Отчет за этап 2

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 7 августа 2014г
№ 14.604.21.0108 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2014- 2020 годы» на этапе № 2 в период с 30 января
2015г. по 30 июня 2015г.
Выполнялись следующие работы:
1. Поиск сульфидогенных микроорганизмов в образцах кислых осадков хвостохранилищ на
основе метагеномного анализа.
2. Выявление присутствия генов устойчивости к тяжелым металлам у новых штаммов
ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов.
3 Направленный поиск присутствия штаммов анаэробных сульфидогенных
микроорганизмов, обладающих системами антиокислительной защиты.
4 Анализ химического состава образующихся сульфидов металлов при культивировании
штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов
При этом были получены следующие результаты:
1. Выполнен поиск сульфидогенных микроорганизмов в образцах кислых осадков
хвостохранилищ на основе метагеномного анализа. На основе вариабельного фрагмента
гена 16S рибосомной РНК длиной 500 нуклеотидов был проведен таксономический анализ
микробного сообщества. Вариабельный фрагмент был амплифицирован с помощью
универсальных вырожденных праймеров PRK341F (CCTACGGGRBGCASCAG) и
PRK806R (GGACTACYVGGGTATCTAAT). Полученные ПЦР фрагмент очищали и затем
проводили его секвенирование с помощью геномного анализатора GS FLX. В результате
было получено 137426 независимых нуклеотидных последовательностей фрагментов гена
16S рРНК. Большинство сульфидогенных бактерий относились к дельта-протеобактериям
(Desulfobulbus, Desulfopila, Desulfocapsa, Desulfatirhabdium, Desulfovibrio, Desulfobacca,
Desulfomonile) и их суммарная доля составляла около 9%. Также обнаружена вторая группа
сульфидогенных бактерий которая относится к филуму Firmicutes и представлена родом
Desulfosporosinus. Доля этой группы микроорганизмов составляет около 1%.
2. Выявлено присутствие генов устойчивости к тяжелым металлам у новых штаммов
ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов. В геноме Desulfosporosinus sp. I2
присутствовали по меньшей мере два оперона, кодирующие комплекс RND-MFP. Оба
оперона (WP_045573056/KJR49082 и WP_045573879/ KJR48138) могут быть связаны с
транспортом Co, Cd и Zn и гомологичны паре CzcA/CnrA из C. metallidurans. Кроме того, в
геноме Desulfosporosinus sp. I2 также присутствует несколько цинковых/кадмиевых АТРаз.
Большинство их них (KJR46488, WP_045575324.1, WP_045576455) характеризовалось
высоким уровнем сходства друг с другом и отсутствием у всех Desulfosporosinus за
исключением штаммов I2, HMP52 и BICA1-9. Ближайшие гомологи были найдены у
различных Clostridium. АТРаза WP_045576455 аннотирована в геноме как гипотетический
белок.
3. Проведен направленный поиск присутствия штаммов анаэробных
сульфидогенных микроорганизмов, обладающих системами антиокислительной защиты.
Были проведены микробиологические и биохимические эксперименты по определению
степени влияния кислорода и пероксида водорода (как продукта неполного восстановления
О2 в клетках) на рост и процесс сульфатредукции, а также на активность основных
ферментов
антиокислительной
защиты,
обуславливающих
относительную
аэротолерантность СРБ. Было установлено, что выделенная СРБ рода Desulfovibrio является
достаточно аэротолерантным микроорганизмом, что позволяет клеткам микроорганизма не
только выживать, но и сохранять жизнеспособность в присутствии достаточно высоких
концентраций кислорода и продуктов его неполного восстановления (клетки обладали как
супероксиддисмутазной, так и пероксидазной активностями). Окислительные стрессы
средней интенсивности привели к возрастанию активностей основных ферментов
антиокислительной защиты на 15-40%. Анализ генома выделенного штамма Desulfovibrio
sp. показал наличие в нем основных генов антиокислительной защиты, характерных для
многих СРБ – кодирующих супероксиддисмутазу (sodB), десульфоферродоксин (dfx),
рубреритрины (rbr1 и rbr2), рубредоксин-кислород оксидоредуктазу (roo), цитохром d
убихинолоксидазу (cydA), цитохром с оксидазу (cox), тиоловую пероксидазу (tpx) и
алкилгидропероксидредуктазу (ahp).
4. Был проведен анализ химического состава образующихся сульфидов металлов при
культивировании штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов в
присутствие повышенных концентраций железа и меди. Основными минералами,
обнаруженными в осадке, были ковеллит, CuS, макинавит, FeS, и вивианит Fe3(PO4)2×8H2O.
Результаты, полученные в первом полугодии 2015 г., будут использованы на
дальнейших этапах работ.
Все задачи, поставленные на первое полугодие 2015 года, выполнены полностью.
Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе
исполненными надлежащим образом.»