Жидкостная хроматография и тандемная хромато-масс-спектрометрия как инструменты в идентификационных исследованиях новых сильнодействующих препаратов Родин И.А. Быстрая жидкостная хроматография Сокращение времени анализа Колонки с размером зерна неподвижной фазы 1,6 мкм - переход от сверхбыстрой хроматографии к хроматографии сверхвысокого разрешения Shim-pack VP-ODS 4.6 mmID×150 mm, 5 µm 1 N for Peak 5 = 12,918 Rt for Peak 5 = 14.79 min 2 3 4 0.0 2.5 5.0 7.5 5 10.0 Shim-pack XR-ODSⅢ 2 mmID×50 mm, 1.6 µm 12.5 15.0 min Shim-pack XR-ODSⅢ 2 mmID×200 mm, 2.2 µm 1 1 Rt for Peak 5 = 0.93 min 2 N for Peak 5 = 32,504 2 3 3 4 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 5 0.7 0.8 0.9 4 1.0 1.1 1.2 min Сокращение времени анализа в 16 раз 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min Разрешение выше в 2,5 раза TOX.I.S. II = TOXicological Identification System Диагностика острых интоксикаций Алкалоиды (псилоцин, скополамин, гиоциамин, …) Лекарства с коротким периодом полураспада в крови (морфин, кодеин, …) Наркотики (производные амфетамина, опиаты, …) TOX.I.S. II = TOXicological Identification System Photodiode Array UV Spectra Library for HPLC-DAD 2682 УФ-спектра веществ, важных для токсикологии: наркотики; лекарственные препараты, вызывающие зависимость; антиэпилептики; важнейшие классы лекарств (анальгетики, стероиды, антибиотики, антигистаминные и др.); растительные яды; пестициды, фунгициды; гербициды; ПАУ, ПХБ и др. экологические загрязнители Спектры получены в интервале 195 – 380 нм, подвижная фаза: ацетонитрил/фосфатный буфер, рН 2.3 TOX.I.S. II = TOXicological Identification System 2860 соединений Inst. Forensic Medicine, Berlin «CoSense» для анализа биологических жидкостей «CoSense»: колонка-ловушка Shim-pack MAYI-ODS Белок Лекарство Иммобилизованная метилцеллюлоза Участки ODS Основа: силикагель Внешняя поверхность: метилцеллюлоза внутренняя поверхность: октадецилсилил Размер частиц: 50 мкм Размер пор: 12 нм Габариты: 10 мм x 4,6 мм pH: 2 - 7.5 Maкс. давление: 20 MПa «CoSense»: эффективная очистка от высокомолекулярных компонентов Условия анализа: 1. Белки плазмы 2. Изопропилантипирин Точка переключения потоков А. Ввод пробы, очистка от белков Колонка - Shim-pack MAYI-ODS (10 х 4,6 мм) Подвижная фаза – 0.1% Фосфорная к-та/ Ацетонитрил= 95/5 Скорость потока - 2.0 мл/мин Фактор разбавления – 8 Детектор - SPD-20A, 280 нм Б. Разделение на аналитической колонке Колонка - Shim-pack VP-ODS (150 х 4,6 мм) Подвижная фаза – А. Вода, В. Ацетонитрил Линейный градиент - В 5% →95% Скорость потока - 1.0 мл/мин Температура – 40ОС Детектор - SPD-20A, 275 нм. «CoSense» + LCMS-2020: определение пяти препаратов в плазме крови 1. 2. 3. 4. 5. Носкапин Пропранолол Димедрол Имипрамин Верапамил Концентрация каждого препарата 0,01 мкг/мл Объем образца 50 мкл Режим SIM (регистрация отдельных ионов) Картриджи для отделения плазмы («Plasma separation cards») • Разработаны для отделения 108 эритроцитов за 3 минуты Картриджи для отделения плазмы («Plasma separation cards») Контрольное пятно [для определения достаточно ли крови нанесено на картридж] Слой фильтрации [Связывает эритроциты за счет фильтрации и адсорбции. Средняя вертикальная скорость миграции – около 1мкм/с] Распределяющий слой [Быстро распределяет цельную кровь по поверхности картриджа с одновременным добавлением буферных растворов и антикоагулянтов. Скорость распределения 150 мкм/с] Изолирующий экран [Исключает боковое затекание вдоль поверхности картриджа] Собирающий слой [Собирает аликвоту плазмы на 6,35 мм диск. Средняя скорость сбора составляет 13 нл/с. Это соответствует потоку 400 пл/мм2/с] Картриджи для отделения плазмы («Plasma separation cards») Нанести 20 – 75 мкл цельной крови и подождать 3 минуты. Дать высохнуть на воздухе, и образец готов к транспортировке, хранению и анализу Картриджи для отделения плазмы: преимущества Быстрый сбор 2,5 мкл плазмы крови. Вариация объема менее 3% (стандартные методы 20 - 71%) Плазма может храниться существенно дольше чем цельная кровь Нет мешающих компонентов для МСанализа Простые методы отбора крови «Nexera Scouting System» - разработка и оптимизация новых методов анализа До 960 комбинаций «NeХera Method Scouting» - сокращение времени разработки новых методов анализа Состав подвижной фазы ・・・ 16 Колонки ・・・ 6 Режимы градиентного элюирования ・・・ 10 Файл метода Файл серии ВСЕГО Число комбинаций 16 × 6 × 10 = 960 Задание условий вручную (UHPLC) Method Scouting System 32 часа 5 минут необходимо создать 960 файлов метода (※1 метод / 2 минуты) только один файл метода 8 часов 5 минут необходимо создать все файлы серии (※ 30 сек / 1 серия) автоматическое создание файлов серии 40 часов 10 минут «Method scouting solution» позволяет создать все файлы всего за 10 минут! Автоматическое создание файлов позволяет избежать ошибок оператора Сверхбыстрые тандемные масс-спектрометры серии LCMS80…. Соотношение сигнал-шум: 1 пг резерпина LCMS-8050 60000 Характеристики : Скорость сканирования: 15’000 а.