МЕТОДЫ РАБОТЫ С ЛИЧИНКАМИ ХИРОНОМИД Сценарий учебного видеофильма из видеокмплекса

МЕТОДЫ РАБОТЫ С ЛИЧИНКАМИ ХИРОНОМИД
Сценарий учебного видеофильма из видеокмплекса
«Видеопрактика по цитологии в НГУ»
О. В. Ермолаева, В. В. Голыгина, А. Д. Брошков
Аннотация.
Фильм «Методы работы с личинками хирономид» является учебным
видеофильмом из видеокомплекса «Видеопрактика по цитологии в НГУ».
Он состоит из пяти частей суммарной продолжительностью более 20 минут.
Первая часть знакомит с биологией и методами сбора личинок хирономид. Описывается рабочее место хирономидолога. Продолжительность
8 мин. 11 с.
Во второй части подробно описывается морфология личинки, как
живой, так и фиксированной, так как методы работы с ними отличаются.
Описан метод определения фазы развития личинок. Описаны морфологические признаки личинок родов Chironomus, Camptochironomus, Lipiniella,
Gliptotendipes, Stictichironomus и Criptochironomus. Продолжительность 4
мин. 52 с.
В третьей части рассмотрено внутреннее строение личинки. Показаны разные способы вскрытия личинки и извлечения органов. Продолжительность 3 мин. 45 с.
Четвертая часть посвящена работе со слюнной железой: методам
выделения, окрашивания, приготовления давленых препаратов политенных хромосом. Продолжительность 5 мин. 53 с.
В пятой части рассказывается об особенностях приготовления препаратов хромосом из имагинальных дисков, ганглиев, желудка, кишечника и
Мальпигиевых сосудов. Продолжительность 3 мин. 24 с.
Методические материалы «Учебный видеокурс» подготовлен в рамках
реализации Программы развития НИУ-НГУ
1
Сценарий.
Летняя практика по цитологии для биологов II курса ФЕН состоит из
двух частей. Вторая часть посвящена кариологическому исследованию на
примере семейства хирономид. В данном фильме мы вас познакомим с
основными методами работы с личинками хирономид.
Часть 1. Биология и методы сбора личинок хирономид.
Хирономиды — это насекомые с полным циклом превращения. Они
относятся к подотряду длинноусых отряда двукрылых насекомых.
Представители этого семейства проводят большую часть жизни в воде на
стадии личинки, и лишь несколько дней — в воздушной среде на стадии
имаго. Личинки хирономид заселяют практически все естественные и
искусственные внутренние водоемы, в жизни которых играют огромную
роль. В пресноводных водоемах, пожалуй, нет группы многоклеточных
животных того же таксономического ранга, равных им по обилию видов,
численности и экологической пластичности. Личинки служат кормом для
многих видов рыб, птиц и хищных насекомых, принимают участие в
трансформации органического вещества и, следовательно, в самоочищении водоемов. Они могут служить индикаторами качества воды. Также
личинок хирономид используют в различных направлениях биологических исследований в качестве модельного объекта.
Наиболее доступны и удобны для работы личинки трибы Chironomini,
особенно рода Chironomus. Личинки этого рода широко известны под
собирательным названием «мотыль». Для знакомства с экологией
хирономид и для сбора живого материала во время практики студенты
выезжают на водоемы в окрестностях Новосибирска.
Личинки хирономид обитают в основном в бентосе водоема. При
сборе материала личинок извлекают из песчаного или илистого грунта, а
также из стеблей водных растений и из-под коры затонувших древесных
остатков. Ил со дна водоема добывают при помощи драги. Драга предс2
тавляет собой привязанную на прочную веревку тяжелую металлическую
рамку с капроновой мелкоячеистой сеткой. Грунт зачерпывают драгой,
закидывая ее с берега или с лодки.
Ловля с берега.
При ловле с берега, веревку от драги нужно зафиксировать в руке, а
драгу закинуть как можно дальше. Нужно подождать, пока драга погрузится на дно водоема. Затем нужно рывками аккуратно протянуть ее по
дну, чтобы зачерпнуть как можно больше ила.
