На правах рукописи КОНОНОВА Мария Сергеевна
реклама
На правах рукописи КОНОНОВА Мария Сергеевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ АДЕНОГИПОФИЗА, ЯИЧНИКОВ И МАТКИ У СВИНЕЙ В ПЕРИОД ПУБЕРТАТА 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук КУРСК – 2011 Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» Научный руководитель: заслуженный ветеринарный врач РФ, доктор биологических наук, профессор Сеин Олег Борисович Официальные оппоненты: заслуженный ветеринарный врач РФ, доктор биологических наук, профессор Безбородов Николай Васильевич доктор биологических наук, профессор Мамаев Андрей Валентинович Ведущая организация: Брянская государственная сельскохозяйственная академия Защита состоится 21 июня 2011 года в 1100 часов на заседании диссертационного совета Д 220.040.03 при ФГОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» по адресу: 305021, г. Курск, ул. К. Маркса, 70. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» Автореферат разослан и размещен на сайте Курской ГСХА, «20» мая 2011 Ученый секретарь диссертационного совета Г.Ф. Рыжкова 2 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Для современного этапа развития животноводства первоочередной задачей является увеличение производства мяса. В этом вопросе свиноводству отводится особая роль, так как именно для свиней характерно многоплодие, скороспелость и высокий выход продуктов убоя. Достижение устойчивого роста производства животноводческой продукции в сельхозпредприятиях страны и высокой рентабельности отрасли может быть обеспечено только при интенсивном использовании маточного поголовья животных в воспроизводстве. В свою очередь необходимо учитывать, что промышленное ведение свиноводства обостряет проблему взаимоотношения организма и окружающей среды, изменяет проявление эволюционно выработанных физиологических реакций животных, вызывает у них угнетение гипоталамо-гипофизарной системы, приводит к нарушению репродуктивной функции. В этой связи необходимы глубокие знания физиологии животных, факторов внутренней и внешней среды, которые в той или иной степени воздействуют на их репродуктивную функцию. Существенную роль в развитии физиологии воспроизводства свиней и регуляции их половой функции сыграла разработка новых точных методов определения гормонов. Это позволило исследователям более глубоко изучить механизмы регуляции процессов, связанных с размножением животных, а также изменить взгляды на сущность полового созревания, режим репродуктивного использования и сроки осеменения свиноматок, эмбриональную смертность и другие процессы. В то же время, несмотря на достигнутые успехи отечественных и зарубежных исследователей в области физиологии размножения животных, многие вопросы остаются малоизученными. К их числу можно отнести период пубертата – полового созревания у самок животных, в том числе и свиней. Период пубертата – это сложный генетически детерминированный процесс, в основе которого лежит перестройка функционирования гипоталамо-гипофизарно-овариального комплекса, обеспечивающая формирование качественно новых отношений между отдельными его звеньями. Данный период онтогенеза у самок характеризуется каскадом морфологических и поведенческих процессов, повышением гормональной активности яичников. При этом некоторые биологические изменения протекают дискретно и могут быть оценены количественно, а другие – менее очевидны и их оценка более сложна. Изучению физиологических основ полового созревания у свиней посвящены экспериментальные исследования многих ученых, результаты которых обсуждаются в отечественной и зарубежной литературе. Показано, что наступление полового созревания у свиней зависит от породы (Н.Н. Михайлов, 1973; R. Cherstenson, 1980), условий содержания (Ф.К. Почерняев, 1983; В.Е. Косарев и др., 1984; A.P. Prunier et al., 1984; M. Diekman, 1988 и 3 др.), уровня кормления (Р.В. Шнейдер и др., 1985; A.Henze et al., 1982; M. Etienne et al., 1983 и др.), дозированного контакта с хряком (В.С. Шипилов и др., 1988; В.А. Володин, 1987; А.Г. Нарижный, 1987; О.Б. Сеин, 1996, 2010; G. W. Dyck, 1988; A. Prunier, 1989 и др.). Многие исследователи предлагают с целью индуцирования полового созревания у свиней, использовать биологически активные препараты (Ю.Д. Клинский и др, 1977, 1991; А.Г. Скварук, 1986,1987; О.Б. Сеин, 2010 ; A.-M. Andersson et al., 1983; W. Heider et. al. 1986 и др.). В то же время имеются работы, в которых указывается о нежелательном использовании гормональной стимуляции полового созревания у ремонтных свинок. Исходя из вышеизложенного можно сделать заключение, что период пубертата у свиней требует дальнейшего углубленного изучения. В свою очередь это позволит разработать рекомендации по выращиванию ремонтных свинок и своевременному их включению в воспроизводительный процесс. Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение морфофункциональных особенностей аденогипофиза, яичников и матки у ремонтных свинок крупной белой породы в период пубертата, а также совершенствование способов биологической стимуляции у них половой функции. Для достижения поставленной цели были поставлены на разрешение следующие задачи: 1. Изучить морфофункциональные особенности аденогипофиза и яичников у ремонтных свинок в период пубертата. 2. Выявить морфологические особенности матки у ремонтных свинок во время формирования половой функции. 3. Установить связь морфологических изменений в яичниках и матке с морфофункциональным состоянием аденогипофиза свинок в период пубертата. 4. Разработать способ получения препарата натуральных половых феромонов хряка и апробировать его с целью индуцирования полового созревания у ремонтных свинок. Научная новизна. На основании комплексных исследований, проведенных на одних и тех же животных, впервые получены данные, раскрывающие морфофункциональные особенности аденогипофиза, яичников и матки у свиней крупной белой породы в период пубертата. Выявлена связь морфологических изменений в яичниках и матке свинок с морфофункциональным состоянием аденогипофиза. Определено содержание гонадотропных и овариальных гормонов в крови свинок в препубертатный и пубертатный периоды. Разработан способ получения препарата натуральных половых феромонов хряка и проведена его апробация с целью индуцирования полового созревания у ремонтных свинок. Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты научно-исследовательской работы дополняют имеющиеся данные о строении и гормональной функции гипофиза и яичников у животных, а также расширяют сведения о роли гипофизарно-овариальных связей у самок 4 млекопитающих в период пубертата. Разработанный способ получения препарата натуральных половых феромонов хряка можно использовать в производственных целях, а изготовленный препарат применять для стимуляции половой функции у свиней. Реализация результатов исследований. Препарат натуральных половых феромонов хряка, полученный по разработанной технологии, используется для стимуляции полового созревания у ремонтных свинок в свиноводческих комплексах «Троицкое» Губкинского района Белгородской области, «Магнитный» Железногорского района, АО им. Тельмана Октябрьского района Курской области. Материалы диссертационной работы и предложения производству вошли в рекомендации «В помощь фермеру. Выращивание ремонтных свинок» (Курск, 2010). Основные положения, выносимые на защиту: результаты комплексных морфологических исследований аденогипофиза, яичников и матки у свинок крупной белой породы в период пубертата; содержание гонадотропных гормонов, эстрадиола-17β и прогестерона в крови ремонтных свинок в препубертатный и пубертатный периоды; связь морфологических изменений в яичниках и матке с морфофункциональным состоянием аденогипофиза в период пубертата; новый способ получения препарата натуральных половых феромонов хряка и результаты его использования с целью стимуляции полового созревания у ремонтных свинок. Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы доложены, одобрены и рекомендованы в практику свиноводства на: - XIV международной научно-практической конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (г. Белгород, 2010); - Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию ректора ФГОУ ВПО «Ижевская ГСХА», доктора с.-х. наук, профессора А.И. Любимова (г. Ижевск, 2010); - II международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (г. Ульяновск, 2010); - Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина – теория, практика, обучение» (г. Санкт-Петербург, 2010); - Международной научно-практической конференции, посвященной 140-летию со дня рождения профессора И.И. Иванова «Обеспечение продовольственной безопасности России» (г. Курск, 2010); - Международной научно-практической конференции «Наука и инновации в сельском хозяйстве», посвященной 60-летию ФГОУ ВПО «Курская ГСХА» (г. Курск, 2010). 5 По результатам диссертационной работы опубликовано 9 научных статей, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений. Работа изложена на 136 страницах компьютерного текста, содержит 13 таблиц и 30 рисунков. 2. Материал и методы исследований Экспериментальные исследования выполнялись в период 2009–2011 гг. по прилагаемой схеме (рис.1) в межкафедральной научно-исследовательской лаборатории факультета ветеринарной медицины Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И.