- Кафедра физико-химической экспертизы

Федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего образования
«Тверской государственный университет»
Кафедра физико-химической экспертизы
биоорганических соединений
ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
по дисциплине «БИОХИМИЯ»
Для студентов II курса направления 260100.62
«Продукты питания из растительного сырья»
(часть I)
ТВЕРЬ 2015
1
Составители: доктор химических наук, профессор Г.П.Лапина (часть I),
асс. кафедры П.С. Лихуша
Технический редактор А.В. Жильцов
Подписано в печать 18.02.2015. Формат 60x84 1/16.
Усл. печ. л. 2,5. Тираж 150. Заказ № 72.
Редакционно-издательское управление
Тверского государственного университета
Адрес: 170100, г. Тверь, Студенческий пер. 12, корпус Б.
Тел. РИУ (4822) 35-60-63.
2
Дисциплина
“Биохимия”
включена
в
математический
и
естественнонаучный цикл для студентов-технологов по рекомендации
Госкомитета РФ по высшему образованию для государственных университетов.
Курс “Биохимия” ставит своей задачей ознакомить студентов-технологов с
современными аспектами химии живой материи. Химическая направленность
преобладает не только в программе дисциплины, которая утверждена научнометодическим советом по специальности “Химия”, но и должна найти свое
отражение в лабораторном практикуме.
Целью настоящего учебного пособия является ознакомить студентовтехнологов с биологически-активными молекулами природного происхождения,
обучить их основным приемам и навыкам, необходимым в экспериментальной
работе с аминокислотами, белками, ферментами, нуклеиновыми кислотами,
липидами, витаминами, гормонами и минеральными компонентами.
Лабораторный практикум по дисциплине “Биохимия” рекомендуется в
качестве пособия для студентов II курса направления 260100.62 «Продукты
питания из растительного сырья», обучающихся в Тверском государственном
университете, и состоит из двух частей. Даны общие правила работы в
химической лаборатории, а также правила техники безопасности и оказания
первой помощи. В I части описаны лабораторные работы, посвященные
следующим разделам программы дисциплины “Биохимия”: “Аминокислоты и
белки”, “Нуклеиновые кислоты”, “Ферменты”. Во II части даны лабораторные
работы по темам “Липиды”, “Углеводы”, “Витамины, гормоны и минеральные
компоненты”. Каждая тема включает несколько лабораторных работ (4 – 5), что
расширяет возможности для студентов в приобретении различных практических
навыков при варьировании различных лабораторных работ в рамках одной темы.
К каждой лабораторной работе даются краткое теоретическое введение,
описание работы (включает описание материала исследования, реактивов и
оборудования и подробное описание методики выполнения работы), вопросы для
самоконтроля при самостоятельной подготовке некоторых разделов дисциплины,
перечень тем рефератов в рамках учебно-исследовательской работы студентов.
УИРС, список литературы, а также вопросы к коллоквиуму завершают II часть
лабораторного практикума.
3
1. Общие правила работы в химической лаборатории
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Необходимость усвоения правил работы в химической лаборатории,
правил техники безопасности, знание мер предупреждения и
предотвращения несчастных случаев является неотъемлемой частью
успешной работы в химической лаборатории любого профиля.
Во время работы в химической лаборатории соблюдайте тишину, порядок,
чистоту, рационально стройте свою работу, ведите ее точно, аккуратно,
быстро и без спешки.
Не приступайте к работе без разрешения преподавателя или лаборанта
В лаборатории запрещается работать одному
Экономьте газ, воду, электричество и реактивы
Во время работы надевайте халат; имейте в лаборатории мыло, полотенце.
Аккуратно и осторожно обращайтесь с химической посудой, реактивами и
приборами. Во избежание несчастных случаев из-за возможного выброса
реакционной смеси не заглядывайте в пробирку или колбу сверху.
Не работайте с грязной посудой, не оставляя ее немытой.
Не включайте ни один прибор без предварительной проверки. Не
оставляйте действующий прибор без присмотра.
Не выносите из лаборатории приборы, посуду и реактивы.
Работу с ядовитыми веществами проводите в вытяжном шкафу.
Соблюдайте меры предосторожности при работе с взрывоопасными и
легковоспламеняющимися веществами.
Не выливайте в раковины остатки кислот, щелочей, огнеопасных жидкостей
и т.д. Сливайте эти вещества в специальные склянки, помещенные в
вытяжном шкафу. Не бросайте в раковину бумагу, песок и другие твердые
вещества.
Растворы, содержащие концентрированные кислоты и щелочи, перед тем,
как выливать в канализационную систему, нейтрализуйте. Остро пахнущие
и ядовитые вещества должны быть обезврежены химической обработкой
или сожжены в специально отведенном месте вне пределов лаборатории,
желательно на воздухе.
Не оставляйте никаких веществ в посуде без этикеток.
Работайте с кислотами и со щелочами только на столах со специальным
покрытием.
4
16.
17.
18.
19.
При взвешивании сухих реактивов не высыпайте их прямо на чашку весов.
В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.
При возникновении пожара немедленно выключите газ во всей
лаборатории, уберите из помещения все горючие вещества, засыпьте песком
или закройте одеялом очаг пожара и сообщите дежурному пожарной
охраны о случившемся. Усвойте и соблюдайте правила противопожарной
безопасности.
Уходя из лаборатории, проверьте, выключены ли газ, вода и электричество.
2. Правила техники безопасности
при работе в химической лаборатории
и оказание первой помощи
Работа в химической лаборатории связана с некоторой опасностью,
поскольку многие вещества в той или иной степени ядовиты, огнеопасны и
взрывоопасны. Опыт показывает, что большинство несчастных случаев,
происходящих в лаборатории, является следствием небрежности и
невнимательности работающих.
Правила работы с огнеопасными веществами
1.
Опыты с легковоспламеняющимися веществами (эфир, петролейный эфир,
ацетон, бензол и т.д.) необходимо проводить дальше от огня и включенных
электроплиток. Нагревать легковоспламеняющиеся жидкости можно
только на предварительно нагретой водяной бане, в колбе, снабженной
водяным холодильником, вдали от нагревательных приборов.
2.
Легковоспламеняющиеся вещества можно отгонять в приборе с водяным
холодильником на водяной бане или роторных испарителях. Нельзя
упаривать горючие жидкости в открытых сосудах.
3.
Приборы, в которых содержатся легковоспламеняющиеся вещества,
следует разбирать после того, как будут выключены газовые горелки,
находящиеся поблизости.
5
4.
Не выливать воспламеняющиеся вещества в канализацию, ведра и ящики
для мусора во избежание пожара от случайно брошенной спички.
5.
Нельзя проводить перегонку досуха, так как многие вещества (диэтиловый
эфир, диоксан) образуют взрывоопасные перекиси при соприкосновении с
воздухом.
Первая помощь при ожогах и отравлениях
1.
При термических ожогах немедленно делают обильные примочки
спиртовым
раствором
танина,
этиловым
спиртом
или
раствором
перманганата калия.
2.
При ожогах кислотами необходимо сразу же промыть пораженное место
большим количеством воды, а затем 3%-ным раствором гидрокарбоната
натрия и опять водой.
3.
При ожогах едкими щелочами следует хорошо и обильно промыть
пораженное место проточной водой, затем разбавленным раствором
уксусной кислоты, а после этого опять большим количеством воды.
4.
При попадании кислоты или щелочи в глаза следует сразу же их промыть.
Для этого направляют небольшую струю воды то в один, то в другой глаз в
течение 3-5 мин. Затем глаза необходимо промыть или раствором
гидрокарбоната натрия (в случае кислоты), или раствором борной кислоты
(в случае щелочи). После этого нужно немедленно обратиться ко врачу.
5.
При ожогах фенолом пораженное место обрабатывают спиртом.
6.
