04. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА САХАРНОГО ДИАБЕТА

ЛАБОРАТОРНАЯ
ДИАГНОСТИКА
САХАРНОГО ДИАБЕТА
1
Концентрация глюкозы в крови
здорового взрослого человека
составляет 3,33—5,55 ммоль/л;
содержание глюкозы в плазме
несколько выше (3,88—6,10 ммоль/л)
2
Из других углеводов, содержащихся в
крови, можно отметить:
· фруктозу — 5,55 — 10,00 мкмоль/л;
· пентозы — 0,12 — 0,22 ммоль/л;
· гликоген — 16,2 — 31,7 мг/л;
· другие полисахариды — около 1,8 мг/л;
3
Уровень
глюкозы
у лиц до 50
лет
Старше 50
лет
в цельной
венозной крови
3,5 - 5.7
ммоль/л
4,4 - 6,2
ммоль/л
в плазме или
сыворотке
3,8 - 6,1
ммоль/л
4,7 - 6,5
ммоль/л
• ** у детей до 5 лет - ниже на 0,3 -0,5 ммоль/л
• * в артериальной крови - выше на 0,1 - 0,2
ммоль/л
4
Молочная кислота (лактат)
— конечный продукт тканевого
обмена глюкозы при нехватке
кислорода.
Нормальная концентрация лактата в
крови - 0,5 - 2,2 ммоль/л.
5
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ГЛЮКОЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ
ЖИДКОСТЯХ
Методы определения глюкозы в крови
условно разделяются на несколько
групп
6
Схема реакций метода
Хагедорна-Иенсена:
белки крови + ZnSO4 ---> дена-турация и
осаждение глюкоза + К3[Fe(CN)6] --->
глюконовая кислота +К4[Fe(CN)6]
К3[Fe(CN)6] (избыток) + KI ---> I2+К4[Fe(CN)6]
I2 + крахмал ---> синяя окраска
I2 + Na2S2O3 (титрование) ---> Na2S4O6 + NaI
(синяя окраска исчезает)
7
метод Хагедорна-Иенсена
Достоинства
Недостатки
Хорошая
воспроизводи-мость
Необходимостьпредварительной депротеинизации и
фильтрации
Не требуется ФЭК
Сложность, многоэтапность и длительность анализа
Завышение результатов на 10-40% из-за влияния
редуцирующих веществ ("кажущееся количество
сахара"). Разница с другими методами - 0,8-1,6
ммоль/л.
8
Схема реакций орто-толуидинового
метода:
Белки крови + ТХУ ---> денатурация и осаждение
глюкоза (Н+, нагрев) -----> оксиметилфурфурол
оксиметилфурфурол + о-толуидин ------>
сине-зеленая окраска
9
орто-толуидиновый
метод
Достоинства
Недостатки
Относительная
простота анализа
Необходимость предварительной
депротеинизации и центрифугирования
Доступность реагентов
Необходимость кипячения в водяной бане точно
8 мин.
Аллергенность и канцерогенность о-толуидина,
его невысокая стабильность из-за окисления
10
Схема реакций
глюкозооксидазного метода:
глюкозооксидаза глюкоза + О2 ----->
глюконовая кислота + Н2О2 перо-ксидаза
Н2О2+ хромоген --------------> Н2О +
окисленный окрашенный хромоген
11
глюкозооксидазный метод
Достоинства
Недостатки
Специфичность,
отсутствие влияния
антикоагулянтов
Снижение активности ферментов при хранении
(нужна периодическая калибровка)
Простота анализа
(конечная точка,
монореагент)
Возможность некоторого занижения результатов из-за
неспецифичности пероксидазы (окисление всех
редуцирующих веществ)
Доступность и
невысокая стоимость
реактивов
Необходимость предварительной депротеинизации
(при анализе цельной крови)
12
Схема реакций гексокиназного
метода:
Гексокиназа
Глюкоза + АТФ ------------> глюкозо-6-фосфат +
АДФ
гл-6-Ф-ДГ глюкозо-6-Ф + НАДФ --------->
6-фосфоглюконат + НАДФ*Н ( Е340)
13
гексокиназный метод
Достоинства
Недостатки
Наивысшая точность
(референтный метод)
Работа только на анализаторах или фотометрах с
УФ-диапазоном (340 нм) кинетическим методом
Простота анализа
(монореагент) и его
специфичность,
Отсутствие посторонних
влияний
Необходимость предварительной
депротеинизации и центрифугирования (при
анализе цельной крови)
14
экспресс-определения глюкозы крови на
тест-полосках (МЕЛЛИФАН и др.)