Важным этапом является промывка. Грунт в драге надо интенсивно
полоскать так, чтобы вода проходила через ячейки сетки и вымывала
мелкие частички набранного грунта. При этом следят, чтобы взмученный
грунт не переливался через край драги. В результате в сетке должны
остаться только крупные частички грунта, части водных растений и
различные представители макрозообентоса, среди которых и нужные нам
личинки хирономид. Все это нужно аккуратно смыть в один угол сетки и
извлечь в какую-либо емкость.
Ловля с лодки.
Бывает, что около берега не удается зачерпнуть достаточно ила, либо
личинок в этом иле нет, или для работы нужны личинки видов хирономид,
обитающих на глубине, не доступной с берега. Тогда материал нужно
собирать, используя лодку.
Драгу следует привязать к лодке. Драгу опускают в воду и ждут, пока
она погрузится на дно. Лодка все это время находится в движении. Драгу
протягивают за веревку по дну и вытаскивают на поверхность.
С лодки проводят первичную промывку грунта так же, как это делают
на берегу.
Окончательная отмывка личинок проводится на берегу.
Для начала из таза нужно выбрать тех личинок, которые выползли на
поверхность. Личинок собирают аккуратно пинцетом и помещают в емкос3
ти с водой.
Для более качественного разбора набранного субстрата с личинками,
нужно взять небольшое количество грунта и поместить его в сито.
Отмывку осуществляют покачивая сито в воде, следя за тем, чтобы она не
перехлестнула через бортики. Таким образом, вымывают личинок из
грунта и из домиков. Пинцетом аккуратно выбирают личинок в емкость с
водой. Такую промывку нужно повторить 2-3 раза. Остатки грунта
скидывают обратно в водоем.
В лаборатории.
В лаборатории личинок еще раз промывают, помещают в емкость с
отстоянной водой, дают личинкам отдохнуть и приступают к работе.
Индивидуальный рабочий стол содержит следующие компоненты:
бинокулярный микроскоп, рабочий журнал, планшетка для препаратов,
предметные и покровные стекла, маленькая чашка Петри для работы с
фиксированным материалом, стекло с лункой для окрашивания, фильтровальная бумага, банка с водой для использованной фильтровальной
бумаги, пипетка, большой и маленький пинцеты, капельницы с реактивами. Из реактивов мы используем: физиологический раствор для
насекомых, 70% этиловый спирт, фиксатор — смесь 96 % этилового спирта
и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1, краситель ацет-орсеин,
45% раствор уксусной кислоты и 50% раствор молочной кислоты.
Главный рабочий инструмент — это препаровальные иглы. От их
состояния зависит успешность и комфорт вашей работы. Иглы должны
быть правильно заточены. Для сравнения две иглы: тупая – неправильно
заточенная внизу, и острая – правильно заточенная вверху.
Для правильной заточки необходим двусторонний брусок для заточки
металлических предметов. Иглу берут за основание большим и средним
пальцами, а указательным пальцем прижимают плашмя к крупнозернистой стороне точильного бруска и водят по этой поверхности однов4
ременно вращая иглу вдоль ее оси. Повторяют 50-100 движений, периодически контролируя процесс заточки под бинокуляром. Когда иглу
достаточно наточили, брусок переворачивают на мелкозернистую сторону
и таким же образом правят иглу, убирая шероховатости, оставшиеся после
заточки иглы на грубой стороне бруска. Игла готова и можно приступать к
работе.
Часть 2. Морфология личинок хирономид.
Для приготовления препаратов используют как живых, так и заранее
фиксированных личинок. Методы работы с живыми и фиксированными
личинками различаются. Прежде мы познакомимся с объектом нашего
исследования.
Живые личинки большинства видов родов трибы Chironomini ярко
красные, благодаря наличию в гемолимфе гемоглобина. При фиксации
этот белок разрушается, и личинки становятся бледно-желтыми.
Личинки хирономид имеют хорошо выраженную головную капсулу и
сегментированное тело, состоящее из трех грудных и десяти брюшных
сегментов.
Под головой на первом грудном сегменте расположены передние
подталкиватели, а на последнем брюшной сегменте расположены задние
подталкиватели или ложноножки, снабженные крючками. Над ними
расположены анальные кисточки. Для опознания личинок в основном
используют детали строения головной капсулы и придатков тела.
У некоторых видов на VII брюшном сегменте могут быть развиты
латеральные отростки. На VIII брюшном сегменте могут присутствовать
одна или две пары вентральных отростков. Эти отростки сильно различаются по длине у разных видов и родов, либо могут вовсе отсутствовать.
