Структурно-функциональная организация ферментов Леонор Михаэлис Мауде Леонора Ментен Берлин, 1912 г. Структурно-функциональная организация ферментов Задача • Получить уравнение для скорости ферментативной реакции, исходя из известных, доступных наблюдению параметров Структурно-функциональная организация ферментов Начальная скорость Структурно-функциональная организация ферментов Уравнение Михаэлиса-Ментен В чем его смысл? — Позволяет получить формальные характеристики скорости ферментативной реакции вида ES • • • k1 k-1 ES k2 k-2 EP Уравнение реакции превращения субстрата (S) в продукт (P), катализируемой ферментом (E); Уравнение Михаэлиса-Ментен описывает зависимость скорости реакции от концентрации субстрата и, в частности, демонстриует явление насыщения. Условия, при которых работает уравнение Михаэлиса-Ментен: 1) 2) 3) Стационарная фаза реакции, т.е. [ES]=const, d[ES]/dt=0; Измеряется начальная скорость; [S] [S0] [E] = [E0] – [ES] Структурно-функциональная организация ферментов Формальная ферментативная кинетика • Скорость мономолекулярной реакции прямо пропорциональна концентрации вещества [A] AP v v d [ A] k[ A] dt [A] • Если ту же реакцию катализирует фермент, при определенной концентрации наблюдается насыщение. ент A Ферм P v [A] Структурно-функциональная организация ферментов Условие стационара ES k1 k2 ES k-1 k-2 EP • При стационарной фазе реакции концентрация фермент-субстратного комплекса, [ES], не меняется d [ ES ] dt 0 • Престационарная фаза, при которой происходит накопление [ES] обычно очень короткая • Уравнение Михаэлиса-Ментен описывает скорость ферментаивной реакции только в стационарной фазе Структурно-функциональная организация ферментов Измеряется начальная скорость k1 ES k-1 k2 ES k-2 EP • В начале реакции концентрация продукта, [P] очень мала. Так что количеством [ES], полученного из обратной реакции E+P, можно пренебречь. • Иными словами, реакция ES -> E+P необратима • Субстрат только начал расходоваться, [S] [S0]. • В этом случае уравнение приобретает вид: ES k1 K-1 ES k2 EP Структурно-функциональная организация ферментов Скорость реакции пропорциональна концентрациям реагентов ES k1 k-1 ES k2 EP • Пригодилось наследие неферментативной кинетики: • Скорость накопления фермент-субстратного комплекса, vf : v f k1 E S • Скорость обратной реакции (исчезновения ES) vd : vd k 1 ES k 2 ES (k 1 k 2 )ES • В стационарной фазе [ES] не меняется: k1E S (k1 k2 )ES v f vd Структурно-функциональная организация ферментов Вывод уравнения Михаэлиса-Ментен • Мы не можем узнать текущую концентрацию фермента, но знаем начальную [Eo], которая равна сумме концентраций комплекса [ES] и текущей концентрации свободного фермента, [E]: Et ES E v f k1 E S k1 (Et ES )S • В стационарной фазе скорость концентрация [ES] постоянна: k1 (Et ES )S (k 1 k 2 )ES k1 Et k1 ES S (k 1 k 2 )ES Et S k1 Et S ES (k1 S (k 1 k 2 )) S (k 1 k 2 ) k1 Et S k1 ES S (k 1 k 2 )ES k1 Et S ES (k1 S (k 1 k 2 )) K m ( k 1 k 2 ) k1 ES k1 • Скорость образования продукта v = k2[ES] : v k 2 Et S S K m Et S S K m Структурно-функциональная организация ферментов Некоторые следствия уравнения ММ • Скорость образования продукта обычно можно наблюдать экспериментально. • Максимальная скорость достигается при полном насыщении субстратом, когда [S] ∞ v[ S ] k E 2 K t k 2 Et v max 1 m [S ] Переписываем уравнением ММ в виде: Скорость реакции уже не меняется v v max S S K m Структурно-функциональная организация ферментов Смысл Km • Km выводится из констант скоростей Km k 1 k 2 k1 • Km в условиях Михаэлиса-Ментен определяет скорость распада фермент-субстратного комплекса k1 k1[ E]S k 1[ ES ] при равновесии, ES ES k-1 Kd [ E ]S k 1 [ ES ] k1 Константа диссоциации Маленькая Km означает сильное связывание; высокая Km означает слабое связывание. • Km равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной v=1/2vmax Структурно-функциональная организация ферментов Смысл vmax • Vmax в реальности недостижима, поскольку требуется, чтобы все молекулы фермента были заняты субстратом (а как же химическое равновесие?) ES k1 k-1 ES k cat vmax [ E0 ] • Число оборотов, kcat, — Равно числу молекул субстрата, превращаемых в