Сердечно-сосудистая патология является одной из самых
реклама
ФГБУ «РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНОПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КОМПЛЕКС» МЗ РФ На правах рукописи Смирнова Людмила Александровна «Изучение связи мутаций митохондриального генома с атеросклеротическим поражением коронарных и сонных артерий» 14.01.05 - кардиология 03.02.07 - генетика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Ежов Марат Владиславович доктор медицинских наук Постнов Антон Ювенальевич Москва – 2014 1 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ - артериальная гипертония АТФ - аденозинтрифосфат ГМК - гладкомышечные клетки ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИБС - ишемическая болезнь сердца КА - коронарный атеросклероз КАГ - коронарная ангиография Лп(а) - липопротеид(а) мтДНК - митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота НАДН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат ОХС - общий холестерин ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота СД - сахарный диабет ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания ТГ - триглицериды тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота ХС ЛВП - холестерин липопротеидов высокой плотности ХС ЛНП - холестерин липопротеидов низкой плотности яДНК - ядерная дезоксирибонуклеиновая кислота DRP1 - dynaminrelated protein 1 MELAS - mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, stroke-like episodes MERRF - myoclonus epilepsy and ragged-red fibres MFN1 - mitofusin 1 MPTP - mitochondrial permeability transition pore NO - оксид азота OPA1 - optic atrophy 1 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 5 Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 10 1.1. Строение и физиологическая роль митохондрий 10 1.2. Митохондриальный геном 11 1.3. Функции митохондрий 15 1.4. Роль митохондрий при сердечно-сосудистых заболеваниях 18 1.5. Факторы риска атеросклероза и митохондрии 26 1.6. Мутации митохондриального генома, ассоциированные с атеросклерозом коронарных и сонных артерий 30 1.7. Исследования, посвещенные изучению связи мутаций митохондриального генома с атеросклерозом 32 1.8. Новые митохондриальные объекты терапии 34 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 39 2.1. Дизайн исследования 39 2.2. Общеклиническое обследование 40 2.3. Инструментальные методы обследования 41 2.4. Лабораторные методы исследования 43 2.4.1. Биохимическое исследование 43 2.4.2. Генетическое исследование 44 2.4.3. Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови 44 2.4.4. Полимеразная цепная реакция 45 2.4.5. Электрофорез в агарозном геле 47 2.4.6. Пиросеквенирование ДНК 48 2.4.7. Определение уровня гетероплазмии мутации митохондриального генома 50 2.5. Статистическая обработка данных 51 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 52 3.1. Сравнительная характеристика групп больных 52 3.2. Уровни гетероплазмии мутаций митохондриального генома 54 3 3.3. Оценка взаимосвязи классических факторов риска атеросклероза с мутациями митохондриального генома 58 3.3.1. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у мужчин и женщин 59 3.3.2. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у пациентов до 45 лет и после 45 лет 61 3.3.3. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у пациентов с наличием и отсутствием артериальной гипертонии 64 3.3.4. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у пациентов с наличием и отсутствием курения в анамнезе 66 3.3.5. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у пациентов в зависимости от наличия гиперлипидемии 69 3.3.6. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у пациентов в зависимости от наличия отягощенного семейного анамнеза 73 3.4. Взаимосвязь липопротеида(а) с мутациями митохондриального генома 76 3.5. Оценка выраженности атеросклеротического поражения коронарных артерий 77 3.6. Сравнительная характеристика пациентов с атеросклерозом сонных артерий 79 3.7. Оценка порогового уровня гетероплазмий мутаций митохондриального генома 83 3.8. Распределение мутаций митохондриального генома, превышающих пороговый уровень среди пациентов 86 3.9. Оценка диагностической значимости мутаций митохондриального генома как генетического биомаркера коронарного атеросклероза 89 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 91 Заключение 101 Практические рекомендации 101 Выводы 102 Список литературы 103 4 ВВЕДЕНИЕ. Актуальность проблемы. Ишемическая болезнь сердца (ИБС) занимает первое место в структуре смертности представляет от сердечно-сосудистых собой прогрессировании заболеваний полиэтиологическое которого играет роль (ССЗ). заболевание, Атеросклероз в взаимодействие развитии и генетических, фенотипических, средовых и социально-экономических факторов [Andreassi M.G., 2003]. В литературе имеются описания генов-кандидатов (9p21.3, 6q25.1, 2q36.3, 6q26-27) и генных полиморфизмов ядерного генома, связанных с атеросклерозом [Weakley S. et al., 2010; Sivapalaratnam S. et al., 2011; Mälarstig A. et al., 2010]. В течение длительного времени мутациям митохондриального генома не уделялось должного внимания, хотя они могут играть важную роль в формировании атеросклеротических поражений артерий, вызывая различные дефекты в белковой цепи некоторых дыхательных ферментов, приводя к развитию митохондриальной дисфункции [Andreassi M.G., 2003]. Митохондриальная дисфункция приводит к избыточному образованию активных форм кислорода и азота, которые вызывают эндотелиальную дисфункцию, пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов (ГМК), способствуют развитию воспалительной сосудистой реакции, апоптозу ГМК и макрофагов, приводя к развитию атеросклеротического поражения сосудов [Madamanchi N.R. еt al., 2007]. По литературным данным, у человека показана ассоциация различных заболеваний с некоторыми мутациями митохондриального генома. Митохондриальные заболевания (синдром Лея, наследственная оптическая нейропатия Лебера, митохондриальная синдром энцефалопатия Кернса–Сейра, с синдром инсультоподобными Пирсона, эпизодами и лактацидозом (MELAS синдром), хроническая прогрессирующая наружная 5 офтальмоплегия) ассоциированы с соматическими мутациями в митохондриальном геноме. Под влиянием факторов внешней (курение, радиация, загрязнение воздуха, вирусная и бактериальная инфекция) и внутренней (нарушение метаболизма, хроническое воспаление, геномная вариабельность) среды происходит образование продуктов окисления, которые оказывают повреждающее действие на митохондриальную дезоксирибонуклеиновую кислоту (мтДНК). В каждой митохондрии содержится несколько копий ее генома, а в каждой клетке – несколько десятков или сотен митохондрий [Veltri K.L. еt al., 1990]. Наследуемый по материнской линии митохондриальный геном отличается нестабильностью, в течение жизни в нем возникают соматические мутации [Wallace D.C., 1987]. Существует ряд факторов, приводящих к ускоренному накоплению мутаций мтДНК: репликация мтДНК происходит в 10 раз интенсивнее, чем ядерной; наличие несовершенной системы репарации мтДНК; образование активных форм кислорода, отсутствие гистонов и другие [Мазунин И.О. и др., 2010]. Для оценки мутантных аллелей митохондриального генома и их связи с патологией используют качественный (наличие или отсутствие мутации) и количественный анализ (определяет процент гетероплазмии – смесь ДНК, содержащих мутации, и ДНК дикого типа). Имеются единичные клинические работы, демонстрирующие ассоциацию между уровнем гетероплазмии мутаций митохондриального генома в лейкоцитах крови человека и атеросклеротическим поражением сонных и коронарных артерий [Sazonova M.A. et al., 2009; Weakley S.M. et al., 2010; Mueller E.E. et al., 2011; Sobenin I.A. et al., 2012]. Соматическая мутация 4977bp делеция, характерная для множества дегенеративных заболеваний, выявляется в атеросклеротически пораженных участках аорты [Bogliolo M. et al., 1999] и в периферическом кровотоке у больных с атеросклерозом [Botto N, et al., 2005]. В одном из исследовании была показана ассоциация мутации С3256Т 6 митохондриального генома с выраженностью атеросклероза сонных артерий [Sobenin I.A. et al., 2012]. Предпосылкой для нашей работы послужило экспериментальное исследование, выполненное в ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ в 2009 году, при изучении 40 мутаций в образцах мтДНК, выделенных из пораженных атеросклерозом и нормальных участков интимы аорты 10 молодых людей, погибших вследствие несчастных случаев, обнаружено, что уровни гетероплазмии десяти мутаций митохондриального генома (A1555G, С3256T, G12315A, T3336C, G13513A, C5178A, G15059A, G14459A, G14846A, 652insG) были значительно выше в участках аорты, пораженных атеросклерозом [Sazonova M. et al., 2009]. Для нашей работы было выбрано 4 мутации: G13513A, G14846A, C3256Т, G12315A, для которых повышенный уровень гетероплазмии был связан с атеросклеротическим поражением по данным аутопсии [Sazonova M. et al., 2009]. Таким образом, исследования, посвященные данной проблеме, немногочисленны, в связи с чем, изучение роли мутаций митохондриального генома в развитии атеросклероза коронарных и сонных артерий представляется актуальным. Цель исследования. Изучить связь мутаций митохондриального генома с наличием и выраженностью атеросклеротического поражения коронарных и сонных артерий. Задачи исследования. 1. Оценить уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома (С3256Т, G12315A, G13513A, G14846A) в лейкоцитах цельной крови у пациентов с наличием и отсутствием коронарного атеросклероза. 2. Изучить связь между митохондриальными мутациями и тяжестью атеросклероза коронарных артерий. 3. Исследовать возможную связь мутаций митохондриального генома с классическими факторами риска атеросклероза. 7 4. Оценить уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома (С3256Т, G12315A, G13513A, G14846A) в лейкоцитах цельной крови у пациентов с различной степенью атеросклеротического поражения сонных артерий. Научная новизна. В работе был использован метод количественной оценки мутантного аллеля митохондриального генома на основе технологии пиросеквенирования для определения уровня гетероплазмии мутаций митохондриального генома. Впервые проведено исследование мутаций митохондриального генома у пациентов с наличием и отсутствием коронарного атеросклероза, верифицированного данными коронарной ангиографии. Установлено, что уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома С3256Т, G13513A выше у пациентов с коронарным атеросклерозом. Выявлена отрицательная связь мутации G12315A c атеросклерозом коронарных артерий. Впервые изучена взаимосвязь изучаемых мутаций с выраженностью коронарного атеросклероза, установлена прямая связь мутации С3256Т со степенью атеросклеротического поражения коронарных артерий. Выявлена прямая зависимость между наличием атеросклероза сонных артерий и уровнем гетероплазмии мутаций митохондриального генома С3256Т, G14846A и обратная - с мутацией G12315A. Впервые было показано наличие прямой связи между мутацией митохондриального генома G14846A и уровнем липопротеида(а) [Лп(а)]. Практическая значимость работы. В работе использована методика количественной оценки мутантного аллеля митохондриального генома. Показана связь уровня гетероплазмии мутаций митохондриального генома G13513A и С3256T с коронарным атеросклерозом, мутаций С3256Т, G14846A - с атеросклерозом сонных артерий. Учитывая полученные данные, мутации митохондриального генома могут быть использованы в качестве генетических маркеров предрасположенности к атеросклерозу коронарных и сонных артерий. 8 Понимание точных механизмов, с помощью которых мутации митохондриального генома способствуют развитию атеросклероза, откроет новые мишени для разработки лекарственных препаратов. Мутации митохондриального генома не связаны с классическими факторами риска ССЗ, такими как курение, артериальная гипертония, ожирение, отягощенный семейный анамнез по ССЗ. Впервые показана положительная связь между уровнем гетероплазмии мутации G14836A и уровнем Лп(а), что требует дальнейшего изучения. 9 Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. 1.1. Строение и физиологическая роль митохондрий. Митохондрии относятся к полуавтономным органеллам - в их матриксе содержится собственный геном. В клетке содержится от одной до двух тысяч митохондрий [Veltri K.L. еt al., 1990]. Митохондрия ограничена двумя мембранами - гладкой внешней и складчатой внутренней, имеющей очень большую поверхность. Наружная мембрана митохондрии имеет толщину около 7 нм, не образует впячиваний и складок, ее основная функция - отграничение митохондрии от цитоплазмы [Alberts B. et al., 1994]. Наружная мембрана митохондрии состоит из билипидного слоя и пронизывающих его белков; соотношение липидов и белков по массе - примерно 1:1 [Chipuk J.E. et al., 2006]. Наружная мембрана содержит большое количество белков, называемых порины, которые образуют каналы, через которые могут проникать небольшие молекулы и ионы весом до 5 кДа [Taylor S.W., 2003]. Крупные молекулы могут пересекать наружную мембрану только посредством активного транспорта через транспортные белки митохондриальной мембраны. Для наружной мембраны характерно присутствие ферментов: монооксигеназы, ацил-СоА-синтетазы и фосфолипазы А2. Наружная мембрана митохондрии может взаимодействовать с мембраной эндоплазматического ретикулума; это играет важную роль в транспортировке липидов и ионов кальция. Так как наружная мембрана митохондрии проницаема для небольших молекул и ионов, их концентрация в периплазматическом пространстве мало отличается от таковой в цитоплазме. Одним из белков, содержащихся в периплазматическом пространстве, является цитохром С - один из компонентов дыхательной цепи митохондрий [Chipuk J.E. et al., 2006]. Внутренняя мембрана образует многочисленные гребневидные складки - кристы, существенно увеличивающие площадь ее поверхности. Различные типы клеток отличаются друг от друга как по количеству и форме митохондрий, так и по количеству крист, особенно много крист имеют 10 митохондрии в тканях с активными окислительными процессами, например, в миокарде. Характерной чертой состава внутренней мембраны митохондрий является присутствие в ней кардиолипина - фосфолипида, содержащего сразу четыре жирные кислоты и делающего мембрану абсолютно непроницаемой для протонов [Andersson S.G. et al., 2003]. Ещё одна особенность внутренней мембраны митохондрий - высокое содержание белков, представленных транспортными белками, ферментами дыхательной цепи, а также крупными аденозинтрифосфат-синтетазными (АТФ-синтетазными) комплексами [Andersson S.G. et al., 2003]. Внутренняя мембрана митохондрии, в отличие от внешней, не имеет специальных пор для транспорта мелких молекул и ионов; на ней, на стороне, обращенной к матриксу, располагаются особые молекулы АТФ-синтазы [Mannella C.A. et al., 2006]. При прохождении через них протонов происходит синтез АТФ. Во внутренней мембране располагаются компоненты дыхательной цепи. Наружная и внутренняя мембраны в некоторых местах соприкасаются. Матрикс - ограниченное внутренней мембраной пространство. В матриксе митохондрии находятся ферментные системы окисления пирувата жирных кислот, а также ферменты цикла трикарбоновых кислот (цикла Кребса). Кроме того, здесь же находится мтДНК, рибонуклеиновая кислота (РНК) и собственный белоксинтезирующий аппарат митохондрии [Alberts B. et al., 1994]. 1.2. Митохондриальный геном. Митохондрии - это единственные органеллы, имеющие собственный геном. Митохондриальная ДНК человека (рисунок 1) представляет собой двухцепочечную кольцевую молекулу размером 16569 пар нуклеотидов, в которой расположены 37 генов, продукты которых участвуют в процессе выработки энергии в дыхательной цепи митохондрий. В их число входят 13 структурных генов, кодирующих субъединицы комплексов окислительного фосфорилирования, а также гены 22 транспортных РНК (тРНК) и двух рибосомальных РНК (рРНК), принимающих участие в синтезе белка 11 непосредственно в митохондриях [Anderson S. еt al., 1981; Chan D.C. еt al., 2006]. В частности, под контролем митохондрального генома кодируются семь субъединиц АТФ-синтетазы, три субъединицы цитохромоксидазы и одна субъединица убихинол-цитохром-с-редуктазы [Kogelnik М.А. et al., 1998]. Дыхательная цепь расположена во внутренней мембране митохондрий и состоит из пяти сопряженно функционирующих ферментных комплексов, насчитывающих 86 субъединиц. Субъединицы, в основном, кодируются ядерными генами, но семь субъединиц первого ферментного комплекса (ND1, 2, 3, 4, 4L, 5, 6), один - третьего (цитохром В), три - четвертого (СОI, СОII, СОIII) и две - пятого (АТФаза 6 и 8) кодируются структурными генами мтДНК [Kogelnik М.А. et al., 1998]. Рисунок 1. Митохондриальная ДНК человека [Madamanchi N.R., 2007]. Митохондриальный геном отличается нестабильностью, в течение онтогенеза в нем возникают соматические мутации. Скорость мутирования мтДНК примерно в 10-17 раз выше, чем ядерной ДНК (яДНК) [Wallace D.C., 1987], что определяется совокупностью таких факторов, как особенности 12 структурной организации митохондриального генома, функциональное состояние рибонуклеотидредуктазы, ошибки репликации, отсутствие защитных гистонов, неэффективная система репарации, близкое прилежание мтДНК к мембране, мутации ядерных генов, кодирующие белки, действующие в митохондриях, однако наиболее значительный вклад вносят активные формы кислорода [Тодоров И.Н., 2009]. Мутации мтДНК могут происходить как в соматических, так и в половых клетках. Последствия их различны, мутации в соматических клетках приводят к снижению производства энергии в клетке. Мутации, возникающие в половых клетках, могут передаваться следующим поколениям и приводить к развитию новых полиморфизмов или митохондриальных заболеваний. Митохондриальная ДНК передается преимущественно через цитоплазму яйцеклетки, то есть наследуется по материнской линии [Мазунин И.О. и др., 2010]. Разнообразие клинических симптомов митохондриальных заболеваний формируется за счет таких факторов, как гетероплазмия, пороговый эффект и эффект «бутылочного горлышка» («генетической воронки»). Существование множества копий мтДНК в клетке может приводить к возникновению гетероплазмии - состоянию, при котором в одной митохондрии, клетке или органе сосуществуют несколько вариантов мтДНК: мутантной и не мутантной, в отличие от гомоплазмии, когда все мтДНК идентичны [Kmiec B. еt al., 2006]. Митохондриальные мутации могут накапливаться в течение жизни индивида. Пенетрантность и экспрессивность митохондриальных мутаций варьируют в широких пределах и зависят от многих факторов, но, главным образом, от генотипа и уровня гетероплазмии [Wonnapinij P. еt al., 2008]. При делении клетки митохондрии распределяются между дочерними клетками случайным образом вследствие митотической сегрегации, в результате чего дочерние клетки могут различаться уровнем гетероплазмии [Wonnapinij P. еt al., 2008]. Предполагается, что в дочерних (соматических) клетках скорость 13 сдвига в сторону мутантных мтДНК, либо мтДНК дикого типа определяется составом нуклеоида родительской клетки. Если материнская клетка содержит гетероплазматические нуклеоиды, то колебание уровня гетероплазмии дочерних клеток остается незначительным, однако, если нуклеоиды гомоплазматические – уровень гетероплазмии дочерних клеток различается весьма значительно и зависит от отбора и генетического дрейфа [Gilkerson R.W. еt al., 2008, 2009]. Уровень гетероплазмии мутации мтДНК определяет тяжесть митохондриального заболевания. Для манифестации заболевания необходимо, чтобы количество мутантной мтДНК превысило определенный уровень – это явление получило название «порогового эффекта» [Lightowlers R.N., 1997]. Митохондриальная ДНК наследуется по материнской линии. Зрелые яйцеклетки содержат около 100000 копий мтДНК [van Blerkom J. еt al., 2008]. Несмотря на большое число копий мтДНК в яйцеклетке, уже в следующем поколении мтДНК может быть представлена новыми вариантами, это проявление эффекта «бутылочного горлышка» («генетической воронки») [Cree L.M., 2008]. После оплодотворения происходит череда зиготических делений без деления митохондрий, в результате чего количество митохондрий уменьшается вдвое с каждым клеточным делением. Поскольку количество митохондрий, характерное для зрелой яйцеклетки, происходит из весьма ограниченного набора митохондрий первичных половых клеток, вновь образовавшиеся митохондрии будут, очевидно, гомогенными по составу [Мазунин И.О. и др., 2010]. Роль «генетической воронки» в эволюции заключается, вероятно, в поддержании гомоплазмии мтДНК, минимизируя гетероплазмию [Cummins J.M. et al., 2001]. В связи с тем, что миотохондриальные болезни в ряде случаев могут быть обусловлены повреждением ядерного генома, передача заболевания будет соответствовать менделевским законам наследования. В тех же случаях, когда развитие болезни обусловлено мутациями мтДНК, наследование будет соответствовать митохондриальному типу, то есть передаваться по материнской 14 линии [Мазунин И.О. и др., 2010]. Если патология развивается при одновременном повреждении генов ядерного и митохондриального геномов, наследование будет носить сложный характер и определяться различными факторами [Мазунин И.О. и др., 2010]. 1.3. Функции митохондрий. Основной функцией митохондрий является синтез аденозинтрифосфата (АТФ) - универсальной формы химической энергии в любой живой клетке [Camara A.K. et al., 2010]. Молекула АТФ может образовываться двумя путями: в результате субстратного фосфорилирования в жидкой фазе или в процессе мембранного фосфорилирования, связанного трансмембранного электрохимического фосфорилирование). Окислительное фундаментальных метаболических с использованием градиента фосфорилирование реакций, протекающая энергии (оксилительное – во одна из внутренней мембране митохондрий, и она состоит из четырех стадий (рисунок 2): 1) превращение поступивших из цитоплазмы в митохондрию пирувата и жирных кислот в ацетил-СоА; 2) окисление ацетил-СоА в цикле Кребса, ведущее к образованию никотинамидадениндинуклеотида (НАДН); 3) перенос электронов с НАДН на кислород по дыхательной цепи; 4) образование АТФ в результате деятельности мембранного АТФ-синтетазного комплекса [Lenaz G. еt al., 2010]. 15 Рисунок 2. Окислительное фосфорилирование [Madamanchi N.R., 2007]. Помимо синтеза АТФ, окислительное фосфорилирование представляет собой источник активных форм кислорода: супероксида, пероксида водорода и гидроксильного радикала [Camara A.K. et al., 2010]. Супероксид формируется, главным образом, в комплексах I и III. При помощи митохондриальной Mnзависимой супероксиддисмутазы либо Cu-Zn-зависимой cупероксиддисмутазы супероксид превращается в пероксид водорода, который, в свою очередь, глутатионпероксидаза превращает в воду. Кроме того, в присутствии ионов Fe2+ и Сu2+ пероксид водорода может превращаться в гидроксильный радикал (рисунок 3). Супероксид может реагировать и с оксидом азота (NO), который образуется эндогенно в митохондриях при помощи митохондриальной NO-синтазы, приводя к образованию пероксинитрита [Giulivi C. et al., 2007]. Хроническое воздействие активных форм кислорода на клетку приводит к окислительному повреждению белков, липидов и нуклеиновых кислот, а острое воздействие – к инактивации FeS-центров ферментативных комплексов окислительного фосфорилирования и фермента цикла трикарбоновых кислот – аконитазы, что приводит к снижению продукции АТФ [Camara A.K. et al., 2010]. 