Отчет за этап 3 - Институт микробиологии РАН

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 7 августа
2014г
№ 14.604.21.0108 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2014- 2020 годы» на этапе № 3 в период с 1 июля
2015г. по 31 декабря 2015г.
При этом были получены следующие результаты:
Все штаммы СРБ, устойчивые к низким значениям рН и высоким концентрациям
металлов, выделены из осадков, загрязненных тяжелыми металлами из отходов
металлургических производств. Поэтому исследование микробных сообществ кислых
сточных вод хранилищ отходов металлургии, в том числе с помощью современных
геномных и метагеномных подходов, может привести к обнаружению штаммов СРБ с
требуемыми свойствами. Использование таких штаммов в биотехнологиях очистки может
позволить разработать более простую и дешевую по сравнению с используемыми
технологическими схемами активной биологической очистки сточных вод. Повышение
рентабельности такой технологической схемы возможно благодаря возможности
исключить
этапы
предварительной
водоподготовки
или
разделения
процессов
сульфидогенеза и осаждения металлов.
Поскольку единичные известные штаммы СРБ, устойчивые к низким значениям рН
и высоким концентрациям металлов, выделены из осадков, загрязненных тяжелыми
металлами из отходов металлургических производств, представляется необходимым
расширить исследование микробных сообществ кислых сточных вод хранилищ отходов
металлургии, в том числе с помощью современных геномных и метагеномных подходов.
Целенаправленный поиск и расширение знаний о функциональном биоразнообразии
штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов, позволит вплотную подойти
к разработке простой и дешевой технологической осаждения металлов в процессе
сульфидогенеза.
На третьем этапе согласно ТЗ были выполнены следующие работы:
1. Была разработана лабораторная, которая относится к способам выделения чистых
культур ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов, устойчивых к низким
значениям рН и высоким концентрациям ионов металлов из отходов добычи сульфидных
руд.
2. Были проведены работы по выделению накопительных культур ацидофильных
сульфидогенных микроорганизмов. Выделение накопительных культур проводили
согласно
разработанной
методике
выделения.
Были
получены
сульфидогенные
накопительные культуры из проб кислых осадков на лактате и этаноле, на пептоне и
формиате, способные к росту при начальных низких значениях рН среды 2.5 и
перспективные для проведения дальнейших исследований. Состав культур был
исследован с помощью ДГГЭ фрагментов генов 16S рРНК. В пробах были обнаружены
филотипы, принадлежащие к таким родам СРБ как Desulfosporosinus, Desulfotomaculum и
Desulfovibrio.
3. Проведены работы по выделению чистых культур ацидофильных сульфидогенных
микроорганизмов. Чистые культуры выделяли методом предельных разведений из
полученных
ранее
накопительных
культур.
После
получения
морфологически
однородных культур проводили анализ близкой к полной последовательности гена 16S
рРНК. В результате удалось выделить и идентифицировать две стабильно растущих при
низких рН чистых культуры СРБ, которые были отобраны для проведения дальнейших
работ: Desulfovibrio sp. OI и Desulfosporosinus sp. OL
4. Проведено культивирование выделенных штаммов ацидофильных сульфидогенных
микроорганизмов в условиях низких значений рН и высокого содержания ионов металлов
(Сu, Zn). Для изучения устойчивости выделенных новых штаммов ацидофильных СРБ к
ионам тяжелых металлов и определения предельных для роста концентраций проводили
культивирование с добавлением ионов таких металлов, как медь (Cu2+), кадмий (Cd2+),
никель (Ni2+) и кобальт (Co2+). Проведенные работы по культивированию выделенных
новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов Desulfovibrio sp. OI и
Desulfosporosinus sp. OL в присутствии ионов металлов позволили выявить устойчивость к
высоким концентрациям ионам меди, никеля, кобальта и кадмия в условиях низких
значений рН (4,0) и определить предельные для роста концентрации. Штаммы
Desulfovibrio sp. OI и Desulfosporosinus sp. OL были способны расти при концентрациях в
среде (мг/л) Cu2+ 100 и 300, Ni2+ - 150 и 300, Co2+ 150 и 150, Cd2+ 10 и 15,
соответственно.
