Часть 1. Культивирование продуцентов.
реклама
НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОТЕХНОЛОГИЯ С.Н. Загребельный Мультимедийный курс Часть 1. Культивирование продуцентов snz@post.nsu.ru «Методические материалы (мультимедийный курс) подготовлены в рамках реализации Программы развития НИУ-НГУ» УСТОЙЧИВОЕ РАЗВИТИЕ • Термин «Устойчивое развитие» все чаще используется при обсуждении направлений и перспектив развития человеческой цивилизации. • Принцип 3 Декларации Рио-де-Жанейро провозглашает: “Право на развитие должно быть реализовано таким образом, чтобы удовлетворялись потребности в развитии и сохранении окружающей среды нынешнего и будущих поколений” (цит. по В.А. Коптюг, Избранные труды. Т. 4, с.321, М., НАУКА, 2006 г) • Под термином «Устойчивое развитие» понимается большой комплекс проблем, и среди них одной из важнейших является дружественное отношение к природе и окружающей среде 2 УСТОЙЧИВОЕ РАЗВИТИЕ • Концепция устойчивого развития предложена в качестве альтернативы сложившейся стратегии развития человеческого общества. • Развитие общества требует энергии и материи. Энергия расходуется на поддержание деятельности членов общества и производственных мощностей, производящих средства производства и предметы потребления. • Вся предыдущая история развития цивилизации представляет собой путь, основанный на экстенсивном использовании природных запасов, сформировавшихся в процессе развития планеты. При этом особенно активно использовались невозобновляемые источники сырья, которые подошли к пределам исчерпания. 3 ТЕХНОЛОГИИ УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ Концепция устойчивого развития включает в себя много аспектов политического, социального и технологического характера. Технологические аспекты устойчивого развития предусматривают: • Использование технологий, характеризующихся пониженными энергоемкостью и материалоемкостью; • Максимально возможное использование возобновляемых источников энергии и сырья; • Минимизация образования отходов производства в сочетании с максимальной возможностью их утилизируемости. 4 ТЕХНОЛОГИИ УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ Бóльшую часть этих требований способна удовлетворить биотехнология. Термин “биотехнология” состоит из двух греческих корней: βιος и τεχνε. Первый означает “жизнь”, второй – “умею”. Сам термин означает способность получить какой-то продукт с использованием живых систем или их компонентов. Технологии этого типа использовались еще на этапе стихийного развития науки и техники, когда в основе технологий лежал опыт. Примером могут служить виноделие, приготовление кисломолочных продуктов, выделка кож с использованием кислого молока и пр. 5 ТЕХНОЛОГИИ УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ Предметом современной биотехнологии является разработка технологических процессов получения продуктов для удовлетворения жизненных потребностей человека с использованием живых систем. В последние годы появился новый термин: технологии живых систем. Жизненные потребности человека при этом трактуются весьма широко. Речь идет как о конкретных продуктах индивидуального потребления, так и о продуктах, являющихся исходными веществами для промышленного производства, о штаммах микроорганизмов для удаления поллютантов из окружающей среды, о трансгенных организмах, обладающих новыми качествами. 6 ТЕХНОЛОГИИ УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ Термин биотехнология употребляется к нескольких смыслах: Биотехнология как отрасль науки, предметом которой является исследование закономерностей физиологии, биохимии, генетики продуцента, позволяющих регулировать развитие популяции продуцента в направлении наиболее эффективного решения технологической задачи; Биотехнология как отрасль инженерной науки, предметом которой является создание аппаратуры, позволяющей наиболее эффективно получать желаемые продукты; Биотехнология как отрасль производства, задачей которой является получение с применением технологий живых систем продукта для последующего использования. 7 ТЕХНОЛОГИИ УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ Продукты биотехнологии могут быть распределены по следующим группам: • Основная биотехнология – крупнотоннажные процессы с получением продуктов технического качества • технические ферментные препараты (микробные протеазы - для облагораживания некоторых видов мяса, обработки шкур; амилазы для частичного гидролиза крахмала в крахмалсодержащих видах пищевого сырья, обработки муки; пектиназы - для облагораживания растительных волокон, осветления соков); • пищевые и кормовые добавки (незаменимые для человека и некоторых животных аминокислоты, жирные, особенно полиненасыщенные кислоты, лимонная кислота; многоатомные спирты) или сырье для их приготовления (белок одноклеточных); • микробиологические средства защиты растений, часто представляющие собой высушенную культуру микроорганизмов, патогенных для насекомых - вредителей сельского хозяйства; • органические растворители (этанол, бутанол, пропанол, ацетон и др.) для химической промышленности; • антибиотики для медицины и ветеринарии 8 ТЕХНОЛОГИИ УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ Тонкая биотехнология: комплекс технологических процессов, ориентированных на получение высокоочищенных продуктов • высокоочищенные ферментные препараты для медицины, ветеринарии, химической промышленности – в качестве катализаторов, аналитических реагентов; • действующие основы лекарственных средств (инсулин и другие вещества гормонального действия; продукты, экстрагируемые из тканей и органов животных или из биомассы растений и микроорганизмов); • вакцинно-сывороточные препараты (рекомбинантные антигены, живые и убитые вакцины, гамма-глобулины, сыворотки иммунных животных и человека). 9 ХИМИЧЕСКАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ - микробная трансформация органических соединений -полупродукты для органического синтеза -растворители СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО микробиологические средства защиты растений кормовые добавки микробиологические удобрения лечебные и диагностические препараты для ветеринарии новые методы селекции ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА -методы контроля состава -технология переработки производственных и бытовых отходов БИО ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВО ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ - Виноделие - сыроделие - пивоварение -производство кисломолочных продуктов -пищевые добавки МЕДИЦИНА -Антибиотики - ферменты медицинского назначения - ферменты для клинической диагностики -ферменты в производстве полусинтетических лекарственных средств -вакцины РАЗРАБОТКА РУДНЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ - микробное выщелачивание рудных месторождений ЭНЕРГЕТИКА - производство биогаза и других видов топлива - микробное аккумулирование рассеянных элементов - производство материалов для повышения нефтеотдачи пластов 10 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОТЕХНОЛОГИИ • Основные преимущества: • Основные направления: • Пониженное энергопотребление; • Пониженная материалоемкость; • Повышенный коэфициент использования сырья; • Более простая технология очистки готового продукта • Биологический синтез с использованием продуцентов; • Инженерная энзимология (использование ферментов как каталитических агентов в химической технологии). 