16 Высокоактивный пероксинитрит нитрирует остатки тирозина окружающих белков, в результате чего повреждаются комплекс I и митохондриальная супероксиддисмутаза. Кроме того, в комплексе I сульфгидрильные группы могут подвергаться нитрозилированию, что приводит к подавлению активности комплекса [Förstermann U. et al., 2006]. Воздействие активных форм кислорода на мтДНК приводит к накоплению множественных мутаций, снижению скорости окислительного фосфорилирования и еще большему накоплению активных форм кислорода. Все это в итоге нарушает функционирование клетки и вызывает программируемую клеточную смерть – апоптоз [Waldmeier P. C. et al., 2003]. Рисунок 3. Механизм образования активных форм кислорода в митохондрии [Madamanchi N.R., 2007]. Основные центры образования супероксида – комплексы I и III, хотя небольшие количества супероксида могут образовываться в комплексе II и IV. Переносчик электронов в комплексе III – убихинон – редуцируется до убихинола, который переносит электроны к цитохрому C, что ингибируется миксотиазолом. Затем убихинон восстанавливается через цитохром B, и может снова переносить электроны, образуя супероксид [Camara А.К. et al., 2011]. 17 1.4. Роль митохондрий при сердечно-сосудистых заболеваниях. В 1963 г. было установлено, что митохондрии имеют собственный уникальный геном, наследуемый по материнской линии. Полная нуклеотидная последовательность мтДНК человека была определена в 1981 г [Anderson S. et al., 1981]. Активное изучение митохондриального генома в 90-х годах 20-го века позволило выделить целый класс болезней, в основе которых лежат мутации генов митохондриального генома [Fernandez-Moreno М.А. et al., 2000]. Митохондриальные болезни (цитопатии) - большая гетерогенная группа наследственных заболеваний и патологических состояний, обусловленных нарушениями структуры, функций митохондрий и тканевого дыхания, при которых наиболее часто поражаются органы нервной, мышечной и сердечнососудистой систем [Di Mauro S., 2004]. К первичным митохондриальным болезням, обусловленными дефектами яДНК и мтДНК, относят: синдром MELAS (mitochondrial encephalomyopathy, митохондриальная lactic энцефаломиопатия, acidosis, stroke-like лактат-ацидоз, episodes - инсультоподобные эпизоды), синдром MERRF (myoclonus epilepsy and ragged-red fibres - миоклонусэпилепсия, "рваные красные волокна"), синдром Кернса-Сейра (наружная офтальмоплегия, пигментный ретинит, атриовентрикулярная блокада сердца), синдром Барта, синдром Пирсона, наследственная оптическая нейропатия Лебера (Leber's hereditary optic neuropathy (LHON)), синдром NARP (neuropathy, ataxia, retinitis pigmentosa, and ptosis - нейропатия, атаксия, птоз), подострая некротизирующая энцефаломиопатия Лея, фумаровая ацидемия и другие. Наряду с первичными митохондриальными болезнями, существует обширный класс состояний, характеризующийся вторичной митохондриальной недостаточностью. Одной из наиболее энергозависимых систем организма человека является сердечно-сосудистая, которая часто поражается при митохондриальных болезнях [Di Mauro S., 2004]. В связи с этим представляет интерес изучение роли 18 митохондрий, мтДНК и функционально связанных с ней ядерных генов при заболеваниях сердечно-сосудистой системы. Митохондриальная физиология и биогенез играют ключевую роль в запуске и прогрессировании ССЗ, вызванных оксидативным повреждением. К таким заболеваниям, например, относится атеросклероз [Sobenin I.A. et al., 2013]. В течение длительного времени мутациям митохондриального генома не уделялось должного внимания, хотя они могут играть важную роль в формировании атеросклеротических поражений артерий. Эндотелий - внутренний слой сосудов, выполняющий множество функций, нарушение работы которого приводит к различным CCЗ. Митохондрии имеют важное значение в обеспечении нормального функционирования эндотелиоцитов, они не только производят АТФ, но также регулируют работу клеточных посредников, таких как кальций и активные формы кислорода в клетках [Groschner L. еt al., 2012]. Активные формы кислорода играют важную роль в процессах клеточной сигнализации [Irani K. еt al., 2000]. Митохондрии взаимодействуют с другими органеллами и вносят существенный вклад в эндотелиальную Ca2+ сигнализацию. Даже производство NO эндотелием зависит от митохондриального Ca2+ обмена [Dedkova E.N. et al., 2004]. Активные формы кислорода в низких концентрациях играют роль в процессах сосудистой сигнализации, регулируют деятельность белков-посредников, ферментов и ионных каналов в клетках эндотелия [Poteser M. et al., 2006; Spitaler M.M. et al., 2002]. Так, например, эндотелий-расслабляющий фактор - одна из наиболее изученных сигнальных молекул является свободным радикалом. Также активные формы кислорода митохондриального происхождения участвуют в процессах пролиферации, гипертрофии и апоптозе как в эндотелиальных, так и в ГМК [Gutierrez J. еt al., 2002]. Так как митохондрии крепятся к цитоскелету клетки [Lin A. еt al.,1990], они могут реагировать на напряжение сдвига и увеличивать производство активных 19 форм кислорода в ответ [Ali M.H. еt al., 2004]. Так, например, повышение артериального давления в легочной циркуляция приводит к колебаниям Ca2+ в цитоплазме эндотелиальных клеток, которые передаются на митохондрии, где усиливается образование активных форм кислорода. Образование новых кровеносных сосудов, так же как и регресс уже существующих, зависит от апоптоза эндотелиальных клеток [Mallat Z. еt al., 2000]. Сердечно-сосудистые факторы риска, такие как гиперлипидемия [KnightLozano C.A. еt al., 2002], сахарный диабет [Kelley D.E. еt al., 2002], артериальная гипертония, курение вызывают дисфункцию митохондрий, что приводит к перепроизводству активных форм кислорода. Токсическое воздействие свободных радикалов на биомолекулы приводит к накоплению повреждений в различных клетках, дезрегулированию редокс-чувствительных метаболических и сигнальных путей. Увеличенная продукция активных форм кислорода вызывает дисфункцию эндотелия, пролиферацию и апоптоз ГМК и макрофагов, внося, тем самым, вклад в прогрессирование атеросклеротического поражения и впоследствии - в разрыв бляшки [Madamanchi N.R. еt al., 2007] (рисунок 4). 20 Рисунок 4. Атерогенные механизмы митохондриальной дисфункции [Madamanchi N.R. et al., 2007]. В результате увеличения окислительного стресса нарушается эндотелиальная функция за счет снижения продукции NO эндотелиальной NOсинтазой [Puddu P. et al., 2005], вместе с перепроизводством активных форм кислорода это инициируют развитие атеросклероза. Избыток активных форм кислорода приводит к образованию пероксинитрит-аниона, который, в свою очередь ингибирует тетрагидробиоптерин, важнейший кофактор эндотелиальной NO-синтазы, что приводит к дальнейшему снижению синтеза NO [Förstermann U. et al., 2006]. Значительное снижение уровня NO не только приводит к повышению продукции активных форм кислорода, но и способствует открытию митохондриальных АТФ-зависимых высвобождению активных митохондрий вызывает К+-каналов, что также приводит к форм кислорода. Окислительное повреждение дисфункцию эндотелия в экспериментальных исследованиях [Ballinger S.W. еt al., 2000]. 21 Клинические исследования также показали связь между митохондриальной дисфункцией и нарушением функции эндотелия у пациентов с ИБС [Dai Y.L. еt al., 2010]. Нарушение функций митохондрий вследствие повышения в них уровня окисленных форм кислорода, накопления ДНКповреждений, истощения дыхательных цепей вызывает гибель эндотелия, ГМК, что способствует формированию/разрыву атеросклеротических бляшек [Madamanchi N.R. еt al., 2007]. Эти процессы осуществляются при экспрессии генов, регулирующих митохондриальный биогенез, в том числе, гена peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator (PGC-1α) [Gleyzer N. et al., 2005]. Активные формы кислорода запускают каскад реакций, в частности, окисление холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС ЛНП), воспалительные процессы, клеточный апоптоз и повреждение эндотелия. В макрофагах и ГМК в атеросклеротической бляшке обнаружен высокий уровень активных форм кислорода [Martinet W. еt al., 2002]. Активные формы кислорода так же могут повреждать такие важные компоненты клеток, как полиненасыщенные жирные кислоты, протеины, нуклеиновые кислоты, углеводы. Это, в свою очередь, может нарушать нормальные свойства клеточных мембран, например, текучесть, ионный транспорт, а также менять активность ферментов, синтез и транспорт белков, что ведет к апоптозу. Гиперпродукция активных форм кислорода является триггером высвобождения проапоптотического белка AIF [Daugas E. et al., 2000] Митохондрии играют важную функцию в запуске ферментативного каскада самоуничтожения - апоптоза [Vaux D.L., 2011]. Исследования показывают, что апоптоз эндотелиальных клеток может играть особую роль в патофизиологии микро- и макроангиопатии при определенных условиях, таких как сахарный диабет или гиперлипидемии [Du X.L. еt al., 1998; Vindis C. еt al., 2005]. В отличие от некроза, апоптоз это определенный каскад событий, на который можно оказывать влияние фармакологически, и поэтому определение точных 22 молекулярных механизмов, приводящих к гибели эндотелиальных клеток, имеет важное значение. При чрезмерном образовании активных форм кислорода в митохондрии активируются антиоксидантные системы (супероксиддисмутаза, цитохромоксидаза и другие), направленные на нейтрализацию активных форм кислорода [Chang JC. et al., 2010]. Если концентрация активных форм кислорода продолжает расти, то это сопровождается открытием the nonselective mitochondrial permeability transition (MPTP-пор), через которые различные ионы и вода поступают в матрикс, происходит его набухание, складки внутренней мембраны расправляются, а внешняя мембрана, площадь которой меньше площади внутренней мембраны, разрывается [Chang JC. et al., 2010]. При этом все белки, растворенные в межмембранном пространстве, в том числе, и цитохром С, поступают в цитозоль, где последний связывается с другими белками, в том числе с "первым фактором, активирующим апоптоз" - Apaf-1, каспазой 9, образуя так называемые апоптосомы. Каспаза 9 атакует прокаспазу 3, расщепляя ее с образованием активной каспазы 3. Каспаза 3 - это протеаза, которая осуществляет протеолиз ферментов, белков-предшественников нуклеаз и структурных белков [Chang J.C. et al., 2010]. Все это в конечном счете ведет к смерти клетки и гидролизу ее белков и нуклеиновых кислот до аминокислот и нуклеотидов [Hajnoczky G. еt al., 2006]. Перегрузка Ca2+ митохондрий является одним из факторов, который вызывает открытие MPTP-пор. Продукция активных форм кислорода является ключевым механизмом, с помощью которого митохондрии вовлечены в развитие таких CCЗ, как ИБС, кардиомиопатии, повреждения при ишемии/реперфузии миокарда, сердечная недостаточность, аритмии. Активные формы кислорода индуцируют целый ряд нарушений, одно- и двунитевые разрывы, делеции, хромосомные транслокации, которые способствуют как геномной, так и митохондриальной нестабильности [Gorenne I. еt al, 2006]. 23 Хотя активные формы кислорода, несомненно, играют важную роль в повреждении мтДНК при атеросклерозе, данные исследования Е.Yu свидетельствуют о другой механизме, связывающем повреждения мтДНК и атеросклероз. Дефекты мтДНК способствуют снижению экспрессии генов, кодирующих белки дыхательных комплексов, что приводит к уменьшению выработки АТФ в ГМК, моноцитах/макрофагах, что стимулирует апоптоз и ингибирует пролиферацию клеток [Yu Е. et al., 2013]. В исследовании, проведенном на апоЕ-нокаутированных мышах, показано, что в образцах аорты апоЕ-нокаутированных мышей значительно более высокие уровни повреждения мтДНК по сравнению с образцами аорты контрольной группы животных (р<0,001) и установлено, что повреждения мтДНК предшествует атерогенезу [Ballinger W. et al., 2002]. Так же было показано, что у мышей с дефицитом супероксиддисмутазы - митохондриального фермента, являющегося антиоксидантом, - отмечено развитие повреждений мтДНК и более раннее развитие атеросклероза. В этом же исследовании было продемонстрировано на аутопсийном материале, что в атеросклеротически измененных участках аорты человека больше повреждений мтДНК, чем в неизмененных участках аорты [Ballinger W. et al., 2002]. На модели мышей в исследовании показано, что моноциты/макрофаги, содержащие повреждения мтДНК, увеличивают производство фактора некроза опухоли-α и интерлейкина-1, способствуя увеличению некротического ядра атеросклеротической бляшки и истончения ее фиброзного покрытия [Yu Е. et al., 2013]. Повреждения мтДНК обнаруживают как в циркулирующих клетках, так и в атеросклеротических бляшках больных атеросклерозом. Например, в клетках содержится большое количество смысловых белков, которые изменяют свой физиологический ответ при повреждении ДНК. Белок АТМ (ataxia telangiectasia mutated) - фосфатидилинозитол-3-киназа - необходим для репарации ДНК и 24 поддержания геномного гомеостаза. Белок АТМ регулирует митохондриальный биогенез и содержание мтДНК [Eaton J.S. еt al., 2007]. Дефицит АТМ приводит к нарушениям в дыхательной цепи митохондрий [Ambrose M. еt al., 2007]. Исследования показали, что повреждение ферментов репарации ДНК способствует прогрессированию атеросклероза [Miles P.D. еt al., 2007]. Митохондрии являются динамическими органеллами эукариотических клеток. В последние годы показана роль, по крайней мере, четырех ферментов гуанозинтрифосфатаз: mitofusin 1 (MFN1), MFN2, optic atrophy 1 (OPA1) и dynaminrelated protein 1 (DRP1), играющих значимую роль в процессах митохондриального распада/синтеза [Twig G. et al., 2008]. Митохондриальный синтез обусловливает митохондриальную морфологию и является многоступенчатым процессом, включающим синтез на внешней и внутренней мембранах митохондрий. В процессах синтеза на наружной мембране MFN1 и MFN2 помогают связывать соседние митохондрии, формируя гомо- и гетеродимеры. Далее, на внутренней мембране, OPA1 ответственна за слияние крист, что приводит к смешиванию содержимого матрикса [Song Z. et al., 2007]. Митохондриальный распад регулируется DRP1, находящейся на внешней мембране [Smirnova митохондрий, E. et вероятно, это al., 2001], активизируется при дисфункции обусловлено повреждением OPA1. Однако торможение распада также приводит к митохонриальной дисфункции и потере мтДНК. Избыточный распад и дефицит синтеза приводит к деформации митохондриальных сетей, потере мтДНК, нарушению дыхательных процессов и повышению уровня активных форм кислорода [Yaffe M.P., 1999], а также к высвобождению цитохрома С. Поли(AДФ-рибоза)-полимераза-1 (PARP-1) - преобладающая изоформа группы ферментов клеточного ядра, участвующих в модификации структуры хроматина, регулирующих транскрипцию генов, а также детектирующих и устраняющих повреждения ДНК [Virág L. еt al., 2005]. Хотя этот фермент 25 является ключевым для восстановления поврежденной патогенными факторами ДНК, в случае массивного повреждения ДНК и гиперактивации PARP-1 наблюдается нарушение работы энергетических цепей клетки, что также ведет к разрушению клеточной структуры. Более того, показано, что данный фермент вовлечен в апоптотический каскад, модулируя транслокацию запускающего апоптоз фактора AIF из митохондрий в ядро в клетках, поврежденных окислительным стрессом [Andrabi S.A. еt al., 2006]. Этот фермент регулирует уровень транскрипции различных белков, вовлеченных в процесс воспаления, таких как циклооксигеназа-2 и главный комплекс гистосовместимости класс II, а также различных воспалительных хемокинов и цитокинов [Szabó C. еt al., 2006]. В ряде работ продемонстрировано, что ингибирование AIF уменьшает экспрессию Р- и Е- селектина, снижает количество воспалительных клеток в составе бляшки и увеличивает признаки ее стабильности [von Lukowicz T. еt al., 2008]. Активация и циркулирующих гиперпродукция мононуклеарных PARР-1 клетках у также была выявлена в пациентов с нестабильной стенокардией, и установлена стимулирующая роль фермента на продукцию фактора некроза опухоли-α и интерлейкина-6 [Huang D., 2008]. Таким образом, митохондрии и повреждения мтДНК играют важную роль в развитии и прогрессировании атеросклероза [Ferrari R., 1996]. 1.5. Факторы риска атеросклероза и митохондрии. Существуют доказательства того, что классические факторы риска ССЗ ассоциируются с повышением уровня производства активных форм кислорода [Ito H еt al., 1995; van Jaarsveld H. еt al., 1992; Ballinger S.W. еt al., 2002]. Активные форма кислорода и азота играют центральную роль в некоторых из наиболее важных процессов, участвующих в атерогенезе, в том числе, дисфункции и апоптозе эндотелиальных клеток, активации матриксных металлопротеиназ, росте сосудистых ГМК и их миграции в интиму, экспрессии молекул адгезии и окислении ЛНП [Harrison D. еt al., 2003; Fearon I.M. еt al., 26 2009]. Все эти процессы способствуют последующей прогрессии атеросклеротического поражения. Сердечно-сосудистые факторы риска могут быть вовлечены в этот процесс, отрицательно влияющий на функцию эндотелиальных митохондрий. К настоящему времени все больше появляется данных, подтверждающих гипотезу, что митохондриальная дисфункция может быть наиболее важным объединяющим механизмом, объясняющим атерогенное действие основных факторов риска ССЗ [Puddu P. еt al., 2009]. Холестерин ЛНП и окисленный ХС ЛНП могут вызвать повреждение митохондрий [Ballinger S.W., 2005]. В экспериментальных исследованиях показано, что кормление кроликов пищей с высоким содержанием холестерина способствует развитию дисфункции митохондрий [Mikaelian N.P. еt al., 1983]. Нагрузка макрофагов свободным холестерином ассоциировано с митохондриальной дисфункцией, предполагается, что происходит снижение трансмембранного потенциала митохондрий и активация митохондриального пути апоптоза – процесса, играющего ключевую роль в атерогенезе [Yao P.M., еt al., 2001]. Циркулирующие окисленные ХС ЛНП представляют собой независимый фактор риска развития атеросклероза и ССЗ. Окисленные ХС ЛНП вызывают увеличение митохондриальной продукции активных форм кислорода в клетках эндотелия [Sato T. еt al., 2004] через активацию митохондриального комплекса II, НАДН-оксидазы [Fleming I. еt al., 2005]. Воздействие окисленных ХС ЛНП на предшественников эндотелиоцитов и зрелые клетки приводит к увеличению производства митохондриями супероксида, что ассоциируется с увеличением экспрессии p53 и последующей активацией проапоптотического протеина Bax. Активированный протеин Bax перемещается в митохондриальные мембраны, где он стимулирует открытие канала, через которые поступает цитохром С, вызывающий апоптотические реакции. Протеин Bax является компонентом многодоменного Bcl-2 проапоптотического белка, его активация и перемещение в митохондрии, как было показано, вызывают митохондриальную 27 дисфункцию и апоптоз клеток [Wei M.C. еt al., 2001]. Окисленные ХС ЛНП вызывают апоптоз во всех клетках, участвующих в атеросклерозе: эндотелиальных клетках, ГМК, макрофагах, Т-лимфоцитах [Geng Y.J. еt al., 2002]. Как и другие факторы риска атеросклероза, артериальная гипертония (АГ) связана с эндотелиальной дисфункцией и окислительным стрессом [Redón J. еt al., 2003; Paravicini T.M. еt al., 2006; McIntyre M. еt al., 1999; Ward N.C. еt al., 2006]. Уменьшение продукции АТФ и снижение активности комплекса IV были обнаружены в гипертрофированном миокарде крыс с экспериментальной АГ [Chen L. еt al., 1995]. Было показано, что у этих животных нарушается транспорт неорганических фосфатов в митохондриях левого желудочка [Seccia T.M. еt al., 1999]. Также при АГ отмечается нарушение работы митохондриальной АТФсинтазы в кардиомиоцитах. Кроме того, перегрузка митохондрий кальцием вносит значительный вклад в развитие гипертонии [Postnov Iu.V., 2001]. Мутации мтДНК были описаны у афроамериканцев с АГ, обусловленной терминальной стадией почечной болезни [Watson B.Jr. еt al., 2001]. Кроме того, было показано, что мутации генов митохондриальной тРНК связаны с гипертонией и гиперхолестеринемией [Wilson F.H. еt al., 2004]. Курение сигарет может значительно увеличить риск развития раннего атеросклероза, влияя на функцию митохондрий. Помимо повреждения эндотелия, активации тромбоцитов и окисления ХС ЛНП, атерогенные эффекты курения обусловлены также окислительным повреждением мтДНК с появлением делеций мтДНК и потерей митохондриального мембранного потенциала [Miró O. еt al., 1999; Eaton M.M. еt al., 2006; Yang Z. еt al., 2004]. Слюна курильщиков и бывших курильщиков по сравнению с никогда не курившими людьми содержит поврежденную мтДНК, что свидетельствует о ее окислительном повреждении [Miró O. еt al., 1999]. 28 Повышение гомоцистеина в плазме крови является независимым фактором риска развития атеросклероза. Было высказано предположение, что дисфункция эндотелия и атеросклероз могут быть вызваны увеличением продукции активных форм кислорода и сниженим содержания NO, обусловленными гомоцистеинемией [Duell P.B. еt al.,1997; Kanani P.M. еt al., 1999]. Austin R.C. и соавт. показали, что гомоцистеин способствует повреждению митохондрий и изменяет экспрессию митохондриальных генов и функцию митохондрий [Austin R.C. еt al., 1998]. Кроме того, гомоцистеин стимулирует экспрессию nuclear respiratory factor 1 и transcription factor A mitochondrial - двух ядерных транскрипционных факторов, участвующих в модуляции митохондриального биогенеза. Кроме того, гомоцистеин вызывает апоптоз эндотелиоцитов через митохондриальные механизмы [Tyagi N. еt al., 2006]. Распространенность атеросклероза коронарных и сонных артерий увеличивается с возрастом. Большое количество доказательств подтверждает гипотезу, что нарушение митохондриального окисления является одной из основных причин старения [Harman D. еt al., 1983; Тодоров И.Н., 2007]. Исследования, выполненные у человека и животных, показали возрастное снижение митохондриальной дыхательной функции и активности АТФ-синтазы. Митохондриальная теория старения постулирует [Hsieh R.H. еt al., 1994], что продукция активных форм кислорода, повреждение мтДНК и дисфункция дыхательной цепи митохондрий связаны друг с другом, создают порочный круг, что приводит к прогрессирующему снижению функций митохондрий и нарушению жизнеспособности клеток. Было показано, что вследствие окислительного повреждения мутации мтДНК накапливаются с возрастом в организме человека и животных [Cortopassi еt al., 1992]. Исследования последнего десятилетия свидетельствуют о независимой от классических факторов риска роли повышенного уровня Лп(а) в развитии атеросклероза [Ежов М.