е.м./с Переключение полярности: 15 мс Макс. число MRM переходов: 555 каналов/с • В 6 раз выше чувствительность • Скорость сканирования: 30’000 а.е.м./с • Шаг сканирования 0,1 а.е.м./с • Переключение полярности: 5 мс • Макс. число MRM переходов: 555 каналов/с LCMS-8040 10000 • В 5 раз лучше чувствительность 2000 LCMS-8030 Комбинированные режимы измерения Запас по быстродействию позволяет реализовать в ходе одного анализа получение как количественных, так и качественных результатов Режимы сканирования (полного диапазона масс, дочерних ионов или ионов предшественников) могут быть задействованы одновременно с режимом регистрации MRM UFscanning обеспечивает получение точных результатов в любом режиме анализа Порог срабатывания MRM Сканирование дочерних ионов Inten.(x100,000) 7.5 700000 600000 167.10 500000 5.0 400000 300000 2.5 200000 141.15 100000 0 1.00 1.05 1.10 1.15 1.20 1.25 1.30 1.35 1.40 1.45 min 382.00 198.55 0.0 50 100 150 200 250 300 350 m/z «Method Packages»: наборы готовых методик Контроль качества воды: 80 определяемых соединений Агрохимикаты: 167 определяемых соединений Ветеринария: 42 лекарственных средства Наркология и судебная медицина: 386 наркотических и токсичных соединений Токсикологический скрининг: 106 токсичных соединений Метаболомика: 55 первичных метаболитов Липидомика: 130 медиаторов липидов ПО для LCMS неонатального скрининга Лекарственный мониторинг 2] Определение опиатов, амфетаминов и кокаина в цельной крови, плазме крови и моче при помощи УВЭЖХ-МС/МС и пробоподготовки QuEChERS Лекарственный мониторинг A Хроматограмма полученная при вводе 5 мкл экстракта цельной крови с добавкой 200 мкг/л B Хроматограмма полученная при вводе 5 мкл экстракта цельной крови с добавкой 200 мкг/л Порядок выхода - A: norephedrine и norpseudoephedrine / B: ephedrine и pseudoephedrine Drugs of Abuse Method Package Готовый к использованию метод, включающий: Условия ВЭЖХ Параметры MRM Параметры сканирования дочерних ионов Библиотку масс-спектров # Category No. Remarks 1 Hypnotics 70 2 Illicit drugs 305 Narcotics and stimulants 3 Psychotropic 105 4 Top 100 Digests 100 30: illicit drugs, 18: psychotropic, 37: hypnotics and 15: others 68 benzodiazepines and 2 other hypnotics (zopiclone and zolpidem) and its metabolites Rapid Tox Screening Package Новое решение для быстрого скрининга 1.Панель целевых соединений: серийный анализ для определения 106 целевых соединений DOA 16 Hypnotics 35 Psychotropics 23 Pharma -ceuticals Pesti -cides Natural toxin 26 4 2 2. Полуколичественный анализ; нет необходимости использовать аутентичные стандарты Калибровочные кривые хранятся в метод-файле 3. Включает описание процедуры пробоподготовки на основе техники QuEChERs Апробированная процедура подготовки образцов для определения всего спектра целевых соединений 4. Автоматизация процесса анализа при помощи Quan Solution Все процедуры, начиная с регистрации образцов и заканчивая печатью отчета, автоматизированы 5. Библиотека содержит масс-спектры 106 целевых соединений Rapid Tox Screening Package MP включает процедуру пробоподготовки основанную на технологии QuEChERS и оптимизированную для использования в судебной медицине и токсикологии Вода 0,5 мл ACN 1,5 мл Диазепан-d5 (IS) 100 нг Гранулы из нержавеющей стали Отбор супернатанта Добавление 100 мкл 0,1% TFA ↓ Сушка ↓ Растворение в 200 мкл MeOH ↓ ЖХ-MС/MС анализ Q-sep QuEChERS соль Образец (MgSO4,NaOAc) [Встряхивание] →[Центрифугирование] 0,5 мл Rapid Tox Screening Package Ввод Кровь, плазма, моча QuEChERS Сбор данных Inten.(x100,000) (x100,000) Zolpidem 6.0 Регистрация массспектров 5.0 4.0 CH3 2.0 1.0 H3C N O 3.0 200 1.0 0.0 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Хроматограмма (MRM) 5.5 min CH3 N CH3 263 308 221 0.0 2.0 235 N 250 300 m/z MС/MС спектр (сканирование дочерних ионов) Поиск по библиотеке LCMS-IT-TOF Источник ионизации при атмосферном давлении Квадруполь для предварительной фокусировки Ионная ловушка 1.Фрагментация активированная соударением (аргон) 2.Импульсная транспортировка в времяпролетный масс-анализаотр Подогреваемый капилляр Октополь Идентификация метаболитов [MetID] Metabolite Identification [MetID] MetID Solution Используются точные моноизотопные массы MetID Данные исходного образца Список ожидаемых метаболитов Образец после метаболизма Пики в масс-спектре соответсвующие ожидаемым метаболитам Спасибо за внимание!