ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОССИЙСКИЙ ЦЕНТР СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (125284 Москва, ул. Поликарпова, д. 12/13) ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ «РЕСПУБЛИКАНСКОЕ БЮРО СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН (420029 Казань, ул. Сибирский тракт, 31 а) «Утверждаю» И.о. директора ФГБУ «РЦСМЭ» Минздравсоцразвития России, доктор медицинских наук __ А.В. Ковалев 29 марта 2012 г. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОТИПОВ ГАПТОГЛОБИНА В ЖИДКОЙ КРОВИ И В ПЯТНАХ КРОВИ МЕТОДОМ ВЕРТИКАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ (Методические рекомендации) Москва 2012 Авторы: Эксперт ГАУЗ РБСМЭ МЗ РТ С.В. Снульник; заведующий отделением судебно-биологических экспертиз ФГБУ РЦСМЭ Минздравсоцразвития России, кандидат медицинских наук А. А. Гусаров; заведующая судебнобиологическим отделением ГАУЗ РБСМЭ МЗ РТ М.В. Перельман. ВВЕДЕНИЕ В настоящее время, дифференцирование крови (жидкой и в пятнах) по системе гаптоглобина (Нр), имеющей большое информативное значение, несмотря на наличие специального оборудования и необходимых реактивов, производится только в Аннотация Предлагаемый вариант метода вертикального электрофореза в полиакриламидном геле позволяет доказательно и наглядно устанавливать фенотипы гаптоглобина в жидкой крови и пятнах крови на вещественных доказательствах с целью определения возможности происхождения исследуемой крови от проходящих по делу лиц, что имеет особенно важное значение при их совпадении по другим, традиционно исследуемым группам и системам крови: АВО, МК8$. Рр, Юг. Для исследования жидкой крови достаточно 5-30 мкл сыворотки, для исследования пятен крови достаточно 20-80 мкл вытяжки. Методические рекомендации предназначены для использования врачами судебно-медицинскими экспертами судебно-биологических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы. 36 из 89 судебно-биологических отделений бюро судебно- Рецензенты: Е.Х. Баринов - зав. учебной частью кафедры судебной медицины и права ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития РФ, к.м.н., доцент, профессор РАЕ В.А. Калянов - и.о. зав. кафедрой судебной медицины ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития РФ первую очередь, изонормальных и героиммунных сывороток, Рекомендовано к изданию Ученым советом ФГБУ «РЦСМЭ» Минздравсоцразвития России (протокол № 2 от 29.03.2012г.). медицинской экспертизы (БСМЭ) Российской Федерации. Между тем, фенотипы белковой системы гаптоглобина являются ценным источником информации при групповой идентификации пятен крови на вещественных доказательствах. Особенное значение диагностика фенотипов гаптоглобина приобретает в случаях, когда проходящие по делу лица имеют одинаковую группу крови по системе АВО. Необходимость дифференцирования жидкой крови и следов крови на вещественных доказательствах по системе гаптоглобина становится как никогда актуальной в условиях снижения качества и дефицита отдельных иммунореагентов, в необходимых для производства судебно-биологических экспертиз и исследований. У людей различают три типа гаптоглобина, которые имеют разную электрофоретическую подвижность молекулярный вес: Нр 1 -1, Нр 2-1, Нр 2-2. Частота и встречаемости фенотипов гаптоглобина у взрослого населения следующая: тип Нр 1-1 - 11%, тип Нр 2-1 - 51%, тип Нр 2-2 - 3) Для формирования ПААГ используют стекла размерами 10x20 см. 4) Используют две гребенки с 20-ю зубцами, что 38%. Методы, предлагаемые для этой цели, прошли определённую фазу развития: от техники на агаровом и позволило одновременно исследовать 40 жидких образцов крови или вытяжек из пятен крови. крахмальном геле [1, 2], до методики проведения электрофореза в полиакриламидном геле [3,4,5]. 