Достоинства
Недостатки
Возможность примене-ния в
домашних или иных условиях
(при отсутствии ФЭКа)
Влияние техники нанесения пробы на результат (объем и
локализация капли крови, необходимость ее удаления)
Быстрота и простота анализа
Неточность (субъективизм) определения при
визуальном анализе
Возможность объекти-визации
данных (при использовании отражательных глюко-метров типа ONE
TOUCH, BETACHECK и др.)
Требуется повторное определение методами
"мокрой" химии:
при снижении уровня глюкозы <2,8 ммоль/л
или повышении >25 ммоль/л;
при значительных сдвигах гематокрита (<25%
или >55%) и гиперосмолярности.
15
метод с использованием
иммобилизированных ферментов на
мембранах
(анализаторы BIOSEN, ESAT, Эксан и др.)
Достоинства
Быстрота, простота и дешевизна анализа (не требуется дополнительных
реагентов)
Широкий диапазон
определения (1 - 50 ммоль/л)
Недостатки
Некоторый дрейф показаний при "старении«
мембраны (нужна периодическая калибровка).
Ресурс мембраны - от 200 до 4000 анализов.
Чувствительность к смене буферного раствора
16
Принцип действия мембранного измерительного электрода с
иммобилизированным ферментом (глюкозооксидазой)
17
Источники вариабельности данных при
определении концентрации глюкозы в
крови:
-метод анализа;
-тип анализируемой пробы (цельная кровь, плазма или сыворотка);
-источник пробы (артериальная, венозная или капиллярная кровь);
-время взятия пробы;
-добавки;
-гликолиз;
-значения гематокрита;
-вещества, мешающие проведению анализа;
-квалификация исполнителя.
18
Важность учета значений
гематокрита
Нормальные значения гематокрита
для различных групп больных:
-Мужчины 41% - 53%
-Женщины 36% - 46%
-Новорожденные45% - 67%
-Дети 34% - 40%
-Больные на гемодиализе 20% - 35%
19
Соотношение концентрации
воды и, следовательно,
концентрации глюкозы в плазме
и в цельной крови составляет
0.93/0.84, или 1.11.
Концентрация глюкозы в цельной
крови может "корректироваться в
соответствии с гематокритом" до
значения, наблюдаемого при
стандартном гематокрите 0.43 с
помощью формулы 0.84/(0.93 -
0.22 х Hct).
Вещества, мешающие
проведению анализа
-мочевая кислота или глутатион
-лекарственные средства
-повышенный уровень билирубина
-аскорбиноваяй кислота
- другие окислители и восстановители
22
При определении глюкозы
ошибка анализа не должна
превышать 5%.
23
Оценка гликемии при
диагностике сахарного
диабета:
актуальные проблемы и пути
их решения
24
Интерпретация результатов стандартного теста
толерантности к глюкозе
Этапы теста
Натощак
Через 2 ч после
нагрузки глюкозой
Тип плазмы
крови
Клинические уровни гипергликемии
(концентрация глюкозы указана в ммоль/л)
Нарушенная
гликемия
(натощак)
Нарушенная
толерантность к
глюкозе
Сахарный
диабет
Венозная
6,1–7,0
<7,0<7,0
≥7,0≥7,0
Капиллярная
6,1–7,0
<7,0<7,0
≥7,0≥7,0
Венозная
<7,8
7,8–11,1
≥11,1
Капиллярная
<8,9
8,9–12,2
≥12,2
Неводная фаза цельной
крови(16%) :
-белки и липидно-белковые
комплексы плазмы - (4%)
-форменными элементами (12%).
26
Концентрация воды:
в цельной крови - 84%;
в плазме - 93%.