В, 2009]. Лп(а) представляет собой частицу, схожую по 29 строению с ЛНП, в состав которой входит одна молекула апобелка (а), связанная с молекулой апобелка В100. Особенности строения Лп(а) определяют ее атеротромбогенный потенциал [Loscalzo J., 1990]. У больных с высоким риском развития сердечно-сосудистых осложнений в 37-40% случаев выявляется высокий уровень Лп(а) [Marcovina S., 2003]. Исследования последних лет продемонстировали причинную связь Лп(а) с ИБС [Erqou S. et al., 2010]. В связи с чем, представляет интерес изучение возможной взаимосвязи мутациий митохондриального генома с Лп(а). 1.6. Мутации митохондриального генома, ассоциированные с атеросклерозом коронарных и сонных артерий. Митохондриальный биогенез и регулирование митохондриальных функций является результатом сложного процесса, который включает в себя скоординированную экспрессию митохондриальных и ядерных генов [Camara A.K. et al., 2010]. Большая часть мтДНК кодирует белки дыхательной цепи. Ядерная ДНК кодирует часть митохондриальных белков и регулирует многочисленные митохондриальные функции. Например, комплексы I и III кодируются яДНК и мтДНК, тогда как комплекс II кодируется только яДНК. Некоторые субъединицы IV комплекса, в зависимости от типа тканей, также могут быть закодированы мтДНК [Kogelnik A.M. et al., 1998]. По литературным данным, с атеросклерозом ассоциируется 17 мутаций митохондриального генома. Эти мутации локализуются в 6 генах тРНК, генах субъединицы 12S рРНК, генах второй и пятой субъединиц НАДН- дегидрогеназы. Мутации G1541A, A1555G расположены в гене 12S рРНК, приводящие к снижению функции рибосом. Ассоциированы с такими заболеваниями, как кардиоэнцефаломиопатия, ИБС, глухота [Jaksch M. et al., 2000, 2001; Lu J. et al., 2000]. 30 Мутация C1624T локализована в гене тРНК–Val, при её наличии происходит замена цитозина на урацил в позиции 25 тРНК-Val, вследствие чего происходит изменение вторичной структуры тРНК, что приводит к снижению активности тРНК–Val. Данная мутация ассоциирована с гипертрофической кардиомиопатией [Pohjoismäki J.L. et al., 2010; Rorbach J. et al., 2008]. Мутации C3256T, A3243G, A3260G расположены в гене тРНК–Leu, приводят к снижению ее активности. Асоциированы с синдромом MELAS [Connolly B.S. et al., 2010; Jeppesen T.D. et al., 2003; Nomiyama T. et al., 2004]. Мутации A4269G, A4300G, A4317G расположены в гене тРНК–Ile, вызывают дефект тРНК–Ile, приводя к снижению ее активности, при наличии данных мутаций развиваются такие заболевания, как несемейная дилатационная и гипертрофическая кардиомиопатия, глухота, эпилепсия, фатальная детская кардиомиопатия [Arbustini E. et al., 1998; Degoul F. et al., 1998; Tomari Y. et al., 2003; Taylor R. et al., 2003]. Мутация A4833G расположена в гене субъединицы НАДН-дегидрогеназы, приводит к снижению функции фермента. Способствует развитию инсулинзависимого сахарного диабета [Kong Q.P. et al., 2006]. Мутации A8296G, G8363A возникают в гене тРНК–Lys, вызывают дефект тРНК–Lys, приводя к снижению её активности [Bornstein B. et al., 2005]. Ассоциированы с такими заболеваниями, как энцефаломиопатия, нейросенсорная тугоухость, гипертрофическая кардиомиопатия, синдром MERR [Santorelli F.M. et al., 1996]. Мутация T9997C расположена в гене тРНК–Gly, при наличии которой наблюдается дефект тРНК–Gly, приводящий к снижению ее активности [Raha S. et al., 1999]. Вызывает развитие гипертрофической кардиомиопатии у детей [Turner L.F. et al., 1998]. 31 G12192A – мутация гена тРНК–His, приводящая к снижению ее активности, вызывает дилатационную гипертрофию [Mimaki M. et al., 2003; Shin W.S. et al., 2000]. T12297C, G12315A – мутации, расположенные в гене тРНК-Leu, приводят к снижению ее активности. Ассоциированы с ткими заболеваниями, как ИБС, офтальмоплегия, птоз, нейросенсорная тугоухость, пигментная ретинопатия [Fu K. et al., 1996; Grasso M. et al., 2001]. Мутация G14846A ведет к изменению аминокислотного состава цитохрома В, который является частью комплекса III дыхательной цепи. При мутировании меняется аминокислота глицин на серин, что создает дополнительный сайт фосфорилирования белковой цепи [Andreu A.L., 1998]. Мутация G13513A возникает в гене субъединицы 5 НАДН-дегидрогеназы, вызывая дефект белковой цепи фермента, приводя к снижению его функции [Chol M. et al., 2003]. Ассоциирована со следующими заболеваниями молочнокислый ацидоз, MELAS синдром, болезнь Лебера [Shanske S. et al., 2008]. 1.7. Исследования, посвещенные изучению связи мутаций митохондриального генома с атеросклерозом. В исследовании, выполненном в ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ, при изучении мутации митохондриального генома G14459А в образцах ДНК, выделенных из пораженных атеросклерозом и нормальных участков интимы аорты 10 молодых людей, погибших вследствие несчастного случая, обнаружено, что уровень гетероплазмии значительно выше в атеросклеротически измененных участках аорты [Sazonova M. et al., 2009]. Мутация G14459А вызывает дефект шестой белковой субъединицы фермента дыхательной цепи митохондрий, способствуя изменению работы НАДН-дегидрогеназы. Ассоциация данной мутации с атеросклеротическим поражением, возможно, связана с тем, что уменьшение количества нормально функционирующих ферментов в митохондриях приводит к окислительному стрессу клеток интимы сосудов человека. 32 В клиническом исследовании, выполненном в ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ с участием 191 больных, была показана ассоциация между уровнем гетероплазмии мутации С3256Т в лейкоцитах крови и атеросклеротическим поражением каротидного бассейна, а также наличием ИБС. У лиц, перенесших инфаркт миокарда, был отмечен более высокий уровень гетероплазмии по полиморфизму С3256Т по сравнению с лицами без инфаркт миокарда в анамнезе [Sobenin I.A. еt al., 2012]. Еще в одной работе, выполненной в ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ, проведен анализ уровня гетероплазмии мутации 652insG митохондриального генома человека. Полученные результаты показывают значительную гетероплазмию данной мутации, не только между различными участками интимы аорты, но и между лейкоцитами крови больных атеросклерозом и здоровых доноров. Был определен пороговый уровень гетероплазмии мутации 652insG митохондриального генома и он равен 20% [Сазонова М.А. и соавт., 2010г]. В другом исследовании сравнивали частоту встречаемости мутации T16189C мтДНК у пациентов с ИБС (n=482) и сахарным диабетом 2 типа (СД 2 типа) (n=505) со здоровыми европейцами (n=1481), проживающими в Австрии. По сравнению с контрольной группой, распространенность мутации T16189C была значительно выше среди пациентов с ИБС (11,8% против 21,6%), а также у пациентов с СД 2 типа (11,8% против 19,4%) [Mueller E.E. et al. 2011]. Ассоциация мутации T16189C с ИБС, но не с СД 2 типа, оставалась весьма значительной после внесения поправки на возраст, пол и индекс массы тела. Данное исследование впервые показало ассоциацию мутации T16189C митохондриального генома с ИБС у лиц европейского населения. Ассоциация мутации Т16189С с ИБС предположительно является результатом изменения белков, связанных с этим регионом, что впоследствии приводит к нарушению репликации мтДНК [Poulton J. еt al., 2002]. 33 Abu-Amero К.К. в исследовании с участием 669 пациентов, у которых диагноз ИБС был подтвержден при коронарографии, обнаружили более высокую распространенность мутации T16189C среди больных ИБС по сравнению с лицами контрольной группы (n=258): 27,8% в сравнении с 20,2%, р = 0,017 [AbuAmero К. К. et al., 2010]. Таким образом, описанные мутации митохондриального генома могут быть использованы в качестве маркера генетической предрасположенности к атеросклерозу коронарных и сонных артерий. 1.8. Новые митохондриальные объекты терапии. Знание функций митохондрий в нормальных и патологических условиях имеет решающее значение не только для понимания причин ССЗ, но и для разработки терапевтических стратегий. Например, уменьшение электронного транспорта, предотвращение открытия MPTP-пор или активация митохондриальных калиевых каналов являются возможными путями для устранения митохондриальных нарушений и сосудистой дисфункции [Doughan А.К. et al., 2008]. Таким образом, если митохондриальные нарушения прямо или косвенно способствуют развитию патологических состояний, то устранение митохондриальной дисфункции должно уменьшить тяжесть или замедлить прогрессирование заболевания [Camara А.К. et al., 2010]. Митохондрии всех клеток сердечно-сосудистой системы могут быть потенциальными мишенями для терапевтического вмешательства при лечении ССЗ. Открытие MPTР-пор является ведущим механизмом некроза и апоптоза клетки при ишемическом поражении [Crompton M., 1987]. Препараты, воздействующие на эти молекулы, являются перспективными терапевтическими кардиопротективными агентами. Первый препарат, инибирующий открытие MPTР-пор, циклоспорин А [Fournier N. еt al., 1987]. Циклоспорин А показал защитные свойства при ишемии-реперфузии в кардиомиоцитах [Griffiths E.J. еt al., 2000]. Пилотное клиническое исследование демонстрировало уменьшение 34 зоны некроза на 20% при введении препарата перед чрескожным коронарным вмешательством у пациентов с острым инфарктом миокарда [Piot C. еt al., 2008], причем эффект сохраняется и через 6 месяцев наблюдения [Mewton N. еt al., 2010]. Исследование 3 фазы (NCT01502774) в настоящее время еще не завершено. Роль оксида азота в эндогенной кардиопротекции. Оксид азота переносится в митохондрию различными молекулами, одним из таких переносчиков является S-нитромеркаптопропилглицин [Nadtochiy S.M. еt al., 2007]. Эта молекула активно накапливается в митохондрии и демонстрирует кардиопротективный эффект в животных моделях при ишемии – реперфузии. [Nadtochiy S.M. еt al., 2009]. Другой вид производных NO, участвующих в митохондриальном метаболизме, - нитролипиды. Эти молекулы синтезируются в митохондриях при ишемическом прекондиционировании, а, будучи добавленными экзогенно, оказывают защитное действие при ишемии-реперфузии миокарда [Rudolph V. еt al., 2010]. Производные нитролипидов в настоящее время также проходят клинические испытания. Наконец, значительное внимание недавно привлекли антиишемические свойства нитрита (NO2−) [Duranski M.R. еt al., 2005; Shiva S. еt al., 2007]. Инъекционный нитрит натрия одобрен как антидот при отравлениях цианидами, и в настоящее время идут исследования его антиишемических свойств (NCT01401517, NCT00924118, NCT01098409). Митохондриальные К+ каналы. Внутренняя мембрана митохондрий содержит большое количество ионных каналов [O’Rourke B., 2007]. В настоящее время много исследований проводится по изучению роли К+ каналов в кардиопротекции. Митохондриальные АТФ-зависимые К+ каналы играют основную роль при ишемической кардиопротекции [Garlid K.D. еt al., 1997; Murata M. еt al., 2001]. Во время кратковременного ишемического эпизода кардиомиоциты начинают выделять аденозин и брадикинин, что вызывает активацию протеинкиназы С, тирозинкиназ, митоген-активирующей 35 протеинкиназы, киназы, фосфатидилинозитол-3-киназы и других ферментов [Argaud L. еt al., 2005]. Происходит активация и открытие митохондриальных АТФ-зависимых К+ каналов [Awad W.I. еt al., 1998]. В частности, было показано, что введение животным фармакологических агонистов митохондриальных АТФзависимых К+ каналов непосредственно перед продолжительной ишемией приводит к следующим эффектам: 1) ослаблению внутриклеточной, в том числе, и внутримитохондриальной перегрузки ионами Са2+; 2) снижению сократительной способности миокарда и, соответственно, его потребности в энергии; 3) стимулированию образования необходимого количества активных форм кислорода и уменьшению выраженности оксидативного стресса; 4) предотвращению отёка матрикса митохондрий; 5) оптимизации синтеза АТФ; 6) замедлению процесса апоптоза; 7) стабилизации структуры мембран кардиомиоцитов. Благоприятные (кардиопротективные) эффекты ишемического прекондиционирования выражаются в уменьшении зоны инфаркта, улучшении насосной функции сердца, снижении частоты желудочковых аритмий на фоне ишемии, тогда как введение ингибитора канала предотвращало ишемическую прекондицию [Liu Y. еt al., 1998]. Кроме того, ишемическое прекондиционирование уменьшает степень повреждения ткани миокарда в результате реперфузии. Наиболее активно изучаемое соединение, способствующее открытию этих каналов, - диазоксид, который демонстрировал протективный эффект на животных моделях. В ходе двух небольших клинических исследований была показана кардиопротективная роль диазоксида при предварительном введении или использовании его при кардиоплегии в ходе хирургического вмешательства [Wang X. еt al., 2003; Deja M.A. еt al., 2009]. Другие факторы, способствующие открытию митохондриальных АТФ- зависимых К+ каналов, такие как BMS-191095, пинацидил, кромакалим, миноксидил и никорандил (который, не показал эффекта в 3 фазе клинических испытаний при остром инфаркте миокарда (J-WIND)) [Kitakaze M. еt al., 2007], 36 демонстрировали кардиопротективный эффект на животных моделях [Grover G.J. еt al., 2002; Sato T. еt al., 2004; Auchampach J.A. еt al., 1992]. Молекулярная структура митохондриальных АТФ-зависимых К+ каналов не до конца понятна. Точное определение структуры К+ каналов поможет в создании препаратов, направленных на регулирование работы этих каналов. Замечено, что применение фармакологических препаратов, таких как флуоксетин и некоторых препаратов сульфонилмочевины, подавляет работу К+ каналов, тем самым, блокируя протективный эффект ишемического прекондиционирования. Несмотря на экспериментальные данные о важности окислительного стресса в стимулировании атеросклероза, клинические исследования не продемонстрировали наличие у антиоксидантов какого-либо влияния на атерогенез [Tsutsui H. еt al., 1999; Yusuf S. еt al., 2000; Rapola J.M. еt al., 1997]. Некоторые исследования показали, что антиоксиданты, такие как альфатокоферол, убихинон и N-ацетилцистеин, могут привести к снижению митохондриального окислительного повреждения в различных экспериментальных моделях [Lass A. еt al., 1998; Victor V.M. еt al., 2003, 2005]. Однако эффективность этих препаратов ограничена, так как они не накапливаются в митохондриях [Kagan V.E. еt al., 1994], а стратегии, позволяющие доставить антиоксиданты в митохондрии, сейчас находятся в стадии развития [Armstrong J.S., 2007]. В то же время некоторые новые антиоксиданты, такие как мелатонин, мангафодипир и эдаравон, в настоящее время проходят клинические испытания. Физические упражнения улучшают функцию эндотелия у пациентов высокого сердечно-сосудистого риска [Hosokawa S. еt al., 2003; Lim S. еt al., 2011]. Кроме того, сообщалось, что более высокий уровень привычной физической активности связан с улучшением функции эндотелия у пациентов с ИБС [Luk T.H. еt al., 2009]. В другом исследовании показано, что физические 37 упражнения приводят к снижению общей и сердечно-сосудистой смертности у пациентов с ИБС [Shibata Y. еt al., 2011]. Заключение. Таким образом, в последнее время появляется все больше данных, что мутации митохондриального генома способствуют развитию атеросклеротического поражения сосудов. Дальнейшие исследования в этом направлении представляются необходимыми. Понимание точных механизмов, с помощью которых мутации митохондриального генома и, как следствие, митохондриальная дисфункция способствуют развитию атеросклероза, откроет новые мишени для разработки лекарственных препаратов. С другой стороны, мутации митохондриального генома могут быть использованы в качестве информативных маркеров генетической предрасположенности к атеросклерозу. 38 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Дизайн исследования. Работа выполнена в отделе проблем атеросклероза (руководитель – членкорреспондент РАМН, д.м.н., проф. В.В. Кухарчук) и в отделе сердечнососудистой патологии (руководитель – д.м.н. А.Ю. Постнов) НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «Российский кардиологический научно- производственный комплекс» МЗ РФ. Исследование было одномоментное. Критерии включения: мужчины и женщины ≥18 лет, имеющие показания для проведения коронарной ангиографии. Критерии исключения: семейная гиперхолестеринемия; концентрация триглицеридов (ТГ) ≥4,5 ммоль/л; острый коронарный синдром, оперативные вмешательства в последние 3 месяца; онкологические заболевания в анамнезе; сахарный диабет; дисфункция печени, почек, щитовидной железы. В исследование включены больные, прошедшие коронарную ангиографию (КАГ) во время госпитализации в 6-е клиническое отделение НИИ кардиологии им. А.Л.Мясникова в период 2010-2012 гг. Общая характеристика больных. В исследование включены 193 человека (154 мужчин, 39 женщин, в возрасте от 33 до 78 лет, средний возраст 54,69,5 лет). Исходя из данных ангиографии, обследованные больные были разделены на 2 группы: основную группу составили 130 пациентов с атеросклерозом коронарных артерий. Группу контроля составили 63 пациента с интактными коронарными артериями. 39 Среди пациентов, включенных в исследование (таблица 1), преобладали мужчины (80%). Женщины были существенно старше мужчин. Артериальной гипертонией страдали 2/3 пациентов, курение в прошлом и/или в настоящее время было примерно у половины больных, отягощенный семейный анамнез по ССЗ определен у 38% участников, ожирение отмечено у 1/3 пациентов. В связи с тем, что исследование было одномоментное, не у всех пациентов были целевые значения липидов на момент включения в исследование, в последующем проводилась коррекция гиполипидемической терапии. Таблица 1. Общая характеристика больных. Показатель Количество мужчин Возраст, лет - мужчин - женщин Артериальная гипертония Гиперлипидемия Курение в прошлом и/или настоящее время Отягощенный семейный анамнез по ССЗ: - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл Пациенты, n=193 154 (80%) 54,69,5 53,18,8 60,59,8 140 (73%) 174 (90%) 103 (53%) 73 (38%) 31 (16%) 42 (22%) 58 (30%) 4,91,2 1,20,3 3,11,0 1,91,3 35,6 (6,1; 91,3) Примечание. ОХС – общий холестерин, ХС ЛВП - холестерин липопротеидов высокой плотности, ХС ЛНП - холестерин липопротеидов низкой плотности, ТГ – триглицериды, Лп(а) – липопротеид(а). 2.2. Общеклиническое обследование. Обследование больных проводилось в стационарных условиях и включало в себя сбор жалоб, анамнеза с оценкой наличия факторов риска ССЗ (АГ, курение, отягощенный семейный анамнез по ССЗ по материнской и отцовской линии, 40 ожирение, гиперлипидемия), сопутствующих заболеваний. Проводилось антропометрическое исследование (измерение роста, веса). Артериальную гипертонию диагностировали на основании рекомендаций [Национальные рекомендации по диагностике и лечению артериальной гипертонии, 2009]. Статус курения оценивали следующим образом: 1 - никогда не курившие, 2 курение в прошлом и/или в настоящее время (не менее 5 лет более 10 сигарет в день). Семейный анамнез по ССЗ считался отягощенным при указании на инфаркт миокарда, внезапную сердечную смерть или инсульт у родственников первой линии: у мужчин до 55 лет и женщин до 65 лет. Всем больным определяли индекс массы тела как отношение массы тела (в кг) к росту, выраженному в м². Если индекс массы тела превышал 30 кг/м², регистрировали ожирение. Если у пациента концентрация ОХС превышала 5,0 ммоль/л и/или уровень триглицеридов был более 1,7 ммоль/л, регистрировали гиперлипидемию. Если указание в анамнезе на перенесенный инфаркт миокарда сочеталось с одним из трех объективных признаков (рубцовые изменения на электрокардиограмме, зоны нарушенной локальной сократимости по данным эхокардиографии или вентрикулографии), диагноз постинфарктного кардиосклероза считали доказанным. 2.3. Инструментальные методы обследования. Коронарография. Коронарографию проводили в лаборатории рентгенэндоваскулярных методов диагностики и лечения в амбулаторных условиях научно-диспансерного отдела НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова (руководитель - д.м.н. Ю.Г. Матчин). Коронарография выполнялась на аппарате Allura Xper FD-10 (Philips, Нидерланды). Изображение левой коронарной артерии регистрировалось в 41 ортогональных стандартных проекциях, изображение правой коронарной артерии – в двух стандартных проекциях. Скорость регистрации изображения составляла 15 кадров в секунду. Автоматический количественный анализ ангиограмм проводился на цифровой системе “Xcelera” (Philips, Нидерланды). Для автоматического количественного анализа ангиограмм выбирался конечный диастолический кадр проекции с визуализацией максимальной степени стенозирования. Оценка поражения коронарного русла проводилась на основе ангиографической симптоматологии по двум методикам: 1) с учетом числа пораженных магистральных артерий (1; 2; 3), имеющих сужение просвета более 70% по диаметру; 2) по суммарному индексу стенозов (индекс Gensini), учитывая степень уменьшения просвета 15 основных сегментов коронарных артерий (Рекомендации Американской Ассоциации Сердца, 1975): ствол левой артерии, проксимальные, средние и дистальные сегменты трех магистральных артерий, септальные, первая и вторая диагональные ветви передней нисходящей артерии, артерии тупого края, задне-боковая и задне-нисходящая артерии. Одним баллом оцениваются сужение просвета артерии до 50% по диаметру; 2 - на 50 - 74%; 3 на 75 - 99% и 4 - окклюзия сосуда. Сумма баллов, полученная при оценке поражения коронарного русла, представляет собой коронарный индекс стенозов для каждого больного. Инструментальные методы исследования проводили в отделе новых методов исследования НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова (руководитель - д.б.н., проф. А.Н. Рогоза). Дуплексное сканирование экстракраниального отдела брахиоцефальных артерий проведено 178 пациентам (92%). Исследование брахиоцефального ствола, правой и левой общих сонных артерий, внутренних и наружных сонных артерий, позвоночных и подключичных артерий проводилось по стандартной методике в В-режиме с цветовым допплеровским картированием 42 потоков линейным датчиком 7 Мгц ультразвуковой системы «АСUSON 128 ХР 10», а также на аппарате Philips iU 22 и Philips Ewiser. У всех больных оценивали наличие атеросклеротических бляшек с оценкой степени стенозирования. Атеросклеротическая бляшка определялась как «фокальная» структура, выступающая в просвет артерии не менее, чем на 0,5 мм или на 50% от величины толщины интима-медиа прилегающих участков артерии, либо имеющая толщину, измеренную как расстояние между линиями раздела «медиа - адвентиция» и «просвет артерия - интима» более 1,5 мм (по данным Международного консенсуса по ТИМ 2004-2006 годов) [Touboul P.J. et al., 2007]. 2.4. Лабораторные методы исследования. 2.4.1. Биохимическое исследование. Кровь для исследования брали из локтевой вены утром через 12-14 ч после последнего приема пищи. Определяли концентрацию ОХС, ТГ, холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС ЛВП), в сыворотке крови ферментативным колориметрическим методом в лаборатории клинической биохимии липидного обмена (руководитель – д.б.н., проф. В.