Влияние полиморфизма С-262Т гена каталазы на устойчивость нормальных и

Влияние полиморфизма С-262Т гена
каталазы на устойчивость нормальных и
опухолевых клеток к окислительному
стрессу
Комина Анна Владимировна
специальность 03.03.04
«клеточная биология, цитология, гистология»
Красноярск, 2014
Актуальность проблемы
• Наличие однонуклеотидных полиморфизмов может отражаться на
особенностях протекания процессов в клетках организма.
• Полиморфизмы в генах ферментов антиоксидантной защиты
приводят к изменениям в работе антиоксидантной системы.
• Окислительный стресс является причиной большого количества
заболеваний (атеросклероз, заболевания почек, гипертензии, нейродегенеративные расстройства и др.).
• Полиморфизм С-262Т в промоторной части гена каталазы приводит к
повышенному риску развития бронхиальной астмы, рака молочной
железы и др.
• Пероксид водорода, утилизируемый каталазой, участвует в регуляции
клеточной пролиферации и апоптоза.
• Понимание молекулярно-генетических особенностей клетки позволит
открыть возможности персонифицированной медицины.
Цель работы - определить характер распределения
полиморфизма С-262Т в промоторной части
гена каталазы в популяции жителей
Красноярского края и оценить влияние
полиморфизма С-262Т на устойчивость
нормальных и опухолевых клеток к
окислительному стрессу.
Задачи
1.
Используя
метод
молекулярно-генетического
анализа,
исследовать
распределение полиморфизма С-262Т в промоторной части гена каталазы в
популяции жителей Красноярского края и среди пациентов с меланомой и
плоскоклеточным раком кожи;
2.
Измерить активность каталазы в физиологическом состоянии в эритроцитах
у лиц с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы,
используя метод спектрофотометрии;
3.
Оценить изменение активности каталазы в мононуклеарных лейкоцитах и
клетках меланомы в условиях окислительного стресса, индуцированного
пероксидом
водорода
спектрофотометрии;
в
различных
концентрациях,
методом
Задачи
4.
Оценить выраженность апоптоза мононуклеарных лейкоцитов и
клеток
меланомы
в
условиях
окислительного
стресса,
индуцированного пероксидом водорода в диапазоне концентраций
400 – 1000 мкмоль/л;
5.
Определить уровень TSPO под воздействием окислительного
стресса, индуцированного пероксидом водорода в концентрациях
400 – 1000 мкмоль/л в зависимости от генотипа по каталазе.
Объекты и методы исследования
• Объекты
исследования:
эритроциты
и
мононуклеарные
лейкоциты
здоровых
добровольцев (n = 103), клеточная культура
меланомы линии Bro, биоптаты меланомы (n =
50) и плоскоклеточного рака (n = 50).
• Методы
исследования:
клеточное
культивирование,
выделение
нуклеиновых
кислот, ПДРФ-анализ, ПЦР в реальном времени,
спектрофотометрическое
определение
активности
каталазы,
флуоресцентная
микроскопия.
Полученные результаты
1. Распределение частот аллелей
полиморфизма С-262Т гена каталазы в
популяции жителей Красноярского края
составляет 82% для дикого аллеля С и 18%
для мутантного аллеля Т, что соответствует
популяционным показателям европейских
стран
Рис. 1. Частота генотипов и аллелей полиморфизма С-262Т гена каталазы
в лейкоцитах жителей Красноярского края,
клетках меланомы и плоскоклеточного рака кожи
ПКР
CT
0,1
CC
0,9
Полученные результаты
2. У лиц с вариантом полиморфизма гена
каталазы -262СС повышен риск развития
меланомы кожи в 45,5 раз и
плоскоклеточного ракам кожи в 4,2 раза
по сравнению с лицами, обладающими
вариантами полиморфизма -262СТ и 262ТТ
Генотип каталазы в клетках меланомы линии
Bro – -262СС
Рис. 2. Электрофорез ДНК-фрагментов гена каталазы в клетках меланомы
линии BRO после рестрикции эндонуклеазой EcoR V. 100bp — маркерная
ДНК 100bp Ladder ; CT — образец с вариантом генотипа СТ; CC — образец с
вариантом полиморфизма СС; Bro — образец ДНК меланомы клеточной
линии Bro.
Полученные результаты
3. Активность каталазы в эритроцитах лиц с
вариантами полиморфизма гена каталазы
-262СТ и -262ТТ достоверно ниже, чем у
носителей дикого варианта -262СС.
Активность каталазы,
ммоль/мин·г белка
0.9
*
*
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
СС
СТ
ТТ
варианты генотипов
Рис. 3. Активность каталазы в эритроцитах людей с различными
вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы. Звездочками отмечены
достоверные различающиеся данные по критерию Крускала-Уоллиса при
p < 0,05.
Относительная активность
каталазы, отн. ед.
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0
200
вариант СС
400
600
[H2O2], мкмоль/л
вариант СТ
800
1000
вариант ТТ
Рис. 4. Зависимость активности каталазы в мононуклеарных лейкоцитах от
концентрации пероксида водорода в культуральной среде.