При ожогах кожи бромом его быстро смывают спиртом или разбавленным
раствором щелочи. После этого пораженное место смазывают специальной
мазью для ожогов. При вдыхании паров брома нужно глубоко подышать
над спиртом, а затем выпить молока и выйти на свежий воздух.
Тушение местного пожара и горящей одежды
1. При
возникновении
пожара
немедленно
отключить
газ
и
электроприборы по всей лаборатории. Быстро убрать все горючие
6
вещества подальше от огня, а пламя быстро гасить огнетушителем,
песком или при помощи противопожарного одеяла. Не следует заливать
пламя водой, во многих случаях это приводит
лишь к большему
распространению пламени и расширению очага пожара.
2. Если на ком-либо загорелась одежда, нужно пострадавшего повалить на
пол и быстро покрыть войлочным одеялом.
Тема «АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ»
Аминокислоты – мономерные единицы молекул белков. Найденные в белках
аминокислоты принято делить на две категории: постоянно встречающиеся и
иногда встречающиеся. Первых насчитывается в белках около 20
(протеиногенные (-аминокислоты). Карбоксильная и аминная группы связаны в
них с (-углеродным атомом. 06щая формула (-аминокислот: R-CHNH2-COOH.
Взаимодействие карбоксильной и аминной групп приводит к образованию
биполярного иона (цвиттериона):
H
H3N C COO
+
R
В кислой среде карбоксил нейтрализуется, поэтому аминокислота реагирует,
как катион. В щелочной среде цвиттерион аминокислоты теряет протон, поэтому
аминокислота реагирует как анион:
+
NH3CH(CH3)COO
+
+
H + NH2CH(CH3)COO
+
NH3CH(CH3)COO + H
NH3CH(CH3)COOH
Амфотерные свойства проявляются у всех аминокислот, однако каждая
аминокислота храрактеризуется индивидуальными особенностями (растворимость,
изоэлектрическая и изоионная точки, принадлежность к D- или L-ряду (в составе
белков только L-аминокислоты) и др.), зависящими от химической природы
радикала R. Степень кислотности аминокислоты выражается отрицательным
логарифмом кажущейся константы диссоциации К1 – рК1.
7
Белки представляют собой сложные высокомолекулярные органические
азотсодержащие природные соединения коллоидного характера, построенные из
большого количества остатков (-аминокислот.
Растворы белков обладают некоторыми свойствами коллоидных растворов, а
также амфотерностью, поскольку содержат одновременно карбоксильные
(отрицательно заряженные) и аминные группы (положительно заряженные).
Аминокислоты, обладая двумя противоположно заряженными функциональными
группами, способны связываться друг с другом, образуя полипептидные цепи.
H
H2N C
H
H
H
CO N C CO N C CO N C COOH
H
H
H
R`
R``
R```
R````
В полипептидах связь между остатками аминокислот
называется
пептидной. Эта связь ковалентная, прочная и разрывается только при гидролизе
белка. Простые белки состоят только из аминокислот, т.е. из полипептида, а
сложные белки содержат, кроме аминокислот, другие небелковые вещества, так
называемые простетические группы, например, углеводы, липиды, нуклеиновые
кислоты и др. Порядок чередования аминокислот, соединенных между собой
пептидной (-СО-NH-) связью, называется
первичной
структурой белка.
Специфичность первичной структуры белка определяет специфичность
пространственной упаковки (II-, III- и IV-я структуры) его молекулы, от которой
в свою очередь зависят биологические функции этого белка. Специфичность
первичной структуры белка заложена в генетическом аппарате и передаётся по
наследству.
Денатурация белка – нарушение уникальной нативной структуры белковой
молекулы. Это любая модификация вторичной, третичной или четвертичной
структуры, происходящая без разрыва пептидных связей. Степень нарушения
нативной конформации молекул белка может быть различной, в зависимости от
чего определяют обратимую и необратимую денатурацию.
Основные проявления жизни - пищеварение, передача нервного импульса,
сократимость, способность к росту и размножению - связаны с белками. Из
основных функций белков можно назвать следующие: пластическая (построение
тканей и органов), каталитическая (ферментативная), иммуно-защитная
(образование антител, бактерицидных веществ, антивирусных белков и др.).
транспортная, дыхательная (транспорт и запасание кислорода), двигательная
(мышечное сокращение и др.), регуляторная (гормональная), передача
наследственных признаков.
8
Лабораторная работа 1. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ
НА АМИНОКИСЛОТЫ
Для обнаружения белков существуют две группы реакций: цветные
реакции и реакции осаждения. При взаимодействии белка с отдельными
химическими веществами возникают
окрашенные
продукты
реакции.
Образование их обусловлено присутствием в молекуле белка той или иной
аминокислоты, имеющей в своём составе определённую химическую группировку.
Значение цветных реакций состоит в том, что они дают возможность
установить белковую природу вещества и доказать присутствие некоторых
аминокислот в различных природных белках. На основе некоторых цветных
реакций разработаны методы количественного определения белков и
аминокислот.
Работа 1. БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ НА ПЕПТИДНУЮ СВЯЗЬ
Биуретовая реакция тестирует в белке пептидную связь -CO-NH-, которая
образуется при взаимодействии групп –NH2 одной молекулы и -СООН другой
молекулы различных (-аминокислот в результате отщепления от них молекулы
воды.
R`
где
H
C COOH + R``
H
C COOH
NH2
NH2
CO N
H
R`
H
C CO N
H
NH2
CHR`` COOH + H2O
- пептидная связь.
Биуретовую реакцию способны давать вещества,
которые содержат не
менее двух пептидных связей -CO-NH-. При добавлении сернокислой меди к
сильно щелочному раствору белка образуются комплексные соединения меди с
пептидной группировкой, окрашенные в красно- или сине-фиолетовый цвет.
И с с л е д у е м ы й м а т е р и а л: раствор яичного белка
Р е а к т и в ы:
1.Едкий натр, 10% .
2. Сернокислая медь, 1%.
9
Об о р у д о в а н и е:
1.Штатив с пробирками.
2.Капельницы или пипетки.
Порядок выполнения работы
К 5 каплям раствора белка (яичный белок, растворенный в воде)
прибавляют 3 капли 10% раствора едкого натра (NaOH) и 1 каплю 1% раствора
сернокислой меди (CuSO4) и перемешивают. Содержимое пробирки приобретает
сине-фиолетовый цвет.
Нельзя добавлять избыток сернокислой меди, поскольку синий осадок гидрата
окиси меди маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового
комплекса белка.
Работа 2. НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ
НА α-АМИНОКИСЛОТЫ
Нингидриновая реакция характерна для аминогрупп, находящихся в (положении, в том числе для (-аминокислот. Растворы белка, (-аминокислот и
пептидов дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином при
нагревании.
И с с л е д у е м ы й м а т е р и а л: раствор яичного белка
Р е ак т и в ы:
1. Нингидрин, 0.1% водный раствор.
О б о р у д о в а н и е:
1. Штатив с пробирками.
2. Капельницы.
Порядок выполнения работы
К 5 каплям раствора белка приливают 5 капель 0,1% водного раствора
нингидрина и кипятят смесь 1-2 минуты.
Появляется розово-фиолетовое или сине-фиолетовое
окрашивание. С
течением времени раствор синеет. Эта реакция не является специфичной,
поскольку ее дают некоторые амины и амиды кислот.
10
Работа 3. КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ НА ЦИКЛИЧЕСКИЕ
АМИНОКИСЛОТЫ
Ксантопротеиновая реакция открывает наличие в белках циклических
аминокислот - триптофана, фенилаланина. тирозина, содержащих в своем составе
бензольное ядро.
Большинство белков при нагревании с концентрированной азотной кислотой
дает жёлтое окрашивание, переходящее в оранжевое при подщелачивании.
Реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца этих аминокислот с
образованием нитросоединений, окрашенных в желтый цвет. Эта реакция носит
название ксантопротеиновой реакции (греч. xantos - желтый).