Н. Титов). Содержание ХС ЛНП рассчитывали по формуле Фридвальда (1972): ХС ЛНП = ОХС - ХС ЛВП - ТГ/2,2 (ммоль/л). Определение концентрации Лп(а) сыворотки крови выполняли в лаборатории проблем атеросклероза (рук. - д.б.н., проф. С.Н.Покровский) Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием моноспецифических поликлональных антител барана против Лп(а) человека [Афанасьева О.И. и др., 1995]. Также оценивали концентрацию глюкозы крови натощак. 2.4.2. Генетические исследования проводились в лаборатории медицинской генетики НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ (руководитель - д.м.н., проф. А.Ю. Постнов). 43 Для данного клинического исследования было выбрано 4 мутации G13513A, G14846A, C3256Т и G12315A (таблица 2), для которых повышенный уровень гетероплазмии был связан с атеросклеротическим поражением по данным аутопсии [Sazonova M. et al., 2009]. Таблица 2. Локализация исследуемых мутаций в митохондриальном геноме. Мутации Ген мтДНК Кодируемый продукт C3256T MT-TL1 тРНК лейцина (кодон узнавания UUR) G12315A MT-TL2 тРНК лейцина (кодон узнавания CUN) G13513A MT-ND5 Субъединица 5 NADH-дегидрогеназы G14846A MT-CYB Цитохром В Все исследуемые мутации расположены в кодирующей области митохондриального генома. 2.4.3. Выделение тотальной ДНК из лейкоцитов периферической крови. Для исследования мутаций митохондриального генома (С3256Т, G12315A, G13513A, G14846А) кровь собирали в пробирки, содержащие этилендиаминтетраацетат в качестве антикоагулянта. Кровь замораживали и хранили при -20оС до проведения анализа. Выделение тотальной ДНК из лейкоцитов цельной крови проводили методом фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К. Кровь размораживали, тщательно перемешивали и отбирали 700 мкл в пробирку типа «эппендорф» объемом 1,5 мл и добавляли 700 мкл Т10Е1-буфера (10мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1мМ ЭДТА), содержимое перемешивали на вортексе. Далее проводили осаждение клеточного осадка центрифугированием в течение 2 мин при 13400 об/мин на центрифуге «Mini Spin». Удаляли супернатант, клеточный осадок расуспендировали на вортексе, затем добавляли 1 мл Т10Е1-буфера и повторяли осаждение клеток центрифугированием. Удаляли весь супернатант. Повторяли отмывку несколько раз. К полученному клеточному осадку добавляли 44 400 мкл буфера для протеиназы К (10мМ Трис-HCl, рН 7,4, 10 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl), содержащего 0,5% додецилсульфата натрия и 100 мкг/мл протеиназы К. Протеиназу К добавляли перед выделением. Полученную смесь инкубировали при 50оС в термостате течение 60омин. Далее пипетированием ресуспендировали осадок и инкубировали при температуре 500С 18 часов. Спустя 18 часов к клеточному осадку добавляли равный объем (400 мкл) смеси фенол : хлороформ : изоамиловый спирт. Далее путем вортексирования перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут на микрофуге при 13400 об/мин. Верхнюю водную фазу переносили в новую пробирку, добавляли 400 мкл хлороформа. Перемешивали на вортексе, путем центрифугирования разделяли фазы в течение 10 минут при 13400 об/мин. Верхнюю водную фазу переносили в новую пробирку и добавляли равный объем изопропилового спирта. Покачиванием осаждали ДНК. Центрифугировали 1 минуту при 13400 об/мин. К осадку добавляли 1 мл 70% этанола, аккуратно перемешивали, центрифугировали 1 минуту при 13400 об/мин. Супернатант удаляли, а осадок высушивали на воздухе при комнатной температуре. Осадок ДНК растворяли в 100 мкл Т10Е1-буфера, инкубировали при 65оС в течение 10 мин. Измеряли концентрацию ДНК нанофотометром IMPLEN, GmbH, Германия, затем разводили ДНК водой до концентрации 30 нг/мкл. Хранили ДНК при температуре - 20оС. 2.4.4. Полимеразная цепная реакция. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет избирательно многократно увеличивать исследуемый участок ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов. Полимеразная цепная реакция проводилась с целью амплификации короткоцепочечных участков мтДНК, с последующим анализом методом пиросеквенирования. 45 ПЦР проводилась в амплификаторе РТС-200 (MJ Research, США). Для проведения ПЦР использовали раствор ДНК с концентрацией 30 нг/мкл и праймеры (таблица 3) с концентрацией 10 пмоль/мкл (ООО «Синтол», Москва). В состав реакционной смеси объемом 40 мкл входили: матричная ДНК 4 мкл, праймер F 2,7 мкл, праймер R 2,7 мкл, Taq-полимераза, 5 ед/мкл (ЗАО «Силекс», Москва) - 1,33 мкл, смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: 2 mM аденозилтрифосфата, 2 mM тимидилтрифосфат, 2 mM гуанозилтрифосфата, 2 mM цитозилтрифосфата – 4 мкл, 70 mM Трис-HCl, pH 8,6, 16,6 mM (NH4)2SO4, MgCl2, 25 mM – 4 мкл (при необходимой концентрации 2,5 мМ) или 2,4 мкл (при необходимой концентрации 1,5 мМ), вода mQ 1,8 – до 40 мкл. Таблица 3. Последовательность праймеров для полимеразной цепной реакции. Мутация Праймеры для ПЦР C3256T bio-AGGACAAGAGAAATAAGGCC ACGTTGGGGCCTTTGCGTAG G12315A bio-CTCATGCCCCCATGTCTAA TTACTTTTATTTGGAGTTGCAC G13513A bio-AAGTCCTAGGAAAGTGACAGCGAGG CCTCACAGGTTTCTACTCCAAA G14846A bio-CATTATTCTCGCACGGACT GCTATAGTTGCAAGCAGGAG Примечание. А – аденин, С - цитозин, Т – тимин, G – C(Mg2+) 2,5mM 2,5mM 1,5mM 1,5mM гуанин, bio – биотинилированный праймер, C(Mg2+) – концентрация магния. ПЦР проводили по схеме: денатурация ДНК при 94°С в течение 4 мин. Затем проводили 35 циклов амплификации, включающей в себя денатурацию ДНК (94°С/30 секунд), отжиг праймеров (56°С/30 секунд для C3256T, G13513A, G14846A и 50°С/30 секунд для G12315A) и элонгацию (синтез второй цепи) 72°С/1 мин. По окончании 35 циклов осуществляли заключительную элонгацию 72°С/7 мин. Для каждого запуска амплификатора вместе с пробами ставился отрицательный контроль, по составу идентичный анализируемым пробам, но 46 вместо раствора ДНК содержащий стерильную воду. Таким образом, при отсутствии амплификации в отрицательном контроли, делали вывод об отсутствии контаминации остальных образцов чужеродными фрагментами ДНК. 2.4.5. Электрофорез в агарозном геле. ПЦР - амплификаты разделяли с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Гель фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете (рисунок 5). Электрофорез проводили с использованием источника постоянного тока (BIO-RAD Power Supply model 500/200), электрофорезного аппарата (LKB 2013 miniphor Elektrophoresis Unit) при напряженности поля 6 В/см. Загрузочный буфер: 10% глицерин, красители – 1% ксиленцианол и 1% бромфеноловый синий. Визуализацию геля производили с помощью гель-документирующей системы Molecular Imager® Gel Doc™ XR System (BioRad) при использовании ультрафиолетового фильтра. Рисунок 5. Ампликоны митохондриальной ДНК. Дорожки 1-6 ПЦР продукт, 7 отрицательный контроль, 8 - ДНК маркер длин фрагментов 100-1000 п.н. ЗАО «Сибэнзим» А. G13513A. B. G12315A C. C3256T D. G14846A. 47 2.4.6. Пиросеквенирование ДНК. После проведения ПЦР амплификаты были пиросеквенированы для детекции нуклеотидной последовательности и определения уровня гетероплазмии исследуемых мутаций с помощью соответствующих праймеров (ЗАО «Синтол», Москва). Исследования проводили на автоматическом 96луночном пиросеквенаторе PSQTM 96MA («Pyrosequensing AB», Швеция). При постановке эксперимента была использована схема приготовления проб, описанная в прилагающемся к пиросеквенатору методическом пособии. Визуализация результатов осуществлялась с помощью программного обеспечения PyroMark ID 1.0 («Biotage AB», Швеция). Пиросеквенирование - это метод секвенирования ДНК, использующий каскад ферментативных реакций, приводящий к появлению светового сигнала при включении исследуемой нуклеотида одноцепочечной в синтезируемую ДНК-матрице. цепь Данный комплиментарную метод основан на измерении вспышки, возникающей при взаимодействии АТФ с люциферином. Реакция катализируется ферментом люциферазой. Пирофосфат выделяется при присоединении нуклеотида, комплементарного нуклеотиду исследуемого одноцепочечного участка, если же добавляемый в реакцию нуклеотид не комплементарен изучаемому участку ДНК, выделения пирофосфата, а следовательно, и вспышки, не происходит. Интенсивность вспышки кратна количеству встроившихся нуклеотидов в комплементарной цепи. Проведение пиросеквенирования. К 40 мкл ПЦР-смеси добавляли 3 мкл сефарозы (Streptavidin Sepharose™) и 43 мкл связывающего буфера (Binding Buffer: 10mM Tris-HCl, 2M NaCl, 1mM EDTA, 0,1 % Tween 20), инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, при интенсивном помешивании на шейкере ELMI SkayLine (Рига, Латвия) при 550 rpm. В результате биотинилированный ПЦР продукт связывался со стрептавидином на поверхности сефарозных шариков с образованием комплекса. 48 С помощью вакуумной рабочей станции (Vacuum Prep Workstation «Biotage», Швеция), связанные с сефарозными шариками ПЦР-продукты переносили на фильтры насадки и последовательно промывали в четырех растворах по 5 секунд. Первый раствор 70% этиловый спирт, потом переносили фильтры насадки в 0,2 М NaOH, где происходила денатурация двухцепоцечной ДНК до одноцепочечной, после этого переносили в промывочный буфер (Wasching Buffer: 10mM Tris-Acetate) и затем промывали в деионизированной воде (µQ Н2О). После окончания промывок фильтры помещали над 96-луночной плашкой (PSQ 96 Plate Low), содержащие в каждой лунке 45 мкл (Annealing Buffer: 20 mM Tris-Acetate, 2mM Mg-Acetate) в смеси с 20 пикомолями праймеров для проведения пиросеквенирования. Затем отключали вакуум и только после этого опускали фильтры насадки в плашку и круговыми движениями элюировали сефарозные шарики с прикрепленными к нам с помощью биотина одноцепочечными нитями ДНК. Плашку помещали на термостат на 80°С на 2 мин для гибридизации праймеров (таблица 4) для проведения пиросеквенирования с одноцепочечной ДНК-матрицей, по окончании охлаждали при комнатной температуре в течении 5-10 мин. При каждом запуске, помимо исследуемых образцов, всегда анализировался отрицательный контроль. Таблица 4. Праймеры для проведения пиросеквенирования. Мутация Сиквенсовый праймер C3256T AAGAAGAGGAATTGA G12315A TTTGGAGTTGCAC G13513A AGGTTTCTACTCCAA G14846A GCGCCAAGGAGTGA Примечание. А – аденин, С - цитозин, Т – тимин, G – гуанин. 49 2.4.7. Определение уровня гетероплазмии мутации митохондриального генома. Количественная оценка мутантного аллеля заключалась в расчете уровней гетероплазмии мутаций мтДНК с использованием высот пиков пирограммы в исследуемой области одноцепочечного ПЦР-фрагмента митохондриального генома. Формула для подсчёта процента гетероплазмии мутаций митохондриального генома была разработана Сазоновой М.А и соавторами в лаборатории медицинской генетики НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова: P = (h-N) / (M-N) * 100%; где P – процент гетероплазмии, h – высота пика исследуемого нуклеотида, N – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% нормальных аллелей, M – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% мутантных аллелей [Sazonova M. et al., 2009]. Для каждой из мутации C3256T, G13513A, G14846A, G12315A на основании общей формулы была создана собственная формула. Расчет производился с помощью программы Microsoft Exel. 2.5. Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью пакета прикладных статистических программ STATISTICA (v.6.0). Вид распределения количественных признаков анализировали при помощи теста КолмогороваСмирнова. При описании количественных показателей с нормальным распределением приводились среднее значение (М) и стандартное отклонение (SD), если распределение не соответствовало параметрическому, приводили медиану (Ме) и межквартильные интервалы (25-й процентиль; 75-й процентиль). Для качественных величин данные представляли как n(%). Для оценки значимости статистических различий по количественному признаку 50 использовались параметрический (t критерий Стьюдента) и непараметрический (критерий Манн-Уитни) методы. Значимость различий качественных признаков в группах наблюдения оценивали при помощи непараметрического критерия 2 Пирсона, при малой встречаемости признака использовали точный тест Фишера. Для оценки связи мутаций митохондриального генома с факторами риска и атеросклерозом коронарных и сонных артерий использовался корреляционный анализ с использованием диагностической значимости рангового мутаций критерия Спирмена. митохондриального Для генома оценки были построены характеристические кривые. В качестве критерия диагностической значимости рассчитывали площадь под кривой. Уровень значимости принят при р<0,05. 51 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 3.1. Сравнительная характеристика групп обследованных больных. Всем пациентам была выполнена КАГ по клиническим показаниям. По результатам КАГ были сформированы две группы пациентов: основная группа (n=130) с атеросклерозом коронарных артерий (КА) и контрольная группа (n=63) без атеросклероза коронарных артерий (без КА). Пациенты контрольной группы, это лица, имеющие несколько факторов риска ССЗ, у которым при проведении обследования выявлен сомнительный результат пробы с физической нагрузкой, в связи с чем им проводилась КАГ. Группы были сопоставимы по возрасту, артериальной гипертонии, ожирению, отягощенной наследственности по отцовской линии (таблица 5). В основной группе было больше мужчин, чем в контрольной группе. Мужчины с КА были существенно старше. Средний возраст у обследованных женщин между группами не отличался. Лиц с отягощенным анамнезом по материнской линии было больше среди больных в основной группе: 26% против 13% в контрольной группе, p=0,05. В группе с КА встречались существенно чаще лица с курением в анамнезе: 68% в сравнении с 24%, p<0,001. В основной группе 60% больных перенесли инфаркт миокарда, у половины было стентирование коронарных артерий, у 18% - операция аортокоронарного шунтирования в анамнезе. 52 Таблица 5. Сравнительная характеристика групп обследованных больных Показатель Мужчины Женщины Возраст, лет Возраст мужчин, лет Возраст женщин, лет Артериальная гипертония Курение Гиперлипидемия Отягощенная наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение Инфаркт миокарда в анамнезе Коронарное стентирование Аортокоронарное шунтирование Основная группа, n=130 116 (89%) 14 (11%) Контрольная группа, n=63 38 (60%) 25 (40%) <0,001 <0,001 55,09,1 54,48,9 59,99,5 95 (73%) 88 (68%) 124 (95%) 53,910,3 49,37,5 60,810,1 45 (71%) 15 (24%) 50 (78%) 0,45 <0,001 0,54 0,94 <0,001 <0,001 22 (17%) 34 (26%) 37 (28%) 78 (60%) 9 (14%) 8 (13%) 21 (33%) 0 0,80 0,05 0,59 - 69 (53%) 23 (18%) 0 0 - p Уровень ОХС и ХС ЛНП, ХС ЛВП и ТГ был достоверно ниже у больных с КА (таблица 6), по сравнению с контрольной группой, как в общей кагорте больных, так и при последующем подгрупповом анализе, что связано с доминирующем применением статинов у больных с КА 100%, в группе без КА лишь 24% пациентов принимали статины. Уровень Лп(а) был выше при наличии КА, p=0,016. 53 Таблица 6. Сравнительная характеристика групп по биохимическим параметрам. Показатель Основная группа, n=130 4,71,3 Контрольная группа, n=63 5,41,1 <0,001 ХС ЛВП, ммоль/л 1,10,3 1,20,3 0,03 ХС ЛНП, ммоль/л 2,91,0 3,40,9 <0,001 ТГ, ммоль/л 1,81,3 2,01,4 0,3 Лп (а), мг/дл 54 (8; 100) 23 (5; 69) 0,016 ОХС, ммоль/л p Все пациенты с КА находились на оптимальной медикаментозной терапии (таблица 7), 100% больных принимали статины. В группе без КА пациенты принимали гипотензивные, антиагрегантные, гиполипидемические препараты, частота приема статинов составила 24%. Таблица 7. Медикаментозная терапия исследованных больных. Группы препаратов Основная группа, n=130 Контрольная группа, n=63 p 98 (75%) 46 (35%) 117 (90%) 47 (36%) 130 (100%) 35 (27%) 130 (100%) 38 (60%) 15 (24%) 25 (63) 14 (22%) 10 (15%) 0 15 (24%) 0,05 0,15 0,001 0,07 0,001 0,0005 0,01 Ингибиторы АПФ Сартаны β-блокаторы Антагонисты Са2+ Антиагреганты Нитраты Статины 3.2. Уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома. Явления гетероплазмии были обнаружены для всех изучаемых мутаций мтДНК лейкоцитов крови в большинстве образцов крови, уровни гетероплазмий мутаций представлены в таблице 8. 54 Таблица 8. Уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома у обследованных пациентов (n=193). Мутация Межквартильные интервалы Миним. Максим. 8,1 0,97 75,14 16,6 23,8 1,75 81,97 7,4 8,5 9,5 3,20 12,40 2,9 5,2 9,4 0,67 18,30 25% Медиана 75% G13513A, % 3,4 5,1 G14846A, % 12,6 C3256T, % G12315A, % Все исследуемые митохондриального мутации генома. Для расположены всех мутаций в кодирующей области распределение уровней гетероплазмии значительно отличалось от нормального (тест КолмогороваСмирнова с коррекцией по Лиллиефорсу, p<0,001). Мы проанализировали связь между уровнем гетероплазмии исследуемых мутаций и наличием КА (таблица 9). Уровень гетероплазмии по мутации С3256Т был выше среди больных с КА 8,6% (7,7; 9,6) по сравнению с лицами без КА 8,1% (6,8; 9,1), p=0,01 (рисунок 6). Уровень гетероплазмии по мутации G13513A был достоверно выше среди больных с КА 5,4% (3,5; 8,6) по сравнению с лицами без КА 4,7% (3,2; 6,8), p=0,03 (рисунок 7), тогда как уровень гетероплазмии по мутации G12315A был значимо выше у лиц без КА 19,2% (15,4; 25,0) по сравнению с 15,5% (11,6; 23,2) в группе с КА, р=0,004 (рисунок 8). По мутации G14846A различий по группам выявлено не было. 55 Таблица 9. Взаимосвязь между уровнями гетероплазмий мутаций и наличием коронарного атеросклероза Мутации G13513A, % Основная группа, n=130 5,4 (3,4; 8,6) Контрольная группа, n=63 4,7 (3,1; 6,8) 0,03 G14846A, % 5,6 (2,8; 9,5) 4,8 (2,9; 9,3) 0,62 C3256T, % 8,6 (7,7; 9,6) 8,1 (6,8; 9,1) 0,01 G12315A, % 15,5 (11,5; 23,4) 19,3 (15,3; 24,9) 0,004 p % гетероплазмии С3256Т 12 p=0,01 10 8 6 4 2 КА без КА Рисунок 6. Cравнение уровня гетероплазмии мутации С3256Т между пациентами с и без коронарного атеросклероза (КА). 56 % гетероплазмии G13513A 40 35 30 p=0,03 25 20 15 10 5 0 . КА без КА Рисунок 7. Cравнение уровня гетероплазмии мутации G13513A между пациентами с и без коронарного атеросклероза (КА). % гетероплазмии G12315A 70 60 50 р=0,004 40 30 20 10 0 . КА без КА Рисунок 8. Cравнение уровня гетероплазмии мутации G12315A между пациентами с и без коронарного атеросклероза (КА). 57 3.3 Оценка взаимосвязи классических факторов риска атеросклероза с мутациями митохондриального генома. Для оценки возможной взаимосвязи изучаемых мутаций митохондриального генома с возрастом был проведен корреляционный анализ по Спирмену. С возрастом выявлена слабая позитивная связь для мутации G14846A (рисунок 9). Для других мутаций митохондриального генома взаимосвязи с возрастом не установлено. % гетероплазмии G14846A 20 18 r=0,15, p=0,03 16 14 12 10 8 6 4 2 0 . 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Возраст Рисунок 9. Взаимосвязь уровня гетероплазмии мутации митохондриального генома G14846A и возраста. При проведении корреляционного анализа не установлено взаимосвязи мутаций митоходриального генома с полом, курением, артериальной гипертонией, с отягощенным семейным анамнезом по ССЗ, как по отцовской, так и по материнской линии. С наличием гиперлипидемии отмечена прямая положительная связь мутации C3256T (r=0,18, р=0,01) (рисунок 10) и обратная для мутации G12315A (r= -0,2, р=0,005) (рисунок 11). Для других мутаций зависимости выявлено не было. 58 % гетероплазмии С3256Т 14 r=0,18, р=0,01 12 10 8 6 4 2 нет есть . Гиперлипидемия Рисунок 10. Взаимосвязь уровня гетероплазмии мутации митохондриального генома С3256Т и гиперлипидемии. % гетероплазмии G12315A 90 80 70 r= -0,2, р=0,005 60 50 40 30 20 10 0 нет есть . Гиперлипидемия Рисунок 11. Взаимосвязь уровня гетероплазмии мутации митохондриального генома G12315A и гиперлипидемии. 3.3.1 Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у мужчин и женщин. Курение и отягощенная наследственность по материнской линии у мужчин с КА встречались достоверно чаще, чем у мужчин без КА (таблица 10). По таким факторам риска как артериальная гипертония и ожирение отличий между 59 группами выявлено не было. Уровень Лп(а) был выше при наличии КА, а концентрация ОХС, ХС ЛНП была ниже среди больных с КА. Более высокий уровень гетероплазмии мутаций G13513A и C3256T отмечен среди мужчин с КА, в то время как уровень гетероплазмии G12315A был достоверно выше среди пациентов без КА. Таблица 10. Сравнительная характеристика мужчин. Показатель Средний возраст, лет Артериальная гипертония Курение Отягощенная наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % Основная группа, n=116 54,48,9 82 (71%) 84 (72%) Контрольная группа, n=38 49,37,5 25 (66%) 14 (37%) 0,0018 0,71 0,0005 19 (16%) 29 (25%) 34 (29%) 4,71,3 1,10,2 2,91,0 1,81,3 39 (7; 93) 5,4 (3,4;8,7) 5,2 (2,7; 9,4) 8,6 (7,7; 9,6) 15,5 (11,7; 23,4) 9 (24%) 3 (8%) 14 (37%) 5,31,2 1,10,3 3,31,0 2,01,3 22 (5; 65) 4,7 (3,0; 6,6) 4,6 (2,2; 9,0) 8,1 (7,3; 9,0) 19,4 (16,6; 25,3) 0,44 0,03 0,42 0,013 1,0 0,034 0,41 0,05 0,01 0,68 0,03 0,01 p Также как у мужчин, у женщин с КА (таблица 11) чаще отмечено курение в анамнезе (29% в сравнении с 4%, p<0,05), однако не выявлено отличий между группами по таким факторам риска, как возраст, АГ, ожирение. Также обращают внимание более низкие значения ОХС и ХС ЛНП при наличии КА, однако различия не достигают достоверности. Уровень Лп(а) у женщин с КА был существенно выше, чем у мужчин с КА и у женщин без КА (p<0,05, p<0,001 60 соответственно). Наличие КА было связано с более высокой частотой анамнеза по отцовской линии (р=0,03). Что касается мутаций митохондриального генома, отличий между подгруппами получено не было. Таблица 11. Сравнительная характеристика женщин. Показатель Средний возраст, лет Артериальная гипертония Курение Отягощенная наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % 3.3.2.