5) В процессе пробоподготовки очистку вытяжек из пятен крови проводят хлороформом вместе с предметом-носителем. Определение фенотипов гаптоглобина Нр в судебно- 6) Определение фенотипов гаптоглобина в образцах биологических отделениях БСМЭ РФ в настоящее время жидкой и гемолизированной крови проводят в двухслойном производится по модификациям методик, разработанным в полиакриламидном геле, одновременно с вытяжками из пятен конце 1990-х - начале 2000-х годов [6, 7]. крови. Нами были разработаны методические рекомендации по 7) Для эффективного заполнения карманов ПААГ определению фенотипов гаптоглобина в жидкой крови и в сыворотку жидкой крови замораживают и хранят необходимое пятнах время до начала исследования. методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), с внесением ряда существенных изменений в существующие методики, что позволило повысить её доказательность. 8) Герметизацию камеры проводят отрезками фильтровальной бумаги с применением состава нижнего геля. 9) При приготовлении проявляющего раствора бензидин растворяют в ледяной уксусной кислоте. Усовершенствования метода заключаются в следующем: Изменения в методике, позволили значительно 1) Определение фенотипов Нр проводится в ПААГ уменьшить расход реагентов, сократить время проведения толщиной 1 мм (в ранее опубликованных методиках описано исследований, добиться стабильной четкости результатов и определение фенотипов Нр в ПААГ толщиной 2 или 3 мм). большой производительности при определении фенотипов Нр. 2) Уменьшена плотность нижнего ПААГ с 8% до 6,6% и верхнего слоя ПААГ с 4,5 % до 3,4 %. На указанный метод определения фенотипов Нр оформлено рационализаторское предложение №2002/62 от 15.12.2006 года, выданное Казанским государственным медицинским университетом. Разработанный метод - при отсутствии образцов крови потерпевшего либо обвиняемого; по чувствительности и - при исследовании гнилостно измененных образцов специфичности не уступает вариантам методов горизонтального крови, мышечной ткани и пятен крови на вещественных электрофореза, применяемым за рубежом для определения доказательствах; фенотипов гаптоглобина [8-10] и выгодно отличается от них большой экономичностью и использованием отечественных реагентов. - для дифференцирования «смешанных» пятен крови нескольких лиц; - при исследовании «смешанных» пятен (кровь + выделения), поскольку Нр определяется лишь в крови, а в выделениях его не устанавливают; Методика определения фенотипов гаптоглобина Нр - для дифференцирования крови человека в следах с методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле может быть использована при судебно-медицинском исследовании вещественных доказательств, - для дифференцирования крови взрослого человека и для дифференцирования жидкой крови, следов крови, «смешанных» следов крови и выделений в следующих случаях: - при одногруппности образцов крови по системе АВО; - при получении нечётких результатов при определении группы крови по системе АВО; - при решении вопроса о возможной примеси в пятнах крови лица группы Оар; - при решении вопроса о возможности происхождения крови от одного лица труппы АВо, либо нескольких лиц с различным сочетанием групповых свойств А и В; примесью крови животных; новорожденного, поскольку у новорожденных Нр практически не определяется; - при влиянии предметов-носителей на результаты по системе АВО; - при отсутствии контролен предметов-носителей. В результате дифференцирования пятен крови по системе (Нр) значительно повышается доказательность экспертизы вещественных доказательств. в 2 мл ледяной уксусной кислоты, затем добавить 10% уксусную МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ Используют оборудование и реактивы, стандартные для судебно-биологических отделений бюро судебно-медицинской экспертизы. кислоту. 7.7.5. 75% раствор сахарозы на электродном буфере: сахароза 1,5 г, дистиллированная вода до 10 мл. Хранить при температуре + 4-6°С. ОПИСАНИЕ 7.7.6. Раствор гемоглобина: у донора с типом НР 1-1 Определение фенотипов гаптоглобина в жидкой крови и пятнах крови методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле проводят в двухслойном ПААГ. 1 этап. Приготовление растворов. 7.7.7. Электродный трис-глициновый буфер: трис 1,5 г, глицин 12 г, дистиллированная вода 3 литра. Хранить при комнатной температуре. взять 1,5 мл крови, отмыть физиологическим раствором 7 раз. Тщательно убрать физиологический раствор и добавить 2 мл дистиллированной воды. Хранить в замороженном состоянии. 