Жёлтое
окрашивание наблюдается при попадании концентрированной азотной кислоты
на кожу, ногти и т.п. Такие белки, как желатина и некоторые другие, не
содержащие выше названные циклические аминокислоты, не дают
ксантопротеиновой реакции. Ксантопротеиновую реакцию дают также более
простые ароматические соединения (например, фенол).
И с с л е д у е м ы й м а т е р и а л : раствор яичного белка.
Р е а к т и вы:
1.Азотная кислота концентрированная.
2.Едкий натр, 10% .
О б о р у д о в а н и е:
1.Штатив с пробирками.
2.Капельницы.
Порядок выполнения работы
К 5 каплям раствора белка добавляют 3 капли концентрированной азотной
кислоты (НNО3) и осторожно кипятят. Вначале появляется осадок свернувшегося
белка (под влиянием кислоты), который затем окрашивается в желтый цвет при
нагревании.
После охлаждения в пробирку наливают по каплям 10% раствор едкого
натра (NaOH) до появления оранжевого окрашивания вследствие образования
натриевой соли динитротирозина.
11
Работа 4. РЕАКЦИЯ ФОЛЯ НА АМИНОКИСЛОТЫ,
СОДЕРЖАЩИЕ СЕРУ
Реакция Фоля указывает на присутствие в белке аминокислот цистина и
цистеина, содержащих серу. Метионин, хотя и является содержащей серу
аминокислотой, но данной реакции не дает, поскольку сера в нем связана
прочно. Реакция состоит в том, что при кипячении белка со щелочью
аминокислоты (цистеин, цистин) легко отщепляют серу в виде сероводорода,
который с солью свинца дает черный или бурый осадок сернистого свинца.
Реактив Фоля состоит из 5% раствора уксусно-кислого свинца
Рb(СНзСОО)2 и избытка 10 % раствора NaOH. Реакция протекает в реактиве Фоля
по следующим уравнениям:
1. а) Рb(СН3 СОО)2 + 2 NaOH → 2 NaСН3 СОО + Рb(ОН)2  + NaOH (избыток)
б) РЬ(ОН)2 + 2NaOH → 2Na2РbО2 + 2 Н2О + NaOH (избыток)
плюмбит
натрия
CH2 SH
CH2OH
CHNH2 +
2 NaOH
CHNH2 + Na2S + H2O
2. COOH
цистеин
COOH
серин
3. Na2S + Na2PbO2 + 2Н2О → 4PbS + 4 NaOH
осадок
черного цвета
Интенсивность окраски зависит от количества в белке аминокислот цистина
и цистеина, содержащих слабосвязанную серу, и от концентрации белка в
растворе.
И с с л е д у е м ы й м а т е р и а л: раствор яичного белка.
Р е а к т и в ы:
1. Реактив Фоля. .
О б о р у д о в а н и е:
1.Штатив с пробирками.
2.Капельницы.
3.Оборудование для нагревания пробирок.
12
Порядок выполнения работы
К 5 каплям раствора белка добавляют 5 капель реактива Фоля.
Полученную смесь кипятят и дают постоять 1-2 минуты, после чего появляется
бурый и черный осадок сернистого свинца.
Указания к составлению отчёта
Полученные результаты всех цветных реакций надо записать в виде
таблицы, а в лабораторном журнале отдельно написать химическую структуру
компонентов, открываемых каждой цветной реакцией и написать химизм
реакции Фоля.
Таблица 1
Цветные реакции на белки
NN по
порядк
у
Название
реакции
1.
2.
3.
Биуретовая
Нингидритновая
Ксантопротеино
вая
Реакция Фоля
4.
Употребляем Наблюдаемое
ые
окрашивание
реактивы
Что
открывается
Выводы по работе:
Лабораторная работа 2. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД
ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ
Хроматографические методы применяют для сорбционно-динамического
разделения смеси аминокислот, белков, углеводов, липидов и их метаболитов.
В зависимости от природы адсорбента и механизма разделения веществ
хроматографию подразделяют на несколько видов: адсорбционная — основана на
различной способности отдельных компонентов смеси адсорбироваться на
поверхности твердой фазы сорбента; этот метод предложен М. С. Цветом в 1903
г; распределительная — основана на различной растворимости разделяемых
13
веществ в двух малосмешивающихся жидкостях; ионообменная — основана на
различной способности разделяемых веществ к обмену их ионов на ионы неподвижной
фазы
сорбента;
осадочная
—
основана
на
образовании
труднорастворимых осадков в определенной последовательности; диффузионная
— основана на разделении веществ по скорости диффузии внутрь сорбента в
зависимости от размера молекул; к данному типу относится гель-фильтрация,
разделение веществ в которой основано на механическом явлении молекулярных
сит (просеивания).
Различают хроматографические методы анализа и по технике выполнения их:
колоночная и плоскостная (на бумаге или в тонком слое). В зависимости от агрегатного состояния фаз хроматографию подразделяют на газовую, жидкостную и
газожидкостную. Различаются виды хроматографии и по направлению движения
растворителя
(подвижной
фазы):
восходящая,
нисходящая,
одномерная,
двухмерная и радиальная.
Точным и доступным является метод распределительной хроматографии на
бумаге (модификация адсорбционной хроматографии). В качестве адсорбента в
этом методе используют специальную фильтровальную бумагу. Хроматографию
проводят в закрытой камере, чтобы избежать испарения растворителя.
Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии
на бумаге используют для определения аминокислотного состава белка, для
качественного и количественного определения аминокислот в биологических
жидкостях и тканях. Этот метод позволяет выделить отдельные вещества из
небольшого количества сложной смеси.
Радиальная хроматография является одной из разновидностей метода
распределительной хроматографии.
Принцип
метода.
Отдельные
аминокислоты
обладают
различной
растворимостью в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых
является вода, другой - водонасыщенный органический растворитель, например
фенол. Из двух частично смешивающихся жидкостей один растворитель должен
быть полярным (неподвижная фаза), а другой неполярным — подвижная фаза.
14
Более гидрофобная аминокислота или другое вещество, лучше растворяющееся в
неполярном растворителе, движется с большей скоростью от линии старта, чем
гидрофильная аминокислота. В результате этого смесь аминокислот по окончании
хроматографического разделения оказывается на разном расстоянии от линии
старта.
Радиальную хроматографию проводят на бумаге в чашке Петри. Растворитель
перемещается от центра к периферии и захватывает аминокислоты, которые
распределяются
концентрическими
кругами
и
обнаруживаются
после
высушивания бумаги и проведения нингидриновой реакции.
Клинико-диагностическое
значение
определения
аминокислот
в
сыворотке крови и моче. Определение свободных аминокислот важно для
изучения обмена белков в организме. В норме в плазме крови содержится около
21,42 ммоль/л (30 мг %) аминокислот. С мочой выделяется до 0,5 г аминокислот.
Изменения в содержании аминокислот в сыворотке крови и моче наблюдаются
при недостаточной функции печени: усиленном распаде белков, нарушении
распада аминокислот (дезаминирование, переаминирование), а также при
нарушении выделительной функции почек. Недостаток аминокислот сказывается
в первую очередь на сердечной мышце, например, при нарушении переваривания
белков в желудочно-кишечном тракте.
И с с л е д у е м ы й
м а т е р и а л: растворы аминокислот, 0.4 М
(приготовление см. на стр. ).
Р е а к т и в ы:
1. Фенол, насыщенный водой.
2. Нингидрин, 0,2% раствор в ацетоне или в этиловом спирте 96%.
О б о р у д о в а н и е:
1.Чашка Петри.
2. Хроматографическая бумага (вырезают бумажный диск диаметром 12 см).
3. Ножницы.
4. Сушильный шкаф с термометром.
5. Пинцет.
6. Линейка.
