Слайд 1 - Учебный центр молекулярной биологии
реклама
Двойная спираль ДНК (Дж. Уотсон и Ф. Крик, 1953) A T Г Ц А Т Г Ц Альтернативные модели ДНК Упорядоченные волокна ДНК Механизм редупликации 1 Рентгеновская структура гемоглобина (М. Перутц и Дж. Кендрю, 1957) α-цепь β-цепь Гемы β-цепь α-цепь Молекула гемоглобина состоит из двух -цепей и двух -цепей. Каждая глобиновая цепь состоит из 8 спиралей, связанных короткими перемычками и образующих карман, в 2 котором помещается группа гема. Первое революционное событие в структурной молекулярной биологии 1. Появление синхротронных источников 2. Появление быстродействующих рентгеновских детекторов 3. Девиз: «N C - N G” Второе революционное событие в структурной молекулярной биологии – определение первичной структуры белка по его ДНК последовательности Сегодня: около 3000 белковых структур в год 3 Рентгеноструктурный анализ Любопытная особенность рентгеноструктурного анализа – существование четырех моментов в ходе исследования, когда оно достигает своих переломных точек. Первый момент – получение кристаллов, размера и формы. Доводка кристаллов подходящего Второй момент – это окончание экспериментальных измерений, которые суммируются в наборе величин F(h,k,l). Все усилия и ухищрения экспериментатора направлены на то, чтобы сделать этот набор наиболее точным и полным. Третий момент – это получение таблицы координат атомов, в которой набором цифр представлен полный отчет обо всем, что удалось установить исследователю. Модель структуры и ее уточнение. Четвертый момент– «разглядывание модели - как лучший вид теории» (О.Б. Птицын) 4 Кристалл как эстетически приятное начало структурного анализа 5 Кристаллизация Первые кристаллы белка (пепсин) получены в 1934 случайн (забыты в холодильнике). Кристаллизация – это достижение точки пересыщения (выпадение в осадок) белка. Нахождение точки насыщения зависит от многих факторов, главными из которых являются: изменение растворимости при изменении концентрации, ионной силы, температуры, pH, добавление органических растворителей. Метод микродиализа Метод висячей капли 6 Полностью автоматизированное микро устройство (5 нл реактор), позволяющее произвести тысячи экспериментов за один день при минимальном количестве реагентов. Это позволяет получить полную фазовую диаграмму белка, из которой легко получить условия для роста подходящих кристаллов На рис. слева показана фазовая диаграмма белка ксинолазы при разном соотношении татрата калия и натрия и при разной концентрации белка. Условия, в которых были получены кристаллы, отмечены черными квадратами, а преципитационные условия – красными квадратами, очерченными черным. Синие кружки относятся к условиям, в которых белок был растворим и кристаллов не образовывал. Полученные кристаллы 7 изображены на рис. 1(б). Шкала 200 μм. (Hansen et al., 2004) Дифракционная картина кристалла лизоцима Q=4π/λ×sinθ/2 Рентгенограмма тетрагонального кристалла лизоцима. Отметим наличие в картине дифракции поворотной оси четвертого порядка. 8 Картина дифракции на круглом отверстии. Аналогия с рассеянием света Картина оптической дифракции на круглом отверстии: чем меньше диаметр отверстия, тем больше диаметр первого темного кольца (один из примеров обратного соотношения размеров в реальном и дифракционном пространстве). При дифракции рентгеновских лучей размеры рассеивающего объекта (атомов) того же порядка, что и длина волны рентгеновских лучей. Таким образом, чтобы представить картину оптической дифракции на атоме надо пробить отверстие с размером порядка длины волны света и прозрачностью, изменяющейся так же как распределение 9 электронной плотности атома (!!). Оптическая дифракционная картина «молекулы», имитируемой рядом отверстий А –Шесть точечных отверстий, моделирующих шестиатомную молекулу. 6 тонких отверстий Б – Две шестиатомные молекулы расположенные горизонтально. Видно появление дополнительных вертикальных полос. 12 тонких отверстий В – Четыре шестиатомные молекулы. Вертикальная повторяемость вызывает появление дополнительных горизонтальных полос Картинка становится все красивее и красивее 24 тонких отверстия Картина оптической дифракции, показывающая рассеяния различными «молекулы». Слева изображены маски, имитирующие молекулы. Справа - соответствующие им дифракционные картины. 