Личинки разных видов различаются размерами, однако только размер
не может служить четким видовым признаком, так как в процессе
развития особи её размеры меняются. Для изучения политенных хромосом
5
используют личинок четвертого возраста. Морфология дисков политенных хромосом зависит от фазы развития. В связи с этим была разработана
система определения фазы развития личинки по степени развития
имагинальных дичков в грудных сегментах личинки, а весь четвертый
возраст, включая стадию предкуколки, был условно разделен на девять
фаз.
На только что фиксированной личинке хорошо видны имагинальные
диски, расположенные непосредственно под кутикулой. В данном случае
представлена личинка на третей фазе развития.
Наиболее точно определить род исследуемой личинки хирономиды
можно по деталям строения головной капсулы.
Личинки рода Chironomus очень вариабельны по размерам. Отметим,
что самые крупные личинки в семействе Chironomidae – до 2,5 см –
относятся именно к этому роду. Латеральные и вентральные отростки у
личинок этого рода варьируют по размерам у разных видов, а у некоторых
видов могут отсутствовать. Головная капсула у личинок этого рода
каплевидной формы, на вентральной стороне часто можно наблюдать
интенсивное окрашивание. У личинок вдов рода Chironomus ментум
окрашен и имеет острый тройной центральный зубец. Вентроментальные
пластинки короткие и закругленные. Мандибулы характерной формы.
Для подрода Camptochironimus из рода Chironomus характерны
личинки крупных размеров. Имеются латеральные отростки. Вентральные
отростки длинные, часто завитые. Головная капсула с характерной темной
полосой
на
фронтальном
склерите.
Центральный
зубец
ментума
закругленный.
Для рода Lipiniella характерны личинки средних размеров до 1,5 см без
латеральных отростков. Вентральные отростки могут быть полностью
редуцированы либо в наличии может быть одна пара очень коротких.
Личинки этого рода имеют уплощенную головную капсулу, ширина у
6
которой больше длины. Ментум с двойным центральным зубцом, вентроментальные пластинки тонкие и вытянутые.
Для рода Gliptotendipes характерны личинки мелких и средних
размеров с одной парой вентральных отростков лил без них. Головная
капсула личинок этого рода характерной овально-прямоугольной формы,
часто интенсивно окрашенная со всех сторон. На боковых сторонах головы
имеются характерные угловые утолщения. Центральный зубец ментума
одинарный и закругленный. Вентроментальные пластинки вытянутые.
Для рода Stictochironomus характерны личинки мелкого размера до 1
см. Ментум с многочисленными тупыми зубцами, центральные зубцы
двойные. Вентроментальные пластинки вытянутые, мандибулы характерной формы.
Для рода Criptochironomus в основном характерны личинки мелких и
средних размеров до 1,5 см. Форма тела часто веретеновидная. Головная
капсула вытянутой формы. Ментум часто с характерным бесцветным
центральным участком и окрашенными краевыми зубцами. Вентроментальные пластинки вытянутые. Мандибулы характерной формы.
Часть 3. Внутренне строение личинок хирономид.
Многие ткани личинок хирономид являются полиплоидными, в их
ядрах содержатся политенные хромосомы. Самый высокий уровень политении наблюдается в ядрах клеток слюнных желез. Именно эти хромосомы
используют для кариологического анализа. Для извлечения слюнных
желез и других внутренних органов необходимо правильно вскрыть
личинку.
Вскрытие живой личинки.
Если мы работаем с живой личинкой, прежде всего ее необходимо
обсушить на фильтровальной бумаге. Так мы понизим ее активность.
Затем переносят личинку на предметное стекло и работают под
бинокуляром на общем увеличении в 16 раз.
7
Придерживая личинку одной иглой, другой точным и резким
движением отсекают головную капсулу для быстрого умерщвления
личинки. При удачном отделении головы, слюнные железы выпадают из
тела наружу с вытекающей гемолимфой. Если это не произошло, то
иголкой можно осторожно выдавить содержимое грудных сегментов. В
процессе работы можно покапать физиологический раствор для клеток
насекомых, для того чтобы выделяемые органы не подсохли.