11 ПРОДУЦЕНТЫ • Многие продукты биотехнологии получаются непосредственно биосинтезом. В связи с этим в биотехнологии применяется понятие “продуцент”. Под этим термином понимают организм, который осуществляет биосинтез интересующего нас продукта. • В качестве продуцентов могут выступать различные организмы: это могут быть растения, животные, низшие эукариотические организмы (напр., грибы), изолированные клетки и микроорганизмы. 12 ПРОДУЦЕНТЫ • Наиболее часто продуцентами в биотехнологии являются микроорганизмы. Это обусловлено относительной простотой их культивирования, высокой скоростью роста и возможностью активно управлять протекающими в культуре микроорганизмов процессами. • Простота культивирования микроорганизмов связана с их способностью использовать в качестве источников питания простые органические соединения (для гетеротрофов), а то и вовсе обходиться без органических компонентов (для автотрофов). • Эукариотические клетки изначально приспособлены к существованию в многоклеточном организме, в котором клетки различных органов имеют специализацию, а продукты их биосинтеза по специальным транспортным путям попадают к тем клеткам, для которых они предназначены. Перевод таких клеток в культуру требует включения в состав питательной среды компонентов, которые в организме поставляются из других органов. 13 МИКРООРГАНИЗМЫ В давние времена люди ничего не знали о микробах, но использовали их возможности для получения продуктов. Научная микробиология возникла в XVIII-XIX веках, после изобретения микроскопа Антони ван Левенгуком. Он работал в мануфактурной лавке, а в свободное время занимался шлифованием линз. Впервые увидел с помощью своего микроскопа невидимых живых существ и по-детски заинтересовался ими. Рассматривание предметов под микроскопом стало его любимым занятием. 14 ПРОДУЦЕНТЫ • Помимо высокой скорости роста, относительной простоты культивирования микроорганизмы существенно отличаются от эукариотических организмов по биохимии. • Эти отличия приводят к способности микроорганизмов синтезировать большое разнообразие продуктов, которые недоступны в привычных метаболических схемах и путях. 15 ПРОДУЦЕНТЫ • Микроорганизмы распространены повсеместно и легко перемещаются потоками воды и воздуха, попадая при этом в самые различные условия, где они вынуждены существовать и использовать компоненты окружающей среды для добывания питательных компонентов. • В связи с этим их метаболический потенциал должен быть достаточно мощным, чтобы обеспечивать их энергией и строительными материалами исходя из самых простых компонентов, доступных из окружающей среды. • Благодаря такому разнообразию микроорганизмы способны использовать в качестве источников питания вещества, которые непригодны для других представителей биосферы. 16 ТИПЫ ПИТАНИЯ МИКРОРГАНИЗМОВ • АВТОТРОФНЫЙ – использование в качестве источников питания простейших компонентов: воды, углекислого газа (как единственного источника углерода) и минеральных солей; • АВТОТРОФЫ – микроорганизмы, получающие весь углерод за счет фиксации СО2 . • Варианты автотрофного питания: • фотоавтотрофы – используют свет как источник энергии для расщепления СО2; хемоавтотрофы – используют химический источник энергии для вовлечения СО2 в обмен веществ (энергия окислительно-восстановительных реакций: окисление восстановленных неорганических соединений - NH3, NO2-, H2, восстановленные формы серы (H2S, S0, S2O32-), соединения Fe2+) 17 ТИПЫ ПИТАНИЯ МИКРОРГАНИЗМОВ • ГЕТЕРОТРОФНЫЙ – использование в качестве источников питания более сложных источников углерода - органических соединений; • ГЕТЕРОТРОФЫ – микроорганизмы, источником углерода для которых являются простые органические соединения. • Варианты гетеротрофного питания: фотогетеротрофы используют свет как источник энергии и органическое вещество как основной источник углерода (зеленые и пурпурные бактерии); хемогетеротрофы используют химический источник энергии и органическое вещество как источник углерода (подавляющее большинство бактерий). Организмы, удовлетворяющие все свои потребности в углероде за счет основного источника, относят к прототрофам. 18 ТИПЫ ПИТАНИЯ МИКРОРГАНИЗМОВ Классификация микроорганизмов по природе используемых доноров электронов ЛИТОТРОФНЫЙ Неорганические доноры электронов (Н2, NH3, H2S, Fe+2, CO и др.) ОРГАНОТРОФНЫЙ Доноры электронов органические соединения 19 ТИПЫ ПИТАНИЯ МИКРОРГАНИЗМОВ • Важным классификационным признаком для микроорганизмов по типу питания является отношение к использованию молекулярного кислорода. • Организмы, не способные расти в отсутствие кислорода, называют аэробами, способные к бескислородному существованию – анаэробами. • Облигатные аэробы (анаэробы) растут только в присутствии (отсутствии) кислорода. • Факультативные аэробы (анаэробы) могут расти как в тех, так и в других условиях. • Микроаэрофилы - облигатные аэробы, предпочитающие более низкие парциальные давления кислорода, чем в воздухе (например, микроорганизмы, получающие энергию путем окисления молекулярного водорода: гидрогеназа – фермент, катализирующий эту реакцию, инактивируется кислородом) 20 ПИТАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ элементный состав микробной клетки Элемент Содержание (% от сухого вещества) S 1 K 1 С 50 Na 1 О 20 Ca 0,5 N 14 Mg 0,5 Cl 0,5 Fe 0,2 H 8 P 3 Все остальные элементы 0,3 21 ПИТАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ основные функции элементов Элемент Физиологическая роль H О Входит в состав воды и органического вещества С N Входит в состав органического вещества S P Входит в состав белков и некоторых коферментов K Один из главных неорганических катионов клетки, кофактор некоторых ферментов Входит в состав воды и органического вещества; служит акцептором электронов при дыхании Входит в состав белков, нуклеиновых кислот, коферментов Входит в состав нуклеиновых кислот, осолипидов, коферментов 22 ПИТАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ основные функции элементов Элемент Физиологическая роль Mg Важный катион клетки; неорганический кофактор многих ферментов; входит в состав хлорофиллов Mn Неорганический кофактор многих ферментов, иногда заменяет Mg Сa Важный катион клетки, кофактор некоторых ферментов Fe Входит в состав окислительных систем (цитохромов и других белков, содержащих или не содержащих гем); кофактор некоторых ферментов Co Cu, Zn, Mo Входит в состав витамина В12 и его производных Неорганические компоненты некоторых ферментов; Mo – кофактор нитрогеназ, гидрогеназ 23 ПИТАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ • КАТАБОЛИЗМ - расщепление питательных веществ, поступающих из окружающей среды преимущественно за счет реакций окисления; сопровождается освобождением энергии, заключенной в молекулах сложных органических соединений, и накоплением ее в форме энергии макроэргических пирофосфатных связей АТФ; • АНАБОЛИЗМ - биосинтез сложных веществ из простых продуктов катаболических реакций; образование сложных молекул из простых связано с уменьшением энтропии в системе, и, следовательно, с потреблением энергии, заключенной в макроэргических связях. 