27
Соотношение концентрации
воды и, следовательно,
концентрации глюкозы в плазме
и в цельной крови составляет
0.93/0.84, или 1.11.
28
Активность и молярность
Концентрация массы воды
(кг/литр)
-в цитоплазме эритроцитов 0.71,
-в цельной крови - 0.84,
-плазме - 0.93,
-в водном калибраторе - 0.99.
29
соотношение результатов:
для цельной крови - 1.18
(=0.99/0.84),
для плазмы -1.06 (= 0.99/0.93)
30
Пример:
Образец крови с гематокритом (Hct) равным 0.43.
Концентрация воды в эритроцитах = 0.71кг/литр.
Концентрация воды в плазме = 0.93 кг/литр.
Концентрация воды (кг Н2О/литр) в образце крови =
(0.43)(0.71) + (1 - 0.43)(0.93) = 0.84.
Соотношение концентрации в плазме и в цельной
крови = 0.93/0.84, или 1.11.
31
Пересчет концентрации глюкозы
в цельной крови в эквивалентную
концентрацию в плазме с учетом
гематокрита:
0.84/(0.93 - 0.22 х Hct).
32
Рекомендации ВОЗ
основанные на мнении
экспертов Международной
Федерации по Клинической
Химии и Лабораторной
Медицине
33
1. необходимо
использовать только
данные об уровне
глюкозы в плазме крови.
34
2. Определение концентрации
глюкозы в плазме следует проводить
только в условиях забора крови в
контейнер-пробирку с ингибитором
гликолиза и антикоагулянтом.
Хранение контейнера-пробирки с кровью во
льду до момента отделения плазмы, но не
более чем 30 мин от момента забора крови.
35
3. При анализе цельной капиллярной
крови (без разведения) концентрацию
глюкозы определять на приборах,
имеющих отделение форменных
элементов (Reflotron) или встроенное
преобразование результата измерения в
уровень глюкозы плазмы крови
(индивидуальные глюкометры).
36
4. Соотношение концентрации
глюкозы в плазме и в цельной
крови составляет 0.93/0.84, или
1.11.
37
5. В бланках необходимо отражать
вид образца крови, в котором
производилось измерение уровня
глюкозы (уровень глюкозы
плазмы капиллярной крови
или уровень глюкозы плазмы
венозной крови).
38
Этапы теста
Натощак
Через 2 ч после
нагрузки
глюкозой
Тип плазмы
крови
Клинические уровни гипергликемии
(концентрация глюкозы указана в ммоль/л)
Нарушенная
гликемия
(натощак)
Нарушенная
толерантность к
глюкозе
Сахарный
диабет
Венозная
6,1–7,0
<7,0<7,0
≥7,0≥7,0
Капиллярная
6,1–7,0
<7,0<7,0
≥7,0≥7,0
Венозная
<7,8
7,8–11,1
≥11,1
Капиллярная
<8,9
8,9–12,2
≥12,2
39
6. не допускается
использование сыворотки крови,
вследствие неконтролируемого
снижения концентрации глюкозы
в процессе образования сгустка
и последующего ее хранения.
40
Анализатор глюкозы и лактата АГКМ-01
41
Отличительные особенности:
Измерения в сыворотке, плазме, цельной крови
Возможность измерения глюкозы, лактата, глюкозы и лактата
Простота управления
Высокая производительность
Точность
Низкая стоимость исследования
Встроенные программы контроля качества, диагностики,
энергонезависимая память и многое другое
Комплектуется биосенсорами ведущих европейских
производителей
Режим "Standby«(обеспечивает постоянную готовность к
работе и исключает отказы прибора в результате
долговременного простоя)
42
Медицинский биохимический
анализатор МБА 540
Анализатор МБА-540 является
современным отечественным
программируемым
фотометром,
предназначенным для
определения биохимических
веществ крови, позволяет
выполнять измерения
оптической плотности и
концентраций на длине волны
540 нм
43
Преимущества теста на HbA1c
Gl плазмы
натощак
HbA1c
Преаналитический этап
о
-стабильность при 37
С
+
-
-стабильность по
времени
+
-
- в любое время
- утром
- не зависит от приема
пищи
- натощак (8 ч)
-
+
Забор пробы
Зависимость результата
от нагрузок пациента
перед анализом,
стресса и проч.