Сравнение Основная группа n=14 59,99,5 13 (93%) 4 (29%) Контрольная группа n=25 60,810,1 20 (80%) 1 (4%) 0,61 0,39 0,046 3 (21%) 6 (43%) 3 (21%) 5,11,3 1,30,3 3,11,2 1,50,4 93 (58; 138) 5,9 (3,6; 8,2) 8,3 (5,4; 10,2) 8,7 (7,2; 8,9) 14,9 (11,7; 16,8) 0 5 (20%) 7 (28%) 5,60,8 1,30,3 3,60,7 1,81,5 26 (11; 69) 4,8 (3,7; 8,1) 4,9 (3,1; 8,2) 8,1 (6,3;9,2) 18,7 (12,9; 22,8) 0,03 0,25 0,72 0,14 1,0 0,10 0,47 0,002 0,15 0,25 0,35 0,71 факторов риска атеросклероза и p мутаций митохондриального генома у пациентов до 45 лет и после 45 лет. Далее мы проанализировали распределение факторов риска и мутаций митохондриального генома у лиц моложе 45 лет (таблица 12). Не выявлено отличий между больными с КА и без КА по полу, возрасту, артериальной гипертонии, отягощенному анамнезу по отцовской и материнской линиям. Лиц с курением в анамнезе было существенно больше в подгруппе с КА; тогда как ожирение встречалось чаще в подгруппе без КА. Уровень ОХС, ХС ЛНП был достоверно выше среди пациентов без КА. По таким показателям как ХС ЛВП, 61 ТГ, Лп(а) подгруппы не различались. Уровень гетероплазмии по мутации C3256T был достоверно выше в подгруппе с КА, в то время как по другим мутациям отличий между подгруппами не выявлено. Таблица 12. Сравнительная характеристика больных до 45 лет. Показатель Количество мужчин Средний возраст, лет Артериальная гипертония Курение Отягощенная наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии Любой отягощенный анамнез Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % Основная группа n=19 18 (95%) 40,93,2 11 (58%) 16 (84%) Контрольная группа n=12 11 (92%) 40,53,7 7 (58%) 3 (25%) 0,68 0,75 0,73 0,004 5 (26%) 6 (32%) 11 (58%) 2 (17%) 1 (8%) 3 (25%) 0,86 0,28 0,44 2 (11%) 4,61,4 1,10,3 2,91,2 1,60,7 66 (22; 106) 4,6 (3,8; 6,8) 4,1 (2,0; 6,0) 9,0 (8,5; 9,6) 15,0 (6,8; 20,2) 6 (50%) 5,90,8 1,20,4 3,70,9 1,80,9 29 (3; 100) 3,3 (2,1; 4,8) 4,2 (2,9; 5,7) 7,9 (7,2;8,2) 19,8 (18,4; 22,3) 0,04 0,007 0,43 0,057 0,49 0,50 0,23 0,29 0,005 0,33 p Среди лиц старше 45 лет в подгруппе с КА (таблица 13) преобладали мужчины – 88 % по сравнению с 53 % в подгруппе без КА. Между подгруппами нет отличий по частоте артериальной гипертонии, ожирению, отягощенной наследственности по отцовской и материнской линиям. Лиц с курением в анамнезе было значительно больше в подгруппе с КА: 65% против 24% при отсутствии КА. Уровень ОХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП был достоверно выше в 62 подгруппе без КА, в то время как концентрация Лп(а) была выше у больных с КА: 49 (7; 99) мг/дл в сравнении с 19 (5; 61) мг/дл среди пациентов контрольной группы. Уровень гетероплазмии мутации G13513A был достоверно выше среди больных с КА по сравнению с контрольной группой. По другим мутациям подгруппы не различались. Таблица 13. Сравнительная характеристика пациентов старше 45 лет. Показатель Количество мужчин Средний возраст, лет Средний возраст мужчин, лет Артериальная гипертония Курение Отягощенная наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % Основная группа n=111 98 (88%) 57,47,5 56,87,2 Контрольная группа p n=51 27 (53%) 0,0005 0,76 57,08,6 0,0004 52,75,2 84 (76%) 72 (65%) 38 (75%) 12 (24%) 0,97 0,0005 17 (15%) 28 (25%) 35 (32%) 4,71,2 1,10,3 2,91,0 1,81,3 49 (7; 99) 5,9 (3,4; 10,7) 5,8 (3,2; 9,7) 8,6 (6,8; 9,2) 15,5 (12,2; 23,5) 7 (14%) 7 (14%) 15 (29%) 5,31,1 1,20,3 3,40,9 1,81,2 19 (5; 61) 4,9 (3,7; 6,8) 5,1 (2,9; 9,5) 8,4 (6,8; 9,2) 18,8 0,98 0,15 0,07 0,003 0,05 0,003 1,0 0,007 0,02 0,64 0,10 0,34 63 Далее разделили всех пациентов в зависимости от возраста на две подгруппы до 45 лет и после 45 лет (таблица 14) и оценили процент гетероплазмии мутаций у лиц молодого и старшего возраста (тест Манна-Уитни). Таблица 14. Значение гетероплазмии мутаций митохондриального генома у пациентов в зависимости от возраста. Мутации ≤45 лет, n=31 > 45 лет, n=162 p G13513A, % 4,8 (3,6; 7,0) 5,9 (3,4;10,8) 0,3 G14846A, % 4,2 (1,5; 6,0) 5,8 (3,2; 9,8) 0,04 C3256T, % 8,9 (8,5; 9,6) 8,5 (7,4; 9,5) 0,08 G12315A, % 15,9 (6,7; 20,7) 15,5 (12,0; 23,6) 0,24 У пациентов старше 45 лет по сравнению с лицами молодого возраста отмечен более высокий уровень гетероплазмии мутации G14846A, р=0,04. Уровень гетероплазмии мутаций G13513A, C3256T, G12315A не отличался в различных возрастных группах. 3.3.3.Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у пациентов с наличием и отсутствием артериальной гипертонии. Далее мы проанализировали больных без артериальной гипертонии (таблица 15). В подгруппе больных без АГ и с КА преобладали мужчины, средний возраст которых был сопоставим с возрастом мужчин в подгруппе без КА. Подгруппы не различались по ожирению, отягощенному семейному анамнезу, как по отцовской, так и материнской линиям. Среди больных с КА было значительно больше курящих лиц (p<0,001). Концентрация ТГ, Лп(а) была выше при наличии КА. Уровень гетероплазмии по мутациям G13513A, C3256T и G12315A был достоверно выше у больных с КА. 64 Таблица 15. Сравнительная характеристика больных без артериальной гипертонии. Показатель Количество мужчин Средний возраст, лет Курение Отягощенная наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % Основная группа n=35 34 (97%) 51,47,9 22 (63%) Контрольная группа n=18 13 (72%) 50,16,3 2 (11%) 6 (17%) 10 (29%) 6 (17%) 4,71,4 1,2 0,3 2,81,1 1,40,7 65 (23; 117) 7,3 (3,8; 13,2) 2 (11%) 2 (11%) 3 (17%) 5,61,2 1,40,3 3,60,9 1,40,6 27 (5; 79) 4,4 (3,6; 5,9) 5,8 (2,8;9,2) 9,0 (8,1; 10,2) 17,3 (9,8; 24,5) 4,5 (3,2; 8,7) 7,6 (6,5; 8,8) 19,6 (17,7; 31,1) p 0,02 0,54 0,001 0,86 0,27 0,74 0,02 0,03 0,01 1,0 0,06 0,05 0,58 0,005 0,05 Среди пациентов с артериальной гипертонией (таблица 16) в подгруппе с КА преобладали мужчины 86% против 56% в подгруппе без КА, они были старше мужчин без КА. Курение чаще встречалось при наличии КА (p=0,0005). Подгруппы были сопоставимы по ожирению, отягощенному семейному анамнезу, как по материнской, так и по отцовской линии. Уровни ОХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП, ТГ были достоверно выше в подгруппе пациентов без КА, тогда как концентрация Лп(а) была выше у больных КА. Различий по уровням гетероплазмии всех четырех мутаций среди подгрупп выявлено не было. 65 Таблица 16. Сравнительная характеристика больных с артериальной гипертонией. Показатель Количество мужчин Средний возраст, лет Средний возраст мужчин, лет Курение Отягощенная наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % Основная группа n=95 82 (86%) 56,39,2 55,79,0 Контрольная группа p n=45 25 (56%) 0,0005 0,61 55,4 11,2 0,0002 49,78,1 66 (69%) 13 (29%) 0,0005 16 (17%) 24 (25%) 31 (33%) 4,71,2 1,10,2 2,91,0 1,91,4 34 (6; 86) 5,1 (3,4; 8,0) 5,3 (2,9; 9,6) 8,6 (7,5; 9,4) 15,4 (11,7; 22,5) 7 (16%) 6 (13%) 18 (40%) 5,31,0 1,20,3 3,30,9 2,21,6 18 (5; 61) 5,0 (3,0; 6,8) 5,1 (2,9; 8,3) 8,2 (7,1; 9,3) 19,2 (15,2; 23,8) 0,96 0,17 0,50 0,004 0,02 0,02 0,02 0,04 0,08 0,88 0,20 0,32 3.3.4. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у пациентов с наличием и отсутствием курения в анамнезе. В подгруппе некурящих среди больных с КА преобладали мужчины, они были старше мужчин без КА (таблица 17). Среди пациентов без КА больше было женщин 50% против 24 % в подгруппе с КА, по возрасту женщины обеих подгрупп были сопоставимы. По ожирению, отягощенному анамнезу по отцовской линии подгруппы не различались, в то время как отягощенный анамнез по материнской линии встречался только у больных ИБС. По уровню ОХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП, ТГ подгруппы не различались. Концентрация Лп(а) 66 была достоверно выше в подгруппе больных с КА. В сравниваемых подгруппах уровень гетероплазмии мутаций G13513A, С3256T был выше у больных с КА. Уровень мутаций G14846A и G12315A между подгруппами не отличался. Таблица 17. Сравнительная характеристика лиц без курения в анамнезе. Показатель Количество мужчин Средний возраст, лет Средний возраст мужчин, лет Артериальная гипертония Отягощенная наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % Основная группа n=42 32 (76%) 58,08,3 56,78,0 Контрольная группа n=48 24 (50%) 54,610,6 48,77,4 0,02 0,09 <0,0001 29 (69%) 32 (67%) 0,98 7 (17%) 11 (26%) 11 (26%) 5,01,4 1,20,3 3,11,2 1,60,8 57 (17; 120) 5,1 (3,3; 10,4) 6,4 (3,3; 10,0) 8,8 (8,2; 9,6) 15,5 (12,4; 24,6) 6 (13%) 0 14 (29%) 5,41,0 1,30,3 3,50,8 1,71,3 25 (13; 75) 4,5 (3,5; 6,8) 4,7 (3,1; 8,4) 8,0 (6,4; 9,0) 19,4 (15,4; 25,1) 0,79 0,0001 0,94 0,12 0,12 0,06 0,67 0,009 0,03 0,27 0,002 0,16 p Среди курящих пациентов (таблица 18) подгруппы с КА и без КА были сопоставимы по полу, возрасту, артериальной гипертонии, отягощенной наследственности по материнской, отцовской линиям, ожирению. Уровень ОХС был выше среди пациентов без КА. По уровню ХС ЛНП, ХС ЛВП, ТГ подгруппы не различались. Лп(а) был выше при наличии КА (p=0,06). По уровню гетероплазмий изучаемых мутаций различий получено не было. 67 Почти все курильщики в обеих подгруппах имели артериальную гипертонию. Таблица 18. Сравнительная характеристика больных с курением. Показатель Основная группа n=88 Контрольная группа n=15 p Количество мужчин Средний возраст, лет Средний возраст, лет Артериальная гипертония 84 (95%) 53,59,2 53,59,1 66 (75%) 14 (93%) 51,79,2 50,37,8 13 (87%) 0,77 0,48 0,20 0,51 15 (17%) 23 (26%) 26 (30%) 4,61,2 1,10,2 2,80,9 1,91,4 36 (6; 90) 5,4 (3,5; 8,3) 5,2 (2,6; 9,2) 8,6 (7,4; 9,5) 15,6 (11,5; 22,3) 4 (27%) 2 (13%) 7 (47%) 5,31,3 1,0 0,2 3,21,1 2,20,8 5 (3; 25) 4,8 (2,3; 5,8) 6,1 (2,4; 8,8) 8,6 (7,7; 9,3) 18,3 (15,6; 23,6) 0,59 0,46 0,31 0,04 0,07 0,12 0,42 0,06 0,1 0,85 0,66 0,48 Отягощенная наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % Мы выделили в отдельную группу пациентов без таких факторов риска атеросклероза как курение и артериальная гипертония (таблица 19). Между подгруппами не отмечено отличий по полу, возрасту, отягощенной наследственности по отцовской и материнской линиям, ожирению, уровню ОХС, ТГ. Уровень ХС ЛНП и ХС ЛВП был выше среди пациентов без КА, в то время как высокий уровень Лп(а) был связан с наличием КА. Уровень гетероплазмии мутации C3256T был выше среди больных с КА, а уровень гетероплазмии мутации G12315A был выше у пациентов без КА. 68 Таблица 19. Характеристика пациентов без артериальной гипертонии и курения. Показатель Количество мужчин Средний возраст, лет Средний возраст мужчин, лет Отягощенная наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % Основная группа n=13 Контрольная группа n=16 p 12 (92%) 54,36,1 53,86,0 11 (69%) 50,15,7 48,15,2 0,4 0,06 0,01 1 (18%) 5 (38%) 3 (23%) 5,11,4 1,20,3 3,11,2 1,50,7 101 (60; 122) 4,6 (3,5; 10,9) 7,5 (2,9; 10,1) 9,0 (8,4; 9,7) 14,2 (7,6; 24,2) 2 (12%) 2 (12%) 2 (12%) 5,61,1 1,40,2 3,80,6 1,3 0,6 25 (5; 72) 4,4 (3,6; 6,3) 4,5 (3,2; 7,6) 7,4 (6,4; 8,6) 19,6 (17,9; 27,7) 0,8 0,24 0,8 0,3 0,04 0,05 0,4 0,001 0,09 0,23 0,003 0,03 3.3.5. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у пациентов в зависимости от наличия гиперлипидемии. Среди лиц без гиперлипидемии (таблица 20) между пациентами с КА и без КА не было различий по полу, возрасту, артериальной гипертонии, ожирению, курению, отягощенной наследственности. У больных с КА была существенно выше концентрация Лп(а): 55 (5; 116) мг/дл в сравнении с 13 (3; 16) мг/дл у пациентов без КА. Уровень гетероплазмии мутации G14846A был выше у лиц с КА, p=0,007. По другим мутациям отличия не достигали достоверности. 69 Таблица 20. Сравнительная характеристика лиц без гиперлипидемии. Показатель Основная группа n=6 Контрольная группа n=14 p Количество мужчин Средний возраст, лет Средний возраст мужчин, лет Артериальная гипертония 6 (100%) 52,07,2 52,07,2 10 (71%) 52,49,8 50,59,9 0,26 0,92 0,74 2 (33%) 11(79%) 0,12 Курение 4 (67%) 3 (21%) 0,12 3 (50%) 1 (17%) 1 (17%) 4,10,7 1,10,2 2,20,8 1,00,3 55 (5; 116) 8,0 (5,6; 10,8) 8,3 (5,1; 11,0) 7,4 (6,8; 8,0) 16,7 (13,8; 19,1) 2 (14%) 1 (7%) 4 (29%) 5,00,9 1,20,3 3,50,9 1,80,7 13 (3; 16) 5,0 (2,5; 6,9) 3,1 (2,1; 4,4) 7,2 (5,4; 8,7) 28,0 (19,8; 37,5) 0,13 0,52 1,0 0,04 0,46 0,007 0,01 0,006 0,09 0,007 0,51 0,07 Отягощенная наследственность: - по отцовской линии -по материнской линии Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % Среди пациентов с гиперлипидемией (таблица 21) в подгруппе с КА достоверно больше мужчин и по возрасту они были старше мужчин без КА. В подгруппе с интактными коронарными артериями преобладали женщины, по возрасту женщины двух подгрупп были сопоставимы. Артериальная гипертония чаще встречалась среди пациентов с КА. Лиц с курением в анамнезе было значительно больше в подгруппе с КА 67% в сравнении с 24% при отсутствии КА. Между подгруппами не выявлено отличий по ожирению, отягощенному семейному анамнезу. При этом уровень ОХС и ХС ЛНП достоверно ниже у 70 больных с КА по сравнению с пациентами контрольной группы. По уровню ТГ, Лп(а) подгруппы не различались. Уровень гетероплазмии по мутации G13513A, C3256T был выше у больных с КА. По мутациям G14846A и G12315A различия были не достоверны. Таблица 21. Сравнительная характеристика лиц с гиперлипидемиями. Показатель Основная группа n=124 Контрольная группа n=49 p Количество мужчин Средний возраст, лет Артериальная гипертония 111(89%) 55,19,2 93(74%) 28 (57%) 54,310,5 34 (69%) 0,0005 0,62 0,04 Курение 84 (67%) 12 (24%) 0,0005 19 (15%) 33 (27%) 36 (29%) 4,71,3 1,10,2 2,91,0 1,81,3 52 (8; 99) 5,3 (3,4; 8,4) 5,5 (2,7; 9,4) 8,7 (7,9; 9,6) 15,5 (11,5; 23,4) 7 (14%) 7 (14%) 17 (35%) 5,41,1 1,20,3 3,40,9 2,01,5 25 (5; 78) 4,7 (3,5; 6,7) 5,4 (3,2; 9,7) 8,2 (7,2; 9,1) 18,7 (14,3; 22,4) 0,93 0,13 0,59 0,001 0,01 0,003 0,38 0,09 0,03 0,44 0,04 0,62 Отягощенная наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % Провели оценку связи мутаций митохондриального генома с показателями липидного профиля у пациентов с КА и без КА. У больных с КА (таблица 22) выявлена позитивная связь мутации G12315A с ХС ЛВП (r=0,2, p<0,05) и отрицательная связь мутации C3256T c ХС ЛВП (r=0,17, p<0,05). Также определяется отрицательная связь мутации G14846A с ТГ (r=-0,2, p<0,05). 71 Таблица 22. Корреляционный анализ связи мутаций митохондриального генома с показателями липидного профиля у больных основной группы (n=130) Мутации ОХС ХС ЛНП ХС ЛВП ТГ G13513A, % 0,04 0,10 0,04 0,03 G14846A, % -0,06 -0,08 0,13 -0,2* C3256T, % 0,10 0,12 -0,17* 0,06 G12315A, % 0,11 0,12 0,2* 0,13 *р<0,05 Среди пациентов без КА, не принимающих гиполипидемические препараты (n=48), (таблица 23) выявлена положительная связь уровня гетероплазмии мутации G13513A с концентрацией ХС ЛВП (r=0,18, р<0,05), мутации C3256T с уровнем ТГ (r=0,22, р<0,05), мутации G14846A с концентрацией ОХС (r=0,16, р<0,02). Таблица 23. Корреляционный анализ связи мутаций митохондриального генома с показателями липидного профиля у пациентов без КА (n=48). Мутации ОХС ХС ЛНП ХС ЛВП ТГ G13513A, % -0,10 0,05 0,18* 0,06 G14846A, % 0,16* -0,006 -0,09 0,12 C3256T, % 0,08 -0,07 -0,14 0,22* G12315A, % -0,08 0,08 0,07 0,05 *р<0,05 72 3.3.6. Сравнение факторов риска и мутаций митохондриального генома у пациентов в зависимости от наличия или отсутствия отягощенного семейного анамнеза. Среди пациентов с неотягощенным семейным анамнезом по ССЗ (таблица 24) преобладали мужчин с КА. Подгруппы пациентов с КА и без КА были сопоставимы по частоте артерильной гипертонии, ожирению. Больные с КА были старше и у них чаще отмечалось курение в анамнезе 67% в сравнении с 19%, p<0,001. По уровню ТГ и Лп(а) подгруппы не различались. Уровень гетероплазмии по мутациям G13513A и C3256T был достоверно выше в подгруппе с КА. Уровни гетероплазмии мутаций G14846A и G12315A между подгруппами не различались. Таблица 24. Сравнительная характеристика больных без отягощенного семейного анамнеза по ССЗ. Показатель Количество мужчин Средний возраст, лет Артериальная гипертония Курение Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп (а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % Основная группа n=74 69 (93%) 57,09,3 55 (74%) Контрольная группа n=46 26 (57%) 54,410,6 32 (70%) <0,0005 0,16 0,72 50 (67%) 22 (30%) 4,71,4 1,10,2 2,81,1 1,91,4 38 (7; 83) 5,3 (3,4; 10,8) 6,3 (2,6; 9,6) 8,6 (7,5;9,5) 15,5 (12,3; 21,4) 9 (19%) 18 (39%) 5,51,0 1,20,3 3,40,9 2,01,5 20 (5; 78) 4,7 (3,2; 6,9) 5,1 (3,1; 9,0) 8,0 (7,0; 9,0) 19,0 (14,5; 27,9) 0,0005 0,39 0,001 0,03 0,002 0,7 0,1 0,03 1,0 0,03 0,15 p 73 Среди лиц с отягощенным семейным анамнезом по ССЗ (таблица 25) нет различий в подгруппах с КА и без КА по полу, возрасту, артериальной гипертонии, ожирению. В подгруппе с КА чаще встречалось курение (68% против 35%, p=0,03). Подгруппы не различались по уровню ОХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП, ТГ. Уровень Лп(а) был выше в подгруппе с КА 63 (10; 110) мг/дл против 25 (5; 58) мг/дл в подгруппе без КА. Различий по уровню гетероплазмии исследуемых мутаций в данных подгруппах получено не было. Таблица 25. Сравнительная характеристика лиц с отягощенным семейным анамнезом по ССЗ. Показатель Основная группа n=56 Контрольная группа n=17 p Количество мужчин Средний возраст, лет Средний возраст мужчин, лет Артериальная гипертония Курение Отягощенная наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % 47 (84%) 52,38,2 51,27,1 12 (71%) 52,59,3 48,76,4 0,38 0,93 0,19 40 (71%) 38 (68%) 13 (76%) 6 (35%) 0,92 0,03 22 (39%) 34 (61%) 15 (27%) 4,71,2 1,10,3 3,01,0 1,70,9 63 (10; 110) 5,8 (3,9; 8,3) 5,1 (2,9; 8,8) 8,8 (7,9; 9,6) 16,1 (11,5; 25,6) 9 (53%) 8 (47%) 3 (18%) 5,21,3 1,20,4 3,50,9 1,81,1 25 (5; 58) 4,8 (3,3; 6,1) 3,2 (2,1; 7,9) 8,4 (6,4; 9,1) 19,8 (18,0; 22,4) 0,47 0,40 0,66 0,14 0,27 0,06 0,7 0,04 0,11 0,31 0,18 0,38 74 Подгруппы пациентов с отягощенным анамнезом по материнской линии (таблица 26) были сопоставимы по возрасту, артериальной гипертонии, ожирению, отягощенному анамнезу по отцовской линии. Мужчин было больше в подгруппе с КА. Подгруппы не различались по уровню ОХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП, ТГ. Различий по уровню гетероплазмий изучаемых мутаций в данных подгруппах получено не было, что, возможно, свидетельствует о связи отягощенного анамнеза по материнской линии с мутациями митохондриального генома. Таблица 26. Сравнительная характеристика лиц с отягощенным материнским анамнезом по ССЗ. Показатель Количество мужчин Средний возраст, лет Средний возраст мужчин, лет Артериальная гипертония Курение Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % Основная группа n=32 26 (81%) 51,88,9 50,07,3 Контрольная группа n=8 3 (37%) 57,010,3 49,37,0 р 0,01 0,16 0,80 22 (71%) 22 (69%) 10 (31%) 4,71,2 1,10,3 3,10,9 1,81,1 52 (12; 99) 6,0 (4,2; 8,1) 3,9 (2,6; 6,3) 8,9 (7,8; 9,6) 18,1 (11,5; 25,8) 6 (75%) 2 (25%) 2 (25%) 5,21,4 1,30,3 3,51,0 1,60,9 27 (21; 48) 4,5 (3,4; 6,1) 3,4 (2,6; 5,0) 8,5 (5,9; 9,5) 19,1 (17,4; 20,1) 0,8 0,048 0,83 0,31 0,10 0,28 0,64 0,38 0,29 0,4 0,25 0,87 75 3.4. Взаимосвязь липопротеида(а) с мутациями митохондриального генома. В литературе митохондриального нет данных генома. Мы о взаимосвязи решили Лп(а) провести с мутациями анализ возможной взаимосвязи изучаемых мутаций с уровнем Лп(а) (таблица 27). По данным корреляционного анализа отмечена достоверная положительная связь между мутаций G14846A и уровнем Лп(а) у пациентов с КА (r=0,23, р<0,005) (рисунок 12). Для остальных мутаций взаимосвязи с Лп(а) не установлено. Таблица 27. Взаимосвязь уровня Лп(а) с уровнем гетероплазмии мутаций митохондриального генома. Мутации Все пациенты n=164 0 0,19 0,08 -0,12 % гетероплазмии G14846A G13513A G14846A C3256T G12315A *р<0,05 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Пациенты с КА n=113 -0,05 0,23 0 0,12 Пациенты без КА n=51 0,13 0,13 0,11 -0,05 r=0,23, р=0,01 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 Липопротеид(а) Рисунок 12. Взаимосвязь уровня гетероплазмии мутации митохондриального генома G14846A с уровнем Лп(а) среди пациентов основной группы. 76 Оценка 3.5. выраженности атеросклеротического поражения коронарных артерий. Мы разделили пациентов основной группы на четыре подгруппы (таблица 28) в зависимости от количества пораженных основных коронарных артерий (наличие стенозов ≥ 70% в передней нисходящей, огибающей, правой коронарной артерии) 1) начальный атеросклероз коронарных артерий («0» подгруппа - стенозы менее 50%); 2) однососудистое поражение; 2) двухсосудистое поражение; 3) трехсосудистое поражение коронарного русла (таблица 28). Наибольшее количество пациентов было с однососудистым поражением коронарного русла - 42%. Больные с двух- и трехсосудистым поражением коронарного русла составили по ¼ от общего количества пациентов с КА. Среди всех подгрупп преобладали мужчины. Больные с многососудистым поражением коронарного русла, как мужчины, так и женщины были значительно старше пациентов с однососудистым поражением коронарного русла. Артериальная гипертония встречалась чаще среди пациентов с более тяжелым поражением коронарного русла. Наибольшее количество лиц с ожирением было в подгруппе с трехсосудистым поражением (36%). Коронарное стентирование проводилось примерно у 2/3 пациентов с одно- и двухсосудистым поражением, в то время как в подгруппе с трехсосудистым поражением коронарное стентирование выполнено менее чем у 20% пациентов, а аортокоронарному шунтированию были подвергнуты 64% пациентов. Частота перенесенных инфарктов миокарда увеличивалась с нарастанием тяжести коронарного атеросклероза и составила 73% в подгруппе с трехсосудистым поражением. По уровню ОХС, ХС ЛНП подгруппы были сопоставимы. Холестерин ЛВП был выше в подгруппе с начальным атеросклерозом коронарных артерий. Отмечалось нарастание уровня ТГ с тяжестью поражения коронарного русла. Уровень Лп(а) был повышенный у всех больных основной группы независимо от степени поражения коронарных артерий. 77 Таблица 28. Сравнительная характеристика пациентов с атеросклерозом коронарных артерий в зависимости от количества пораженных артерий. Показатель Количество мужчин Средний возраст, лет Средний возраст мужчин, лет Средний возраст женщин, лет Артериальная гипертония Курение Отягощенная наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение Коронарное стентирование Аорто-коронарное шунтирование ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл Инфаркт миокарда Средний индекс стенозов 0 n=10 6 (60%) 1 сосуд n=55 52 (95%) 2 сосуда n=32 29 (91%) 3 сосуда n=33 29 (88%) 51,28,6 45,85,2 55,39,5 55,29,3 53,59,4 53,49,5 56,98,1 55,67,3 59,35,9 57,314,2 55,09,5 66,38,7 6 (60%) 6 (60%) 35 (64%) 35 (64%) 27 (84%) 25 (78%) 27 (82%) 22 (67%) 3 (30%) 3 (30%) 1 (10%) 0 5 (9%) 10 (18%) 15 (27%) 38 (69%) 6 (19%) 10 (31%) 9 (28%) 25 (78%) 8 (24%) 10 (30%) 12 (36%) 6 (18%) 0 0 2 (6%) 21 (64%) 4,91,5 1,30,3 2,91,2 1,60,8 48 (8; 108) 4 (31%) 1,70,9 4,71,2 1,10,3 2,90,9 1,71,4 50 (6; 89) 29 (53%) 6,02,9 4,71,4 1,10,2 2,9 1,2 1,71,0 62,6 (18; 105) 22(69%) 10,13,3 4,81,3 1,10,2 2,91,1 2,11,4 30 (5; 106) 24 (73%) 18,47,0 Далее мы провели оценку взаимосвязи уровня гетероплазмии каждой мутации со степенью поражения коронарного русла. Выявили прямую связь мутации С3256Т с индексом стенозов (r=0,18, р<0,05). Изучили зависимость между количеством пораженных коронарных артерий и уровнем гетероплазмии каждой мутации, установили слабую положительную связь 78 количества пораженных артерий с мутацией С3256Т (r=0,17, p<0,05) (рисунок 13). % гетероплазмии С3256Т 14 r=0,17, p<0,05 12 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 количество пораженных коронарных артерий Рисунок 13. Взаимосвязь уровня гетероплазмии мутации митохондриального генома С3256Т с количеством пораженных коронарных артерий. 