24 ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ •Микроорганизмы обладают более мощным метаболическим потенциалом по сравнению с высшими организмами. •Микробная клетка обладает всем необходимым для развития и роста популяциии способна использовать большое разнообразие веществ как источников энергии и углерода. Наиболее разнообразен метаболизм у бактерий: •Только бактерии – литотрофы способны к извлечению энергии из восстановленных неорганических веществ – Fe, S, H2S, H2, NH3, NO2-, CO и др. •Бактерии могут использовать органические соединения – от С1 до полимеров – в качестве источников углерода. Только бактерии способны утилизировать метан. •Бактерии, как и растения, способны к автотрофному питанию – использованию СО2 как единственного источника углерода, однако у бактерий найдено по меньшей мере три различных механизма усвоения СО2 против единственного у растений. 25 ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ •В связи с большим разнообразием условий обитания микроорганизмов у них сформировались различные типы метаболизма, существенно отличающиеся от метаболизма эукариотов. •Производство энергии всегда сводится к производству макроэргических связей АТФ. Энергия при этом поставляется либо в процессе дыхания, либо в процессе брожения. Это основные процессы энергопроизводства, хотя существуют и другие. 26 ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ •Дыхание - метаболический процесс с образованием АТФ, включающий окислительновосстановительные реакции с участием в качестве доноров электронов либо органических, либо неорганических веществ. • Дыхание может протекать с участием молекулярного кислорода в качестве терминального акцептора электронов – аэробное дыхание; •У некоторых бактерий терминальным акцептором электронов являются сульфаты, нитраты, карбонаты. В этих случаях говорят об анаэробном дыхании. 27 ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ •Брожение – метаболический процесс, при котором как донорами, так и акцепторами электронов являются органические соединения. В процессе брожения происходит строго сбалансированное перераспределение электронов между органическими соединениями без отвода электронов во внешнюю среду. Этот строгий баланс есть главное отличие между дыхательным и бродильным типами метаболизма. •Помимо дыхательного и бродильного типов метаболизма существуют и другие 28 ОСНОВНЫЕ ТИПЫ МЕТАБОЛИЗМА ТИП ПИТАНИЯ ТИП МЕТАБОЛИЗМА ИСТОЧНИК ЭНЕРГИИ ИСТОЧНИК УГЛЕРОДА ДЫХАТЕЛЬНЫЙ Органическое вещество Неорганическое вещество Органическое вещество, СО2 Органическое вещество Органическое вещество МЕТАНОГЕННЫЙ Органическое вещество, Неорганическое вещество, Н2 Органическое вещество, СО2 Органотрофы, автотрофы ФОТОТРОФНЫЙ Солнечная радиация Органическое вещество, СО2 Фотоорганотрофы, Фотоавтотрофы БРОДИЛЬНЫЙ Органотрофы, автотрофы Хемоорганотрофы 29 МЕТАНОГЕНЕЗ ВСТРЕЧАЕТСЯ ТОЛЬКО У МИКРООРГАНИЗМОВ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПУТИ МЕТАНОГЕНЕЗА Предполагаемые биохимические пути образования метана микроорганизмами (Jörn Meuer, H. Craig Kuettner, Jun Kai Zhang, Reiner 30 Hedderich and William W. Metcalf// PNAS, 2002 vol. 99 no. 8, P. 5632–5637) КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ • Первой стадией получения любого продукта биотехнологии является культивирование продуцента. • Первоисточником продуцентов, используемых в промышленном производстве, является природа: именно из почвы, водоемов выделяют штаммы микроорганизмов, способные к выполнению определенной задачи. Следует, однако, иметь в виду, что большинство штаммов микроорганизмов из природных источников не удается перевести в культуру (от 80 до 99% - по разным оценкам). • Выделенные штаммы микроорганизмов подвергаются идентификации по морфологическим, генетическим и биохимическим признакам и помещаются в специальные коллекции. 31 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ • Коллекционные штаммы подвергаются непрерывному изучению, их постепенно адаптируют к выполнению возлагаемых на них биотехнологических задач: ищут варианты с повышенной продуктивностью по данному продукту, с более удобными эксплуатационными свойствами и т.д. • В конце концов эти штаммы превращаются в лабораторные культуры, сильно отличающиеся от выделенных из природы. 32 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ • Существуют коллекции производственных штаммов, в которых содержатся исходные продуценты, предоставляемые предприятиям по их запросам. • Коллекция при этом предоставляет сведения о культуральных свойствах продуцента и гарантирует определенный уровень накопления целевого продукта. • В России такой коллекцией является Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов, держателем ее является Государственный Научный центр РФ Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г. Москва). 33 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ • Производственная культура микроорганизмапродуцента хранится в лаборатории предприятия в виде стока – посева в пробирке на жидкой или твердой питательной среде, предназначенной для среднесрочного хранения. • В процессе хранения клетки микроорганизмов минимизируют свой метаболизм, поэтому передача их в производственный процесс проводится постепенно. • Перед засевом в аппарат культура подращивается в термостате на специальной среде (ночная культура). Цель этой стадии – “оживление культуры”, перевод из “спящего” состояния в активное. Активная культура называется “инокулятом”. 34 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ Сток - культура Ночная культура инокулят Посевной аппарат Производственный ферментер Принципиальная технологическая схема цикла подготовки и проведения культивирования продуцентов. Инокулят засевается в посевной аппарат, в котором производится дальнейшая адаптация культуры, затем из посевного аппарата культура передается в производственный ферментер. Посевной аппарат обычно имеет объем 630 л, производственный ферментер имеет объем от нескольких м3, нескольких десятков м3 и до нескольких сотен м3. 