Если необходимо выделить все органы, то следом нужно отрезать
последний брюшной сегмент и осторожно вытащить кишечник через
передний разрез.
Вскрытие фиксированной личинки.
При работе с фиксированным материалом в маленькую чашку Петри
наливают немного 70% спирта, помещают туда личинку. Если необходимо
извлечь для исследования все органы животного, то личинку следует
вскрывать с головы, чтобы их не повредить.
Придерживая личинку одной иглой, вторую иглу вводят под кутикулу
и вспарывают ее изнутри по спиной стороне личинки, аккуратно
продвигаясь небольшими шагами до последнего брюшного сегмента.
Извлекают кишечник, желудок, слюнные железы. Пищевод аккуратно
выделяют вместе с головой. На пищеводе сразу за головой хорошо видно
кольцо — это надглоточный и подглоточный нервные ганглии.
Далее извлекают задние отделы кишечника, аккуратно отрезав его в
районе последнего брюшного сегмента.
На границе средней и тонкой кишки в виде тонких нитей отходят
Мальпигиевы сосуды.
Часть 4. Работа со слюнными железами личинок хирономид.
Наибольший интерес для экспериментатора представляют слюнные
железы личинок хирономид благодаря наличию в них хромосом высокой
8
степени политении.
Работа с живым материалом.
Придерживая личинку одной иглой, резко отсекают головную капсулу
второй иглой. Осторожно выдавливают содержимое грудных сегментов,
выбираем железы. У живой личинки слюнные железы прозрачные. Далее в
зависимости от методологии железы фиксируют и красят.
Окрашивание слюнных желез нейтральным красным.
Морфологию слюнной железы лучше всего рассматривать
на
прижизненных препаратах, окрашенных нейтральным красным.
Извлеченные из живой личинки слюнные железы помещают в каплю
красителя, разведенного на физиологическом растворе, и накрывают покровным стеклом. Степень окрашивания контролируют под микроскопом,
так как она меняется со временем. Нейтральный красный используют для
неспецифического окрашивания живых клеток, так как его водный
раствор в малых концентрациях не вызывает гибели клеток и позволяет
окрашивать некоторые клеточные структуры.
На данном препарате можно хорошо видеть границы клеток. Перемещая фокус микроскопа вглубь клетки видна цитоплазма, в кортикальном слое видны лизосомы. Четко выявляется граница ядра, в котором
видны политенные хромосомы с характерной исчерченностью и ядрышко
Работа с фиксированным материалом.
Чаще экспериментатору приходится иметь дело с фиксированным
материалом. Для выделения слюнных желез личинку помещают в маленькую чашку Петри с 70% спиртом. Одной иглой придерживая личинку,
другой аккуратно прокалывают кутикулу за грудными сегментами и
вспарывют личинку по направлению к голове, так чтобы не повредить
внутренности. Раздвигают кутикулу и достают слюнные железы.
Слюнные железы – орган парный, поэтому необходимо извлечь две
целые железы.
9
Окрашивание слюнных желез ацет-орсеином.
Для общего анализа используют препараты, окрашенные ацет-орсеином.
В стекло с лункой капают немного красителя. Если краситель не отфильтровали перед работой или он долго стоял, то возможно выпадение
кристаллов орсеина в осадок.
Переносят выделенные фиксированные железы в лунку. Они должны
быть полностью покрыты красителем. Оставляют железы красится на 1520 минут, контролируя степень окрашивания под бинокуляром. Железы
должны быть хорошо прокрашены!
На чистое заранее подписанное предметное стекло капают 45%
уксусную кислоту. Вынимают иглами слюнные железы из красителя и
переносят их в каплю уксусной кислоты. Отмывают железы от лишней
краски и крупинок орсеина, прополаскивая их в кислоте. Небольшим
кусочком фильтровальной бумаги оттягивают уксусную кислоту и
убирают мусор. Важно не касаться железы, чтобы железа не прилипла к
фильтровальной бумаге. Быстро капают 50% молочную кислоту, не
позволяя железе подсохнуть. У хорошо прокрашенной железы видны
клетки, в них ядра с хромосомами, а в центре – студенистое вещество –
секрет.
При изготовлении качественного препарата очень важно полностью
удалить секрет. Оставшийся на стекле секрет будет мешать плотному
прилеганию покровного стекла к предметному, и хромосомы не
расправятся.