15
7. Капельная пипетка или пульверизатор.
8. Микропипетка или капилляр.
9. Пипеткa.
Порядок выполнения работы
1. В центре бумажного диска или квадрата из хроматографической бумаги,
стороны которого на 1 см больше диаметра чашки Петри, делают вырез около 1
см в диаметре. Простым карандашом диск делят на 4 части по диагоналям, затем
помещают его на ножку, сделанную из фильтровальной бумаги в виде трубочки
высотой 2 см, вставленной в вырез диска. Диск следует держать за края, чтобы
избежать появления отпечатков пальцев на хроматограмме.
2. Отступив от центра на 1 см, в каждом секторе диска обводят простым
карандашом кружки и обозначают их цифрами 1, 2, 3, 4. Наносят капилляром
небольшое количество (1—2 капли) исследуемых растворов аминокислот:
аланина (1), глутамина (2) и лейцина (3). В четвертый сектор (4) наносят смесь
аминокислот. При нанесении исследуемых аминокислот в каждый кружок следят
за тем, чтобы капля наносимого раствора не заходила за пределы кружка. После
нанесения растворов аминокислот бумагу необходимо просушить на воздухе в
течение 10 мин, чтобы не было влажного пятна.
3. На дно чашки Петри (одного диаметра с крышкой ее) наливают 10 мл
водонасыщенного раствора фенола так, чтобы ножка диска погружалась в
раствор. Чашку Петри накрывают крышкой и проводят хроматографическое
разделение в течение 40—50 мин при комнатной температуре. По ножке
растворитель поднимается вверх и распределяется по окружности бумажного
диска, увлекая за собой нанесенные аминокислоты. При этом происходит
разделение исследуемой смеси на отдельные аминокислоты, движущиеся с разной
скоростью, соответственно коэффициентам их распределения между водой и
фенолом. Когда фронт растворителя дойдет почти до края бумажного диска,
крышку чашки Петри снимают, на нее кладут бумажный диск, удерживая
16
пинцетом его края, и помещают в термостат при температуре 90-100°С на 10 мин
с целью устранения растворителя (фенола) и фиксации аминокислот.
4. Для выявления пятен аминокислот хроматограмму опрыскивают 0,2%
раствором нингидрина (ацетоновым или спиртовым), либо сухую хроматограмму
быстро, одним движением, смачивают раствором нингидрина, налитым в чашку
Петри, и вновь высушивают в сушильном шкафу при температуре 90-100°С в
течение 5 мин. При этом проявляются аминокислоты в виде отдельных трех
полос, окрашенных в розово-фиолетовый цвет, где каждое пятно соответствует
определенной аминокислоте.
Сравнивая расположение пятен в исследуемой смеси с положением пятен
отдельных аминокислот, устанавливают присутствие в смеси определенных
аминокислот.
Для
каждой
аминокислоты
рассчитывают
коэффициент
распределения — Rf или скорость перемещения по формуле: Rf = а/в, где а —
расстояние в миллиметрах, пройденное аминокислотой от места нанесения
аминокислоты до середины ее пятна; в — расстояние в миллиметрах от места
нанесения аминокислоты (линии старта) до фронта растворителя.
Чем меньше растворимость аминокислоты в воде и чем больше ее
растворимость в феноле или в другом органическом растворителе, тем быстрее
она движется вслед за фронтом органического растворителя, тем больше
величина Rf, и, наоборот, чем больше ее растворимость в воде и меньше в
органическом растворителе, тем медленнее аминокислота будет передвигаться и
тем меньше величина Rf. Коэффициент распределения Rf — величина постоянная
для каждой аминокислоты при постоянных условиях опыта (температура, сорт
бумаги, растворитель). Сравнивают коэффициент распределения известных
стандартных
аминокислот с коэффициентом распределения
полученных
для
исследуемой
смеси
аминокислот в исследуемом материале.
17
и
определяют
аминокислот,
наличие
отдельных
Указания к составлению отчета
Следует записать принцип хроматографического метода, подклеить в
тетрадь полученную хроматограмму с указанными аминокислотами. С помощью
линейки измерить расстояния а и b в миллиметрах и вычислить коэффициент
распределения Rf=a/b для каждой аминокислоты.
Вывод по работе:
Вопросы для самоподготовки к теме: Аминокислоты и белки
1. Дайте определение протеиногенным аминокислотам.
2. Как связаны между собой аминокислоты в молекуле белка?
3. Какие аминокислоты обнаруживаются ксантопротеиновой реакцией?
4. С помощью какой реакции обнаруживаются аминокислоты - цистеин и
цистин?
5. Каково значение рН для 0,1 М раствора солянокислого глицина?
6. Каково значение рН для 0,1 М растворов глицина в катионной и анионной
форме?
7. Для всех форм глицина нарисуйте график зависимости процентного
содержания биполярного иона от изменения величины рН в пределах от 0 до 13.
8. Растворимости тирозина при 0, 25 и 50оС соответственно равны 0,147; 0,351
и 0,836 г на 100 г воды. Величины рКа
при 25оС составляют 2,3; 9,1 и
10,3. Рассчитайте теплоту растворения. Какова растворимость тирозина при
25оС и рН 12?
9. Что называется буферным действием растворов?
10.В чем заключается сущность действия буферной системы?
11..Из каких компонентов должны состоять буферные системы?
12..Как определяется численное значение буферной ёмкости раствора?
13.Какие виды упражнений более эффективно повышают буферную ёмкость
крови?
14.Какое имеет значение для спортсменов повышение буферной ёмкости крови?
15.Что такое белок?
18
16.Чем отличаются простые белки от сложных?
17.Что собой представляет первичная, вторичная, третичная и четвертичная
структуры белков?
18.В чем заключаются биологические функции белков в живом организме.
19. Перечислите цветные реакции на белки и их значение.
20.Рибонуклеаза содержит следующие группы: 11 карбоксильных, 4
имидазольные, одну -NH3- и 10 -NH3-групп, 3 обратимо титруемые
фенольные и 4 гуанидиновые. В порядке перечисления (начиная с
имидазольных) соответствующие значения рКа (int) для этих групп
составляют: 6,5; 7,8; 10,2; 10,0 и  12. Определите изоэлектрическую точку
для этого белка.
21.Какие шесть групп рибонуклеазы (см. 20.) подвергаются ионизации в
интервале 2рН11,5?
22.Сравните изоэлектрическую и изоионную точки (в присутствии и в
отсутствие соли) для белка, способного связывать анионы, если известно,
что его изоэлектрическая точка располагается в щелочной области.
23.Каковы принципы классификации белков?
Тема «ФЕРМЕНТЫ»
Ферменты или энзимы – белковые вещества, биологическая функция
которых состоит в катализе подавляющего большинства биохимических
процессов, протекающих в организме. Это – биологические катализаторы.
Живая клетка может содержать до 1000 ферментов, ускоряющих различные
химические реакции. В основу классификации ферментов положены типы
химических реакций. Все ферменты делятся на шесть классов.
1. Оксидоредуктазы – ускоряют окислительно-восстановительные реакции.
2. Трансферазы – ускоряют перенос различных функциональных групп с
одной молекулы на другую.
3. Гидролазы – ускоряют эфирных или пептидных связей в молекулах
полисахаридов, липидов, белков, нуклеотидов. К гидролазам относятся все
пищеварительные ферменты.
19
4. Лиазы – ускоряют негидролитический распад органических веществ по
связям С - С, С-О-, С – N –
5. Изомеразы – ускоряют процессы внутримолекулярных перестроек,
превращений одних изомеров органических веществ в другие.
6. Лигазы
или
синтетазы
–
катализируют
реакции
синтеза
высокомолекулярных соединений (белков, полисахаридов, липидов, нуклеотидов)
из мономеров, активированных при участии АТФ или других макроэргических
веществ.