35 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ • Для выращивания микроорганизмов необходимы питательные среды. • Основные требования к питательной среде: • Полноценность: в составе среды должны присутствовать все необходимые для роста микроорганизмов компоненты; • Стерильность – среда должна быть свободна от всех микроорганизмов, чтобы в процессе культивирования размножались клетки только целевого микроорганизма. • Полноценность среды обеспечивается при конструировании ее состава. Простые (синтетические) среды получают смешением их компонентов, их состав точно известен и легко контролируется. Сложные среды содержат помимо компонентов точно известной природы добавки, найденные эмпирически и представляющие собой смеси многих компонентов, природа которых не всегда точно известна. Примеры: дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт и т.п. Часто неизвестно, какие из компонентов этих добавок действительно необходимы для роста культуры. 36 МИНИМАЛЬНАЯ СИНТЕТИЧЕСКАЯ СРЕДА K2HPO4 0,5 г NH4Cl 1,0 г MgSO4•7H2O 0,2 г CaCl2 0,01 г FeSO4•7H2O 0,01 г Глюкоза 10,0 г Раствор микроэлементов Вода 1 мл 1000 мл 37 СМЕСЬ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ Биотин 0,2 мг Никотиновая кислота 2,0 мг Тиамин 1,0 мг п-Аминобензойная кислота Пантотеновая кислота 1,0 мг Пиридоксамин 5,0 мг Цианкобаламин 2,0 мг Вода 100 мл 0,5 мг 38 ИСТОЧНИКИ УГЛЕРОДА • Клетки микроорганизмов на 50% (по сухому веществу) состоят из углерода. • Фотоавтотрофные микроорганизмы в качестве источника углерода используют СО2 из атмосферы, вовлекая его в метаболические процессы с использованием световой энергии. • Хемоавтотрофные микроорганизмы в качестве источника углерода используют карбонаты, которые вовлекаются в метаболизм за счет окислительновосстановительных процессов. 39 ИСТОЧНИКИ УГЛЕРОДА • Гетеротрофные микроорганизмы в качестве источника углерода используют различные соединения углерода: • СО2 – без использования внешних источников энергии; • Углеводы – чистые и углеводосодержащее сырье; • Спирты (одно- и многоатомные); • Органические кислоты; • Углеводороды; 40 ИСТОЧНИКИ УГЛЕРОДА • Технические углеродсодержащие продукты (меласса; соки растений; растительная патока; крахмал и продукты его частичной переработки; сульфитный щелок; барда – отход производства спирта; гидролизаты полисахаридов, древесины; отходы сахарной промышленности; отходы молочной промышленности). • Технические источники углерода – сложные многокомпонентные смеси различных веществ, могут служить источниками не только углерода, но и других необходимых для роста культуры микроорганизмов химических элементов - удобство. • Недостаток – состав технических источников углерода обычно невоспроизводим и его трудно контролировать и трудно управлять ростом культуры. 41 ИСТОЧНИКИ УГЛЕРОДА • Наиболее легко усваиваются углеводы, особенно гексозы, далее – многоатомные спирты (маннит, глицерин), карбоновые кислоты. • Углеводороды способны усваивать лишь некоторые группы микроорганизмов; на этой основе возникла промышленность по производству микробного белка (белка одноклеточных – single cell protein, SCP). 42 ИСТОЧНИКИ АЗОТА • Азот составляет до 12% сухого веса биомассы бактерий, у грибов – до 10% массы сухого мицелия • Простые источники азота: - аммиак и соли аммония; - мочевина; • Сложные источники азота: - кукурузный экстракт; - соевая мука, рыбная мука; - отходы спиртового производства; - дрожжевой экстракт; - гидролизат белка. 43 ИСТОЧНИКИ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ ФАКТОРОВ РОСТА • Витамины, гормоны и другие факторы роста, а также микроэлементы обычно содержатся в сложных питательных средах, так что часто нет необходимости добавлять их специально. • Микроэлементы, в частности, содержатся в достаточном количестве в водопроводной воде. • В некоторых случаях – например, при отработке условий культивирования – необходимо точно контролировать состав питательной среды и тогда «минорные» компоненты специально добавляют в определенных количествах – в виде смеси, 44 которая была приведена ранее. СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД • Стерильность питательной среды очень важна для производственного культивирования, чтобы исключить рост посторонних микроорганизмов – контаминантов. • Методы стерилизации питательных сред: - термическая стерилизация (перегретый пар, температура свыше 130°С); - пастеризация – вариант термической стерилизации; - стерилизация фильтрацией (мембранная фильтрация); - химическая стерилизация; - радиационная стерилизация (УФ-, рентгеновское и гамма-облучение); 45 КИНЕТИКА ТЕРМИЧЕСКОЙ ИНАКТИВАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ • Пусть N – число жизнеспособных клеток микроорганизмов в некоторой среде. Тогда при термообработке это число будет изменяться со временем по законам кинетики первого порядка: dN kN, dt где: k – зависящая от температуры константа скорости гибели микроорганизмов, N – число жизнеспособных микробных клеток и t – время. 46 КИНЕТИКА ТЕРМИЧЕСКОЙ ИНАКТИВАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ • Зависимость константы скорости гибели клеток микроорганизмов зависит от температуры по закону Аррениуса для химических реакций: - E k αe RT • Интегрируя, получаем: - при переменной температуре стерилизации t N E ln e RT dt N0 0 47 ТЕХНОЛОГИЯ ТЕРМИЧЕСКОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ Подача стерилизуемой среды теплоноситель хладоагент Схема установки для непрерывной стерилизации (УНС) Непрерывная технология более удобна в применении, поскольку требует меньших габаритов оборудования, обеспечивает снижение энергетических потерь 48 ПАСТЕРИЗАЦИЯ • Обычный вариант термической стерилизации высокотемпературной обработкой не обеспечивает гибели спор микроорганизмов. • Тем не менее найден способ борьбы со споровыми формами. Автором этого способа является выдающийся французский ученый, один из создателей научной микробиологии – Луи Пастер, по его имени и назван способ. • Сущность пастеризации заключается в том, что вегетативные клетки микроорганизмов погибают при температуре ~ 60°С, а споры индуцируются к прорастанию. Охладив питательную среду до ~ 30°С мы создаем условия для прорастания спор в вегетативные клетки. Затем снова прогрев до ~ 60°С, проросшие клетки погибают, непроросшие споры прорастают, цикл повторяется, в конце концов среда становится стерильной. 