik O.I. et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 25541-25548 High-mobility group box 1 protein (HMGB1) был идентифицирован масс-спектрометрией как кофактор репарации оснований ДНК Mol. Cell., 2007, 27, 829-41 Методы высокоселективной модификации ферментов Использование реагентов, соответствующих аналогам субстрата, имитирующим переходное состояние, через которое происходит превращение субстрата в продукт. Каталитически компетентное мечение (ККМ). Модификация с использованием бинарной системы фотоаффинных реагентов (БСФР). Бинарная система фотоаффинных реагентов А) Белок-мишень содержит центр связывания для двух субстратов. Б) Образование комплекса белка-мишени с радиоактивно меченым фотореагентом и сенсибилизатором. В) Во время облучения энергия изначально поглощается сенсибилизатором, а затем переносится на фотоактивируемую группу реагента. Реагенты, связанные вне активного центра и находящиеся в растворе, не возбуждаются. Г) Реагент ковалентно присоединяется в связывающем центре белка-мишени.