О белковой природе ферментов свидетельствует возможность инактивации
(потери активности) ферментов брожения при кипячении, установленная еще
Пастером. Под влиянием различных физических и химических факторов
происходит денатурация ферментов подобно белкам. Ферменты при гидролизе,
как и белки распадаются на аминокислоты, что бесспорно служит веским
доказательством белковой природы ферментов, а также свидетельствует о том,
что ферменты обладают рядом свойств, характерных для высокомолекулярных
соединений. В частности, эти биомолекулы не способны проходить через
полупроницаемые мембраны и легко осаждаются из водных растворов методом
высаливания. Ферменты, как всякие белки, наделены амфотерными свойствами
и электрофоретической подвижностью.
Ферменты,
которые
представлены
простыми
белками,
являются
однокомпонентными ферментами, а ферменты, являющиеся сложными белками,
- двукомпонентными и называют их холоферментом. У холоферментов белковая
часть называется апоферментом, а небелковая часть (простетическая группа) кофактором. Роль кофакторов могут играть неорганические вещества, например,
ионы Fe2+ , Mп2+ или Zn2+. У многих холоферментов небелковая часть
представлена сложными органическими веществами, которые могут легко
отщепляться от белковой части фермента, которые называют коферментами.
Большинство коферментов или содержат в своем составе водорастворимые
витамины, или относятся к витаминам.
Ферменты имеют сложную пространственную структуру, образованную на
основе I-, II-, III- и IV-ной структур. Некоторые функциональные группы
ферментных молекул непосредственно
участвуют
в связывании
и
преобразовании
субстрата.
Участок
фермента,
содержащий
такие
функциональные группы, называется активным центром. В активном центре
условно различают так называемый каталитический участок, непосредственно
20
отвечающий за превращения субстратной молекулы, и "контактную" площадку,
которая обеспечивает специфическое сродство к субстрату и формирование его
комплекса с ферментом – сорбционный участок. Ферменты, связываясь с
субстратом, образуют промежуточный фермент-субстратный комплекс, который
затем распадается на свободный фермент и продукт реакции.
Е + S ↔ ES ↔ Е + Р
Образование промежуточного фермент-субстратного комплекса играет
очень важную роль в ферментативном процессе. Переходный комплекс обладает
более низкой энергией активации, т.е. катализаторы белковой природы (как и
неорганические
катализаторы) снижают
энергию активации химической
реакции, и в присутствии ферментов гораздо более значительная доля молекул
вступает в реакцию в единицу времени.
Помимо активного центра в молекуле фермента может присутствовать
также аллостерический центр,
представляющий собой участок молекулы
фермента,
с
которым
связываются
определенные,
как
правило,
низкомолекулярные вещества (эффекторы), обычно по своей структуре не
сходные с субстратом. Присоединение эффектора к аллостерическому центру
приводит к изменению третичной, а в ряде случаев четвертичной структуры
фермента и соответственно конформации активного центра, вызывая снижение
или повышение энзиматической активности. Несмотря на большое сходство с
неорганическими катализаторами, ферменты имеют ряд существенных отличий,
обусловленных их белковой природой.
Лабораторная работа 3. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА
И ИЗУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ И СПЕКТРАЛЬНЫХ
ХАРАКТЕРИСТИК ФЕРМЕНТОВ
На активность ферментов оказывают влияние различные вещества и
факторы. Одни из них повышают активность ферментов (активаторы) , другие
угнетают ее
(ингибиторы).
Активаторами
являются некоторые ионы (Са2,
Mg2, Co2, CI- и др.). Так, активатором амилазы являются ионы СI- , активатором
АТФ-азы - ионы Са2 и т.д. Ингибиторами ферментов являются соли тяжелых
металлов и структурные аналоги субстратов ферментов. Кроме того, температура,
рН среды, разного рода излучения, вызывающие конформационные изменения в
21
нативной белковой молекуле, влияют на эффективность протекания
ферментативной реакции, изменяя каталитические характеристики фермента.
Работа 5. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ
ФЕРМЕНТАТИВНЫХ ПАРАМЕТРОВ ПЕРОКСИДАЗЫ ЛЬНА
Пероксидаза растений (ПО) – гликопротеид, катализирующий реакции
переноса водорода от молекулы субстрата к перекисям. Большинство субстратов
этого фермента – соединения фенольной природы. Окисляясь до хинонов, они
обладают
сильным
окислительным
действием.
ПО
–
один
из
самых
распространенных ферментных белков. Ее отличает индуцибельность: реагирует
на самые разнообразные воздействия, либо изменяя при этом набор своих
изоэнзимов, либо повышая активность уже имеющихся молекулярных форм.
Кинетика ферментативных реакций и механизмы регуляции ферментативных
параметров подробно изложены в 16 - 19.
М а т е р и а л ы и с с л е д о в а н и я: проростки льна
Р е а к т и в ы:
1.Ацетатный буфер, рН 5.4 (см. приготовление на стр. ).
2.Раствор бензидина (3.510-5М) в ацетатном буфере (см. приготовление на
стр. ).
3.Пероксид водорода, 0.03 % (см. приготовление на стр. ).
О б о р у д о в а н и е:
1.Мерная колба на 25 мл.
2.Чашки Петри.
3.Центрифуга.
4.ФЭК КФК ЗОМЗ-3-01.
5.Штатив с пробирками.
Порядок выполнения работы (работа состоит из 3-х опытов)
Опыт 1. Проращивание семян льна
В чашки Петри на три кружка фильтровальной бумаги помещают по 20
семян льна-долгунца. В каждую чашку Петри вводят пипеткой 10 мл раствора
22
и проращивают семена в темноте при температуре 20ºC. Таким образом
проращивают 3-, 5-, 7-дневные проростки, которые в дальнейшем используют в
качестве биологического материала, из которого экстрагируют фермент
пероксидазу.
Опыт 2. Методика выделения пероксидазы из проростков льна
Навеска растительного материала (100-500 мг) растирается на холоду в
ступке с ацетатным буферным раствором (pH 5,4), после чего переносится в
мерную колбу (25 мл) и доводится до метки ацетатным буфером (pH 5,4).
Каждая вытяжка настаивается 5-10 мин, после чего центрифугируется в течение
15 мин при 3000 об/мин. Осадок отбрасывается, надосадочная жидкость
используется для определения ферментативных параметров ПО.
Для определения концентрации пероксидазы, выделенной
проростков льна-долгунца, следует пользоваться
из
калибровочным графиком
(рис. 1), построенным для
Рис. 1. Калибровочный график зависимости оптической плотности D ( = 280
нм) от концентрации пероксидазы (препарат фирмы Reanal).
пероксидазы из хрена (коммерческий препарат фирмы "Reanal").
Указания к составлению отчета
Описывают методические особенности экстракции пероксидазы из проростков
льна и определяют ее количество по калибровочной кривой. Рассчитывают
содержание фермента на г сырой ткани.
Выводы по работе:
23
Опыт 3. Определение ферментативной активности ПО льна
по методу Бояркина
В
работе
следует
использовать
два
подхода
для
получения
экспериментальных данных по ферментативной активности пероксидазы льна.
I подход. Ферментативную
методу Бояркина по
активность
измерению
достигает определенной
времени,
оптической
пероксидазы
за
которое
плотности.
В
определяют
опытный
качестве
по
раствор
субстрата
используют раствор бензидина на ацетатном буфере, в результате окисления
которого образуется соединение синего цвета
Об активности пероксидазы судят по времени образования синей окраски
окисленного
бензидина.
Для измерения активности лучше брать такие
разведения вытяжки, чтобы изменение окраски происходило за 10 - 40 с.
Непосредственно
для определения
две кюветы (l = 1 см) заполняют 2 мл
вытяжки, 2 мл буферного раствора и 2 мл бензидина. Кюветы помещают в
кюветодержатели прибора, одну в дальнее гнездо (контроль), другую – в ближнее
(опыт). Ручку перемещения кювет установить в крайнее левое положение. При
этом в световой пучок водиться кювета с контрольной пробой.