3.6. Сравнительная характеристика пациентов с атеросклерозом сонных артерий. В зависимости от выраженности атеросклеротического поражения сонных артерий мы разделили пациентов на две группы: 1) со стенозированием сонных артерий до 20%; 2) со стенозированием сонных артерий более 20%. Среди пациентов со стенозированием сонных артерий более 20% (таблица 29) преобладали мужчины в подгруппе с КА, тогда как в подгруппе без КА было достоверно больше женщин. Подгруппы не различались по возрасту, артериальной гипертонии, ожирению, отягощенной наследственности. Курение в анамнезе чаще встречалось в подгруппе с КА. Уровень Лп(а) был выше среди больных с КА. По уровню изучаемых мутаций различий между подгруппами получено не было. 79 Таблица 29. Характеристика пациентов с атеросклерозом сонных артерий. Показатель Количество мужчин Средний возраст, лет Артериальная гипертония Курение Отяг. наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение ОХС, ммоль/л ХС ЛВП, ммоль/л ХС ЛНП, ммоль/л ТГ, ммоль/л Лп(а), мг/дл G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % Основная группа n=98 98 (89%) 55,49,1 83 (75%) 76 (69%) Контрольная группа n=33 17 (52%) 57,79,1 26 (79%) 10 (30%) 0,0005 0,2 0,87 0,0005 18 (16%) 26 (24%) 32 (29%) 4,71,3 1,10,2 2,91,0 1,91,3 55 (9; 100) 5,2 (3,4; 9,3) 5,7 (3,0; 9,6) 8,6 (7,6; 9,6) 15,6 (12,2; 23,6) 6 (18%) 3 (9%) 13 (39%) 5,41,1 1,20,3 3,30,9 1,91,0 20 (5; 63) 4,8 (3,3; 7,5) 8,2 (3,1; 10,6) 9,0 (7,5; 9,7) 18,0 (13,9; 22,4) 0,98 0,12 0,37 0,005 0,027 0,04 1,0 0,01 0,09 0,07 0,8 0,87 p Среди пациентов, включенных в исследование у 178 (92%) проведено дуплексное сканирование экстракраниального отдела брахиоцефальных артерий. Из 178 обследованных пациентов лишь у 14 человек (8%) не выявлены изменения в сонных артериях (таблица 30). В зависимости от выраженности атеросклеротического поражения мы разделили пациентов на 4 подгруппы: 1) нет изменений в сонных артериях (8% пациентов); 2) утолщение комплекса интима-медиа (11% пациентов); 3) стенозы в сонных артериях 20-49% (63% пациентов); 4) стенозы в сонных артериях более 50% (15% пациентов). Во всех четырех подгруппах преобладали мужчины. С возрастом отмечалось нарастание выраженности атеросклеротического поражения сонных артерий. Частота артериальной гипертонии, курения, гиперлипидемии, ожирения нарастала с 80 увеличением степени стенозирования сонных артерий и была максимальная у пациентов со стенозом сонных артерий более 50%. Уровень ХС ЛВП был ниже среди пациентов с тяжелым поражением сонных артерий. По уровню ОХС, ХС ЛНП, ТГ, Лп(а) значимых различий между подгруппами не выявлено. По исследуемым мутациям различий по подгруппам не установлено. Таблица 30. Сравнительная характеристика пациетов с атеросклерозом сонных артерий в зависимости от выраженности поражения. Показатель Нет изменений, n=14 13 (93%) 46,67,2 46,37,4 6 (43%) Утолщение ТИМ, n=21 13 (62%) 49,49,3 45,86,2 11 (52%) Cтенозы 20-49%, n=116 97 (84%) 54,98,7 53,68,0 84 (72%) Стенозы >=50%, n=27 18 (67%) 60,39,8 59,69,5 25 (93%) 4 (29%) 6 (43%) 5 (24%) 17 (81%) 69 (59%) 108 (93%) 17 (63%) 26 (96%) 3 (21%) 3 (21%) 2 (14%) 3 (14%) 6 (29%) 6 (29%) 22 (19%) 23 (20%) 35 (30%) 2 (7%) 6 (22%) 11 (41%) ИМ в анамнезе КА ОХС, ммоль/л 2 (14%) 4 (29%) 5,11,6 3 (14%) 5 (24%) 5,31,1 58 (50%) 87 (75%) 4,81,1 6 (22%) 23 (85%) 5,21,6 ХС ЛВП, ммоль/л 1,30,3 1,20,2 1,10,3 1,10,2 ХС ЛНП, ммоль/л 3,41,2 3,30,9 2,90,9 3,21,3 ТГ, ммоль/л 2,11,5 1,91,1 1,81,2 2,11,5 Лп(а), мг/дл 36,346,5 55,742,2 55,952,5 55,560,1 5,6 (4,3; 6,9) 4,2 (3,5; 6,4) 5,1 (3,4; 9,2) 3,6 (1,8; 4,8) 4,4 (2,9; 5,5) 6,6 (2,9; 9,9) 7,5 (5,4; 8,5) 19,6 (16,8; 35,8) 7,6 (6,3; 8,1) 21,1(17,7; 25,0) 8,8 (7,8; 9,6) 15,6 (12,3; 22,4) Количество мужчин Средний возраст, лет Средний возраст ужчин Артериальная гипертония Курение Гиперлипидемия Отягощенная наследственность - по отцовской линии - по материнской линии Ожирение G13513A, % G14846A, % C3256T, % G12315A, % 4,6 (3,2; 7,4) 5,4 (3,5; 8,8) 8,5 (7,0; 9,7) 18,7 (14,6; 31,5) 81 Взаимосвязь между атеросклерозом сонных артерий и мутациями митохондриального генома мы оценивали лишь у пациентов контрольной группы без атеросклероза коронарных артерий (n=63). При проведении корреляционного анализа взаимосвязи атеросклероза сонных артерий с уровнем гетероплазмии мутаций выявили прямую связь между атеросклерозом сонных артерий и мутацией С3256Т (r=0,49, p=0,0001) и мутацией G14846A (r=0,48, p=0,0001) (рисунок 14,15). Для мутации G12315A установлена достоверная отрицательная связь с атеросклерозом сонных артерий % гетероплазмии С3256Т (r= - 0,32, p=0,01) (рисунок 16). 12 r=0,49, p=0,0001 10 8 6 4 2 . 0 1 2 3 . атеросклероз сонных артерий Рисунок 14. Взаимосвязь между уровнем гетероплазмии мутации митохондриального генома С3256Т и атеросклерозом сонных артерий. 82 % гетероплазмии G14846A 20 r=0,48, p=0,0001 16 12 8 4 0 . 0 1 2 3 . атеросклероз сонных артерий Рисунок 15. Взаимосвязь между уровнем гетероплазмии мутации % гетероплазмии G12315A митохондриального генома G14846A и атеросклерозом сонных артерий. 70 r= - 0,32, p=0,01 60 50 40 30 20 10 0 0 Рисунок 1 2 3 . атеросклероз сонных артерий 16. Взаимосвязь между уровнем гетероплазмии мутации митохондриального генома G12315A и атеросклерозом сонных артерий. 3.7. Оценка порогового уровня гетероплазмий мутаций митохондриального генома. В литературе нет данных по пороговому уровню гетероплазмии изучаемых мутаций. Известно, что мутации митохондриального генома начинают 83 проявляться клинически при достижении определенного порога. Мы определили пороговый уровень для каждой мутации с помощью ROC анализа. Для мутации G13513A пороговый уровень составил - 7,1% (чувствительность 40%, специфичность 82,5%) (рисунок 17А). Площадь под кривой составила 0,594 (95% доверительный интервал, 0,521-0,664) (рисунок 17Б). А Б Рисунок 17. А. Площадь под кривой при введении в модель мутации G13513А. Б. Пороговый уровень гетероплазмии мутации G13513A. 84 Для мутации C3256T пороговый уровень составил 8,4% (чувствительность 60,8%, специфичность 58,7%) (рисунок 18А). Площадь под кривой - 0,605 (95% доверительный интервал, 0,532-0,674) (рисунок 18Б). А Б Рисунок 18. А. Площадь под кривой при введении в модель мутации С3256Т. Б. Пороговый уровень гетероплазмии мутации С3256Т. 85 Для мутации G12315A пороговый уровень составил 16,4% (чувствительность 56,2%, специфичность 71,4%) (рисунок 19А). Площадь под кривой - 0,626 (95% доверительный интервал, 0,554-0,695) (рисунок 19Б). А Б Рисунок 19. А. Площадь под кривой при введении в модель мутации G12315A. Б. Пороговый уровень гетероплазмии мутации G12315A. 86 3.8. Распределение мутаций митохондриального генома, превышающих пороговый уровень, среди пациентов. В соответствии с полученным пороговым уровнем для каждой мутации мы оценили их распределение у пациентов с наличием или отсутствием КА. Среди всех пациентов (n=193) у 5% ни одна из изучаемых мутаций не достигала порогового уровня, у 35% пациентов 1 мутация превышала пороговый уровень, у 33% - 2 мутации, у 23% – 3 мутации. И лишь у 4% пациентов все 4 мутации превышали пороговый уровень (рисунок 20). 23% 4% 5% 33% 35% нет мутаций 1 мутация 2 мутации 3 мутации 4 мутации Рисунок 20. Частота мутаций митохондриального генома, превышающих пороговый уровень в общей группе больных. Далее мы проанализировали распределение мутаций, превышающих пороговый уровень среди больных с КА и пациентов без КА. Полученные данные представленны в виде диаграмм (рисунок 21, 22). 87 Рисунок 21. Частота мутаций, превышающих пороговый уровень у больных c коронарным атеросклерозом (n=130). Рисунок 22. Частота мутаций, превышающих пороговый уровень у лиц без коронарного атеросклероза (n=63). Среди больных с КА (рисунок 21) количество лиц с 1 мутацией составило 28%, тогда как в группе без КА 49% (рисунок 22). В то же время доля больных с наличием двух мутаций была равна 37% и 24% соответственно. Между подгруппами не было отличий по встречаемости лиц с 3 и 4 мутациями, а также с 88 отсутствием мутаций. В целом, при оценке распределения мутаций между больными с наличием и отсутствием КА отмечена тенденция к преобладанию мутаций, превышающих пороговый уровень гетероплазмии, в основной группе: χ2 = 8,49; р = 0,07. 3.9. Оценка диагностической значимости мутаций митохондриального генома как генетического биомаркера атеросклероза. Для оценки диагностической значимости мутаций митохондриального генома как генетического биомаркера атеросклероза коронарных и сонных артерий был проведен метод построения ROC-кривых (рисунок 23). Рисунок 23. Характеристические кривые для оценки диагностической значимости мутаций митохондриального генома. МГ – митохондриальный геном, ФР – факторы риска. Мы создали четыре модели (таблица 31). Первая модель включает только мутации митохондриального генома, вторая модель - мутации и возраст, третья модель - классические факторы риска, четвертая модель – мутации в сочетании с возрастом и классическими факторами риска ССЗ. 89 Таблица 31. Данные характеристических кривых. Переменные Площадь Стандартна под кривой я ошибка 95% доверительный интервал Нижняя Верхняя граница граница 0,511 0,719 0,517 0,724 0,576 0,774 Мутации МГ 0,615 0,053 Мутации МГ+возраст 0,620 0,053 Классические ФР 0,675 0,050 Мутации+возраст 0,734 0,047 0,642 0,827 +классические ФР Примечание. МГ – митохондриальный геном, ФР – факторы риска При изолированном использовании мутаций митохондриального генома (C3256T, G14846A, G13513A) в качестве предиктора атеросклероза площадь под кривой составила 0,615, что свидетельствует о связи мутаций с наличием атеросклеротического поражения коронарных и сонных артерий, но степень этой взаимосвязи слабее, чем у классических факторов риска (площадь под характеристической кривой 0,675). При использовании в модели мутаций митохондриального генома в сочетании с возрастом площадь под кривой была 0,620, и она существенно возрастала при использовании в модели возраста, классических факторов (0,7340,047). Таким риска образом, и мутаций наилучшее митохондриального предсказующее генома значение для подтверждения наличия атеросклероза коронарных и сонных артерий имеет модель, в которую вошли классические факторы риска, возраст и мутации митохондриального генома (C3256T, G13513A, G14846A). 90 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. Одним из приоритетных направлений современной медицины является доклиническая ранняя диагностика и профилактика социально-значимых заболеваний, таких как ИБС. Несмотря на достижения в области фармакологии, кардиологии заболеваемость и смертность от ИБС остаются на высоком уровне представляя глобальную медико-социальную проблему. Большое количество исследований в последние годы было направлено на поиск генетических биомаркеров атеросклероза. В основном изучались мутации ядерного генома, ассоциированные с данной патологией, в то время как изучению роли мутаций митохондриального генома в развитии атеросклероза посвящено ограниченное количество исследований. Данная работа была направлена на поиск генетических биомаркеров атеросклероза – мутаций митоходриальногогенома. В ней использовался метод количественного определения мутантного аллеля митохондриального генома на основе технологии пиросеквенирования в модификации, разработаной Сазоновой М.А. и соавторами в отделе сердечно-сосудистой патологии ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ. Благодаря данному методу, возможна не только качественная, но и количественная оценка мутантных аллелей митохондриального генома в лейкоцитах крови человека. Для митоходриального генома характерна высокая скорость мутирования и накопления соматических мутаций в процессе онтогенеза. В одной клетке могут одновременно присутствовать митохондрии с геномом дикого типа и несущие мутации. При достижении определенного порога дефектных копий мтДНК снижается продукция АТФ, в связи с этим мутации митохондриального генома могут длительное время не иметь клинических проявлений. Предпосылками для нашей работы послужили следующие исследования. В исследовании, выполненном в ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ, при изучении 40 мутаций в образцах митохондриальной ДНК, выделенных из пораженных атеросклерозом 91 и нормальных участков интимы аорты 10 молодых людей, погибших вследствие несчастных случаев, обнаружено, что уровни гетероплазмии десяти мутаций мтДНК (A1555G, С3256T, G12315A, T3336C, G13513A, C5178A, G15059A, G14459A, G14846A, 652insG) были значительно выше в участках аорты, пораженных атеросклерозом [Sazonova M. et al., 2009]. В пилотном исследовании, выполненном в лаборатории медицинской генетики ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ (неопубликованные данные) на секционном материале, при электронно-микроскопическом исследовании было отмечено, что у пациентов без атеросклероза сонных артерий кристы в матрице митохондрий имеют правильное расположение, в то время как в митохондриях лейкоцитов, полученных из крови пациентов с атеросклерозом сонных артерий, отмечались структурные изменения крист, которые проявлялись как в изменении их формы, так и в уменьшении их количества. Это побудило авторов исследования изучить уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома в лейкоцитах крови пациентов с атеросклерозом сонных артерий. В исследовании с участием 191 пациента (84 мужчин, средний возраст 65,09,4 лет), из которых у 45 больных были клинические проявления ИБС, была показана ассоциация между уровнем гетероплазмии мутации митохондриального генома С3256Т в лейкоцитах крови и атеросклеротическим поражением сонных артерий [Sobenin I.A. еt al., 2012]. Учитывая данные литературы о том, что мутации митохондриального генома могут накапливаться с возрастом [Marin-Garcia J. et al., 2002; Тодоров И.Н., 2009] мы провели оценку связи изучаемых мутаций мтДНК с возрастом. Получена положительная связь мутации G14846A с возрастом (r=0,21, р=0,012), тогда как в другом исследовании была показана ассоциация и других мутаций митоходриального генома с возрастом: G13513A (r =-0,363, p<0,001), C3256T (r=0,279, p<0,001), G12315A (r=0,255, p<0,001) [Sobenin I.A. et al., 2013]. В то время как в работе, выполненной Чичевой М.М., которая изучала мутации 92 митохондриального генома у 183 женщин с бессимптомным атеросклерозом, получены данные, что мутации G13513A, G14846A, С3256Т и G12315A не взаимосвязаны с возрастом [Чичева М.М., 2013]. Ассоциация мутаций с возрастом свидетельствует о накоплении мутаций митохондриального генома в течение жизни человека. Данный факт может быть обусловлен несколькими причинами. Возможно, мутации являются соматическими, это подтверждается тем, что для мтДНК характерна высокая скорость мутирования за счет повышенной концентрации активных форм кислорода в митохондриях, отсутствия защитных гистонов и неэффективной системы репарации [Тодоров И.Н., 2009]. Следующим объяснением накопления мутантной мтДНК может быть пролиферация митохондрий, содержащих мутантный аллель, переданный по наследству по материнской линии. Мутации митохондриального генома приводят к развитию заболевания, если порог гетероплазмии мутации достигает определенного уровня [Silvestri G. et al, 1994; Merante F. et al., 1994]. В связи с данными литературы, свидетельствующими о том, что классические факторы риска ССЗ (курение, артериальная гипертония, гиперлипидемия) ассоциируются с повышением производства активных форм кислорода в митохондриях и, как следствие, с развитием повреждения мтДНК [Wallace D.C. еt al., 1992; Ballinger S.W. еt al., 2002], мы провели оценку взаимосвязи классических факторов риска с изучаемыми мутациями мтДНК. В проведенном нами исследовании не выявлено связи мутаций митохондритального генома с такими факторами риска ССЗ, как пол, курение, артериальная гипертония, ожирение, отягощенный семейный анамнез по ССЗ. С наличием гиперлипидемии отмечена прямая связь мутации C3256T (r=0,18, р=0,01) и обратная для мутации G12315A (r= -0,2, р=0,005). Для других мутаций зависимости выявлено не было. Такие же данные были получены в исследовании с участием 183 условно здоровых женщин в возрасте от 34 до 86 лет, не 93 имеющих клинические проявления атеросклероза, где было показано, что мутации митохондриального генома G13513A, G14846A, С3256Т и G12315A не связаны с классическими факторами риска (курение, артериальная гипертония, ожирение) [Чичева М.М., 2013]. При проведении подгруппового анализа мы выявили следующие закономерности: у женщин, лиц с курением в анамнезе, лиц с артериальной гипертонией, лиц с отягощенным семейным анамнезом по материнской линии уровни гетероплазмии между пациентами с КА и пациентами без КА не различаются. Мы разделили всю выборку на две группы с отягощенным семейным анамнезом и без него. В группе без отягощенного семейного анамнеза мутации С3256Т и G13513А были связаны с наличием КА. В то время как в группе с отягощенным семейным анамнезом уровни гетероплазмий мутаций между пациентами с КА и без КА не различались. В нашей работе мы впервые провели подробный анализ по взаимосвязи мутаций митохондриального генома и отягощенного семейного анамнеза по ССЗ по материнкой линии. Во всех работах по изучению ССЗ оценивается общий отягощенный семейный анамнез, включающий анамнез по материнской и отцовской линиям. Мы провели анализ в зависимости от наличия отягощенного семейного анамнеза по материнской линии. Среди группы пациентов без отягощенного материнского анамнеза выявлялась ассоциация мутаций С3256Т и G13513А с КА. А в группе больных с отягощенным материнским анамнезом различий по уровню гетероплазмии между пациентами с КА и без КА выявлено. Как известно, мутации митохондриального генома наследуются по материнской линии, в связи с чем, полученные результаты, возможно, подтверждают связь мутаций мтДНК с развитием атеросклероза коронарных артерий. Холестерин ЛНП и окисленный ХС ЛНП могут вызвать повреждение митохондрий [Ballinger S.W., 2005]. Нагрузка макрофагов свободным 94 холестерином ассоциирована с митохондриальной дисфункцией [Yao P.M. еt al., 2001]. В исследовании, проведенном на апоЕ-нокаутированных мышах, показано, что в образцах аорты апоЕ-нокаутированных мышей значительно более высокие уровни повреждения мтДНК по сравнению с образцами аорты контрольной группы животных (р<0,001) и установлено, что повреждения мтДНК предшествует атерогенезу [Ballinger W. et al., 2002]. В рамках диссертационной работы была исследована связь мутаций митохондриального генома лейкоцитов крови с различными липидными параметрами (ТГ, ОХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП, Лп(а)) крови пациентов, не получавших статины и другие гиполипидемические препараты. Выявлена положительная связь уровня гетероплазмии мутации G13513A с концентрацией ХС ЛВП (r=0,18, р<0,05), мутации C3256T с уровнем ТГ (r=0,22, р<0,05), мутации G14846A с концентрацией ОХС (r=0,16, р<0,02). В исследовании Желанкина А.В. выявлена слабая положительная корреляция между ТГ уровнями гетероплазмии мутаций C3256T, G12315A, уровень гетероплазмии мутации G12315A положительно коррелировал с уровнями ТГ, ОХС и ХС ЛНП в крови [Желанкин А.В., 2013]. В работе Чичевой М.М. ни одна из изучаемых мутаций не коррелировала с липидами крови [Чичевой М.М., 2013]. Различия полученных результатов, вероятно, обусловлены тем, что в других исследованиях не учитывали факт приема пациентами гиполипидемических препаратов. Мы впервые провели анализ взаимосвязи концентрации Лп(а) крови с мутациями митохондриального генома. Выявили положительную связь мутации G14846A с уровнем Лп(а) (r=0,23, р=0,01). Полученные данные требуют дальнейшего изучения. В нашем исследовании была показана положительная ассоциация мутаций G13513A и С3256T мтДНК лейкоцитов крови человека с наличием КА и отрицательная связь мутации G12315A с наличием КА. Данные нашего исследования частично совпадают с работой, в которую было включено 192 95 пациента (85 мужчин, средний возраст 65,09,4 лет), среди них 45 участников имели клинические проявления ИБС и было показано, что с ИБС ассоциированы мутации митохондриального генома C3256T, G12315A, G13513A, уровень мутации G14846A не различался между группами [Желанкин А.В., 2013]. Однако в этой работе диагноз ИБС выставлялся клинически и коронарный атеросклероз не был верифицирован с помощью КАГ. Достоинством нашей работы является то, что всем пациентам коронарный атеросклероз был подтвержден данными КАГ. В ранее проведенных исследованиях не изучалась ассоциация мутаций митохондриального генома со степенью выраженности коронарного атеросклероза. Оценка поражения коронарного русла в нашем исследовании проводилась по количеству пораженных основных магистральных артерий и на основе расчета индекса Gensini. Выявлена прямая связь мутации С3256Т с количеством пораженных коронарных артерий (r=0,18, р<0,05) и с индексом стенозов (r=0,18, р<0,05). В нашем исследовании показана прямая связь атеросклероза сонных артерий с мутацией С3256Т и G14846A. Для мутации G12315A установлена отрицательная связь с атеросклерозом сонных артерий. В ранее проведенных исследованиях была установлена корреляция между толщиной комплека интимамедиа сонных артерий и уровнем гетероплазмии мутаций C3256T (r=0,362, р<0,001), G12315A (r=0,306, р<0,001), G13513A (r=-0,357, р<0,001), в то время как уровень гетероплазмии мутации G14846A не ассоциирован с толщиной комплекса интима-медиа [Sobenin I.A. et al., 2013; Желанкин А.В., 2013]. В исследовании Чичевой М.М. уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома C3256T, G14709A, G12315A, G13513A и G14846A ассоциирован с атеросклерозом сонных артерий у женщин [Чичева М.М., 2013]. Различия между исследованиями могут быть обусловлены разными выборками, в частности, в нашей работе были пациенты с более тяжелым каротидным атеросклерозом, не 96 только с утолщением комплекса интима-медиа, но и с гемодинамически значимыми атеросклеротическими бляшками в сонных артериях. Таким образом, в ходе анализа данных, полученных в нашем исследовании, мы можем сделать вывод, что на исследуемой выборке мутации С3256T, G13513А, G14846A оказывают проатерогенное действие, а мутация G12315A антиатерогенное. Кроме изучаемых в нашей работе мутаций, для других мутаций митохондриального генома в литературе была описана ассоциация с атеросклерозом сонных и коронарных артерий (652insG, T16189C, A1555G, T3336C, C5178A, G15059A, G14459A). В исследовании с участием 190 пациентов было показано, что уровень гетероплазмии мутации 652insG митохондриального генома в лейкоцитах крови пациентов с атеросклеротическим поражением сонных артерий ниже по сравнению с лицами без атеросклероза сонных артерий, p=0,026. [Сазонова М.А. и соавт., 2010]. В австрийском исследовании, в котором сравнили частоту мутации T16189C мтДНК у пациентов с ИБС (n=482) и здоровых лиц (n=1481) европейского происхождения, установили, что распространенность мутации T16189C была значительно выше у пациентов с ИБС (21,6% против 11,8%) [Mueller E.E. et al., 2011]. Abu-Amero К.