10 Оптическая дифракционная картина «молекулы», имитируемой рядом отверстий Г– Вертикальный двойной ряд шестиатомных молекул. Пятна сжимаются в вертикальном направлении, но расширяются в горизонтальном. Д – Двумерная кристаллическая решетка шестиатомных молекул. Дифракционная картина представляет собой систему очень острых рефлексов. Е – Другая кристаллическая решетка. Увеличению размеров кристаллической решетки соответствует уменьшение размеров обратной решетки. Картина оптической дифракции, показывающая рассеяния различными «молекулы». Слева изображены маски, имитирующие молекулы. Справа - соответствующие им дифракционные 11 картины. Закон Брегга Представление рассеяние рентгеновских лучей кристаллом как отражение от атомных плоскостей 2d sin n d - расстояние между последовательными атомными плоскостями Θ - угол отражения n- целое число Из закона Брэгга следует, что 1) Усиление интерференции будет происходить только в том случае, если разность хода равна целому числу длин волн; 2) Чем ближе друг к другу плоскости (чем меньше d), тем больше угол дифракции 3) Разная ориентация кристалла относительно пучка позволяет получить дифракцию 12 от всех плоскостей кристалла Рациональные индексы плоскостей кристалла (индексы Миллера) Дифракция рентгеновских лучей в кристалле может быть представлена как зеркальное отражение по закону Брэгга всех плоскостей, которые можно представить в кристаллической решетке. Три набора плоскостей решетки. Внизу приведены соответствующие Миллеровские индексы (h, k, l) Пример шести наборов плоскостей, характеризующимися разными Миллеровскими индексами. Разделение ребер кристаллической решетки на некоторое число частей, соответствующих реальным расстояниям между ее элементами, однозначно определяет ориентацию любой плоскости 13 Дифракционная картина решетки в прямом и обратном пространстве Прямое Обратное 1 b a b * asin * a) 1 a a* 1 b b * sin Картина дифракции ряда линий – это ряд точек, перпендикулярных ряду линий. Расстояние между точками обратно пропорционально расстоянию между линиями. b) Картина дифракции другого ряда линий c) Наложение двух рядов линий дает решетку Вывод: Дифракционная картина от решетки в обратном пространстве есть тоже решетка, но14 с размерами, обратно пропорциональными размерам решетки в прямом пространстве Сравнение оптического микроскопа с рентгеновским 1. Проблема линзы. Показатель преломления для рентгеновских лучей близок к 1 (0,999999). Линз в рентгеновском диапазоне не существует 2. Проблема фаз. Для выполнения преобразования Фурье какой-либо функции необходимо знание амплитуды и фазы в каждой точке. Последняя неизвестна, поскольку все детекторы излучения дают только величины интенсивности (детектирование является квадратичным процессом). Роль линзы в микроскопе играет математическое преобразование Фурье 15 Математическое преобразование Фурье Преобразование Фурье вычисляется всякий раз, когда мы слышим звук. Ухо автоматически выполняет вычисление, проделать которое наш сознательный ум способен лишь после нескольких лет обучения математике. Наш орган слуха строит преобразование, представляя звук — колебательное движение частиц упругой среды, распространяющееся в виде волн в газообразной, жидкой или твёрдых средах — в виде спектра последовательных значений громкости для тонов различной высоты. Мозг превращает эту информацию в воспринимаемый звук. Первым человеком, поведавшим миру об этом методе, был французский математик Жан Батист Жозеф Фурье, именем которого и было названо преобразование. (21 марта 1768, Осер, Франция - 16 мая 1830, Париж) 16 Математическое преобразование Фурье Число длин волн Любая периодическая функция (внизу справа) может быть представлена как сумма волн (компонент), периоды колебаний которых в n раз (n=0, 1, 2…) меньше периода исходной функции. 