Клавишой
выбора
режима
«С»
(«D»)
выбрать
режим
измерения
«А-
ОПТИЧЕСКАЯ ПЛОТНОСТЬ». Нажать на клавишу «#». На индикаторе должно
отобразиться «ГРАДУИРОВКА», через 3-5 с данная надпись исчезает и вместо
неё отображается «ИЗМЕРЕНИЕ», на нижней строчке «А=0,000».
В левую контрольную кювету наливают 2 мл воды, в правую опытную
кювету доливают 2 мл 0,03% H2O2 пипеткой с широким носиком. При этом
сильная струя перемешивает содержимое кюветы, одновременно с первой каплей
включают секундометр. Ручку перемещения кювет устанавливают вправо до
упора. При этом в световой пучок вводиться кювета с исследуемым раствором. На
нижнем индикаторе отображается значение оптической плотности исследуемого
раствора. В опытной кювете раствор синеет, числовое значение оптической
плотности увеличивается. Отмечают время (t) от начала приливания H2O2 до
достижения
раствором
заданной оптической
24
плотности. Проводят три
определения, определяют среднее значение.
Активность фермента рассчитывают по формуле:
D/ d t,
А =
где D - оптическая плотность, равная 0,250;
d - толщина кюветы, равная 1 см;
t - время, с;
, ,  - факторы разведения:
 - отношение количества жидкости, взятой
для приготовления вытяжки, к навеске ткани в граммах;  - степень
дополнительного разведения вытяжки (если это потребуется);  -
степень
постоянного разведения вытяжки в реакционной смеси (в данной работе равна 4).
Таким образом, величина активности пероксидазы,
рассчитанная
по
вышеприведенной формуле, отражает изменение оптической плотности за 1 с на 1
г сырого веса ткани.
Реактивы:
1. Ацетатный буферный раствор (pH - 5,4).
2. Раствор бензидина на ацетатном буфере.
3. Пероксид водорода (0,03%).
Оборудование:
1. ФЭК КФК-3-01.
2. Штатив с пробирками.
II
подход.
Параметры
ферментативной
пероксидазы определяют на основе
концентраций
H2O2: 0,01;
0,02;
активности
метода
Бояркина
для
0,03;
0,04;
0,05;
Km и Kcat.
шести
разных
0,06%
-
спектрофотометрически при  = 540 нм. Снимают кинетические зависимости D в течение 1,5-2 минут через каждые 5 сек. Обработка начальных участков
кинетических зависимостей D- в координатах Лайнуивера-Берка (1/Vo;1/[S]o)
позволяет рассчитать
важнейшие
кинетические
параметры ферментативной
реакции - Km - константу Михаэлиса, и Kcat. - константу каталитическую.
25
Схема опыта:
В контрольную кювету толщиной 10 мм наливают 0,5 мл буферного
раствора (pH-5,4), 0,5 мл вытяжки пероксидазы, 0,5 мл раствора бензидина,
0,5 мл дистиллированной воды. В опытную кювету толщиной 10 мм наливают
0,5 мл буферного раствора (pH-5,4), 0,5 мл вытяжки пероксидазы, 0,5 мл
раствора бензидина. Затем добавляют 0,5 мл водного раствора пероксида
водорода. Измерения проводят при длине волны 540 нм в течение 1,5-2 минут
через каждые 5 секунд.
Указания к составлению отчета
1. Активность любого фермента
следует
определять
по
начальной
скорости ферментативной реакции.
2. Исходная концентрация субстрата должна
быть
достаточной
для
насыщения фермента: [S]o>>[E]о.
3. Кинетика
реакции
должна
приближаться
к
кинетике
реакции
нулевого порядка.
4. Зависимость активности во времени должны быть получены не
менее, чем для шести
концентраций
субстрата
при стандартной
концентрации фермента.
5.
Первичные
координатах
экспериментальные
"двойных
обратных
зависимости представляют
величин" или
Лайнуивера-Берка (1/Vo;1/[S]o) и по ним
в
в координатах
определяют Kcat. и
Km
(константу каталитическую и константу Михаэлиса).
6. Проводят сравнение числовых
значений
графически, с табличными значениями.
Выводы по работе:
26
Km
и
Kcat.,
найденных
Работа 6. ИЗУЧЕНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ СВОЙСТВ РАЗЛИЧНЫХ
КОНФОРМАЦИОННЫХ СОСТОЯНИЙ ПЕРОКСИДАЗЫ
ПО – регуляторный фермент, способный менять каталитическую
активность при разного рода воздействиях: ковалентной или ионной
модификации
своих
специфических
функциональных
групп
(три
карбоксильные группы, входящие в состав активного центра фермента);
изменении химической природы субстрата (этот фермент отличает широкая
специфичность к субстратам различной химической природы); изменении
рН
и т.д. Эффективными регуляторами каталитической активности ПО
являются
вещества,
разрушающие
гидрофобные
взаимодействия
(додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия и т.д.), водородные связи (8М
мочевина, соляно- или сернокислый гуанидин и т.д.), электростатические
взаимодействия (высокая ионная сила).
Материалы исследования: коммерческий препарат ПО
Реактивы:
1.Водный раствор ПО (2,510-5М).
2.Соляно- или сернокислый гуанидин, 1-6 М.
3.Додецилсульфат натрия, 1 %.
4.Дистиллированная вода.
Оборудование:
1.Спектрофотометр.
2.Штатив с пробирками.
Порядок выполнения работы
Приготовить водные растворы ПО в концентрации 2,510-5М, а также
водные растворы додецилсульфата натрия (1%) и 1–6 М растворы соляноили
сернокислого
гаунидина.
додецилсульфата натрия
К
раствору
ПО
добавить
раствор
в обьемном соотношении 1:1. Приготовить
указанным способом смеси, содержащие ПО и гуанидин.
27
Зарегистрировать электронные спектры поглощения раствора ПО,
разбавленного дистиллированной водой в объемном соотношении 1:1 (учет
эффекта
разведения
белка
при
приготовлении
его
смесей
с
денатурирующими агентами).
Зарегистрировать спектры поглощения смесей ПО - додецилсульфата
натрия и ПО – гаунидин 1 – 6 М. Построить полученные спектры
Указания к составлению отчета
Проанализировать
полученные
спектры.
Построить
кривую
зависимости оптической плотности в главных максимумах поглощения ПО
от концентрации гуанидина. Сделать вывод о характере и природе
структурных
нарушений,
возникающих
в
ПО
под
влиянием
денатурирующих агентов.
Выводы по работе:
Вопросы для самоконтроля по теме «Ферменты»
1. Дайте определение ферментам и назовите их биологические функции.
2. Какова химическая природа ферментов?
3. Перечислите доказательства белковой природы ферментов.
4. Как называются составные части холофермента? Ответ иллюстрируйте
примерами.
5. Какие небелковые группы веществ могут входить в состав ферментов?
6. Какая связь существует между ферментами и витаминами?
7. Чем объяснить термолабильность ферментов? Какой температурный
оптимум для действия ферментов живых организмов?
8. Почему ферменты обладают специфичностью действия и в чем это
свойство проявляется?
9. На чем основана классификация ферментов? Перечислите классы
ферментов и их кодовые шифры.
28
10.Количественный подход оценки активности ферментов с применением
уравнения Михаэлиса-Ментен и важнейших ферментативных параметров
– константы Михаэлиса Кm и константы каталитической Кkat.
11.Ингибиторы и активаторы ферментов. Их химическая природа и
молекулярный
механизм действия.
12.Как определить порядок ферментативной реакции по отношению к
концентрации фермента?
13.Почему в системе, в которой энергетические уровни реагентов и
продуктов реакции одинаковы, все же может протекать реакция, в
результате которой в растворе, в котором первоначально присутствовали
только реагенты, устанавливается равновесие между реагентами и
продуктами реакции?
