Химерные коровые частицы HBcAg, несущие эпитопы

реклама
Химерные коровые частицы HBcAg, несущие
эпитопы района preS поверхностного белка вируса
гепатита В и суппозиторная форма для их доставки
Л.И. Карпенко, T.A Веремейко, Н.Н. Нагайцева, Л.Р. Лебедев, Б.Н. Зайцев,
Н.А. Некрасова, Г.М. Левагина, T.A. Терещенко, A.A. Ильичев
НИИ биоинженерии, НИКТИ биологически активных веществ, ГНЦ ВБ
“Вектор”, Кольцово Новосибирская обл. 630559, Россия
Строение вириона HBV
Рекомбинантные вирусоподобные частицы –новое направление в создании вакцин. Одним из наиболее
перспективных вирусоподобных частиц является коровый антиген вируса гепатита В (HBсAg). Данный
белок может быть получен как в эукариотической, так и прокариотической системе экспрессии и
способен к самосборке в нативные частицы. Кроме того, HBcAg известен как удачный носитель
чужеродных эпитопов.
Вакцина против гепатита В, использующаяся в настоящее, время основана на поверхностном антигене
ВГВ. В тоже время иммунизация шимпанзе рекомбинантным HBcAg также способна обеспечивать
частичную защиту против инфекции (Murray K., и др. 1984). Иммунизация HBcAg индуцирует мощный
цитотоксический ответ, Т-зависимый и Т- независимый синтез антител, а также HBcAg способен
усиливать синтез антител к HBsAg (Milich D.R., и др. 1987). Настоящая работа посвящена
конструированию и исследованию свойств химерных частиц HBcAg, несущих протективные эпитопы
из районов preS-1 и preS-2 HBsAg.
HBs+preS2
HBs
HBs+preS1
+preS2
HBcAg
ДНК
Характеризация полученных рекомбинантных белков
Схема конструирования химерных частиц HBcAg
1 2 3 4 5
A
- 24kD
Олигонуклеотидв
кодирующие
эпитопы HBsAg
HBV
ген HBc
Электромикроскопия очищенных
частиц химерных HBcAg.
AHBc-preS1
B.HBc-preS2
pUC8HBc
pUC8HBc
-preS1
pUC8HBc
-preS2
-18kD
27
38
DHQLDPAFRAN
B
100nm
preS1
131
preS2
145
LQDPRVRGLYFPAGG
Western-blot анализ с использованием antiHBcAg моноклональных антител.
1Лизат E.coli DH5F’
2 Очищенный HBcAg
3 Лизат E.coli DH5F’/pUC8HBc-preS1
4 Лизат E.coli DH5F’/pUC8HBc-preS2
100 nm
Группы по 5 мышей линии BALB/c были трехкратно внутримышечно иммунизированы 5 g рекомбинантных
белков в адъюванте Фрейнда
Гуморальный иммунный ответ после трехкратной иммунизации
анализировался с помощью ИФА. В качестве антигенов были
использованы рекомбинантные белки HBc, HBc-preS1 and HBc-preS2.
HBc-preS1 c
Адъювантом
Фрейнда
60000
50000
OD
405 nm
3000
HBc-preS1 c
адьювантом
Фрейнда
3.0
2500
40000
1/титр
Гуморальный иммунный ответ после трехкратной иммунизации
анализировался с помощью ИФА. В качестве антигенов были
использованы пептиды DHQLDPAFRAN (27-38 preS1) для группы мышей,
иммунизированных HBc-preS1 белком и LQDPRVRGLYFPAGG (131-145
preS2) для мышей иммунизированных HBc-prerS2
2.5
HBc-preS2 c
Адъювантом
Фрейнда
30000
20000
2000
HBc-preS2 с
адьювантом
Фрейнда
не
иммунизирован
ные мыши
2.0
1500
1.5
1000
Не иммунизированные
мыши
10000
500
1.0
0.50
0
HBc
1
HBc-preS1
HBc-preS2
1
2
3
4
-500
0
Антиген
1/200
1/400
1/800
1/1600
Разведения сыворотки
Для успешного проведения всемирных программ вакцинации необходимо создание
эффективных вакцин, удобных в применении и хранении. Аттенуированные штаммы
Salmonella широко исследуются как живые бактериальные вектора для доставки
гетерологичных антигенов, т.к. эти внутриклеточные бактерии стимулируют гуморальный,
мукозальный и клеточный иммунный ответ у человека и лабораторных животных.
Аттенуированные штаммы Salmonella колонизируют лимфоидные ткани кишечника, затем
распространяются в другие ткани иммунной системы, такие как ткани селезенки и печени.
После периода персистенции аттенуированные штаммы Salmonella элиминируют из
организма.
Salmonella как вектор доставки антигенов
Tag
promotor
ген HBc
Гуморальный и мукозальный иммунный ответ. Группы по 20
мышей BALB/c были иммунизированы перректально
рекомбинатными штаммами Salmonella/pKHBc
pKHBc
Ap
Трансформация
клеток
Salmonella
Col E1 Ori
Анти-HBc IgG сыворотки
Анти-HBc IgA слизистой кишечника
Проникновение
клеток Salmonella в
Гастроткани
350
3500
4000
400
интерстициональный
тракт
300
3000
3000
2500
EE2323/pKHBc
pKHBc
2000
2000
T10
pKHBc
T 10/pKHBc
1500
1000
1000
Клетки
Salmonella.
продуцирующие
белок HBc
Salmonella
Бактериальный
лизис
Перректальная
иммунизация
Индукция плазматических
и Т-хелперных клеток
Tх*
Tх
MHC-II +
Антиген
B*
TCR
B
Антиген
250
300
200
MHC-I +
Aнтиген
M клетка
200
150
Tц
Tц*
Л
Л
TCR
100
500
100
50
0
00
0
2
4
5
Mф
Л
ДК
2
6
недель после иммунизации
Mф
2
4
4
Mф
66
недель после иммунизации
Среди современных подходов к созданию вакцин весьма перспективными представляются
неинвазивные формы вакцин, которые вводят в организм через слизистые оболочки. Мы
предлагаем перректальную форму введения сконструированных рекомбинантных Salmonella.
Такие вакцины могут индуцировать не только системный, но и мукозальный иммунный ответ,
формируя защиту у ворот инфекции. В медицинской практике используются суппозитории,
содержащие живые микроорганизмы. Суппозиторные формы, содержащие бактерии используются
для лечения дизбактериозов и воспалительных процессов. Мы разработали технологию
производства суппозиторной формы вакцины, содержащей клетки рекомбинантного
аттенуированного штамма сальмонелл. Бактерии сохраняют жизнеспособность в составе
суппозитория в течении длительного времени (данные представлены в таблице).
1 месяц
3 месяца
Жизне Стабил Жизне
споьспособнос ность
собнос
ть
ть
E23 pKHBc
3,5
108
· 100%
2,7
107
Заключение: В качестве кандидатов в
6 месяцев
Стабил Жизне Стаби
ьспосо льность
бность Ность
· 100%
1,5 · 100%
107
вакцину созданы антигены HBc-preS1 HBcpreS2, представляющие собой коровый
антиген
ВГВ,
несущий
эпитопы
поверхностного
белка
ВГВ.
Для
эффективной доставки антигена был
предложен
перректальный
способ
введения с помощью рекомбинантных
аттенуированных штаммов сальмонелл.
Разработана форма вакцинного препарата в
виде суппозиториев.
Работа была выполнена в рамках федеральной целевой
научно-технической
программы
“Исследования
и
разработки по приоритетным направлениям развития
науки и техники” подраздел “Защита от патогенов”
Скачать