27.12.1822 - 28.09.1895 Хорошо рисовал, открыл оптическую изомерию, брожение, природу инфекционных болезней 49 СТЕРИЛИЗАЦИЯ ФИЛЬТРОВАНИЕМ • Многие компоненты питательных сред термолабильны и не выдерживают термической стерилизации. Глюкоза, например, при высокой температуре претерпевает химические изменения – «карамелизуется». Раствор при этом темнеет из-за образования полимерных продуктов. В таких случаях используют щадящие методы стерилизации, одним из которых является фильтрация. • Фильтрация как способ стерилизации известна со времен Пастера. Часто использовались неглазурованные фарфоровые фильтры (свечи Шамберлана), в настоящее время в лабораториях применяют фильтр Беркефельда (из прессованного кизельгура), асбестовые пластины (в фильтрах Зейтца), стеклянные фильтры и мембранные фильтры, наиболее широко применяемые в промышленности для стерилизации больших объемов растворов. • Современная технология изготовления мембран позволяет создавать мембраны с заданным размером пор и достаточно узким распределением этих размеров. • Стерилизующая фильтрация является одним из процессов так называемой мембранной технологии, которая используется не только для стерилизации, но и для фракционирования сложных смесей, с чем мы познакомимся в дальнейшем более подробно. 50 ХИМИЧЕСКАЯ СТЕРИЛИЗАЦИЯ O O H2C CH2 H5C2O окись этилена O O H2C C C O C OC2H5 H2C O диэтилпирокарбонат β-пропиолактон Химические стерилизующие агенты представляют собой алкилирующие или ацилирующие соединения. При взаимодействии с клетками микроорганизмов происходит их химическая модификация, сопровождающаяся инактивацией. После обработки реагенты, находясь в водной среде, постепенно гидролизуются. Окись этилена является опасным для персонала реагентом, так что она в большинстве случаев запрещена к применению. 51 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ • Пусть в некотором объеме питательной среды, содержащей все необходимые компоненты, находятся клетки микроорганизмов в концентрации x. С течением времени концентрация клеток будет возрастать пропорционально исходной концентрации клеток и времени: • dx = μxdt • Здесь dx – приращение биомассы за время dt, μ – удельная скорость роста. 52 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ • В виде дифференциального уравнения: dx = μx dt Решая уравнение, получаем: ln x = ln x0 + μt, x = x0 eμt Рост, подчиняющийся этому при x = 2x0 закону, называется ln2 0, 693 t = td = = μ μ экспоненциальным или логарифмическим ростом. 53 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ • Полученные уравнения справедливы лишь при постоянном μ, то есть при постоянных условиях окружающей среды и составе биомассы. Приближенно эти закономерности выполняются и при малых изменениях в культуре, например, когда доля потребленных питательных компонентов мала по сравнению с их содержанием в питательной среде. 54 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ • Для оценки эффективности использования питательных субстратов и метаболической активности культуры вводятся специальные параметры: • Экономический коэффициент характеризует связь накопления биомассы с потреблением субстратов Δx = Y, Δs в пределе Y = dx ds 55 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ • Метаболический коэффициент характеризует скорость потребления субстрата (удельная скорость метаболизма) 1 ds q= . x dt Смысл метаболического коэффициента можно представить как суммарную скорость совокупности ферментативных процессов утилизации субстрата в клетке: q = qm s s + Ks Сравнивая выражения для основных параметров роста культуры можно видеть связь между ними: μ = 1 dx 1 dx ds = = Yq, μ = qY, x dt x ds dt при s>> Ks q = qm, μ = μm и не зависят от концентрации субстрата 56 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ • Приведённые уравнения справедливы при наиболее благоприятных условиях культивирования: • Малые степени утилизации субстратов (отсутствие лимитирования субстратами); • Эфективный массообмен (отсутствие застойных зон в аппарате). • По мере исчерпания субстратов в ходе их потребления растущей культурой концентрация питательных веществ в культуральной среде падает, что приводит к замедлению, а затем и прекращению накопления биомассы. 57 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ • В ходе роста культуры происходит появление новых клеток и – параллельно – гибель клеток. • При благоприятных условиях роста скорость накопления новых клеток много выше скорости отмирания; • При наступлении лимитирования субстратами скорость деления клеток падает, происходит сближение скоростей накопления клеток и гибели. • В процессе развития культура проходит несколько фаз. 58 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ • 1 – лаг-фаза (фаза адаптации культуры к среде) • 2 – экспоненциальная (логарифмическая) фаза • 3 – предстационарная фаза • 4 – стационарная фаза • 5 – фаза отмирания культуры • Фазы роста культуры С 1 2 3 4 5 t 59 ЛАГ - ФАЗА • “Ночная культура” выращивается на богатой среде, чтобы клетки из “стока”быстро переходили в активное состояние • При переносе культуры из “ночной культуры” в посевной аппарат питательная среда меняется на более бедную и состоящую из других, более дешевых компонентов • Культура при таком переносе должна приспособиться к новым условиям, что выражается в замедленном росте культуры • Фаза адаптации культуры называется лаг-фазой (от английского слова “lag”, что значит “задержка”); адаптация может, например, заключаться в индукции синтеза ферментов, необходимых для усвоения компонентов питательной среды (амилаз – для использования крахмала, протеаз для использования рыбной или соевой муки и т.п.) 60 ЭКСПОНЕНЦИАЛЬНАЯ (ЛОГАРИФМИЧЕСКАЯ) ФАЗА • После фазы адаптации культура накапливает весь необходимый для активного роста потенциал. При этом концентрация питательных компонентов велика, рост культуры ничем не ограничивается и происходит в соответствии с ранее выведенными уравнениями. Через промежуток времени равный t = td = ln2 0, 693 = μ μ концентрация клеток в системе удваивается, и так продолжается до тех пор, пока концентрация питательных субстратов остается достаточно большой 61 СТАЦИОНАРНАЯ ФАЗА • На стадии экспоненциального роста скорость накопления клеточной массы многократно превосходит скорость отмирания, так что этим процессом можно пренебречь. • По мере использования питательных субстратов начинает сказываться их недостаток, что приводит к замедлению накопления биомассы. Скорость гибели клеток при этом остается на том же уровне, культура вступает в предстационарную фазу своего развития, а затем и в стационарную фазу. • В стационарной фазе скорости накопления и гибели клеток практически выравниваются, так что видимая концентрация клеток не меняется. • Подобное состояние культуры может возникнуть и в случае, если в культуре накапливается ингибитор ее роста. 