иммуноферментная индикация антител против вируса чумы

ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ИНДИКАЦИЯ АНТИТЕЛ ПРОТИВ
ВИРУСА ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ
Сагдеев Д.И., Равилов Р.Х.
Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана
Герасимов В.В.
Республиканский центр профилактики и борьбы со СПИД и ИБ Минздрава
РТ
Введение. Проблема быстрой и точной диагностики заболеваний
мелких домашних животных является весьма актуальной. Значительный
полиморфизм клинических проявлений при чуме плотоядных и преобладание
в последнее время абортивных, стертых и латентных форм этой инфекции
над клинически выраженными исключают возможность постановки диагноза
только на основании клинической картины, в связи с этим возрастает роль
лабораторных исследований, включающих и иммунологические методы.
В настоящее время наиболее перспективным методом выявления
специфических антител является иммуноферментный анализ. Метод
отличается высокой специфичностью, превышающую в несколько раз
рутинные методы диагностики инфекционных болезней. Антитела в ИФА
определяются в первые 2-3 дня и отслеживаются в организме на протяжении
10-12 месяцев после взаимодействия с антигеном. К преимуществам ИФА
относят
также:
экспрессность,
возможность
исследовать
антикомплементарные сыворотки, воспроизводимость, простота постановки
реакции и учета ее результатов, стабильность регентов при хранении,
автоматизация некоторых операций и т.д. Эти преференции позволяют с
успехом использовать этот тест и в ветеринарной практике. Применение
иммуноферментного метода ветеринарными специалистами во многом
сдерживается отсутствием в достаточном количестве необходимых
диагностических наборов.
Исходя из вышеизложенного перед нами стояла задача разработать
иммуноферментную тест-систему для индикации антител против вируса
чумы плотоядных в сыворотках крови собак.
Материалы и методы исследований. При конструировании наборов
для диагностики инфекционных заболеваний в ИФА главным моментом
является подготовка антигена. Он должен хорошо адсорбироваться на
твердой фазе (полистирол и др.), с высокой чувствительностью выявлять
антитела и не вызывать ложноположительных реакций. Для этого в первую
очередь необходимо максимально очистить микроорганизмы от питательной
среды (бактерии) или клеточного дебриса (вирусы). В ИФА чаще всего
используют антигены, полученные путем лизиса микроорганизмов. Для
разрушения микробных клеток используют обработку детергентами (тритон
Х-100, додецилсульфат и дезоксихолат натрия и т.п.), ультразвук,
автоклавирование и др.
В своей работе мы использовали антигены, изготовленные путем
лизиса культур вируса чумы плотоядных (штамм ЭПМ).
ИФА выполняли по непрямому методу, на микротитрационных
планшетах из полистирола отечественных, изготовленных на ПО ВНИИ
медицинской техники (г. Москва). В качестве конъюгата использовали белок
А, меченный пероксидазой хрена. В модельных опытах антиген на планшеты
наносили в различных концентрациях от 5 до 15 мг/мл. Исследуемые
сыворотки разводили в соотношении 1:100.
Результаты учитывали визуально по интенсивности окрашивания и
инструментально на фотометрах фирмы Titerter модификации Multiskan при
длине световой волны 492 нм, измеряя оптическую плотность (ОП) цветной
реакции ферментзависимой метки с субстратом. Для каждой пробы
определяли коэффициент специфичности, т.е. отношение ОП в лунках с
исследуемой сывороткой к ОП в лунках с отрицательным контролем.
Результаты подлежали оценке и анализу, если в контроле конъюгата среднее
значение ОП составлял не более 0,100, а в отрицательном контроле – не
превышала 0,150 оптической единицы (о.е.). Пробу считали положительной,
если ОП в лунках с исследуемой сывороткой не менее чем в 2 раза
превышало ОП отрицательного контроля. ОП положительного контроля при
этом должно быть не ниже 0,8 о.е.
Позитивные сыворотки получали путем иммунизации собак и кошек
возбудителем хламидиоза. Негативные сыворотки подбирали из числа проб
полученных от неиммунных животных.
При изготовлении антигена культуру вируса обрабатывали сначала 1%ным раствором дезоксихолата натрия в течение 30-40 минут, а затем
ультразвуком в течение 30 секунд. Полученный лизат центрифугировали на
градиенте сахарозы от 5 до 55% (с шагом 5%) в течение 6 часов при 100 000g.
Антигенные фракции, полученные после центрифугирования,
испытывали в ИФА с положительными и отрицательными контрольными
сыворотками. Анализ полученных результатов свидетельствовал, что
наибольшую активность имела антигенная фракция, извлеченная из 20%-ной
ступени сахарозного градиента. Коэффициент ее специфичности при
концентрации белка 6 мг/мл составила 9,8.
Для испытания разработанной тест-системы мы провели исследование
24 сывороток крови, полученных от собак, иммунизированных
противочумной вакциной (Мультикан 4 , НАРВАК). Кровь для исследований
брали до иммунизации и затем каждую неделю, т.е. через 1, 2, 3 и 4 недели
после введения вакцины.
Результаты
исследований.
При
изучении
сероконверсии
противочумных антител в сыворотках крови собак были получены данные,
которые представлены на рисунке 1.
ОП
3
2,5
2
1,5
1
0,5
до иммунизации
через 2 недели
Рис. 1. Выявление специфических антител против чумы плотоядных в
сыворотках крови вакцинированных собак иммуноферментным
методом.
Динамика средних значений уровня токсоплазменных антител в
сыворотках крови по всей группе иммунизированных кошек представлена на
рисунке 2.
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
Среднее значение по группе собак
0
до иммунизации
через 1 неделю
через 2 недели
через 3 недели
через 4 недели
Рис. 2. Динамика специфических антител против чумы плотоядных
в сыворотках крови вакцинированных собак
(ИФА, средние значения ОП по всей группе животных).
В результате исследований установлено, что у животных отмечалась
различная реакция на введение вакцины, которая зависела, в том числе и от
начального (до иммунизации) уровня антител. Полученные данные требуют
анализа, исследования в этом направлении будут продолжены
Заключение. Наши исследования позволили подобрать эффективные
режимы очистки и лизиса антигенов вируса чумы плотоядных при
конструировании иммуноферментных тест-систем и установили пригодность
иммуноферментного анализа для анализа иммунного статуса собак при
иммунизации против данного заболевания.