Министерство образования и науки Республики Казахстан Казахский национальный университет имени аль-Фараби

Министерство образования и науки Республики Казахстан
Казахский национальный университет имени аль-Фараби
ПРОЕКТ
на
тему
«ВЛИЯНИЕ
МИКРООРГАНИЗМОВ»
РАЗНЫХ
РЕЖИМОВ
СТЕРИЛИЗАЦИИ
НА
ГИБЕЛЬ
Проверила: Мукашева Тогжан Джангельдиевна
Выполнили: Байдильдинова Гаухар
Молдагалиева Айгерим ПБТ105Р
Алматы 2012 год
Цель работы: изучение эффективности режимов стерилизации физическими
и химическими методами
1. Теоретическая часть. Определение терминов ««асептические условия»,
«стерилизация», «пастеризация».
2. Описание алгоритмов постановки опыта.
3. Характеристика объектов исследования.
4. Полученные результаты
5. Вывод
6. Используемая литература
1. Теоретическая часть.
Под асептическими условиями понимают мероприятия, режимы препятствующие
попаданию контаминантов. Термином «контаминанты» обозначают постороннюю
микрофлору, микроорганизмы-загрязнители.
Под поддержанием и созданием асептических условий в технологии следует
понимать:
- обеспечение условий получения чистых культур в лаборатории и
специализированных отделениях в растильных аппаратах, камерах;
- стерилизация, герметизация оборудования и коммуникаций;
- специальные приемы при введении добавок, посев, отбор проб;
- стерилизация пеногасителей, питательных сред, воздуха.
Под стерилизацией понимают полное освобождение любого материального потока.
а также оборудования и коммуникации от жизнеспособных микроорганизмов, их
спор. Процессы, использование на практике которых, способствует достижению и
поддержанию асептических условий, условно можно разделить на две группы:
процессы, уничтожающие постороннюю микрофлору; процессы, удаляющие
микроорганизмы из материального потока. При выборе метода стерилизации
следует учитывать чувствительность микроорганизмов к применяемым факторам, а
также их численность, видовую принадлежность, содержание в них влаги,
физиологическую форму (вегетативная, споры), возраст клеток спор, значение рН,
химический состав, физические свойства среды и ее объем.
Гибель микроорганизмов при стерилизации обусловлена повреждением
биологически важных макромолекул клетки и, как следствие, нарушение
определенных физиологических функций. Так, отмирание клеток при
термообработке во влажной среде наступает из-за денатурации белков, и
освобождения нуклеиновых кислот, инактивации ферментов, повреждения
цитоплазматической мембраны. При воздействии на клетки сухого жара гибель
происходит в результате активных окислительных процессов и нарушения
клеточных структур. В пищевых производствах на губительном действии высоких
температур основаны многие приемы по уничтожению микроорганизмов в пищевых
продуктах и других объектах, путем кипячения, варки, обжарки, пропаривания,
бланширования, пастеризации, стерилизации.
Пастеризация — это нагревание материала при температуре ниже 100 °С в течение
20 — 40 мин. При пастеризации погибают не все микроорганизмы, так некоторые
термоустойчивые бактерии, а также споры остаются живыми. Поэтому
пастеризованные продукты следует немедленно охлаждать до 4 - 8 оС и хранить в
холоде, чтобы задержать прорастание спор и развитие сохранившихся клеток.
Пастеризации подвергают молоко, пиво, вино, икру, фруктовые соки.
Стерилизация — это термическая обработка при температурах выше 100 °С, в
результате которой гибнут и вегетативные клетки, и их споры. Стерилизуют
баночные консервы, многие предметы и материалы в медицинской практике,
питательные среды и оборудование в биотехнологическом производстве.
Асептические условия
Процессы, удаляющие
микроорганизмы из
материального потока
Процессы, уничтожающие
постороннюю микрофлору
Химические вещества
(кислоты, щелочи,
хлорсодержащие
вещества)
Физические
факторы
Фильтрование
Герметизация
Тепло-стерилизация,
пастеризация, фламбирование, кипячение
Рис1. Процессы асептических условий
2. Описание алгоритмов постановки опыта.