62 СТАЦИОНАРНАЯ ФАЗА • • Рассмотрим кинетику перехода к стационарной фазе. Пусть А – некоторый компонент питательной среды с концентрацией а; по мере его потребления культурой эта концентрация падает со скоростью, пропорциональной концентрации живых клеток: da = -ka x dt • Считая, что лаг-фаза в нашей культуре отсутствует, кинетику накопления биомассы можно представить в виде уравнения: • • • • x = x0e μt При t=0 x=x0 и a=a0. Интегрируя от a0 до 0 и от t=0 до t=ts (начало стационарной фазы), получаем: a0 = ka (x - x0 ), μ s xs = x0 + μ a0 . ka xs – концентрация клеток в стационарной фазе, рост культуры прекратился из-за исчерпания А. Это максимально достижимая концентрация клеток, линейно зависит от начальной концентрации А. 63 СТАЦИОНАРНАЯ ФАЗА • В случае накопления в среде ингибитора роста культуры. • Ингибитор продуцируется культурой. Происходящие при этом процессы могут быть описаны уравнением: dx = kx 1 - f ct , dt здесь сt – концентрация ингибитора, f(ct) – функция, описывающая накопление ингибитора в культуре в зависимости от времени. Если f(ct) – линейная функция, то можно записать: 1 dx = k 1 - bct , b = const x dt Поскольку ингибитор продуцируется клетками, то ct ~x; 64 СТАЦИОНАРНАЯ ФАЗА • Кинетическое уравнение для продукции ингибитора может быть, очевидно, записано в виде: dct = qx. dt t В интегральной форме: ct = q xdt (ct=0 при t=0). 0 Уравнение для скорости роста культуры в этом случае: t dx = kx 1 - bq xdt . dt 0 Текущая величина удельной скорости роста μeff при t 1 dx этом равна μ = = k 1 - bq xdt . eff x dt 0 65 СТАЦИОНАРНАЯ ФАЗА • Видно, что эта величина уменьшается во времени с возрастающей скоростью: μeff t 1 dx = = k 1 - bq xdt x dt 0 dμeff dt = -kbqx 0, d 2 μeff dt 2 = -kbq dx dt 0. Рост культуры прекращается при t μeff 1 = 0, = xdt bq 0 С учетом предыдущих уравнений можно видеть, что это происходит при концентрации ингибитора ct = 1/b. 66 НЕПРЕРЫВНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ • Наиболее распространенным способом культивирования микроорганизмов является периодическое культивирование. • При таком способе культивирования ферментер готовится: подвергается стерилизации, в него помещается весь объем питательной среды, которая либо простерилизована предварительно, либо подвергается стерилизации в ферментере. • В подготовленный ферментер засевается инокулят из «посевного аппарата» и начинается процесс культивирования. • После завершения процесса культура выгружается из ферментера и подвергается обработке, ферментёр промывается и далее запускается в тот же цикл. • Аппаратура, таким образом, используется в периодическом режиме. 67 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ Одним из вариантов непрерывного культивирования является так называемая культура полного вытеснения (тубулярная культура). Схема такого процесса приведена ниже. Питательная среда P-4 dv инокулят Питательная среда Устройство для концентрирования биомассы s=s x=x s=sa x=xa B dv культура A культура s=s x=x s=sa x=xa Возврат части культуры на вход 68 НЕПРЕРЫВНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ Сущность процесса состоит в следующем: • В трубчатый реактор подается питательная среда и инокулят; • Эта смесь прокачивается с определённой скоростью через объём реактора и далее выводится из процесса; часть культуры возвращается на вход реактора. • По мере перемещения по реактору культура развивается и проходит через все те же стадии, что и в периодическом процессе. • В итоге мы получаем ту же самую кривую роста культуры, но по оси абсцисс отложено не время, а расстояние от входа в реактор. Задавая скорость протока, можно на выходе из реактора получить культуру в любой фазе развития. 69 НЕПРЕРЫВНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ • Тубулярная культура предоставляет лишь ограниченные возможности управления ростом культуры и имеет соответственно ограниченные возможности использования в производстве. В частности, такую технику культивирования микроорганизмов используют в процессах микробиологической очистки сточных вод. В подобных же условиях удобно осуществлять анаэробную ферментацию при производстве молочных продуктов, таких как йогурт и сыр. Тубулярная культура может также использоваться для моделирования процессов, протекающих в пищеварительном тракте в результате жизнедеятельности кишечной микрофлоры. 70 НЕПРЕРЫВНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ • Другим вариантом технологии непрерывного культивирования является культивирование в режиме хемостата. • В этом случае в реактор, представляющий собой емкость, снабженную мешалкой, рубашкой для поддержания постоянной температуры, датчиками рН, устройствами для ввода и вывода питательной среды и культуры, с постоянной и регулируемой скоростью подается питательная среда и с той же скоростью выводится культура (после предварительного установления желаемого режима). 71 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ Подача питательной Вывод среды x = 0, культуры x s = s0, s F - поток F мешалка Хемостат – реактор идеального смешения. Принципиальным отличием хемостата от периодической культуры является возможность фиксации удельной скорости роста культуры на любом значении – от нуля до максимума, регулируя (подбирая) скорость подачи среды и оттока культуры. После перевода культуры в режим хемостата может реализоваться три возможности: 1. Скорость отвода культуры выше максимальной скорости роста; 2. Скорость вымывания биомассы равна максимальной скорости роста; 3. Скорость вымывания биомассы ниже максимальной скорости роста. 72 НЕПРЕРЫВНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ • Случай 1. Накопление биомассы не будет успевать за отводом культуры - концентрация биомассы в реакторе будет со временем падать, культура будет вымываться из ферментера; • Случай 2. Может установиться стационарное состояние, при котором концентрация биомассы будет постоянной. Однако, культура будет немедленно реагировать на любое изменение условий (например, изменение концентрации лимитирующего рост субстрата), состояние не будет устойчивым. • Случай 3. Концентрация биомассы будет расти до тех пор, пока скорость роста не сравняется со скоростью ее вымывания. При этих условиях скорость роста культуры задается скоростью потока и остается постоянной и меньшей, чем максимальная скорость, – возникает устойчивое стационарное состояние культуры: снижение по каким-либо причинам скорости роста приведет к повышению концентрации субстрата, что вызовет увеличение скорости роста. Таким образом, культура сама регулирует скорость своего роста. 