14.Исследуется
каталитическая
активность
фермента,
имеющего
молекулярный вес 20 000 и находящегося в растворе концентрации 1
мг/мл. Реакция идет при постоянной ионной силе и рН. Начальные
скорости при концентрациях субстрата 1,0; 4,0; 8,0; 12,0; 16,0 и 20,0103
М равны соответственно 7,1; 13,8; 20,6; 29,6; 33,3; 36,2 и 38,710-5 с-1.
Рассчитайте Vmax., Кm, Кkat.
15.Каким должен быть ответ на вопрос 14, если молекулярный вес фермента
равен не 20 000, а 22 000?
16.Дайте определение иммобилизованным ферментам и назовите области
их применения.
Тема «НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ»
Нуклеиновые кислоты - высокомолекулярные биополимеры, обнаруженные
во всех типах клеток. Структурными единицами нуклеионовых кислот являются
мононуклеотиды,
состоящие
из
гетероциклических
азотистых
оснований
(пуриновых и пиримидиновых), пентоз (рибозы или дезоксирибозы) и офосфорной кислоты.
29
На основании данных рентгеноструктурного анализа, а также данных о
химическом строении ДНК Уотсон и Крик (1953) выдвинули гипотезу о том, что
молекула ДНК построена из двух полинуклеотидных цепей, закрученных вправо
вокруг одной и той же оси в двойную спираль, стабилизированную водородными
связями между комплементарными парами азотистых оснований.
Нуклеиновые кислоты делятся на два типа: рибонуклеиновые (РНК) и
дезоксирибонуклеиновые (ДНК). РНК и ДНК различаются особенностями
химического строения входящих в них пуриновых и пиримидиновыхъ оснований
и пентоз, а также локализацией в клетке и функциональным назначением в
клеточном метаболизме.
Денатурация ДНК – полный или частичный разрыв водородных связей
между
парами
азотистых
оснований,
ведущий
к
раскручиванию
полинуклеотидных цепей ДНК и их последующему разделению. Температура,
при которой отмечается середина структурного перехода спираль-клубок,
называется температурой плавления. Ее рассматривают как температуру фазового
перехода.
Этот
переход
сопровождается
изменениями
всех
основных
молекулярных параметров ДНК.
Биосинтез нуклеиновых кислот – система биохимических реакций,
обеспечивающая
по
матричному
механизму
транскрипцию
матрицы,
нуклеотидный состав которой соответствует синтезируемой нуклеиновой кислоте
(ДНК или РНК).
Лабораторная работа 4. Качественное определение нуклеиновых кислот
и изучение структурных изменений ДНК под влиянием различных доз УФ
излучения
Работа 7. НУКЛЕАЛЬНАЯ РЕАКЦИЯ ФЕЛЬГЕНА
Эта реакция широко применяется гистологами и цитологами для
окрашивания клеточных ядер и хромосом. Она основана на том, что продукты
частичного
гидролиза
дезоксирибонуклеиновой
кислоты
восстанавливают
окраску основного фуксина, обесцвеченного сернистой кислотой (реактив
30
Шиффа). Воздействию подвергается 2-дезоксирибоза, связанная с основной
цепочкой нуклеиновой кислоты через фосфатные группы при атомах углерода,
находящихся в 3- и 5-положениях.
Под действием кислоты значительная часть дезоксирибозы, устойчиво
сохранявшей фуранозную форму, превращается в альдегид. Этот последний
вступает в реакцию с реактивом Шиффа, образуя нерастворимую окрашенную
молекулу. Фотометрические измерения интенсивности окраски, развивающейся в
срезах тканей при реакции Фельгена, послужили основой для количественного
определения ДНК.
Материалы исследования: тканевые срезы (обезвоженные)
Реактивы:
1. Соляная кислота, 1н.
2. Фуксинсернистая кислота, 1 %
3 .Парафин.
Оборудование:
1. Термостат.
2. Микроскоп лабораторный.
Порядок выполнения работы
Тканевые срезы, предварительно обезвоженные, помещают в 0,1 н соляную
кислоту при температуре 50 – 60°С на 10-20 мин. После этого срезы погружают в
фуксинсернистую кислоту на 15-20 мин, промывают водой и заключают в
парафин.
Полученные
таким
образом
препараты
просматривают
под
микроскопом и зарисовывают в лабораторном журнале.
Указания к составлению отчета
Содержащаяся в ядрах ДНК подвергается частичному гидролизу в теплой
соляной кислоте. Продукты гидролиза остаются в местах их образования и дают
густое фиолетовое окрашивание. Поэтому богатые ДНК участки оказываются
интенсивно окрашенными.
Выводы по работе:
31
Работа 8. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ УФ-ЛУЧЕЙ НА ПОКАЗАТЕЛЬ
ПРЕЛОМЛЕНИЯ РАСТВОРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Основными акцепторами энергии квантов УФ излучения в нуклеиновых
кислотах являются пуриновые и пиримидиновые основания. Именно эти элементы
структуры нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) с высоким квантовым выходом и
подвергаются
фотолизу
(разрушению)
под
действием
ультрафиолетововго
облучения. В результате фотоинактивации нуклеиновых кислот наблюдаются
изменения нативной конформации этих молекул на уровне II-, III- и IV-ной
структур. Процесс, как правило, сопровождается агрегацией молекул нуклеиновых
кислот, зависящей от дозы облучения. С ростом дозы облучения степень агрегации
возрастает, что находит отражение в УФ спектрах, рефрактометрических
характеристиках, светорассеянии, молекулярной массе и т. д.
Материалы исследования: кристаллические препараты ДНК
Реактивы:
1. С2Н5ОН.
2. Дистиллированная вода.
Оборудование:
1. Рефрактометр.
2. Ртутно-кварцевый облучатель.
3. Светофильтры УФС-1 или УФС-5.
4. Штатив с пробирками.
5. Аналитические весы.
Порядок выполнения работы
Приготовить водные растворы ДНК в концентрации 510-5М. На
рефрактометре
определить
значения
показателей
преломления
этих
растворов. Облучить по 1 мл растворов ДНК интегральным потоком
ультрафиолетового излучения различных доз и определить значения их
показателей преломления в 4-х кратной повторности для каждой дозы.
32
Полученные средние величины показателей преломления облученных
растворов ДНК занести в таблицу 2.
Таблица 2
Значения показателя преломления контрольных и облученных
растворов ДНК
Анализируем
Величина показателя преломления
ые растворы
ДНК
Контрольн
ый раствор
Облученный раствор
30 с
1 мин
5 мин
10 мин
Указания к составлению отчета
На основании данных таблицы составить описание природы
обнаруженных структурных изменений ДНК под влиянием различных доз
УФ излучения.
Выводы по работе:
Вопросы для самоконтроля к теме «Нуклеиновые кислоты»
1. Как влияют на структуру ДНК замещения групп оснований, участвующих и
не участвующих в образовании водородных связей?
2. Как должна влиять ионная сила на трансформирующую способность
медленно охлажденной денатурированной ДНК?
3. Укажите
характерные
особенности
ферментативного
синтеза
ДНК,
подтверждающие структуру ДНК, предложенную Уотсоном и Криком?
4. Два вида организмов имеют ДНК с приблизительно одинаковым
нуклеотидным составом. Каким образом можно отличить ДНК одного
организма от другого?
33
5. Почему следует избегать фосфатных буферов при ферментативном синтезе
полирибонуклеотидов?
6. В чем состоит различие между поли-АУ и поли-(АУ) ?
7. Какую роль можно приписать Мg2 при получении смешанных двойных
спиралей поли-А и поли-У, учитывая, что цепи полинуклеотидов в
спиральной структуре удерживаются вместе за счет водородных связей
между комплементарными основаниями?