продукт одной молекулой фермента в единицу времени при условии насыщения фермента субстратом, [S]>>[Et], vmax k2 [ E0 ] kcat Структурно-функциональная организация ферментов Vmax (число оборотов) некоторых ферментов Фермент Скорость (c-1) Каталаза 40 000 000 Ацетилхолинэстераза Лактат-дегидрогеназа Химотрипсин ДНК-полимераза I Лизоцим 14 000 1 000 100 15 0,5 Структурно-функциональная организация ферментов Порядок уравнения ММ • Когда концентрация субстрата мала, уравнение ММ — уравнение первого порядка по [S] v kcat [ E0 ][ S ] kcat [ E0 ][S] [S ] K m Km • При той же низкой концентрации субстрата, [Et][E], уравнение ММ — второго порядка по [E] и [S], kcat/Km называют кажущейся константой второго порядка: k [ E ][S] k [ E ][S] v cat t Km cat Km • Когда концентрация субстрата велика, уравнение ММ — уравнение нулевого порядка по [S]: v vmax [ Et ][ S ] vmax [ Et ] [S ] K m Структурно-функциональная организация ферментов КПД ферментативного катализа, kcat/Km • kcat/Km говорит о том, насколько «хорошо работает» фермент v kcat [ E0 ][S] kcat [ E ][S] Km Km • Верхний предел kcat/Km лимитируется скоростью диффузии E и S k cat k k 2 k1 2 k1 K m K m k 1 k 2 Структурно-функциональная организация ферментов Графическое представление уравнения ММ • v v max [ S ] [S ] K m можно изобразить так v vmax Km • но это непрактично [S] Структурно-функциональная организация ферментов Линеаризация по Лайнуиверу и Берку (Lineweaver-Burk) • Уравнение ММ приобретает вид y=kx+b для обратных координат: v vmax [ S ] K 1 [S ] K m 1 1 m [S ] K m v vmax [ S ] vmax vmax [S ] 1/v Угловой к-т=Km/vmax -1/Km 1/vmax 1/[S] •График в двойных обратных координатах Структурно-функциональная организация ферментов Картинка из жизни Структурно-функциональная организация ферментов Картинка из хорошей жизни Структурно-функциональная организация ферментов Линеаризация по Эди-Хофсти (Eadie-Hofstee) v vmax [ S ] K v v[ S ] K m vmax [ S ] v[ S ] vmax [ S ] K m v v vmax m [S ] K m [S ] v vmax Угловой к-т=-Km v/[S] Структурно-функциональная организация ферментов Линеаризация по Хейнсу-Вольфу (Hanes-Wolff), они же Диксон и Уэбб v vmax [S ] [S ] [S ] K m [S ] K m [S ] K m v vmax vmax vmax [S]/v -Km Угловой к-т=1/vmax Km/vmax •Hanes-Wolff Plot [S] Структурно-функциональная организация ферментов Ингибирование ферментов • Ингибиторы — связываются с ферментами и уменьшают их активность. • Бывают обратимыми и необратимыми; • Обратимые ингибиторы связываются с ферментами посредством невалентных взаимодействий. Различают два вида обратимых ингибиторов – Конкурентные ингибиторы; – Неконкурентные ингибиторы; • Необратимые ингибиторы ковалентно связываются с ферментами, уменьшая концентрацию активных ферментов. Структурно-функциональная организация ферментов Обратимые ингибиторы субстрат неконкурентный ингибитор конкурентный ингибитор Структурно-функциональная организация ферментов Влияние ингибиторов на уравнение ММ k 2 Et S v S K m Структурно-функциональная организация ферментов Конкурентные обратимые ингибиторы связывание только с E ES I k3 k1 k-1 v k-3 EI ES k2 v max [ S ] [I ] [ S ] K m (1 ) KI v EP Km повышается vmax не меняется +ингибитор 1/v vmax Угл. к-т=Km/vmax Угл. к-т= Km(1+[I]/KI)/vmax Km Km(1+[I]/KI) [S] -1/Km 1/vmax -1/(Km(1+[I]/KI)) 1/[S] Структурно-функциональная организация ферментов Неконкурентные обратимые ингибиторы Связывание с E и ES ES k1 k-1 ES I I KI’ KI EI S EIS k2 v EP [S ] [S ] K m v max [I ] (1 ) KI Km не меняется vmax уменьшается v +ингибитор 1/v vmax (1+[I]/KI)/Vmax Vmax/(1+[I]/KI) Km Km [S] -1/Km Угл. к-т =Km/vmax Угл. к-т= Km(1+[I]/KI)/vmax 1/vmax 1/[S] Структурно-функциональная организация ферментов Бесконкурентные обратимые ингибиторы Связывание только с ES k1 ES • k-1 Km уменьшается vmax уменьшается Km /vmax не изм ES I KI’ k2 v EIS EP v max [S ] Km K (1 I ) [S ] K [I ] (1 I ) [I ] +inhibitor v 1/v vmax (1+ KI/[I])/Vmax Vmax/(1+KI/[I]) Km/(1+ KI/[I]) Km [S] -1/Km - (1+ KI/[I])/Km Slope=Km/vmax Угл. к-т = Km/vmax 1/vmax 1/[S] Структурно-функциональная организация ферментов Смешанный тип ингибирования +ингибитор 1/v Угл. к-т =Km/vmax -1/Km 1/vmax 1/[S] +ингибитор 1/v Угл. к-т=Km/vmax -1/Km 1/vmax 1/[S]