Термообработка – пастеризация, 15 мин; кипячение 15 мин; автоклавирование
при 1,5 атм (127) 15 мин.
Для изучения влияния величины температуры на гибель микроорганизмов три
пробирки с 10 мл исходной суспензии ставят в разные условия термообработки на
15 мин.
После стерилизации с соблюдением условий асептики стерильной пипеткой на 1 мл
по одной капле обработанной суспензии вносят на поверхность агаризованной
среды СА и МПА в чашки Петри и шпателем распределяют по поверхности. Чашки
подписывают, переворачиваю и помещают в термостат на 1—2 суток при 37 °С.
Следует определить количество клеток в исходной суспензии. Для этого из
пробирки с исходной взвесью берется 1 мл и вносится в пробирку с 9 мл стерильной
воды, затем 1 мл разведенной взвеси разбавляется в 100 и 1000 раз. Из этих
пробирок по 1 капле вносят взвесь на чашки Петри с СА и МПА, растирают
шпателем, подписывают и отправляют в термостат.
Для изучения кинетики гибели клеток одну пробирку с исходной суспензией,
помещают в разные условия стерилизации и через каждые 15 мин в получаса
отбирают стерильной пипеткой (всякий раз новой) по 0,1 мл суспензии и вносят на
агаризованные пластинки с питательной средой в чашки Петри. Растирают каплю
шпателем по поверхности среды. Чашки подписывают, переворачивают и
помещают в термостат.
Облучение УФ – лучами 15 мин и 30 мин.
Для изучения влияния дозы облучения из пробирок с исходными суспензиями
микроорганизмами, стерильной пипеткой на поверхности четырех чашек с МПА и
четырех чашек с СА вносят с соблюдением правил асептики по 0,1 мл суспензии.
Распределяют шпателем их по поверхности. Устанавливают восемь чашек под
бактерицидной лампой на расстояние 40 см. Через 15 мин вынимают первые две
чашки, последующие попарно с интервалом 15 мин. Подписывают, переворачивают
и устанавливают чашки Петри в термостат.
Воздействие уксусной кислоты 0,01 мл, 0,02 мл, 0,03 мл и, 0,04 мл.
Для
изучения влияния концентрации органических кислот на микроорганизмы
используют четыре пробирки с исходной суспензией, в каждую из которых вносят
ледяную уксусную кислоту по схеме (таблице. 1).
Для изучения влияния концентрации органических кислот на микроорганизмы
используют четыре пробирки с исходной суспензией, в каждую из которых вносят
ледяную уксусную кислоту по схеме (табл. 1).
Таблица 1. Схема внесения ледяной уксусной кислоты, мл
Номер пробирки
1
2
3
Объем суспензии, мл
10
10
10
10
Количество ледяной уксусной 0,01
0,02
0,03
0,04
кислоты, мл
Аккуратно взбалтывают содержимое пробирок и оставляют в покое на 15 мин.
Затем из каждой пробирки стерильными пипетками отбирают по 0,1 мл
обработанной суспензии и наносят на агаризованную среду СА и МПА.
Распределяют каплю по всей поверхности пластинки среды шпателем. Чашки
подписывают, переворачивают и помещают в термостат.
Воздействие поваренной соли 2,5 %, 5% и 10 %.
Для изучения влияния концентрации поваренной соли
на микроорганизмы
используют три пробирки с 10 мл раствором поваренной соли 2,5 %, 5% и 10 %.
В каждую пробирку вносят по 1 мл суспензии. Аккуратно взбалтывают содержимое
пробирок и оставляют в покое на 15 мин. Затем из каждой пробирки стерильными
пипетками отбирают по 0, 1 мл
обработанной суспензии и наносят на
агаризованную среду СА и МПА. Распределяют каплю по всей поверхности
пластинки среды шпателем. Чашки подписывают, переворачивают и помещают в
термостат.