2 этап. Подготовка прибора (аппарата для электрофореза) к работе, формирование ПААГ на 40 исследуемых объектов. 2.7.7. Сборка гелевой ячейки: используют 4 стекла 1.1.2. Полимер «Акрис»: акриламид 150 г, бисакриламид размерами 10x20 см (два прямоугольных и два с вырезом). С 5 г, дистиллированная вода 0,5 литра. Раствор профильтровать, внутренней стороны камеры устанавливают стекла с вырезом. хранить в темной бутыли при температуре + 4-6°С. Между стеклами вставляют «спейсеры» толщиной 1 мм, а с 1.1.3. Полимер «Трис НС 1»-гелевый раствор: трис 72,6 г, нижней стороны стекол вставляют сложенный в 4 слоя отрезок ТЭМЭД-0,92 мл, концентрированная соляная кислота - 5мл, фильтровальной бумаги шириной 2-3 см, с выступающим дистиллированная вода до 200 мл. Хранить в темной бутыли при свободным краем длиной 0,5-1 см. Стекла со спейсерами и температуре + 4~6°С. фильтровальной 1.1.4. Раствор для окраски гелевых пластин: бензидин бумагой вниз у крепят к камере прилагающимися зажимами. 50 мг, 10% уксусная кислота 120 мл, пергидроль 10 капель. 2.7.2. Приготовление нижнего разделительного 6,6% Готовить непосредственно перед окраской. Бензидин растворить геля: «Акрис» 7,2 мл, трис 4,8 мл, дистилированная вода 18 мл. 11 10 Компоненты смешивают, используют для герметизации камеры и формирования нижнего геля. 3 этап. Приготовление вытяжек из пятен крови, подготовка жидкой крови 2.7.3 Герметизация камеры: камеру устанавливают под В зависимости от насыщенности и давности пятен крови углом 30-45°. К 10 мл смеси нижнего геля добавляют 20 мг вырезают участки размерами от 0,3x0,3 см до 3x3 см, можно персульфата аммония. После растворения персульфата аммония исследовать соскобы и смывы. Экстрагирование проводят 15% раствор быстро вносят на внутренний край фильтровальной раствором сахарозы 18-24 часа в условиях холодильника в бумаги. После полимеризации образуется ПААГ высотой от 0,5 пробирках «эппендорф» объемом 1,8 мл. После экстрагирования до 1 см, надежно герметизирующий камеру. в пробирки вместе с предметом носителем вносят хлороформ в Камеру устанавливают вертикально, вставляют «гребенку» соотношении 1:1. Содержимое перемешивают до появления толщиной 1 мм с 20 зубцами и ниже на 0,5-2 см от зубцов твердой пены. Пробирки центрифугируют 20 мин при делают отметку. Гребенки убирают, к оставшемуся объему для 4000 об/мин. Верхний слой служит для исследования. Если нижнего геля добавляют 60 мг персульфата аммония. После вытяжка бесцветная добавляют 10 мкл гемоглобина. В карманы растворения персульфата аммония, раствор быстро вносят на вносят 60-80 мкл вытяжки. Внесение хлороформа в пробирки к герметизирующий слой ПААГ. Сверху наносят 5-10 мл вытяжкам с предметом-носителем позволяет эффективнее дистиллированной воды для выравнивания свободного края извлекать сыворотку из пятна крови, сократить время ПААГ. После окончания полимеризации воду сливают. приготовления вытяжек. В первый и последний карманы 2.1.4. Приготовление верхнего концентрирующего 3,4% следует вносить вытяжки из заведомых образцов крови. геля. «Акрис» 1,4 мл, трис 1,2 мл, дистиллированная вода 8 мл, После центрифугирования жидкой крови отделяют персульфат аммония 20 мг, перемешивают, вносят в камеру и сыворотку, если сыворотка бесцветная, то добавляют 10 мкл вставляют гребенки. После окончания полимеризации камеру гемоглобина. Исследование проводят одновременно с заполняют буферным раствором. вытяжками из пятен крови в двухслойном ПААГ. Необходимо Если разгонку необходимо проводить в одной гелевой помнить, что для полного заполнения 20 или 40 карманов ячейке (20 исследований), то объемы верхнего и нижнего ПААГ образцы сыворотки жидкой крови можно накапливать, для этого уменьшают в 2 раза. их замораживают при температуре - 20° С и хранят необходимое 13 12 время до исследования. Гемолизированную и загнившую кровь НЬ. Фенотипы Нр 2-1 и 2-2 имеют многочисленные фракции с сначала центрифугируют 10 