К. в исследовании с участием 669 пациентов, у которых диагноз ИБС был подтвержден при коронарографии, обнаружили более высокую распространенность мутации T16189C среди больных ИБС по сравнению с лицами контрольной группы (n=258): 27,8% в сравнении с 20,2%, р = 0,017 [AbuAmero К. К. et al., 2010]. Kokaze A. и соавторы провели исследование мутации А5178С мтДНК среди 461 здоровых лиц в японской популяции. Оказалось, что мутация А5178С значительно чаще встречалась среди мужчин с более высоким уровнем ХС ЛВП 97 и эта закономерность сохранялась после поправки на возраст и индекс массы тела (p=0,026). Концентрация ТГ у женщин с мутацией А5178С была значительно ниже, чем у женщин без наличия данной мутации (р=0,012). Это первое генетическое эпидемиологическое исследование по ассоциации мутации А5178С с липидами крови в японском населении. Частота мутации А5178A оказалась значительно выше среди японских долгожителей, чем в общей популяции [Kokaze A. et al., 2001]. Лейкоциты играют важную роль в атерогенезе. Они мигрируют в субэндотелиальное пространство и участвуют в развитии атеросклеротического поражения сосудистой стенки [Galkina E. et al., 2007, 2009]. Наличие мутаций митохондриального генома в лейкоцитах, находящихся в сосудистой стенке, может привести к локальному окислительному стрессу и другим патологическим реакциям, которые могут способствовать развитию атеросклероза. Возможным механизмом, объясняющим влияние мутаций мтДНК на развитие атеросклероза является то, что в макрофагах, содержащих мутантную мтДНК, снижается продукция АТФ, синтез ферментов-липаз, работающих в лизосомах, макрофаги становятся неспособными полностью метаболизировать модифицированные ЛНП, в результате чего они накапливаются в атеросклеротической бляшке, превращаясь в пенистые клетки. Поражение сосудистой стенки при атеросклерозе развивается локально. Классические факторами риска невозможно объяснить локальность атеросклеротического поражения. Мутации митохондриального генома могут частично объяснить данный факт. Мутации, передающиеся по материнской линии, могут избирательно накапливаться в определенных участках сосудистой стенки в связи с тем, что при делении митохондрии распределяются между дочерними клетками случайным образом вследствие митотической сегрегации, в результате чего дочерние клетки могут значительно различаться уровнем гетероплазмии [Wonnapinij P. еt al., 2008]. Возможно, участки интимы, где содержатся клетки с 98 большим количеством мутантной мтДНК, вследствие митохондриальной дисфункции, снижения производства АТФ и увеличения выработки активных форм кислорода становятся наиболее подвержены атеросклеротическому процессу. Хотя активные формы кислорода, несомненно, играют важную роль в повреждении мтДНК при атеросклерозе, данные исследования Yu Е. свидетельствуют о другой механизме, связывающем повреждения мтДНК и атеросклероз. Дефекты мтДНК способствуют снижению экспрессии генов, кодирующих белки дыхательных комплексов, что приводит к уменьшению выработки АТФ в ГМК, моноцитах/макрофагах, что стимулирует апоптоз и ингибирует пролиферацию клеток, приводя к развитию атеросклероза [Yu Е. et al., 2013]. На модели моноциты/макрофаги, мышей в исследовании содержащие Yu повреждения Е. показано, мтДНК, что увеличивают производство фактора некроза опухоли-α и интерлейкина-1, способствуя увеличению некротического ядра атеросклеротической бляшки и истончения фиброзного покрытия [Yu Е. et al., 2013]. По данным внутрисосудистого ультразвукового исследования коронарных артерий человека показано, что нет корреляции между повреждением мтДНК лейкоцитов крови человека и объемом атеросклеротических бляшек, но имеется прямая связь повреждений мтДНК с тонкой фиброзной покрышкой атеросклеротических бляшек [Calvert P.A. et al., 2011; Stone G.W. et al., 2011]. Мутация мтДНК C3256T происходит в гене, кодирующем митохондриальную транспортную рибонуклеиновую кислоту (тРНК) лейцина. Мутация C3256T вызывает нарушение терминации трансляции, что препятствует отделению полипептидной цепи от рибосомы и приводит к нарушению дальнейшего использования как полипептида, так и рибосомы. Следствием дефектов тРНК лейцина снижается синтез белков дыхательной цепи в 99 митохондриях, что приводит к падению уровня энергии в клетке [Rossmanith W., 1998]. Мутация G12315A происходит в нуклеотиде 52 тРНК лейцина, который входит в состав Т-петли тРНК лейцина. Мутация G12315A приводит к замене гуанина на аденин в одной из цепей тРНК лейцина, что приводит к нарушению ее третичной структуры и к снижению ее функциональности [Levinger L. et al., 2004]. Мутация G13513A вызывает замену аспарагиновой кислоты на аспарагин в белке субъединицы 5 комплекса НАДН-дегидрогеназы дыхательного комплекса I, что приводит к нарушению переноса НАДН с убихинона на различные цепи пластохинона. В результате наличия мутации происходит снижение эффективности работы комплекса I дыхательной цепи митохондрий, что способствует развитию митохондриальной дисфункции [Shanske S. et al., 2000; Sudo A. et al., 2004]. Мутация G14846A ведет к изменению аминокислотного состава цитохрома В, который является частью комплекса III дыхательной цепи. При мутировании меняется аминокислота глицин на серин, что создает дополнительный сайт фосфорилирования белковой цепи [Andreu A.L., 1998]. Определение точных патогенетических механизмов, с помощью которых мутации митохондриального генома влияют на атерогенез, является важной задачей и требует дальнешего изучения. Ограничением нашей работы является то, что исследование было одномоментное. Учитывая данные литературы о влиянии факторов риска ССЗ на развитие мутаций митохондриального генома, мы полагаем, что идеальная модель для контрольной группы - это здоровые лица без наличия классических факторов риска атеросклероза, так как имеются работы, показывающие что курение, артериальная гипертония, гиперлипидемия могут вызывать мутации 100 митохондриального генома [Puddu P. et al., 2009]. В нашем же исследовании пациентов без классических факторов риска было крайне мало. Заключение. В нашей работе были исследованы мутации митохондриального генома и показана их ассоциация с атеросклерозом коронарных и сонных артерий. Учитывая полученные данные, мутации митохондриального генома могут быть использованы в качестве информативных маркеров генетической предрасположенности к атеросклерозу. В настоящее время появляется все больше доказательств того, что мутации митохондриального генома принимают непосредственное участие в развитии атеросклероза. Дальнейшие исследования в этом направлении представляются необходимыми. Понимание точных механизмов, с помощью которых мутации митохондриального генома и, как следствие, митохондриальная дисфункция способствуют развитию атеросклероза, откроет новые мишени для разработки лекарственных препаратов. 101 ВЫВОДЫ. Уровень гетероплазмии мутаций G13513A и С3256T существенно 1. выше у пациентов с наличием коронарного атеросклероза. Выявлена прямая связь между мутацией С3256Т и степенью 2. поражения коронарных артерий. Установлена положительная связь мутации G14846A с возрастом. С 4. гиперлипидемией отмечена прямая связь мутации С3256T. Не установлено связи мутаций митохондриального генома с полом, курением, артериальной гипертонией, ожирением, отягощенным семейным анамнезом по ССЗ. 5. Выявлена прямая зависимость между наличием атеросклероза сонных артерий и мутациями митохондриального генома С3256Т, G14846A. Установлена отрицательная связь мутации G12315A c атеросклерозом сонных артерий. 6. Показана положительная связь между уровнем гетероплазмии мутации G14846A и уровнем липопротеида(а). ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Измерение уровня гетероплазмии мутаций С3256T, G13513A и G14846A митохондриального генома может быть рекомендовано в качестве генетического маркера для улучшения диагностики предрасположенности к атеросклерозу коронарных и сонных артерий. Метод количественной оценки мутантного аллеля митохондриального генома на основе технологии пиросеквенирования, может быть предложен для определения уровня гетероплазмии мутаций митохондриального генома в популяции. 102 Список литературы. 1) Афанасьева О.И. Липопротеид(а) и полиморфизм апобелка(а) как факторы риска атеросклероза и его осложнений. Автореферат дисс. докт. биол. наук. Москва 2011, 44 стр. 2) Ежов М.В. Липопротеид(а) и его роль в развитии коронарных осложнений у больных ишемической болезнью сердца. Дисс. докт. мед. наук. Москва 2009, 190 стр. 3) Желанкин А.В. Мутации митохондриального генома лейкоцитов крови при атеросклерозе сонных артерий и ишемической болезни сердца у человека: Автореферат дисс. канд. биол. наук. Москва 2013, 24 стр. 4) мутации Сазонова М.А., Иванова М.М., Желанкин А.В. и др. Ассоциация митохондриального генома 652insG с атеросклеротическими поражениями человека. Фундаментальные науки и практика 2010; 1(4): 168-171. 5) Собенин И.А., Сазонова М.А., Мясоедова В.А. и др. Полиморфизм 3256С/Т митохондриальной ДНК как маркер ишемической болезни сердца и атеросклероза. Проблемы и перспективы современной науки 2011; 3(1): 108-110. 6) Тодоров И.Н. Митохондрии: окислительный стресс и мутации митохондриальной ДНК в развитии патологий, процессе старения и апоптозе. Российский химический журнал 2007; 51(1): 93-106. 7) Тодоров И.Н., Тодоров Г.И. Мультифакторная природа высокой частоты мутаций в мтДНК cоматических клеток млекопитающих. Биохимия 2009; 74: 1184–1194. 8) Чичева М.М. Изучение патогенетической значимости мутаций митохондриального генома в клетках крови при бессимптомном атеросклерозе у женщин. Автореферат дисс. канд. биол. наук. Москва 2013, 24 стр. 9) Abu-Amero K.K., Al-Boudari O.M, Mousa A., et al. The mitochondrial DNA variant Т16189С is associated with coronary artery disease and myocardial infarction in Saudi Arabs. Genet Test Mol Biomarkers 2010; 14: 43–47. 103 10) Agaton C., Unneberg P., Sievertzon M., et al. Gene expression analysis by signature pyrosequencing. Gene 2002; 289: 1(2): 31-39. 11) Alberts Bruce, Alexander Johnson, Julian Lewis, et al. Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Publishing Inc 1994; 232-234. 12) Aldakkak M., Stowe D.F., Lesnefsky E.J., еt al. Modulation of mitochondrial bioenergetics in the isolated Guinea pig beating heart by potassium and lidocaine cardioplegia: implications for cardioprotection. Cardiovasc Pharmacol 2009; 54(4): 298-309. 13) Ali M.H., Pearlstein D.P., Mathieu C.E., еt al. Mitochondrial requirement for endothelial responses to cyclic strain: implications for mechanotransduction. Am J Physiol 2004; 287 (3): 486–496. 14) Ambrose M., Goldstine J.V., Gatti R.A., еt al. Intrinsic mitochondrial dysfunction in ATM-deficient lymphoblastoid cells. Hum Mol Genet 2007; 16(18): 2154-64. 15) Ames B.N. Delaying the mitochondrial decay of aging. Ann NY AcadSci 2004; 1019: 406–411. 16) Anderson S., Bankier A.T., Barrell B.G., еt al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 1981; 290: 457–465. 17) Andersson S.G., Karlberg O., Canbäck B., et al. On the origin of mitochondria: a genomics perspective. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2003; 358(1429): 165-77; discussion 177-9. 18) Andrabi S.A., Kim N.S., Yu S.W., et al. Poly(ADP-ribose) (PAR) polymer is a death signal. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103(48):18308-13. 19) Andreassi M.G., Botto N., Colombo M.G., et al. Genetic instability and atherosclerosis: can somatic mutations account for the development of cardiovascular diseases? Environ Mol Mutagen 2000; 35(4): 265-269. 20) Аdreassi M.G., Botto N. DNA damage as a new emerging risk factor in atherosclerosis.Trends. Cardiovasc. Med 2003; 413(7): 270-275. 104 21) Andreu A.L., Bruno C., Shanske S., et al. Missense mutation in the mtDNA cytochrome b gene in a patient with myopathy. Neurology 1998; 51(5): 14441447. 22) Arbustini E, Fasani R, Morbini P., et al. Coexistence of mitochondrial DNA and beta myosin heavy chain mutations in hypertrophic cardiomyopathy with late congestive heart failure. Heart 1998; 80(6): 548-58. 23) Argaud L., Gateau-Roesch O., Raisky O., et al. Postconditioning inhibits mitochondrial permeability transition. Circulation 2005; 111: 194–197. 24) Armstrong J.S. Mitochondrial medicine: pharmacological targeting of mitochondria in disease. Br J Pharmacol 2007; 151: 1154-1165. 25) Auchampach J.A., Cavero I., Gross G.J. Nicorandil attenuates myocardial dysfunction associated with transient ischemia by opening ATP-dependent potassium channels. J Cardiovasc Pharmacol 1992; 20: 765–771. 26) Austin R.C., Sood S.K., Dorward A.M., et al. Homocysteine-dependent alterations in mitochondrial gene expression, function and structure. Homocysteine and H2O2 act synergistically to enhance mitochondrial damage. J Biol Chem 1998; 273: 30808-17. 27) Awad W.I., Shattock M.J., Chambers D.J. Ischemic preconditioning in immature myocardium. Circulation 1998; 98: 206–213. 28) Ballinger S.W., Patterson C., Knight-Lozano C.A., et al. Mitochondrial integrity and function in atherogenesis. Circulation 2002; 106(5): 544-549. 29) Ballinger S.W., Patterson C., Yan C.N., еt al. Hydrogen peroxide- and peroxynitrite-induced mitochondrial DNA damage and dysfunction in vascular endothelial and smooth muscle cells. Circ Res 2000; 86(9):960-6. 30) Ballinger S.W. Mitochondrial dysfunction in cardiovascular disease. Free Radic Biol Med 2005; 38: 1278-1295. 105 31) Bornstein B., Mas J.A., Patrono C., et al. Comparative analysis of the pathogenic mechanisms associated with the G8363A and A8296G mutations in the mitochondrial tRNALys gene. Biochem J 2005; 387(3): 773–778. 32) Botto N., Berti S., Manfredi S., et al. Detection of mtDNA with 4977 bp deletion in blood cells and atherosclerotic lesions of patients with coronary artery disease. Mutat Res 2005; 15: 570(1):81-8. 33) Botto N., Rizza A., Colombo M.G., еt al. Evidence for DNA damage in patients with coronary artery disease. Mutat Res 2001; 493(1-2): 23-30. 34) Brownlee M. Biochemistry and molecular cell biology of iabetic complications. Nature 2001; 414(6865): 813–820. 35) Calvert P.A., Obaid D.R., O'Sullivan. Association between IVUS findings and adverse outcomes in patients with coronary artery disease: the VIVA (VH-IVUS in Vulnerable Atherosclerosis) Study M,JACC Cardiovasc Imagin 2011; 4(8): 894-901. 36) Camara A.K., Bienengraeber M., Stowe D.F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Front Physiol 2011; 2:1-34. 37) Camara A.K., Lesnefsky E.J., Stowe D.F. Potential therapeutic benefits of strategies directed to mitochondria. Antioxid Redox Signal 2010; 13(3): 279-347. 38) Chan D.C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell 2006; 125(7): 1241-52. 39) Chang J.C., Kou S.J., Lin W.T., Liu C.S. Regulatory role of mitochondria in oxidative stress and atherosclerosis. World J Cardiol 2010; 2(6): 150-9. 40) Chen L., Tian X., Song L. Biochemical and biophysical characteristics of mitochondria in the hypertrophic hearts from hypertensive rats. Chin Med J (Engl) 1995; 108: 361-366. 41) Chinnery P.F., Turnbull D.M. Mitochondrial DNA and disease. Lancet 1999; 354: 17-21. 106 42) Chipuk J.E., Bouchier-Hayes L., et al. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation 2006; 13 (8): 1396–1402. 43) Chistiakov D.A., Sobenin I.A., Bobryshev Y.V., et al. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial DNA mutations in atherosclerotic complications in diabetes. World J Cardiol 2012; 4: 148–156. 44) Chol M., Lebon S., Bénit P., et al. The mitochondrial DNA G13513A MELAS mutation in the NADH dehydrogenase 5 gene is a frequent cause of Leigh-like syndrome with isolated complex I deficiency. J Med Genet 2003; 40(3): 188-91. 45) Connolly B.S., Feigenbaum A.S., Robinson B.H., et al. MELAS syndrome, cardiomyopathy, rhabdomyolysis, and autism associated with the A3260G mitochondrial DNA mutation. Biochem Biophys Res Commun 2010; 402(2): 443-447. 46) Cortopassi G.A., Shibata D., Soong N.W., et al. A pattern of accumulation of a somatic deletion of mitochondrial DNA in aging human tissues. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 7370 –7374. 47) Cree L.M., Samuels D.C., de Sousa Lopes S.C. A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes. Nat. Genet 2008; 40: 249–254. 48) Crompton M., Costi A., Hayat L. Evidence for the presence of a reversible Ca2+-dependent pore activated by oxidative stress in heart mitochondria. Biochem J 1987; 245: 915–918. 49) Cummins J.M. Mitochondria: potential roles in embryogenesis and nucleocytoplasmic transfer. Hum.Reprod. Update 2001; 7: 217–228. 50) Dai Y.L., Luk T.H., Siu C.W., et al. Mitochondrial dysfunction induced by statin contributes to endothelial dysfunction in patients with coronary artery disease. Cardiovasc Toxicol 2010; 10: 130 – 138. 107 51) Daugas E., Nochy D., Ravagnan L., et al. Apoptosis-inducing factor (AIF): a ubiquitous mitochondrial oxidoreductase involved in apoptosis. FEBS Lett 2000; 476: 118-23. 52) Dawson V.L., Dawson T.M. Poly(ADP-ribose) (PAR) polymer is a death signal. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: 18308-18313. 53) De Pinieux G., Chariot P., Ammi-Said M., et al. Lipid-lowering drugs and mitochondrial function: еffects of HMG-CoA reductase inhibitors on serum ubiquinone and blood lactate/ pyruvate ratio. Br J Clin Pharmacol 1996; 42: 333 – 337. 54) Dedkova E.N., Ji X., Lipsius S.L., et al. Mitochondrial calcium uptake stimulates nitric oxide production in mitochondria of bovine vascular endothelial cells. Am J Physiol 2004; 286(2): 406–415. 55) human Degoul F., Brulé H., Cepanec C., et al. Isoleucylation properties of native mitochondrial tRNAIle and tRNAIle transcripts. Implications for cardiomyopathy-related point mutations (4269, 4317) in the tRNAIle gene. Hum Mol Genet 1998; 7(3): 347-54. 56) Deja M.A., Malinowski M., Golba K.S., et al. Diazoxide protects myocardial mitochondria, metabolism, and function during cardiac surgery: a doubleblind randomized feasibility studyof diazoxide-supplemented cardioplegia. J Thorac Cardiovasc Surg. 2009; 137: 997–1004. 57) Di Mauro S. Mitochondrial medicine. Biochim Biophys Acta 2004; 1659: 107-114. 58) Doughan A.K., Harrison D.G., Dikalov S.I. Molecular mechanisms of angiotensin II-mediated mitochondrial dysfunction: linking mitochondrial oxidative damage and vascular endothelial dysfunction. Circ Res 2008; 102(4): 488-96. 59) Du X.L., Sui G.Z., Stockklauser-Farber K., еt al. Introduction of apoptosis by high proinsulin and glucose in cultured human umbilical vein endothelial cells is mediated by reactive oxygen species. Diabetologia 1998; 41(3) : 249–256. 108 60) Duchen M.R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes 2004; 53; 96-102. 61) Duell P.B., Malinow M.R. Homocysteine: an important risk factor for atherosclerotic vascular disease. Curr Opin Lipidol 1997; 8:28-34. 62) Duranski M.R., Greer J.J., Dejam A., et al. Cytoprotective effects of nitrite during in vivo ischemia-reperfusion of the heart and liver. J Clin Invest 2005; 115: 1232–1240. 63) Eaton J.S., Lin Z.P., Sartorelli A.C., еt al. Ataxia-telangiectasia mutated kinase regulates ribonucleotide reductase and mitochondrial homeostasis. J Clin Invest 2007; 117(9): 2723-2734. 64) Eaton M.M., Gursahani H., Arieli Y., et al. Acute tobacco smoke exposure promotes mitochondrial permeability transition in rat heart. J Toxicol Environ Health A 2006; 69: 1497-1510. 65) Erqou S., Thompson A., Di Angelantonio E., et al. Apolipoprotein(a) isoforms and the risk of vascular disease: systematic review of 40 studies involving 58,000 participants. J Am Coll Cardiol 2010; 55(19): 2160-7. 66) Esposito L.A., Melov S., Panov A., et al. Mitochondrial disease in mouse results in increased oxidative stress. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 4820-4825. 67) Fearon I.M., Faux S.P. Oxidative stress and cardiovascular disease: novel tools give (free) radical insight. J Mol Cell Cardiol 2009; 47: 372–381. 68) Fernandez-Moreno M.A., Bornstein В., Petit N., еt al. The pathophysiology of mitochondrial biogenesis: towards four decades of mitochondrial DNA research. Mol. Genet. Metab 2000; 71: 481-495. 69) Ferrari R. The role of mitochondria in ischemic heart disease. J Cardiovasc Pharmacol 1996; 1:1-10. 70) Fleming I., Mohamed A., Galle J., et al. Oxidized low-density lipoprotein increases superoxide production by endothelial nitric oxide synthase by inhibiting PKCalpha. Cardiovasc Res 2005; 65: 897-906. 109 71) Forbes R.A., Steenbergen C., Murphy E. Diazoxide-induced cardioprotection requires signaling through a redox-sensitive mechanism. Circ Res 2001; 88: 802-809. 72) Förstermann U. Janus-faced role of endothelial NO synthase in vascular disease: uncoupling of oxygen reduction from NO synthesis and its pharmacological reversal. Biol Chem 2006; 387: 1521-33. 73) Fournier N., Ducet G., Crevat A. Action of cyclosporine on mitochondrial calcium fluxes. J Bioenerg Biomembr 1987; 19(3): 297-303. 74) Fu K, Hartlen R, Johns T., et al. A novel heteroplasmic tRNAleu(CUN) mtDNA point mutation in a sporadic patient with mitochondrial encephalomyopathy segregates rapidly in skeletal muscle and suggests an approach to therapy. Hum Mol Genet 1996; 5(11): 1835-40. 75) Galkina E., Ley K. Leukocyte influx in atherosclerosis. Curr Drug Targets 2007; 8 :1239–1248. 76) Galkina E. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol 2009; 27: 165–197. 77) Garlid K.D., Paucek P., Yarov-Yarovoy V., et al. Cardioprotective effect of diazoxide and its interaction with mitochondrial ATP-sensitive K+ channels. Possible mechanism of cardioprotection. Circ Res 1997; 81:1072–1082. 78) Geng Y.J., Libby P. Progression of atheroma: a struggle between death and procreation. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22: 1370-1380. 79) Gilkerson R.W. Mitochondrial DNA nucleoids determine mitochondrial genetics and dysfunction. Int. J. Biochem. Cell Biol 2009; 41: 1899–1906. 80) Gilkerson R.W., Schon E.A. Nucleoid autonomy: An underlying mechanism of mitochondrial genetics with therapeutic potential. Commun. Integr. Biol 2008; 1: 34–36. 81) Giulivi C. Mitochondria as generators and targets of nitric oxide. Novartis Fdn Symp 2007; 287: 92–100. 110 82) Gleyzer N., Vercauteren K., Scarpulla R.C. Control of mitochondrial transcription specificity factors (TFB1M and TFB2M) by nuclear respiratory factors (NRF-1 and NRF-2) and PGC-1 family coactivators. Mol Cell Biol 2005; 25: 1354-66. 83) Gorenne I., Kavurma M., Scott S., еt al. Vascular smooth muscle cell senescence in atherosclerosis. Cardiovasc Res 2006; 72(1):9-17. 84) Grasso M., Diegoli M., Brega A., et al. The mitochondrial DNA mutation T12297C affects a highly conserved nucleotide of tRNA(Leu(CUN)) and is associated with dilated сardiomyopathy. Eur J Hum Genet 2001; 9(4): 311-315. 85) Griffiths E.J., Ocampo C.J., Savage J.S., et al. Protective effects of low and high doses of cyclosporin A against reoxygenation injury in isolated rat cardiomyocytes are associated with differential effects on mitochondrial calcium levels. Cell Calcium 2000; 27: 87–93. 86) Groschner L.N., Waldeck-Weiermair M., Malli R., et al. Graier WF. Endothelial mitochondria - less respiration, more integration. Pflugers Arch 2012; 464(1): 63-76. 87) Grover G.J., Atwal K.S. Pharmacologic profile of the selective mitochondrial-K(ATP) opener BMS-191095 for treatment of acute myocardial ischemia. Cardiovasc Drug Rev 2002; 20: 121–136. 88) Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'Infarto miocardico: Dietary supplementation with n-3 polyunsaturated fatty acids and vitamin E after myocardial infarction: results of the GISSI-Prevenzione trial. Lancet 1999; 354: 447455. 89) Gutierrez J., Ballinger S.W, Darley-Usmar V.M., еt al. Free radicals, mitochondria, and oxidized lipids: the emerging role in signal transduction in vascular cells. Circ Res 2002; 99(9): 924–932. 90) Hajnoczky G., Csordas G., Das S., еt al. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium 2006; 40(5–6): 553–560. 