3. Характеристика объектов исследования.
Escherichia coli (кишечные палочки) - грамотрицательные палочковидные бактерии,
принадлежат к семейству Enterobacteriaceae, род Escherichia (эшерихия), короткие
(длина 1-3 мкм, ширина – 0,5-0,8 мкм), полиморфные подвижные и неподвижные,
спор не образуют. Впервые были открыты немецким ученым Эшерихом (T.
Escherich) в 1885 году. E. coli были выделены из остатков жизнедеятельности
человека. E. coli является естественных обитателем толстого отдела кишечника
многих млекопитающих, в частности приматов и человека.
В организме человека E.coli подавляет рост патогенных бактерий и синтезирует
некоторые витамины.
Рис. 1 E. coli – электронный микроскоп
Бактерии хорошо растут на простых питательных средах: мясопептонном бульоне
(МПБ), мясопептонном агаре (МПА). На МПБ дают обильный рост при
значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета,
легкоразбивающийся. Образуют пристеночное кольцо, пленка на поверхности
бульона обычно отсутствует. На МПА колонии прозрачные с серовато-голубым
отливом, легко сливающиеся между собой.
Рис. 2 Колонии E. coli на плотной питательной среде
Устойчивость во внешней среде
Е. coli не устойчивы к высокой температуре. Бактерии группы кишечных палочек
обезвреживаются обычными методами пастеризации (65 - 75° С). При 60° С
кишечная палочка погибает через 15 минут. 1% раствор фенола вызывает гибель
микроба через 5-15 минут, сулема в разведении 1:1000 - через 2 мин., устойчивы к
действию многих анилиновых красителей.
Bacillus
subtilis —
грамположительная,
спорообразующая
аэробная
грамположительная почвенная бактерия. Первоначально были описаны в 1835
Эренбергом как Vibrio subtilis, в 1872 были переименованы Коном в Bacillus subtilis.
Название «сенная палочка» вид получил из-за того, что накопительные культуры
этого микроорганизма получают из сенного экстракта. Является продуцентом
некоторых полипептидных антибиотиков, а также ферментов (амилазы, протеазы),
получаемых промышленно.
Биологические свойства
Палочковидная бактерия, размер 3-5x0,6 мкм. Споры овальные, не превышающие
размер клетки, расположены центрально. Перитрихиальное расположение жгутиков,
подвижная. Колонии сухие, мелкоморщинистые, бархатистые, бесцветные или
розовые. Край колонии волнистый. Растёт на МПА, МПБ, а также на средах,
содержащих растительные остатки, простых синтетических питательных средах для
гетеротрофов. Хемоорганогетеротроф, аммонифицирует белки, расщепляет крахмал,
гликоген. По данным из Большой советской энциклопедии (2001 года) и данным из
зарубежных источников не патогенна.
Рис.3 Клетки Bacillus subtilis (споры окрашены в синий цвет)
Дрожжи — внетаксономическая группа одноклеточных грибов, утративших
мицелиальное строение в связи с переходом к обитанию в жидких и полужидких,
богатых органическими веществами субстратах. Объединяет около 1500 видов,
относящихся к аскомицетам и базидиомицетам. Размеры дрожжевых клеток обычно
составляют 3—7 мкм в диаметре.
Местообитания дрожжей связаны преимущественно с богатыми сахарами
субстратами: поверхностью плодов и листьев, где они питаются прижизненными
выделениями растений, нектаром цветов, раневыми соками растений, мёртвой
фитомассой и т. д., однако они распространены также в почве и природных водах.
Некоторые виды дрожжей с давних пор используются человеком при приготовлении
хлеба, пива, вина, кваса и др. Полезные физиологические свойства дрожжей
позволяют использовать их в биотехнологии. В настоящее время их применяют в
производстве ксилита, ферментов, пищевых добавок, для очистки от нефтяных
загрязнений.