Чтобы отделить клетки от секрета, одной иглой придерживают секрет,
а второй иглой отделяют клетки. Студенистый остаток подцепляют
иглами и убирают с препарата.
Те же манипуляции проделывают и со второй железой.
В результате на стекле остаются только клетки, которые необходимо
10
собрать ближе друг к другу в центре стекла, распределив их равномерно в
капле молочной кислоты.
Препарат
накрывают
покровным
стеклом.
Для
этого
чистое
покровное стекло берут за края, ни в коем случае не касаясь самой
поверхности, подставляют препаровальную иглу, чтобы аккуратно
опустить стекло. Стекло не бросать, иначе появятся пузыри, а клетки
могут оказаться за границей стекла.
Затем берут два слоя фильтровальной бумаги, несколько большей по
размеру, чем покровное стекло, осторожно накрывают покровное стекло и
убирают излишки кислоты. Фильтровальную бумагу нужно придерживать
так, чтобы она не смещалась относительно препарата и покровное стекло
под ней не сдвигалось.
На готовом препарате область, где расположены клетки, выглядит как
розовая дымка.
Так выглядит качественно сделанный препарат в микроскоп.
Препарат считается пригодным для анализа, если на нем есть несколько
хорошо лежащих кариотипов.
Часть 5. Приготовление препаратов из других внутренних органов
личинок хирономид.
Почти все органы личинок хирономид полиплоидны, исключение
составляют гонады, нервные ганглии и имагинальные диски. Именно эти
органы используют для приготовления препаратов метафазных хромосом
мейотически или митотически делящихся клеток.
Имагинальные диски.
Имагинальные диски расположены непосредственно под кутикулой.
Выделяем имагинальные диски из грудных отделов, там они наиболее
крупные. Так выглядит одиночный диск.
Окрашивание по стандартной ацет-орсеиновой методике, но красить
следует дольше 30-60 минут, прикрыв лунку покровным стеклом.
11
Окрашенный материал хорошо отмывают в уксусной кислоте. Так диск
выглядит после окрашивания. Для приготовления препарата окрашенные
имагинальные диски помещают в каплю молочной кислоты, накрывают
покровным стеклом и хорошо, с силой, раздавливают. В идеале желательно
получить монослой клеток, но это не всегда обязательно.
Нервный ганглий.
Так выглядит препарированный нервный окологлоточный ганглий.
Его можно выделить вместе с куском пищевода, чтобы не повредить и не
потерять. После окрашивания пищевод нужно убрать. Окрашивают
ганглий по стандартной методике в ацет-орсеине 30-40 минут.
После окрашивания важно хорошо отмыть ганглий в уксусной кислоте
от осадка красителя. Затем его помещают в каплю молочной кислоты,
накрывают покровным стеклом и раздавливают. Давить ганглий нужно
достаточно сильно сильно.
Желудок и кишечник.
Желудок и кишечник удобнее препарировать вместе. Морфологически
они хорошо различимы. Так выглядит желудок, а это кишечник.
Окрашивание проводят по стандартной методике.
Так выглядят окрашенные органы. Даже на таком увеличении видно,
что клетки желудка крупнее, чем клетки кишечника.
Мальпигиевы сосуды.
Мальпигиевы сосуды отходят от кишечника на границе средней и
тонкой кишки. Они выглядят как тонкие длинные трубочки. Когда их
выделяют из фиксированной личинки, они довольно хрупкие и легко
ломаются, поэтому выделять их удобнее с частью кишечника.
Мальпигиевы сосуды окрашивают ацет-орсеином по стандартной
методике 20-30 минут. Для приготовления качественного препарата,
нужно отделить Мальпигиевы сосуды от кишечника. Кишечник удалить, а
сосуды накрыть покровным стеклом и раздавить также как при приго12
товлении препаратов политенных хромосом из слюнных желез.
Окрашенные трубочки выглядят как бусы из-за крупных полиплоидных ядер. Политенные хромосомы из клеток Мальпигиевых сосудов имеют
более низкую степень политении, чем хромосомы из клеток слюнных
желез.
На этом мы заканчиваем знакомство с основными методами работы с
личинками хирономид. Этот опыт может быть с успехом перенесен и на
других личинок двукрылых насекомых. Удачи.
13