111 91) Harman D. Free radical theory of aging: consequences of mitochondrial aging. Age 1983; 6: 86 –94. 92) Harrison D., Griendling K.K., Landmesser U., et al. Role of oxidative stress in atherosclerosis. Am J Cardiol 2003; 91(3А): 7A–11A. 93) Hosokawa S., Hiasa Y., Takahashi T., et al. Effect of regular exercise on coronary endothelial function in patients with recent myocardial infarction. Circ J 2003; 67: 221 – 224. 94) Hsieh R.H., Hou J.H., Hsu H.S., et al. Age-dependent respiratory function decline and DNA deletions in human muscle mitochondria. Biochem Mol Biol Int 1994; 32(6): 1009-22. 95) http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 96) Huang C.H., Su S.L., Hsieh M.C., et al. Depleted leukocyte mitochondrial DNA copy number in metabolic syndrome. J Atheroscler Thromb 2011; 18(10): 867873. 97) Huang D., Yang C.Z., Yao L., еt al. Activation and overexpression of PARP-1 in circulating mononuclear cells promote TNF-alpha and IL-6 expression in patients with unstable angina. Arch Med Res 2008; 39(8): 775-784. 98) Irani K. Oxidant signaling in vascular cell growth, death, and survival: a review of the roles of reactive oxygen species in smooth muscle and endothelial cell mitogenic and apoptotic signaling. Circ Res 2000; 87: 179-183. 99) Ito H., Torii M., Suzuki T. Decreased superoxide dismutase activity and increased superoxide anion production in cardiac hypertrophy of spontaneously hypertensive rats. Clin Exp Hypertens 1995; 17: 803-816. 100) Jaksch M., Horvath R., Horn N. et al. Homozygosity (E140K) in SCO2 causes delayed infantile onset of cardiomyopathy and neuropathy. Neurology 2001; 57(8): 1440-6. 112 101) Jaksch M., Ogilvie I., Yao J., et al. Mutations in SCO2 are associated with a distinct form of hypertrophic cardiomyopathy and cytochrome c oxidase deficiency. Hum Mol Genet 2000; 9(5): 795-801. 102) Jeppesen T.D., Schwartz M., Hansen K., et al. Late onset of stroke-like episode associated with a 3256C-->T point mutation of mitochondrial DNA. J Neurol Sci 2003; 214(1-2): 17-20. 103) Kagan V.E., Serbinova E.A., Stoyanovsky D.A., et al. Assay of ubiquinones and ubiquinols as antioxidants. Methods Enzymol 1994; 234: 343-354. 104) Kanani P.M., Sinkey C.A., Browning R.L., et al. Role of oxidant stress in endothelial dysfunction produced by experimental hyperhomocyst(e)inemia in humans. Circulation 1999; 100: 1161-1168. 105) Kelley D.E., He J, Menshikova E.V., et al. Dysfunction of mitochondria in human skeletal muscle in type 2 diabetes. Diabetes 2002; 51: 2944 – 2950. 106) Kitakaze M., Asakura M., Kim J., et al. Human atrial natriuretic peptide and nicorandil as adjuncts to reperfusion treatment for acute myocardial infarction (JWIND): two randomised trials. Lancet 2007; 370: 1483–1493. 107) Kmiec B., Woloszynska M., Janska H. Heteroplasmy as a common state of mitochondrial genetic information in plants and animals. Curr. Genet 2006; 50: 149– 159. 108) Knight-Lozano C.A., Young C.G., Burow DL., et al. Cigarette smoke exposure and hypercholesterolemia increase mitochondrial damage in cardiovascular tissues. Circulation 2002; 105: 849 – 854. 109) Kogelnik A.M., Lott M.T., Brown M.D., et al. MITOMAP: a human mitochondrial genome database – 1998 update. Nucl Acids Res 1998; 26: 112–115 110) Kokaze A., Ishikawa M., Matsunaga N., et al. Association of the mitochondrial DNA 5178 A/C polymorphism with serum lipid levels in the Japanese population. Hum Genet 2001; 109(5): 521-5. 113 111) Kong Q.P., Bandelt H.J., Sun C., et al. Updating the East Asian mtDNA phylogeny: a prerequisite for the identification of pathogenic mutations. Hum Mol Genet 2006; 15(13): 2076-86. 112) Lass A., Sohal R.S. Electron transport-linked ubiquinonedependent recycling of alpha-tocopherol inhibits autooxidation of mitochondrial membranes. Arch Biochem Biophys 1998; 352: 229-236. 113) Lenaz G., Genova M.L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid. Redox Signal 2010; 12: 961–1008. 114) Lenka N.C., Mullick J., Avadhani N.G. Structural organization and transcription regulation of nuclear genes encoding the mammalian cytochrome c oxidase complex. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 1998; 61: 309-44. 115) Levinger L., Morl M., Florentz C. Mitochondrial tRNA 39 end metabolism and human disease. Nucl Acids Res 2004; 32: 5430–5441. 116) Lightowlers R.N., Chinnery P.F., Turnbull D.M., еt al. Mammalian mitochondrial genetics: heredity, heteroplasmy and disease. Trends Genet 1997; 13: 450–455. 117) Lim S., Despres J.P., Koh K.K. Prevention of atherosclerosis in overweight/obese patients: in need of novel multi-targeted approaches. Circ J 2011; 75: 1019 – 1027. 118) Lin A., Krockmalnic G., Penman S. Imaging cytoskeleton–mitochondrial membrane attachments by embedment-free electron microscopy of saponin-extracted cells. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87(21): 8565–8569. 119) Lin J., Puigserver P., Donovan J., еt al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1beta (PGC-1beta), a novel PGC-1-related transcription coactivator associated with host cell factor. J Biol Chem 2002; 277: 1645-1648. 120) Loscalzo J. Lipoprotein(a). A unique risk factor for atherothrombotic disease. Arteriosclerosis 1990; 10(5): 672-9. 114 121) Lu J., Qian Y., Li Z., et al. Mitochondrial haplotypes may modulate the phenotypic manifestation of the deafness-associated 12S rRNA 1555A>G mutation. Mitochondrion 2010; 10(1): 69-81. 122) Luk T.H., Dai Y.L., Siu C.W., еt al. Association of lower habitual physical activity level with mitochondrial and endothelial dysfunction in patients with stable coronary artery disease. Сirc J 2012; 76(11): 2572-2578. 123) Luk T.H., Dai YL, Siu CW., et al. Habitual physical activity is associated with endothelial function and endothelial progenitor cells in patients with stable coronary artery disease. Eur J Cardiovasc Prev Rehabil 2009; 16: 464 – 471. 124) Madamanchi N.R., Runge M.S. Mitochondrial dysfunction in atherosclerosis. Circ Res 2007; 100: 460 – 473. 125) Mälarstig A., Hamsten A. Genetics of atherothrombosis and thrombophilia. Curr Atheroscler Rep 2010; 12: 159-66. 126) Mallat Z., Tedgui A. Apoptosis in the vasculature: mechanisms and functional importance. Br J Pharmacol 2000; 130(5): 947–962. 127) Mannella C.A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochimica et Biophysica 2006; 1763 (5–6): 542–548. 128) Marcovina S.M., Koschinsky M.L., Albers J.J., et al. Report of the National Heart, Lung, and Blood Institute Workshop on Lipoprotein(a) and Cardiovascular Disease: recent advances and future directions. Clin Chem 2003; 49(11): 1785-96. 129) Marín-García J., Goldenthal M.J. The mitochondrial organelle and the heart. Rev Esp Cardiol 2002; 55(12): 1293-310. 130) Marín-García J., Goldenthal M.J. Understanding the impact of mitochondrial defects in cardiovascular disease: a review. Card Fail 2002; 8(5): 347-61. 131) Martinet W., Knaapen M.W., De Meyer G.R., et al. Elevated levels of oxidative DNA damage and DNA repair enzymes in human atherosclerotic plaques. Circulation 2002; 106(8): 927-32. 115 132) Matthews R.T., Yang L., Browne S., et al. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 5: 8892-8897. 133) McIntyre M., Bohr D.F., Dominiczak A.F. Endothelial function in hypertension: the role of superoxide anion. Hypertension 1999; 34: 539-5345. 134) Merante F., Tein I., Benson L., et al. Maternally inherited hypertrophic cardiomyopathy due to a novel T-to-C transition at nucleotide 9997 in the mitochondrial tRNA-glycine gene.Am.J.Hum. Genet 1994; 55: 437-446. 135) Mewton N., Croisille P., Gahide G., et al. Effect of cyclosporine on left ventricular remodeling after reperfused myocardial infarction. J Am CollCardiol 2010; 55: 1200–1205. 136) Mikaelian N.P., Khalilov E.M., Ivanov A.S., et al. Mitochondrial enzymes in circulating lymphocytes during hemosorption for experimental hypercholesterolemia. Biull Eksp Biol Med 1983; 96: 35-37. 137) Mimaki M., Ikota A., Sato A. et al. A double mutation (G11778A and G12192A) in mitochondrial DNA associated with Leber's hereditary optic neuropathy and cardiomyopathy. J Hum Genet 2003; 48(1): 47-50. 138) Miró O., Alonso J.R., Jarreta D., et al. Smoking disturbs mitochondrial respiratory chain function and enhances lipid peroxidation on human circulating lymphocytes. Carcinogenesis 1999; 20:1331-1336. 139) Moraes C.T., Ciacci F., Bonilla E., et al. Two novel pathogenic mitochondrial DNA mutations affecting organelle number and protein synthesis. Is the tRNALeu(UUR) gene an etiologic hot spot? Journal of Clinical Investigation1993; 92: 2906-2915. 140) Mueller E.E., Eder W., Ebner S., et al. The Mitochondrial T16189C Polymorphism Is Associated with Coronary Artery Disease in Middle European Populations. PLoS ONE 2011; 6(1): e16455. 116 141) Murata M., Akao M., O’Rourke B., et al. Mitochondrial ATP-sensitive potassium channels attenuate matrix Ca2+ overload during simulated ischemia and reperfusion: possible mechanism of cardioprotection. Circ Res 2001; 89: 891–898. 142) Nadtochiy S.M., Baker P.R., Freeman B.A., et al. Mitochondrial nitroalkene formation and mild uncoupling in ischaemic preconditioning: implications for cardioprotection. Cardiovasc Res 2009; 82: 333–340. 143) Nadtochiy S.M, Burwell L.S., Brookes P.S. Cardioprotection and mitochondrial S-nitrosation: effects of S-nitroso-2-mercaptopropionyl glycine (SNOMPG) in cardiac ischemia-reperfusion injury. J Mol CellCardiol 2007; 42: 812–825. 144) Nadtochiy S.M., Burwell L.S., Ingraham C.A., et al. In vivo cardioprotection by S-nitroso-2-mercaptopropionyl glycine. J Mol Cell Cardiol 2009; 46: 960–968. 145) Nomiyama T., Tanaka Y., Piao L., et al. Accumulation of somatic mutation in mitochondrial DNA and atherosclerosis in diabetic patients. Ann N Y Acad Sci 2004; 1011: 193-204. 146) O’Rourke B. Mitochondrial ion channels. Annu Rev Physiol 2007; 69: 19– 49. 147) Pamukcu B., Lip G.Y., Shantsila E. The nuclear factor–kappa B pathway in atherosclerosis: a potential therapeutic target for atherothrombotic vascular disease. Thromb Res 2011; 128(2): 117–123. 148) Paravicini T.M., Touyz R.M. Redox signaling in hypertension. Cardiovasc Res 2006; 71: 247-258. 149) Piot C., Croisille P., Staat P., et al. Effect of cyclosporine on reperfusion injury in acute myocardial infarction. N Engl J Med 2008; 359: 473–481. 150) Pohjoismäki J.O., Goffart S., Taylor R.W., et al. Developmental and Pathological Changes in the Human Cardiac Muscle Mitochondrial DNA Organization, Replication and Copy Number. PLoS ONE 2010; 5(5): e10426. 117 151) Postnov Iu.V. The role of mitochondrial calcium overload and energy deficiency in pathogenesis of arterial hypertension. Arkh Patol 2001; 63: 3-10. 152) Poteser M., Graziani A., Rosker C., еt al. TRPC3 and TRPC4 associate to form a redox-sensitive cation channel. Evidence for expression of native TRPC3– TRPC4 heteromeric channels in endothelial cells. J Biol Chem; 2006: 281(19): 13588– 13595. 153) Poulton J., Luan J., Macaulay V., et al. Type 2 diabetes is associated with a common mitochondrial variant: evidence from a population-based case-control study. Hum Mol Genet 2002; 11: 1581–1583. 154) Puddu P., Puddu G.M., Galletti L., et al. Mitochondrial dysfunction as an initiating event in atherogenesis: а plausible hypothesis. Cardiology 2005; 103: 137 – 141. 155) Puddu P., Puddu G.M., Cravero Е., еt al. The emerging role of cardiovascular risk factor-induced mitochondrial dysfunction in atherogenesis. J Biomed Sci 2009; 16(1): 112-118. 156) Raha S., Merante F., Shoubridge E., et al. Repopulation of rho0 cells with mitochondria from a patient with a mitochondrial DNA point mutation in tRNA(Gly) results in respiratory chain dysfunction. Hum Mutat 1999; 13(3): 245-54. 157) Raha S., Robinson B.H. Mitochondria, oxygen free radicals, and apoptosis. Am J Med Genet 2001; 106: 62-70. 158) Rapola J.M., Virtamo J., Ripatti S., et al. Randomised trial of alphatocopherol and betacarotene supplements on incidence of major coronary events in men with previous myocardial infarction. Lancet 1997; 349: 1715-1720. 159) Redón J., Oliva M.R., Tormos C., et al. Antioxidant activities and oxidative stress byproducts in human hypertension. Hypertension 2003; 41: 1096-1101. 160) Ronaghi M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Reseach 2001; 11: 3-11. 118 161) Rorbach J., Yusoff A.A., Tuppen H., et al. Overexpression of human mitochondrial valyl tRNA synthetase can partially restore levels of cognate mttRNAVal carrying the pathogenic C25U mutation. Nucleic Acids Res 2008; 36(9): 3065-74. 162) Rossmanith W., Karwan R.M. Impairment of tRNA processing by point mutations in mitochondrial tRNA(Leu)(UUR) associated with mitochondrial diseases. FEBS Letters 1998; 433: 269-274. 163) Rudolph V., Rudolph T.K., Schopfer FJ., et al. Endogenous generation and protective effects of nitro-fatty acids in a murine model of focal cardiac ischaemia and reperfusion. Cardiovasc Res 2010; 85:155–166. 164) Santorelli F.M., Mak S.C., El-Schahawi M., et al. Maternally inherited cardiomyopathy and hearing loss associated with a novel mutation in the mitochondrial tRNA(Lys) gene (G8363A). Am J Hum Genet 1996; 58(5): 933-9. 165) Sarre A., Lange N., Kucera P., еt al. mitoKATP channel activation in the postanoxic developing heart protects E-C coupling via NO-, ROS-, and PKC-dependent pathways. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005; 288: 1611-1619. 166) Sato T., Li Y., Saito T., Nakaya H. Minoxidil opens mitochondrial K(ATP) channels and confers cardioprotection. Br J Pharmacol 2004; 141: 360–366. 167) Sato T., Machida T., Takahashi S., et al. Fas-mediated apoptosome formation is dependent on reactive oxygen species derived from mitochondrial permeability transition in Jurkat cells. J Immunol 2004; 173: 285-296. 168) Sazonova M., Budnikov E., Khasanova Z., еt al. Studies of human aortic intima by a direct quantitative assay of mutant alleles in the mitochondrial genome. Atherosclerosis 2009; 204(1): 184-90. 169) Seccia T.M., Atlante A., Vulpis V., et al. Abnormal transport of inorganic phosphate in left ventricular mitochondria from spontaneously hypertensive rats. Cardiologia 1999; 44: 719-725. 119 170) Shanske S., Coku J., Lu J., et al. The G13513A mutation in the ND5 gene of mitochondrial DNA as a common cause of MELAS or Leigh syndrome: evidence from 12 cases. Arch Neurol 2008; 65: 368–372. 171) Shibata Y., Hayasaka S., Yamada T., et al. Physical activity and risk of fatal or non-fatal cardiovascular disease among CVD survivors: the JMS cohort study. Circ J 2011; 75: 1368 – 1372. 172) Shigenaga M.K., Hagen T.M., Ames B.N. Oxidative damage and mitochondrial decay in aging. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 10771–10778. 173) Shin W.S., Tanaka M., Suzuki J., et al. A novel homoplasmic mutation in mtDNA with a single evolutionary origin as a risk factor for cardiomyopathy. Am J Hum Genet 2000; 67(6): 1617-1620. 174) Shiva S., Sack M.N., Greer J.J., et al. Nitrite augments tolerance to ischemia/reperfusioninjury via the modulation of mitochondrial electron transfer. JExp Med 2007; 204: 2089–2102. 175) Shuster R.C., Rubenstein A.J., Wallace D.C. Mitochondrial DNA in anucleate human blood cells. Biochem Biophys Res Commun 1988; 155; 3; 1360-1365. 176) Silvestri G., Santorelli F.M., Shanske S. A new mtDNA mutation in the tRNA leu(UUR) gene is associated with maternally inherited cardiomyopathy. Hum.Mut 1994; 3; 37-43. 177) Sivapalaratnam S., Motazacker M., Maiwald S., et al. Genomewide association studies in atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep 2011; 13: 225-32. 178) Smirnova E., Griparic L., Shurland D.L., еt al. Dynamin-related protein Drp1 is required for mitochondrial division in mammalian cells. Mol Biol Cell 2001; 12: 2245-2256. 179) Sobenin I.A., Chistiakov D.A., Bobryshev Y.V., et al. Mitochondrial mutations in atherosclerosis: new solutions in research and possible clinical applications. Curr Pharm Des 2013; 19(33): 5942-53. 120 180) Sobenin I.A., Sazonova M.A., Ivanova M.M., et al. Mutation C3256T of mitochondrial genome in white blood cells: novel genetic marker of atherosclerosis and coronary heart disease. PLoS One 2012; 7(10): e46573. 181) Sobenin I.A., Chistiakov D.A., Bobryshev Y.V., et al. Mitochondrial mutations in atherosclerosis: new solutions in research and possible clinical applications. Curr Pharm Des 2013; 19(33): 5942-53. 182) Song Z., Chen H., Fiket M., еt al. OPA1 processing controls mitochondrial fusion and is regulated by mRNA splicing, membrane potential, and Yme1L. J CellBiol 2007; 178: 749-755. 183) Spitaler M.M., Graier W.F. Vascular targets of redox signaling in diabetes mellitus. Diabetologia 2002; 45(4): 476–494. 184) Stone G.W., Maehara A., Lansky A.J., et al. PROSPECT Investigators. A prospective natural-history study of coronary atherosclerosis. N Engl J Med 2011; 364(3): 226-35. 185) Sudo A., Honzawa S., Nonaka I., et al. Leigh syndrome caused by mitochondrial DNA G13513A mutation: frequency and clinical features in Japan. J Hum Genet 2004; 49: 92–96. 186) Szabó C. Poly(ADP-ribose) polymerase activation by reactive nitrogen species-relevance for the pathogenesis of inflammation. Nitric Oxide 2006; 14: 169179. 187) Taylor R.W., Giordano C., Davidson M.M., et al. A homoplasmic mitochondrial transfer ribonucleic acid mutation as a cause of maternally inherited hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol 2003; 21; 41(10): 1786-96. 188) Taylor S.W., Fahy E., Zhang B., et al. Characterization of the human heart mitochondrial proteome. Nat Biotechnol 2003; 21 (3): 281–6. 189) Tomari Y., Hino N., et al. Decreased CCA-addition in human mitochondrial tRNAs bearing a pathogenic A4317G or A10044G mutation. J Biol Chem 2003; 278(19): 16828-16833. 121 190) Touboul P.J., Hennerici M.G., Meairs S., et al. Mannheim carotid intimamedia thickness Consensus (2004-2006). Cerebrovasc Dis. 2007: 23: 346-349. 191) Tsutsui H., Kinugawa S., Matsushima S. Oxidative stress and mitochondrial DNA damage in heart failure. Circ J 2008; 72: 31–37. 192) Turner L.F., Kaddoura S., Harrington D. et al. Mitochondrial DNA in idiopathic cardiomyopathy. European Heart Journal 1998; 19: 1725–1729. 193) Twig G., Elorza A., Molina A.J., еt al. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. EMBO J 2008; 27: 433-446. 194) Tyagi N., Ovechkin A.V., Lominadze D., et al. Mitochondrial mechanism of microvascular endothelial cells apoptosis in hyperhomocysteinemia. J Cell Biochem 2006; 98: 1150-1162. 195) van Blerkom J. Mitochondria as regulatory forces in oocytes, preimplantation embryos and stem cells. Reprod. Biomed 2008; 16: 553–569. 196) van Jaarsveld H., Kuyl J.M., Alberts D.W. Exposure of rats to low concentration of cigarette smoke increases myocardial sensitivity to ischaemia/reperfusion. Basic Res Cardiol 1992; 87: 393-399. 197) Vaux D.L. Apoptogenic factors released from mitochondria. Biochim Biophys Acta 2011; 1813(4): 546–550. 198) Veltri K.L., Espiritu M., Singh G. Distinct genomic copy number in mitochondria of different mammalian organs. J Cell Physiol 1990; 143: 160-4. 199) Victor VM, Rocha M, De la Fuente M. N-acetylcysteine protects mice from lethal endotoxemia by regulating the redox state of immune cells. Free Radic Res 2003; 37: 919-929. 200) Victor V.M., Rocha M., Esplugues J.V., et al. Role of free radicals in sepsis: antioxidant therapy. Curr Pharm Des 2005; 11: 3141-3158. 201) Vindis C., Elbaz M., Escargueil-Blanc I., еt al. Two distinct calciumdependent mitochondrial pathways are involved in oxidized LDL-induced apoptosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol; 2005: 25(3): 639–645. 122 202) Virág L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol 2005; 3: 209-214. 203) von Lukowicz T., Hassa P.O., Lohmann C., еt al. PARP1 is required for adhesion molecule expression in atherogenesis. Cardiovasc Res 2008; 1; 78(1): 158166. 204) Waldmeier P.C. Prospects for antiapoptotic drug therapy of neurodegenerative diseases. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2003; 27(2): 303-21. 205) Wallace D.C. Mitochondrial genetics: a paradigm for aging and degenerative diseases? Science 1992; 256: 628-632. 206) Wallace D.C., Ye J.H., Neckelmann S.N., еt al. Sequence analysis of cDNAs for the human and bovine ATP synthasebeta subunit: mitochondrial DNA genes sustain seventeen times more mutations. Curr. Genet 1987; 12: 81–90. 207) Wallace D.C., Brown M.D., Lott M.T. Mitochondrial DNA variation in human evolution and disease. Gene 1999; 238(1): 211-30. 208) Wang X., Wei M., Kuukasjrvi P., et al. Novel pharmacological preconditioning with diazoxide attenuates myocardial stunning in coronary artery bypass grafting. Eur J Cardiothorac Surg 2003; 24: 967–973. 209) Ward N.C., Croft K.D. Hypertension and oxidative stress. Clin Exp Pharmacol Physiol 2006; 33: 872-876. 210) Wasson J., Scolnick G., Love-Gregory L. Assesing allele frequencies of single nucleotide polymorphisms in DNA pools by pyrosequencing technology. BioTechniques 2002; 32 :1144-1152. 211) Watson B.Jr., Khan M.A., Desmond R.A., et al. Mitochondrial DNA mutations in black Americans with hypertension-associated end-stage renal disease. Am J Kidney Dis 2001; 38: 529-536. 212) Weakley S.M., Jiang J., Kougias P., et al. Role of somatic mutations in vascular disease formation. Expert Rev Mol Diagn 2010; 10(2): 173-85. 123 213) Wei M.C., Zong W.X., Cheng E.H., et al Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science 2001; 292: 727-730. 214) Wilson F.H., Hariri A., Farhi A., et al. A cluster of metabolic defects caused by mutation in a mitochondrial tRNA. Science 2004; 306: 1190-1194. 215) Wonnapinij P., Chinnery P.F., Samuels D.C. The distribution of mitochondrial DNA heteroplasmy dueto random genetic drift. Am. J. Hum. Genet 2008; 83:5 82–593. 216) Yaffe M.P. The machinery of mitochondrial inheritance and behavior. Science 1999; 283: 1493-1497. 217) Yang Z., Knight C.A., Mamerow M.M., et al. Prenatal environmental tobacco smoke exposure promotes adult atherogenesis and mitochondrial damage in apolipoprotein E-/- mice fed a chow diet. Circulation 2004; 110: 3715-20. 218) Yao P.M., Tabas I., Wei M.C., еt al. Free cholesterol loading of macrophages is associated with widespread mitochondrial dysfunction and activation of the mitochondrial apoptosis pathway. J Biol Chem 2001; 276(45): 42468-76. 219) Yu E., Calvert P.A., Mercer J.R., et al. Mitochondrial DNA damage can promote atherosclerosis independently of reactive oxygen species through effects on smooth muscle cells and monocytes and correlates with higher-risk plaques in humans. Circulation 2013; 128(7):702-12. 220) Yusuf S., Dagenais G., Pogue J., et al. Vitamin E supplementation and cardiovascular events in high-risk patients. The Heart Outcomes Prevention Evaluation Study Investigators. N Engl J Med 2000; 342: 154-160. 124