Рис.4 Дрожжи под микроскопом.
Также дрожжи широко используются в науке в качестве модельных организмов для
генетических исследований и в молекулярной биологии. Пекарские дрожжи были
первыми из эукариот, у которых была полностью определена последовательность
геномной ДНК.
Микроскопические грибы – микромицеты – составная часть практически любой
экосистемы.
Грибки могут расти на самых разных поверхностях - животного или растительного
происхождения, на живом и мертвом материале. Ученые находили их даже на
ракетном топливе. Плесень - единственный из простейших организмов, способный
размножаться половым путем. Колония плесени делится на разнополых особей.
Рис.5 Микромицеты.
5. Вывод:
Температура.
Температура является одним из эффективных способов стерилизации.
Использование высокой температуры для стерилизации основано на необратимой
коагуляции протоплазмы, пирогенетическом ее разрушении и на повреждении
ферментных систем микробной клетки. Температура и длительность нагревания,
необходимые для достижения стерильности, могут изменяться в зависимости от
вида микрофлоры и других условий.
Большинство патогенных микроорганизмов погибает при температуре около 60, но
их споры выдерживают значительно более высокую температуру. Кипящая вода
убивает микроорганизмы значительно быстрее, но многие споры и в этих условиях
сохраняются в течение нескольких часов (особенно в вязких средах).
Пар под давлением (при температуре выше 100) убивает микроорганизмы быстрее.
Кипячение. Этим способом стерилизуют резиновые предметы, инструментарий,
стеклянную посуду. Применять кипячение для стерилизации инъекционных
растворов не рекомендуется, так как по эффективности оно значительно уступает
стерилизации паром.
Автоклавирование. Осуществляется в различной конструкции автоклавах. Автоклав
представляет собой герметические закрывающийся сосуд, состоящий из
толстостенной стерилизационной камеры и кожуха. На автоклаве имеются
предохранительный клапан, обеспечивающий выход пара при избыточном
давлении, и манометр.
Автоклавирование является наиболее надежным способом стерилизации. Обычно
стерилизация в автоклаве производится при 119-121° в течение 5-30 мин в
зависимости от объема раствора. Этим гарантируется достаточно полная
стерилизация независимо от вида микроорганизма. Таким образом, стерилизуют
посуду, бумажные и стеклянные фильтры, инструменты, водные растворы
устойчивых к воздействию высокой температуры лекарственных веществ,
перевязочный материал.
Преимущества термических методов стерилизации:
Надёжность
Отсутствие необходимости удаления стерилянтов с предметов медицинского
назначения
Удобство работы персонала
Стерилизация проводится в упаковках, что позволяет сохранить стерильность
некоторый период времени.
УФЛ.
Поглощение УФ лучей (длина волны 253,7 нм) сопровождается образованием
димеров тимина в молекуле ДНК, что подавляет репликацию ДНК, приводит к
прекращению деления клетки и нередко является причиной ее гибели. На
бактерицидном действии УФЛ основано использование их для обеззараживания
продуктов питания, лабораторных питательных сред, для стерилизации воздуха
приточно-вытяжной вентиляции, оборудования в биксах, также для стерилизации
дистиллированной воды.
Этот метод холодной стерилизации не изменяет качества продуктов, так как в
малых дозах не нарушает целостность макромолекул белков, витаминов, ферментов,
полисахаридов и т.д. УФ излучение применяют для обработки биологических
препаратов – вакцин и сывороток. Установлено, что излучение длиной волны 260300 нм вызывает инактивацию многих вирусов и фагов.
Источники УФ-излучения — ртутные кварцевые лампы. При недостаточно мощном
действии УФ в прокариотической клетке активизируются процессы световой и
темновой репарации и клетка может восстановиться.