мин при 4000 об/мин. К 1 мл разной электрофоретической подвижностью. Гомозиготный верхнего слоя добавляют 1 мл дистиллированной воды, фенотип Нр 2-2 не представлен отдельным компонентом. перемешивают. Берут 100 мкл смеси, добавляют 10 мкл 60% Фракций в фенотипе Нр 2-2 при разных условиях разделения сахарозы, обрабатывают хлороформом и вносят в карман ПААГ может быть до 10, а в фенотипе Нр 2-1 - более 10. Группы в количестве 80 мкл. (фенотипы) Нр крови определяют путем сопоставления уровней расположения фракций исследуемых и контрольных образцов 4 этап. Проведение электрофореза (рис. 1.). Входной электрофорез проводят при напряжении 200 В и силе тока 50 мА 30 мин, затем при напряжении 300 В и силе тока 80-100 мА 2-3 часа. Электрофорез завершают после перемещения фронта гемоглобина на 5 см от старта. 5 этап. Окраска гелевых пластин ПААГ Из прибора сливают буферный раствор, разбирают гелевые ячейки, извлекают пластины ПААГ, отрезают нижний край и метят его, отрезая углы ПААГ. Пластины ПААГ помещают в проявляющий раствор на 20 минут. Затем добавляют 8—10 капель пергидроля. Учет результатов проводят в течение часа. Рис. 1. Фенотипы гаптоглобина; 1— 1-1; 2 — 2-1; 3 — 2-2; 4 — НЬ 6 этап. Учет результатов. На фореграмме выявляют зоны Нр. Фенотип Нр 1-1 представлен единичной ярко выраженной, плотной фракцией. Он располагается над полосой 14 15 ЛИТЕРАТУРА ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДА Предлагаемый способ определения фенотипов Нр в жидкой крови и пятнах крови методом вертикального 1. Старостин Н.Н. Приготовление геля для электрофореза в полиакриламидном геле толщиной 1 мм электрофоретического определения типов гаптоглобина // Суд. - апробирован на заведомых образцах крови в жидком виде и в мед. эксперт. - 1972. -№3. - С. 44-46. пятнах. 2. Николенко О.В. К определению типов гаптоглобина в По сравнению с ранее применяемыми методиками по пятнах крови // Суд. - мед. эксперт. - 1972. - №2. - С. 31-33. определению фенотипов Нр, данный метод обладает рядом существенных преимуществ: 1. 3. Старостин Н.Н. Определение групп гаптоглобина дискэлектрофорезом в акриаламидном Высокая чувствительность и специфичность в эксперт. - 1974. - №3. - С. 21-22. сочетании с объективной регистрацией и возможностью фотографирования результатов позволяет иллюстрировать 4. Николенко О.В. К определению групп гаптоглобина в пятнах крови // Суд. - мед. эксперт. заключения экспертов. 2. Высокая геле// Суд. - мед. 1975. - №1. - С. 39-40. 5. Свирский М.С. Определение фракций гемоглобина и технологичность метода позволяет гаптоглобина при исследовании пятен крови методом одновременно исследовать в двухслойном ПААГ образцы электрофореза в вертикальных пластинах полиакриламидного жидкой крови и пятна крови. геля // Суд. - мед. эксперт. 3. Высокая производительность метода обеспечивает определение фенотипов Нр в 40 объектах одновременно. 4. Высокая экономичность метода, связанная 1981. - №1. - С. 33-36. 6. Барсегянц Л. О. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств (кровь, выделения, волосы). - М. : со Медицина, 1999.-С. 106-112. значительно меньшим расходом реагентов. Данный метод был апробирован в ГАУ «Республиканское 7. Информационное медицинского эксперта письмо Минздрава Главного РФ судебно- №416/01-07 от бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ Республики 13.04.2000 г. Об определении фенотипов гаптоглобина в пятнах Татарстан» на 20000 объектах, при проведении 500 судебно- крови биологических экспертиз. полиакриламидном геле. - М., - 27 с. методом вертикального электрофореза в Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «РЦСМЭ» Минздрава России) 125284, г.Москва, ул. Поликарпова, д. 12/13 Тел.:+7 (495) 945-21-69 Тел.: +7 (495) 653-13-37 Подписано в печать 6.12.2012 г. Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура Ттез. Печ.л. 1. Тираж 200. Заказ №1306 Отпечатано в типографии ООО «Корина-офсет» 119049, Москва, ул. Б. Якиманка, 38 «А» +7(499)238-42-23 ета11: когта@гте1.ги Факс.: +7 (495) 945-00-97 Эл. почта: таП@гс-5гпе.ги, гс5те@5ис!тес1.тто