Значение активности каталазы в культуре без пероксида водорода принято за
единицу
Полученные результаты
4. В состоянии окислительного стресса,
индуцированного пероксидом водорода, в
мононуклеарных лейкоцитах с
различными вариантами полиморфизма
С-262Т гена каталазы не происходит
значимого изменения активности данного
фермента относительно физиологического
значения независимо от концентрации
пероксида водорода.
Рис. 5. Зависимость активности каталазы в клетках меланомы клеточной линиии
Bro от концентрации пероксида водорода в культуральной среде. Значение
активности каталазы в культуре без пероксида водорода принято за единицу
Полученные результаты
5. Мононуклеарные лейкоциты с генотипом
ТТ в положении -262 промоторной части
гена каталазы обладают меньшей
устойчивостью к окислительному стрессу,
индуцированному пероксидом водорода,
чем мононуклеарные лейкоциты с
генотипами СС и СТ.
А
Б
В
Г
НК
Рис. 6. Мононуклеарные лейкоциты при окраске акридиновым
оранжевым/бромистым этидием. А – живые клетки; Б – клетки в состоянии
раннего апоптоза; В – клетки на более поздних этапах апоптоза; Г –
некротическая клетка (НК).
СС
*
80
60
40
20
*
*
80
60
40
20
0
0
0
400
700
[H2O2], мкмоль/л
ТТ
1000
*
100
Доля клеток, %
*
100
*
Доля клеток, %
100
Доля клеток, %
СТ
*
*
80
60
40
20
0
0
400
700
[H2O2], мкмоль/л
живые клетки
апоптоз
1000
некроз
0
400
700
[H2O2], мкмоль/л
1000
Рис. 7. Сравнительное распределение
долей живых, апоптотических и
некротических клеток в культурах
мононуклеарных лейкоцитов с
различными вариантами
полиморфизма С-262Т в гене каталазы
в зависимости от концентрации
пероксида водорода в культуре.
Звездочкой обозначены достоверные
различия при p < 0,05
А
Б
В
Рис. 8. Меланомные клетки линии Bro при окраске акридиновым
оранжевым/бромистым этидием. А — живая клетка; Б — клетка в
состоянии апоптоза; В — некротическая клетка.
*
Доля клеток, %
120
*
100
80
60
40
20
0
0
400
700
1000
[H2O2], мкмоль/л
живые клетки
апоптоз
некроз
Рис. 9. Сравнительное распределение долей живых, апоптотических и
некротических клеток в культуре меланомы Bro в зависимости от концентрации
пероксида водорода в культуре.
Звездочкой обозначены достоверные различия при p < 0,05.
Полученные результаты
6. Меланома клеточной линии Bro не
содержит мутаций в положении -262 в
промоторной части гена каталазы и
обладает чувствительностью к
окислительному стрессу,
индуцированному пероксидом водорода:
при концентрации пероксида водорода
1000 мкмоль/л доля жизнеспособных
клеток достоверно снижается.
Полученные результаты
7. Экспрессия гена TSPO в мононуклеарных
лейкоцитах в условиях окислительного
стресса, индуцированного пероксидом
водорода, не коррелирует с
концентрацией пероксида водорода.
8
7
RQ, отн. ед
6
1,4
2,5
5
4
3
2
1,2,3
5
1
4
3
0
0
200
400
600
[H2O2], мкмоль/л
СТ1
СТ2
800
1000
СТ3
Рис. 10. Относительное количество мРНК TSPO к β-актину (RQ) в трёх образцах
мононуклеарных лейкоцитов с полиморфизмом -262СТ в гене каталазы в
зависимости от концентрации пероксида водорода в культуре. Цифрами 1–5
отмечены значения, имеющие достоверные различия при p < 0,05.
Рис. 11. Относительное количество мРНК TSPO к β-актину (RQ) в культурах
мононуклеарных лейкоцитов с различными вариантами полиморфизма С-262Т в
гене каталазы в зависимости от концентрации пероксида водорода в культуре.
Выводы
1.
2.
3.
4.
5.
Распределение полиморфизма С-262Т гена каталазы в популяции жителей
Красноярского края составляет 82% для дикого аллеля С и 18% для
мутантного аллеля Т, соответствует распределению Харди-Вайнберга, что
свидетельствует о генетической устойчивости популяции, совпадает с
распределением данного полиморфизма в популяциях стран европеоидной
расы.
У индивидов, обладающих диким вариантом полиморфизма гена каталазы 262СС, повышен риск развития меланомы в 45,5 раз и риск развития
плоскоклеточного рака в 4,2 раза по сравнению с лицами, содержащими в
генотипе мутацию С-262Т в одном или двух аллелях.
Активность каталазы в лейкоцитах людей с различными вариантами
полиморфизма С-262Т гена каталазы в состоянии окислительного стресса
достоверно не изменяется, однако при оценке активности в эритроцитах в
физиологическом состоянии, активность каталазы в клетках с генотипом 262СС) оказывается достоверно выше таковой для клеток с гомо- и
геретозиготной мутацией (-262ТТ и -262СТ).
Мононуклеарные лейкоциты, содержащие мутацию С-262Т в обоих аллелях
гена, обладают меньшей устойчивостью к окислительному стрессу,
индуцированному пероксидом водорода, чем аналогичные клетки с диким
и гетерозиготным вариантами полиморфизма.
Уровень TSPO в мононуклеарных лейкоцитах не связан с действием и
концентрацией пероксида водорода.
Спасибо за внимание