Ассоциация мутации митохондриального генома человека 652insG

ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА 652INSG
ПРИ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЯХ СОСУДОВ ЧЕЛОВЕКА.
М.А. Сазонова (1), М.М. Иванова (1,2), А.В. Желанкин (2), К.Ю. Митрофанов (2),
З.Б. Хасанова (3), И.А. Собенин (1,2), В.А. Мясоедова (1,2), А.Ю. Постнов (3), А.Н. Орехов (1,2)
Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской
академии медицинских наук; 2Научно-исследовательский институт атеросклероза
Российской академии естественных наук; 3 ФГУ «Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс» Минздравсоцразвития России, г. Москва.
1
Введение.
В России, как и в большинстве индустриальных стран, сердечно-сосудистые
заболевания (ССЗ) занимают первое место в структуре инвалидизации и смертности, в том
числе, преждевременной, а также ведут к эскалации расходов на здравоохранение.
Поскольку морфологической основой смертности от сердечно-сосудистых заболеваний в
90% случаев является атеросклероз, то вклад заболеваний атеросклеротического генеза и
их последствий в России в общую смертность является наиболее весомым. Одной из
причин этого неблагоприятного дисбаланса является недостаточное количество
верифицированных биомаркеров ССЗ, и, в частности, атеросклероза.
По литературным данным, в патологии человека показана ассоциация различных
заболеваний с некоторыми мутациями митохондриального генома [1-3]. Согласно одной из
гипотез, мутации митохондриального генома вызывают окислительный, который и
является причиной широкого круга патологических процессов.
Следует отметить, что в каждой митохондрии содержится несколько копий ее генома.
Митохондриальный геном наследуется по материнскому типу и отличается выраженной
нестабильностью, в нем часто возникают мутации. Пенетрантность и экспрессивность
таких мутаций варьируют в широких пределах от семьи к семье и между родственниками
(по материнской линии) одной семьи и зависят от многих факторов, но главным образом,
от генотипа и уровня гетероплазмии (смесь мутантных и нормальных молекул ДНК).
Поэтому при изучении ассоциации митохондриальных мутаций с заболеваниями людей
необходима не только качественная (наличие/отсутствие мутации), но и количественная
оценка мутантного аллеля митохондриального генома (процент гетероплазмии).
В настоящей работе проведен молекулярный анализ мутации 652insG
митохондриального генома человека в образцах ДНК из лейкоцитов крови пациентов,
больных атеросклерозом и здоровых доноров. Мутация локализована в кодирующей
области митохондриального генома, в частности, в гене рРНК 12S. Данная мутация
вызывает дефект малой субъединицы рибосомальной РНК, вследствие чего нарушается
синтез митохондриальных белков. По литературным данным, мутация 652insG
ассоциирована с митохондриальными миопатиями [4] .
Цель и задачи
Целью данного исследования является нахождение ассоциации мутации
митохондриального генома человека 652insG с атеросклеротической патологией интимы
сонных артерий различной степени тяжести.
Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
1)
Тестировать образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов крови индивидов на
наличие мутации 652insG;
2)
Расчитать процент гетероплазмии мутации 652insG в данных образцах;
3) На основании полученных данных определить, имеется ли у индивида
предрасположенность к возникновению и развитию атеросклероза.
Материалы и методы
Материалом для данного исследования служили образцы лейкоцитов крови
пациентов, прошедших ультрасонографическое исследование.
Общая выборка проб крови из 190 образцов была разделена на 3 приблизительно
равные группы: 1) образцы крови пациентов, у которых отсутствовали поражения
атеросклеротического характера - «норма», 2) образцы крови пациентов, у которых было
выявлено диффузное утолщение интимы аорты, которое является одной из ранних стадий
формирования атеросклеротической бляшки - «диу» и 3) образцы крови пациентов, у
которых наблюдались атеросклеротические бляшки - «асб».
Выделение тотальной ДНК из образцов крови проводилось с помощью метода фенолхлороформной
экстракции.
После
проведения
ПЦР
амплификаты
были
пиросеквенированы для выявления инсерции G в гене субъединицы 12S в позиции 652
митохондриального генома человека. Исследования проводили на автоматическом
пиросеквенаторе PSQTMHS96MA.
Статистическую обработку данных проводили при помощи статистического пакета
SPSS 14.0 (SPSS Inc., США).
Основные результаты
Для количественной оценки мутантного аллеля, содержащего инсерцию G в позиции
652 митохондриального генома человека, мы использовали метод пиросеквенирования в
нашей модификации. Благодаря разработанному авторами статьи методу возможна не
только качественная (есть мутация или ее нет), но и количественная оценка мутантного
аллеля митохондриального генома (процент гетероплазмии ) в биологических образцах.
В нашей выборке выявлены значительные отличия в проценте гетероплазмии
мутантного аллеля митохондриального генома 652insG между образцами ДНК пациентов,
имеющими атеросклеротические поражения в сонных артериях и здоровыми донорами. С
помощью двух независимых статистических методов программы SPSS 14.0 был
определен средний пороговый уровень для гетероплазмии по мутации 652insG в
митохондриальной ДНК лейкоцитов крови человека, равный 20%. Значение,
превышающее данный пороговый уровень, соответствует низкой предрасположенности к
атеросклерозу и формированию атеросклеротических бляшек. Значение, не достигающее
данного порогового уровня, соответствует высокой предрасположенности к атеросклерозу
и формированию стенозирующих атеросклеротических бляшек.
Заключение
Определенный процент гетероплазмии мутации митохондриального генома 652insG
может служить прогностическим признаком атеросклероза сонных артерий у человека.
Разработанный авторами метод определения процента гетероплазмии данной мутации
позволяет повысить точность диагностики риска развития сосудистых осложнений.
Список литературы.
1. Andreassi M.G. Coronary atherosclerosis and somatic mutations: an overview
of the contributive factors for oxidative DNA damage. // Mutat. Res., 2003, Jan.,
V. 543(1), P. 67-86. Review.
2. Andreassi M.G., Botto N. DNA damage as a new emerging risk factor
in atherosclerosis.// Trends. Cardiovasc. Med. , 2003, Oct;13(7), P.270-275. Review.
3. Andreassi M.G., Botto N., Colombo M.G et al. Genetic instability
and atherosclerosis: can somatic mutations account for the development
of cardiovascular diseases?// Environ. Mol. Mutagen, 2000,35(4), P.265-269. Review.
4. Han CB, Ma JM, Xin Y, Mao XY, Zhao YJ, Wu DY, Zhang SM, Zhang YK.. Mutations of
mitochondrial 12S rRNA in gastric carcinoma and their significance.// World J Gastroenterol.
2005 Jan 7;11(1):31-5.