73 КИНЕТИКА РОСТА КУЛЬТУРЫ В ХЕМОСТАТЕ • Кинетика роста культуры в режиме хемостата должна учитывать факт обмена культуры с внешней средой. Если F – скорость протока через ферментер, V – объем ферментера, то F / V = D – скорость потока на единицу объема - скорость разбавления. • Баланс биомассы: Общее увеличение биомассы = Рост – Отток. • Для малого промежутка времени dt : Vdx = Vμxdt – F xdt , dx/dt = (μ – D)x. • Отсюда видно, что при μ = D, т. е. когда скорость потока на единицу объема культуры равна скорости роста, наступает стационарный режим: концентрация биомассы остается постоянной во времени, dx / dt = 0. 74 КИНЕТИКА РОСТА КУЛЬТУРЫ В ХЕМОСТАТЕ • Соотношение для баланса биомассы исходит из того, что никакие другие факторы, кроме скорости поступления питательной среды в аппарат, не лимитируют рост культуры. В случае лимитирования субстратом необходимо рассматривать соотношение материального баланса по такому субстрату, которое может быть записано в виде: Общее изменение = Поступление - Отток – массы субстрата Субстрат, использованный на рост • Для малого промежутка времени dt этот баланс по всему объему культуры выразится уравнением: Vds = Fsr dt – Fsdt – Vμxdt / Y. • Далее ds / dt = D(sr - s ) - x/Y. • • В стационарном состоянии dx / dt = ds / dt = 0. 75 КИНЕТИКА РОСТА КУЛЬТУРЫ В ХЕМОСТАТЕ Значения стационарных концентраций s и x задаются уравнениями: μ - D x = 0; D sr - s - x = 1 = 0, Y Y Из ранее полученного уравнения максимальной скорости роста μ = μms / (s + K s) и условия стационарности μ = D получаем KsD s= μm - D K D x = YD sr - s = Y sr - s . μm - D При s = sr достигается максимальная скорость роста, но стационарная концентрация биомассы становится равной нулю: чем выше скорость разбавления культуры, тем меньше стационарная концентрация биомассы. 76 НЕПРЕРЫВНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ • Культура микроорганизмов неоднородна: некоторые клетки обладают более интенсивным метаболизмом, другие – менее интенсивным. Это приводит к различиям в скорости роста между группами клеток. • При культивировании в хемостате условия устойчивого стационарного состояния возникают не для всех клеток одновременно: для быстро растущих клеток это состояние поддерживается при определенной скорости протока, для других эта скорость протока оказывается выше максимальной скорости роста для данной группы клеток 77 НЕПРЕРЫВНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ • Задавая скорость протока, можно вымывать из хемостата клетки с меньшей максимальной скоростью роста, оставляя в хемостате клетки, растущие с большей скоростью. Повысив скорость протока, мы сможем вымыть из хемостата популяцию клеток с более высокой максимальной скоростью роста, чем в первой группе клеток, оставив клетки с ещё более высокой скоростью роста. • Иными словами, в хемостате возможно создать условия для селекции популяций микроорганизмов по скорости роста 78 СМЕШАННЫЕ КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ • Встречаются ситуации, когда образование целевого продукта не может быть достигнуто использованием какого-либо одного продуцента. В подобных случаях используют смешанные культуры микроорганизмов: один из них синтезирует некоторый промежуточный продукт, превращаемый далее в целевой другим микроорганизмом. 79 СМЕШАННЫЕ КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ • В природе для микроорганизмов существование в смешанных культурах является абсолютно естественным и единственно возможным. • В таких сообществах микроорганизмов между участниками сообщества возникают определённые взаимоотношения. 80 СМЕШАННЫЕ КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ • Наиболее распространено применение смешанных культур микроорганизмов в производстве кисломолочных продуктов: йогурта, сыров, сливочного масла. • При этом смешанные культуры микроорганизмов добавляются в виде заквасок, которые сразу содержат несколько микроорганизмов и разрабатываются для каждого вида продуктов отдельно. 81 МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА • Между участниками сообщества микроорганизмов могут устанавливаются определенные взаимоотношения: • Нейтрализм - практическое отсутствие взаимодействия; • Мутуализм – различные виды микроорганизмов «содействуют» друг другу в использовании питательных компонентов; резко выраженный мутуализм – симбиоз – когда один организм не может существовать без другого. В свое время была описана «бактерия» Metanobacillus omelianskii, которая оказалась смесью двух видов. Один из них способен окислять этанол до ацетата с образованием водорода, но водород подавляет его рост. СН3СН2ОН + Н2О ⇨ СН3СОО- + Н+ +2Н2 • Другой вид не способен расти на этаноле, но использует водород, окисляя его в метан: 4Н2 + СО2 ⇨ СН4 + 2Н2О 82 МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА • Комменсализм – один из видов использует «помощь» (продукты жизнедеятельности) другого вида, который развивается самодостаточно и независимо от присутствия соседей. • Аменсализм – один из видов продуцирует вещество, подавляющее рост соседей (механизм конкурентной борьбы). Примером такого рода ингибиторов являются антибиотики, которые продуцируются для освобождения жизненного пространства от конкурентов. • Взаимоотношения типа «хищник – жертва» - когда один из участников сообщества представляет собой пищу для других. 83 МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА • Экосистема желудочно-кишечного тракта жвачных животных (плотная смешанная культура бактерий (около 1010 клеток/мл) и простейших) – пример естественного многокомпонентного микробного сообщества, находящегося в симбиотических взаимоотношениях с макроорганизмом. • Деятельность этой смешанной популяции приводит к разложению растительных материалов – целлюлозы и других сложных углеводов – на более простые компоненты, доступные для усвоения организмом животных. 84 МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА Arthrobacter CH2 C O Энергия + CO2 + H2O + биомасса обоих видов Pseudomonas Сообщества микроорганизмов можно конструировать. Недавно был выделен штамм Arthrobacter sp. 101, способный окислять флюорен до флюоренона, который подавляет рост этого штамма. Был также найден штамм Pseudomonas mendocina, способный окислять флюоренон до СО2 и Н2О, но неспособный окислять флюорен. Совместное культивирование этих штаммов позволяет полностью минерализовать флюорен. 85 МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА • Группой Шиоя описан пример использования смешанной культуры для производства антибактериального пептида низина. Продуцентом этого пептида является бактерия Lactococcus lactis subsp. lactis (ATCC11454), которая одновременно продуцирует и молочную кислоту. Последнее приводит к постепенному подавлению биосинтеза низина. Введение в культуру дрожжей Kluyveromyces marxianus, выделенных из кефирных зерен и способных утилизировать лактат, позволило взять под контроль изменение рН в культуре и тем самым исключить влияние закисления среды, подавляющее накопление низина. В итоге уровень продукции низина повышен в 1,7 раза. • Shimizu Hiroshi, Mizuguchi Taiji, Tanaka Eiji, Shioya Suteaki. Nisin Production by a Mixed-Culture System Consisting of Lactococcus lactis and Kluyveromyces marxianus // Applied and Environmental Microbiology. 