5.
Была проверена устойчивость выделенных штаммов к окислительному стрессу.
Выделенные штаммы Desulfovibrio sp. OI и Desulfovibrio sp. O1 были способны к слабому
росту на агаризованной питательной среде Постгейта С в условиях аэробиоза и поэтому
могут
считаться
аэротолератными.
Были
проведены
микробиологические
и
биохимические эксперименты по определению степени влияния кислорода и пероксида
водорода (как продукта неполного восстановления О2 в клетках) на рост и процесс
сульфатредукции,
антиокислительной
а
также
по
измерению
защиты
супероксиддисмутазы/супероксидредуктазы),
активностей
основных
(каталазы,
обуславливающих
ферментов
пероксидазы,
относительную
аэротолерантность СРБ. Было установлено, что штаммы Desulfovibrio sp. OI и
Desulfovibrio sp. O1 были активны при концентрации O2 в газовой фазе до 3 и 5%, при
концентрации H2O2 до 0,1 и 0,5 мМ, соответственно. Биохимические исследования
показали наличие у исследованных штаммов Desulfovibrio sp. OI и Desulfovibrio sp. O1
супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы и каталазы,
соответственно.
6.
Было изучено образование сульфидных минералов СРБ. Для изучения процесса
образования нерастворимых сульфидов штаммами OI и OL культивирование проводили
на среде с лактатом при добавлении к основной среде раствора ионов никеля и кобальта в
концентрации 200 мг/л
при рН 4,5 и 3,5, соответственно. Было обнаружено, что в
процессе сульфатредукции образуются такие минералы как лепидокрокит (FeO(OH)),
вивианит (Fe3(PO4)2×8H2O), кристаллическая сера (S8), кобальтпентландит (Co9S8),
пентландит (Fe6Ni3S8).
.
7. В соответствии с ТЗ, предусматривающем депонирование выделенных в ходе ПНИ
штаммов СРБ были подготовлена заявка на депонирование штамма Desulfosporosinus sp.
OL1 и штамма Desolfovibrio sp. OI1 во Всероссийской коллекции микроорганизмов
Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (ИБФМ). К заявке на
депонирование были составлены
паспорта депонируемых штаммов, в которых были
приведены сведения о физиологических свойствах штамма, условиях культивирования и
таксономическом положении. В коллекции штаммам были присвоены регистрационные
номера ВКМ В-3021 D (Desulfosporosinus sp. OL1) и ВКМ В-3020 D (Desolfovibrio sp. OI1).
Заявки на депонирование и паспорт штамма представлены в виде отдельных документов к
отчету.
8. Были провдены эксперименты по культивированию штамма Desulfovibrio sp. OI в
непрерывном проточном режиме, и выявлены наибольшие значения ростовых параметров
при значениях рН 5,0-5,3. Снижение рН в условиях биореактора ниже 5,0 ингибировало
рост культуры, хотя в режиме периодического культивирования наблюдали хороший рост
культуры при рН ниже 5,0 вплоть до 3,5. Эксперименты по оптимизации условий
культивирования в биореакторе при низких значениях рН будут продолжены на
последующих этапах выполнения работ.
9. Были проведены дополнительные патентные исследования и подготовка заявки на
получение патента. Проведенные патентные исследования позволили выявить ближайшие
аналоги полученных в ходе выполнения ПНИ результатов и сформулировать объект
правовой защиты – заявку на изобретение «Ацидофильный штамм Desulfosporosinus sp.
OL для очистки загрязненных экосистем с экстремально кислыми значениями рH».
Результаты, полученные во втором полугодии 2015 г., будут использованы на
дальнейших этапах работ.
Все задачи, поставленные на второе полугодие 2015 года, выполнены полностью.
Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном
этапе исполненными надлежащим образом.»