8. Как должна меняться конформация молекулы РНК при понижении ионной
силы?
9. Изоэлектрическая точка нуклеиновых кислот находится в области значений
рН от 1 до 2.
Что можно сказать об изоэлектрической точке белка,
нейтрализующего заряд нуклеиновой кислоты при рН 7? Каким должен
быть аминокислотный состав такого белка?
10. Объясните, почему при больших концентрациях NaCI (больше 1М)
дезоксирибонуклеопротамины диссоциируют?
11. Сколько витков спирали в одной частице вируса табачной мозаики (ВТМ)?
12. Укажите черты сходства и различия в строении сферических вирусов и
рибосом.
13. Назовите молекулы, с которыми s-РНК связывается специфически.
14. Какие изменения в нуклеотидном составе РНК последующих поколений
ВТМ могут возникнуть в результате обработки родительской РНК ВТМ
азотистой кислотой?
15. Напишите резонансные структуры таутомерных форм 2-оксипиридина и его
катиона С.
34
Перечень тем рефератов по типу УИРС (в рамках самостоятельной работы
студентов
1. Принципы и современные физико-химические методы исследования
биологических макромолекул (белков, ферментов, нуклеиновых кислот,
липидов, витаминов и гормонов).
2. Хроматографические методы исследования биологически-активных
молекул и их возможности.
3. Метод рентгеноструктурного анализа кристаллов белков.
4. Спектральные характеристики аминокислот, белков, нуклеиновых кислот.
5. Структурная организация биологических мембран.
6. Макроэргические соединения и их биологическая роль.
7. Современные представления о механизме действия лизоцима и химотриисина.
8. Иммобилизованные ферменты: способы получения, физико-химические
характеристики, применение.
9. Современные представления о механизмах мышечного сокращения.
10. Биотехнология. Современное состояние и перспективы развития.
11. Проблемы создания искусственной и синтетической пищи.
12. Нейропептиды. Их структура, биологическая роль.
13. Проблема «белкового голодания» и пути ее решения.
14. Структура, динамика связанной воды и ее роль в формировании
гидрофобных взаимодействий.
15. Генетическая инженерия и ответственность ученого за результаты своих
исследований.
16. Современные представления о биосинтезе белков и путях регуляции.
17. Типы молекулярных и межмолекулярных взаимодействий.
18. ДНК:
денатурация,
гиперхромизм,
гипохромизм,
молекулярная
гибридизация.
19. Хромосомы, хроматин, структура и функции.
20. Современные представления о структуре и функциях гена.
21. Гормоны – регуляторы процессов развития и старения.
22. Механизмы действия гормонов.
23. Современные представления о природе «молекулярных» болезней.
35
24. Химия биологически активных соединений на рубеже столетий.
25. Химиотерапевтические средства.
26. Сердечные гликозиды. Химический состав. Характеристика агликона,
сахарного компонента. Физико-химические свойства.
27. Лекарственная аллергия, ее особенности. Диагностика и лечение.
28. Аллергические реакции, биохимические механизмы их развития. Общие
принципы диагностики и лечения.
29. Наркотики и нервная система.
30. Направленный синтез природных соединений.
31. Молекулярный дизайн – источник задач современного органического
синтеза.
32. Анаболические стероиды. Последствия их приема на различные органы и
системы организма спортсмена.
33. Иммуно-корректирующие средства. Их характеристики и механизм
действия.
34. Фармакологические препараты нового поколения на основе гликопротеинов
клеточного микроокружения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Мецлер Д. Биохимия: в 3 т. – М.: Мир, 1980, Т.1-3, 1124 с.
2. Ленинджер А. Основы биохимии: в 3 т. – М.: Мир, 1983, Т.1-3, 1056 с.
3. Страйер Л. Биохимия: в 3 т. – М.: Мир, 1984-1985, Т. 1-3, 936 с.
4. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. – М.: Высшая школа, 1985, 503 с.
5. Березин И.В., Савин Ю.В. Основы биохимии: Учеб пособие. – М.: МГУ,
1990, 254 с.
6. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. – Новосибирск, 1997, 399 с.
7. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998,
703 с.
8. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. – М.: Просвещение, 1999, 817 с.
9. Кнорре Ю.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 2000,
478 с.
10.Кучеренко Н.Е., Виноградова Р.П., Литвиненко А.Р. Цудзевич Б.А.,
Васильев А.Н. Биохимический справочник. – Киев.: Вища шк., 1979, 304 с.
36
11.Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Щеголева Л.И. Упражнения и задачи
по биологической химии. – М.: Просвещение, 1976, 151 с.
12.Сборник тестов и задач по биохимии. Учебное пособие /Под ред. Ашмарина
И.П., Николаева А.Я. – М.: МГУ, 1996, 233 с.
13.Руководство
к
практическим
занятиям
по
биологической
химии
Методические разработки к лабораторным работам. Якутск.1996. с. 63.
14.Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по
биологической химии. Москва. 1983. с. 272.
15.Практикум по биохимии: Учебное пособие /Под ред. С.Е.Северина,
Г.А.Соловьевой. Москва. МГУ. 1989. с. 509.
16.Лапина Г.П. Элементы кинетики ферментативных реакций Метод. пособие.
Тверь. 1998. c. 76.
17.Лапина Г.П. Молекулярные механизмы изменчивости пероксидазы льна и
их регуляция монография. Тверь. 1999. c. 230.
18.Лапина Г.П. Методы выделения, очистки, количественного определения и
исследования физико-химических свойств белков и ферментов. Калинин.
КГУ. 1982. ч.1. 31 c.
19.Лапина Г.П. Методы выделения, очистки, количественного определения и
исследования физико-химических свойств белков и ферментов. Калинин.
КГУ. 1982. ч.2. 32 c.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ
1. Растворы аминокислот
для хроматографирования:
аминокислоты
растворяют в концентрации 1/25 М. В 10 мл воды растворяют:
Глутаминовой кислоты--------------------------------60 мг
Аланина---------------------------------------------------40 мг
Лейцина---------------------------------------------------50 мг.
Можно также пользоваться следующими сочетаниями аминокислот
(на 10 мл воды):
1. Глутаминовая кислота---------------------------------60 мг
37
Гликокол-------------------------------------------------40 мг
Аланин----------------------------------------------------40 мг
2. Глутаминовая кислота---------------------------------60 мг
Лейцин----------------------------------------------------50 мг
3. Аспарагиновая кислота--------------------------------60 мг
Серин-----------------------------------------------------40 мг
Лейцин----------------------------------------------------60 мг
4. Аспарагиновая кислота--------------------------------60 мг
Гликокол-------------------------------------------------40 мг
Лейцин----------------------------------------------------60 мг
Для ускорения растворения аминокислот можно растворять их при
нагревании на водяной бане.
2. Ацетатный буферный раствор рН 5,4: отвешивают на технических весах
45 г сухого х.ч. едкого натра и растворяют его сначала в 400-500 мл воды. Этот
раствор щелочи после охлаждения количественно переносят в мерную колбу
вместимостью 1 л, добавляют 115 мл ледяной уксусной кислоты и доводят
водой до метки.
2. Бензидин: в мерную
колбу емкостью 200 мл, наполненную на 2/3
дистиллированной водой, прибавляют 2,3 мл (2,4 г) ледяной уксусной кислоты
и 184 мг бензидина. Колбу с содержимом нагревают до 5- - 600С на водяной
бане при постоянном взбалтывании. После полного растворения бензидина
(10-15 мин) в колбу добавляют 5,45 г ацетата натрия, после его растворения
колбу охлаждают и доливают водой до метки. При хранении в темном месте
раствор сохраняется 7-10 дней.
3. Пероксид водорода, 0,03 %: для приготовления пероксида водорода 0,03 %
необходимо взять на 0,03 весовых части 33 % пероксида водорода 32,97
весовых частей воды.
38
39
40