1999. Vol. 65, No. 7. P. 3134–3141. 86 КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ • Помимо поиска продуцентов среди микроорганизмов, существующих в природе, в последние десятилетия исключительно широко используется технология создания продуцентов путем манипуляций с геномом. Эта техника получила название генной (или генетической) инженерии. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ • Сущность этой технологии состоит в выделении генов, кодирующих желаемые продукты, из одних микроорганизмов и пересадке их в другие. • Подобного рода задачи возникают тогда, когда целевой ген обнаружен в микроорганизме, промышленное культивирование которого затруднительно: Либо он требует для роста сложного состава среду; Либо низка скорость его роста; Либо низок уровень продукции целевого продукта. Либо это микроорганизм патогенный для человека и животных. Могут быть и многие другие причины. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ • При этом должны решаться следующие задачи: 1. Необходимо подбирать в качестве продуцента микроорганизм, легко растущий на простых средах; 2. Этот микроорганизм должен быть хорошо изучен со стороны частоты использования кодонов (если целевым продуктом является белок); 3. Потенциальный продуцент должен иметь хорошо изученную систему регуляции транскрипции; 4. Потенциальный продуцент должен быть хорошо изучен в отношении поведения в случае накопления в клетке больших количеств чужеродного материала (в особенности белкового) КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ • Кроме того, конструирование продуцента должно учитывать последующие операции по выделению и очистке продукта. В частности, всегда желательно уже на первых стадиях процесса добиться выхода продукта из клеток продуцента, чтобы он оказался в менее многокомпонентной смеси, что упрощает процедуру последующего фракционирования. Последнее достигается путем использования бактериальных систем секреции. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ • К настоящему времени накоплен большой опыт конструирования продуцентов. • Для повышения эффективности технологического процесса специальным процедурам модификации подвергаются и гены белковых продуктов опять-таки с целью упрощения процедур их последующей очистки. Эти модификации будут рассмотрены в последующих разделах курса. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ Статус оперона Субстрат репрессор нет • выкл САР РНК-полимераза не может связаться с промотором глюкоза выкл • РНК-полимераза связывается с промотором лактоза вкл оперон глюкоза + лактоза выкл САР-сайт промотор оператор Схема функционирования lac-оперона • Одним из наиболее важных этапов конструирования продуцента является создание эффективной системы регуляции синтеза продукта. Наиболее широко распространено конструирование продуцентов белковых продуктов, кодируемых отдельными генами, часто входящими в состав оперонов. Пример одной из простейших схем оперона приведен слева (lac-оперон). КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ • Приведенная схема показывает, что для транскрипции гена важнейшим элементом является промотор, который не является структурным элементом гена, но обеспечивает связывание РНК-полимеразы, позиционирует ее в точке начала транскрипции и тем самым обеспечивает правильное прочтение последовательности ДНК, кодирующей ген интересующего нас белка. • При этом прочность связывания РНК-полимеразы с промотором определяет эффективность транскрипции. Эту прочность часто называют «силой промотора». • Активность промотора также подвержена регуляции. В частности, в состав оперона входит оператор, который находится ближе к точке начала транскрипции, чем промотор, и может быть включен или выключен. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ • При конструировании продуцентов всегда стремятся создать штамм с максимальной продукцией целевого белка – «суперпродуцент». • Для решения такой задачи подбирают промотор с наибольшим сродством к РНК-полимеразе, наиболее «сильный». • Описаны конструкции, обеспечивающие синтез целевого белка до 40% от суммарного белка клетки. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ • Суперпродуценты синтезируют большие количества целевых белков, которые являются чужеродными для клетки. Этот синтез отвлекает значительные энергетические ресурсы клетки и усложняет ее жизнь. • Клетка пытается найти пути преодоления этих трудностей. • Таких путей клетка обнаружила два: 1. Выброс чужеродного материала из клетки наружу (за счет механизмов секреции); 2. Складирование чужеродных белков внутри клетки, так, чтобы своими функциями эти белки не мешали обычным метаболическим процессам. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ Секреция белков изобретена природой для выброса наружу ферментов для подготовки питательных компонентов, не способных проникать в клетку. Гены секретируемых белков содержат специальные сигнальные пептиды обычно на N-конце, которые специальными ферментами отщепляются в процессе секреции, так что из клетки выходит нормальный белок, синтезируемый в виде «пре-белка». КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ Схема встраивания сигнального пептида в цитоплазматическую мембрану и его отщепления сигнальной пептидазой I. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ Электронная фотография клеток E. coli, содержащих цитозольные тела включения (показаны стрелками) Тела включения состоят из белков, находящихся в денатурированном состоянии Тела включения могут быть выделены из клетки и подвергнуты процедурам ренатурации с целью восстановления их функции. Время, мин Среда а. Среда б. 0 0,05 0,05 30 0,067 0,05 В параллельных экспериментах получены результаты по кинетике накопления биомассы на средах с разными источниками углерода: 60 0,092 0,05 А. глюкоза (0,2% w/v), 90 0,12 0,058 120 0,17 0,08 150 0,22 0,11 180 0,32 0,15 210 0,41 0,22 Разбавление D420 Разбавление D420 240 2 0,29 0,27 270 2 0,37 0,36 300 2 0,43 0,40 330 2 0,43 0,42 360 0,43 390 2 0,25 420 2 0,35 450 2 0,42 480 2 0,42 Б. смесь глюкозы (0,1% w/v), и лактозы (0,1% w/v) По ходу роста культур в определенные моменты времени измеряли оптическую плотность при 420 нм, которая линейно зависит от концентрации клеток вплоть до величины 0,5 и при величине 0,167 соответ-ствует содержанию 0,1 г сухой массы бактерий в 1 мл культуры. Построить и объяснить кривые роста