ОГТТ: в ряде исследований было показано, что при скрининге
воспроизводимость этого теста около 50% !!!
Ann Clin Biochem. 1998 Jan;35 ( Pt 1):62-7
Преимущества HbA1c
1. Более адекватный показатель уровня гликемии
2. Позволяет хорошо оценивать риск развития осложнений
3. Тест стандартизован
4. Как аналит – более стабилен
5. Низкая вариабельность
6. Нет необходимости частых измерений, проведения
измерений натощак
7. Влияние стресса на результат минимально
8. Рекомендован для использования при выборе терапии
Рекомендации
Рекомендации
международных
экспертов 1980 год
Рекомендации
международных
экспертов 1997 год
1. Глюкоза – базовый
показатель для оценки
прогрессирования
диабета
2. Диагностические
критерии:
- глюкоза натощак
> 7,8 ммоль/л
-ОГТТ
> 11,1 ммоль/л
…
Диагностические
критерии:
- глюкоза натощак
> 7,0 ммоль/л
-ОГТТ – не рекомендован
(рекомендации ВОЗ –
ОГТТ – золотой
стандарт)
Нет рекомендации по
HbA1c по причине
отсутствия
стандартизации
Рекомендации
международных
экспертов 2009 год
…
HbA1c
1. Тест стандартизован:
- 99% исследований
выполнены на
сертифицированных
по NGSP методах
2. Хорошая доступность
теста
Новые данные по
взаимосвязи между
уровнем гликемии и
риском развития
осложнений
Рекомендации NGSP:
При выборе метода исследования HbA1c отдавать
предпочтение тем методам, при использовании которых
минимизирован эффект интерференции с фракциями
гемоглобина:
1. При гемоглобинопатиях: HbS, HbC и др.
2. При повышенном содержании HbF и CarbHb
Стандарты Американской диабетической
ассоциации (ADA) 2010 год
Диагностика СД
1 Вариант: HbA1c ≥ 6,5%. Исследование должно проводиться в лаборатории,
использующей метод, сертифицированный и стандартизованный NGSP.
2 Вариант: гликемия натощак ≥ 7,0 ммоль/л. Отсутствие приема калорий не
менее 8 часов перед исследованием.
3 Вариант: ОГТТ – гликемия ≥ 11,1 ммоль/л.
4 Вариант: классические симптомы гипергликемии / гипергликемический криз
/ случайная гликемия >11,1 ммоль/л.
Диагноз ставится при превышении пороговых значений при выполнении любых 2-х
тестов (HbA1c, гликемия натощак или ОГТТ)
При получении 2-х взаимоисключающих результатов повторно выполняется тот
тест, по которому значение превышает пороговое для подтверждения или
опровержения диагноза СД.
Стандарты Американской диабетической
ассоциации (ADA) 2010 год
HbA1c
Низкий риск
развития СД
Высокий риск
развития СД
(предиабет)
СД
<5,8%
5,8%-6,4%
> 6,4
скрининг и диагностика СД
мониторинг развития и течения СД
Рекомендации Американской диабетической
ассоциации (ADA) 2010 год
Использование теста на HbA1c для скрининга СД
(Исследование должно проводиться в лаборатории, использующей метод,
сертифицированный и стандартизованный NGSP)
1. Всем лицам старше 45 лет. Если HbA1c < 5,7% - повторный тест через 3 года.
2
2. При избыточной массе тела (ИМТ≥25 кг/м ) в сочетании с:
-малоподвижный образ жизни
-наличие СД у родственников 1-й линии
-принадлежность к этническим группам с высоким риском развития СД
-гестационный диабет в анамнезе или весом плода при родах > 4,5 кг
-повышенное АД (от 140/90 или терапия антигипертензивными ЛС)
-ЛПВП < 0,9 ммоль/л и/или уровень триглицеридов > 2,82 ммоль/л
-поликистоз яичников
-…
Благодарим за
внимание!
51