17 Восстановление исходной электронной плотности по ее дифракционной картине Фурье-синтезом Фурье-синтез распределения электронной плотности в одномерном кристалле, состоящем из двухатомных молекул сложением определенного числа волн, имеющих соответствующую амплитуду и фазу. Выводы: 1) Для приблизительного расположения атомов в кристаллической решетке необходимо мало (всего около двух) компонент Фурье 2) Добавление все большего числа компонент (соответствующего суммированию все большего числа дифракционных пятен приводит к все лучшему пространственному разрешению. Так увеличение числа компонент до n=5 дает практическую точную локализацию двух атомов в кристалле 3) Фазы важнее амплитуд Вопрос о сходимости рядов Фурье. Достигнете ли вы когда-нибудь стены, если 18 с каждым шагом будете проходить половину оставшегося расстояния? Методы решения фазовой проблемы в рентгеновской кристаллографии 1. Метод изоморфного замещения: внедрение тяжелого атома в структуру белка. В качестве тяжелого атома чаще всего используются атомы ртути. Метод не всегда строго изоморфен. 2. Метод аномального рассеяния: изменение вклада в рассеяние “избранного” атома за счет длины волны падающего излучения. Длина волны падающего излучения подбирается близкой к резонансной частоте атома. В качестве “избранного” атома чаще всего используется атомы селена. Метод строго изоморфен. Селенметиониновые производные белка можно получить в процессе выращивания клеток 3. Метод молекулярного замещения: часть неизвестной структуры в молекуле замещается на известную (совпадающие мотивы). 19 Метод молекулярных замещений “Глобиновый” . “Трилистник” “Вверх-вниз” “Греческий ключ” Девять основных мотивов сворачивания в мире “- сэндвич” глобулярных “Мягкий рулет” белков (Orengo et. аl. “Двойное крыло” Nature,1994) “- рулет” “бочка” Возникает вопрос: можно ли зная структуру или ее часть одного белка гомологического ряда установить структуру другого белка этого же ряда? Ответ “Да” 20 Collection of some recent X-ray structural triumphs а б 50S рибосомная частица РНК окрашена серым, белки -золотым. Пептидил-трансферазный центр - красным в 700 Å реовирусная частица Нуклеосомная частица РНК-геном располагается в центре. Защитные белки располагаются в два слоя (красный и желтый). Места выхода РНК на поверхность окрашены голубым Спиральный ДНК фрагмент из 146 нуклеотидных пар (желтый и зеленый цвета) навит на октамер из гистонных белков (разные цвета) 21 Collection of some recent X-ray structural triumphs РНК полимераза из дрожжей F1-F0 ATP синтетазный комплекс из дрожжей 10 субьединиц окрашены в разные цвета. α, β, и γ цепи F1 изображены в виде общей головки. Семь спиралей окрашены в разные цвета. δ и ε цепи F1- в средней части рисунка. Ретинол окрашен в зеленый цвет. Атомы цинка и магния - в синий и зеленый, соответственно. 10 белков трансмембранной части F0- в нижней части рисунка. Бычий родопсин 22 Нужен ли в действительности кристалл для нахождения трехмерной структуры биологической макромолекулы? Согласно электромагнитной теории взаимодействия рентгеновских лучей с атомом, развитой Дж. Дж. Томпсоном, интенсивность рассеяния под углом 2, при падении пучка неполяризованных рентгеновских лучей равна I 2 Ne4 I 0 2 2 4 (1 cos 2 2 ) 2r m c где I0 интенсивность падающего пучка, N -эффективное число независимо рассеивающих электронов, r - расстояние до рассеивателя, е заряд электрона, m – масса электрона, c –скорость света. Множитель в скобках учитывает поляризацию рассеянных рентгеновских лучей. Три принципиальных вывода следуют из формулы Томпсона • Обратная зависимость между интенсивностью рассеяния и массой электрона показывает, почему только электроны, а не протоны вносят вклад в рассеяние рентгеновских лучей (протон в 2000 раз тяжелее электрона) • Доля рентгеновских лучей, рассеиваемых веществом невелика. Так она для «кристалла» объемом 1 мм3 составляет меньше 2%. • Кристалл в рассеянии рентгеновских лучей нужен только для увеличения доли рассеянных лучей в дифракционную картину. Альтернатива – увеличение интенсивности первичного пучка (синхротронный источник). 23 24 Вопрос о сходимости возникает всякий раз при суммировании бесконечного ряда чисел. Рассмотрим классический пример: достигнете ли вы когда-нибудь стены, если с каждым шагом будете проходить половину оставшегося расстояния? Первый же шаг приведёт вас к отметке на половине пути, второй — к отметке на трёх его четвертях, а после пятого шага вы преодолеете уже почти 97% пути. Вы почти дошли до цели, однако сколько бы ещё шагов ни сделали, вы никогда не достигнете её в строгом математическом смысле. Можно лишь доказать математически, что в конце концов вы сможете приблизиться на любое заданное, сколько угодно малое расстояние. 25