NaCl
Величины осмотического давления зависят от содержания в воде, в среде
растворенных веществ и измеряются в единицах осмолярности. Осмолярность
внутри клетки должна быть выше, чем в окружающей среде, тогда вода будет
поступать внутрь клетки. Если в среде осмотическое давление очень высокое, то
нарушаются внутриклеточные регуляторные механизмы и может наступить
плазмолиз как результат выхода из клетки воды.
Одной только солью невозможно надёжно защитить пищевой продукт от всех
микробных поражений, даже превысив все мыслимые вкусовые ограничения.
Неспособность основной массы микроорганизмов расти на средах с высокими
концентрациями солей широко используют в пищевой промышленности при
консервировании продуктов.
Уксусная кислота.
Давно известно, что реакция среды, выражаемая концентрацией водородных ионов
(рН), является важным фактором, определяющим возможность существования
прокариот. Концентрация ионов водорода в окружающей среде действует на
организм прямо (непосредственное воздействие Н+) или косвенно (через влияние на
ионное состояние и доступность многих неорганических ионов и метаболитов,
стабильность макромолекул, равновесие электрических зарядов на поверхности
клетки). При низких значениях рН растворимость углекислоты, являющейся
основным или даже единственным источником углерода для автотрофных
прокариот, понижается, а растворимость некоторых ионов (Cu2+, Mo2+, Mg2+, Al3+)
возрастает и достигает уровней, токсичных для многих прокариот.
Отрицательное влияние кислотности среды на большинство микроорганизмов
используют при консервировании пищевых продуктов. Так, приготовление
маринадов идет с использованием уксусной кислоты, квашение плодов и овощей –
молочной.
6. Используемая литература:
М. Х. Шигаева, В. Л. Цзю «Общая микробиология», Алматы «Қазақ университеті»
2008 год.
http://www.textra-vita.com/technology/konserv6.php
http://avinpharma.ru/aptechnoe-izgotovlenie/fizicheskie-metody-sterilizacii.html
http://pulmonolog.com/content/escherichia-coli
http://micromir.59311s007.edusite.ru/p8aa1.html
http://ru.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae
4. Полученные результаты.
объекты
температура
УФЛ
авто
15
контроль пастеризация кипячение клавирование контроль мин
грамотрицательные
бактерии
грамположительные
бактерии
эукариотные
микроорганизмы
30
мин
Escherichia coli
752
12
2
0
752
2
0
Bacillus subtilis
912
372
16
0
2248
1121
0
дрожжи
микромицеты
332
57
86
10
11
2
0
0
590
22
202
15
0
0
УК
10% контроль
0,01
объекты
NaCl
контроль
2,50%
5%
Escherichia coli
752
9
3
0
752
9
3
1
0
Bacillus subtilis
912
441
0
0
2024
704
762
0
6
дрожжи
797
528
225
0
1194
186
микромицеты
9
3
0
0
22
7
объекты
температура
УФЛ
пастеризация кипячение автоклавирование 15 мин 30 мин
грамотрицательные Escherichia
бактерии
coli
98,4
99,7
100
99,7
100
грамположительные Bacillus
бактерии
subtilis
59,2
99,3
100
50,1
100
эукариотные
микроорганизмы
дрожжи
74,1
96,7
100
65,8
100
микромицеты
82,5
96,5
100
31,8
100
объекты
NaCl
УК
2,5%
5%
10%
0,01
0,02
0,03
0,04
грамотрицательные Escherichia
бактерии
coli
98,8
99,6
100
98,8
99,6
99,9
100
грамположительные Bacillus
бактерии
subtilis
51,6
100
100
65,2
62,3
0
99,7
эукариотные
дрожжи
33,8
71,7
100
84,4
50
100
100
93
3
0
0
0
0
грамотрицательные
бактерии
грамположительные
бактерии
эукариотные
микроорганизмы
0,02 0,03 0,04
микроорганизмы
микромицеты
66,7
100
100
Диаграмма 1. Сравнение эффективности различных методов стерилизации.
68,2
86,4
100
100