И. Иванова, учебноопытном хозяйстве «Знаменское», свиноводческих комплексах «Магнитный» Железногорского района Курской области и ЗАО «Троицкое» Губкинского района Белгородской области. Объектом исследований являлись ремонтные свинки крупной белой породы, которых подбирали в группы по принципу аналогов с учетом происхождения, массы тела, возраста и развития. Морфофункциональные особенности гипофиза, яичников и матки у свиней в период пубертата Гистологическая структура гипофиза, яичников и матки у свинок в препубертатный период Гормональная активность яичников у ремонтных свинок в препубертатный период Гистологическая структура гипофиза, яичников и матки у свинок в пубертатный период Гормональная активность гипофиза и яичников у свинок в пубертатный период Разработка способа получения препарата натуральных половых феромонов хряка и его производственная апробация с целью стимуляции полового созревания у ремонтных свинок Рис. 1. Общая схема исследований 6 Было выполнено две серии опытов. В первой серии опытов изучали морфологическую структуру матки, а также морфофункциональное состояние гипофизов и яичников у ремонтных свинок в период пубертата. Вторая серия опытов была посвящена разработке способа получения препарата натуральных половых феромонов хряка и его апробации с целью стимуляции полового созревания у ремонтных свинок. Все подопытные животные содержались в типовых свинарниках, параметры микроклимата которых соответствовали зоогигиеническим требованиям. Кормление свиней осуществлялось согласно нормам, рекомендованным ВИЖ. Материалом исследований являлись гипофизы, яичники, матка и кровь, которые получали у свинок с учетом возраста и физиологического состояния животных. Половую охоту у свинок определяли с использованием хряковпробников и по функциональному состоянию яичников во время контрольного убоя животных. Перед убоем свинок у них получали кровь, а после убоя извлекали из туш половые органы. Из середины рогов матки вырезали кусочки длиной 2,5– 3,0 см. Одновременно вырезали маточно-трубные сочленения и отбирали яичники. Полученный материал помещали в фиксирующий раствор (яичники и маточно-трубные сочленения фиксировали целиком). Для получения гипофизов отделенную от туловища голову животного распиливали в нескольких плоскостях с использованием электропилы. После распила черепа проводили разъединение правой его части от левой. Затем путем визуального обследования обеих частей черепа со стороны распила обнаруживали гипофиз, который извлекали из «турецкого седла» клиновидной кости пинцетом. Извлеченные гипофизы также помещали в фиксирующий раствор. Во всех случаях для фиксации использовали 10%-ный нейтральный формалин и жидкость Карнуа. После обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации отобранный материал заливали в парафин, готовили парафиновые блоки и делали гистосрезы на санном микротоме. Окраску препаратов производили гематоксилин-эозином и альдегид-фуксином. Для морфологических измерений слоев матки, размеров маточных желез и структур фолликулов в яичниках, площади гипофизарных клеток и их ядер применяли винтовой окуляр-микрометр. Наиболее характерные изменения в аденогипофизах и половых органах фотографировали с использованием микроскопа XSP-107E и цифровой фотокамеры. Определение в плазме крови гонадотропных гормонов (ФСГ, ЛГ), эстрадиола-17β и прогестерона осуществляли иммуноферментным методом. Для стимуляции полового созревания у ремонтных свинок использовали препарат натуральных половых феромонов хряка, который изготавливали из тканей и экскретов половозрелых самцов и растительного сырья, содержащего 7 стероиды, входящие в состав половых феромонов хряка. Полученные в ходе проведения эксперимента данные подвергались биометрической обработке на ПЭВМ с использованием прикладных программ. 3. Результаты исследований 3.1. Особенности морфологической структуры аденогипофиза у ремонтных свинок в период пубертата В паренхиме аденогипофиза нами были выявлены различные группы гипофизарных клеток – аденоцитов. Из ацидофильных клеток наиболее хорошо дифференцировались кортикотропоциты, которые отличались от других клеток округлой формой и относительно крупным овальным ядром. При этом ядро размещается в кор-тикотропоцитах обычно в центре клетки. Из базофилов выделялись тиреотропоциты и гонадотропоциты. Тиреотропоциты отличались неправильной полигональной формой и фиолетовой окраской. В них обнаруживалось круглое или слегка овальное светлое ядро, занимающее центральное или несколько смещенное положение в клетке. Мелкая зернистость в цитоплазме окрашивается в бледно-розовый цвет. Тиреотропоциты преимущественно располагаются в центральной зоне аденогипофиза и не контактируют с кровеносными сосудами. Гонадотропоциты имели яркую пурпурно-красную окраску. Форма этих клеток в основном была округлой, в некоторых случаях расширенной с одной стороны клетки. Отличительной особенностью для гонадотропоцитов являлось смещение ядра к одному из краев клетки. Форма ядра округлая или слегка вытянутая, в нем просматриваются уплотнения хроматина. В цитоплазме гонадотропоцитов встречаются гранулы. Гонадотропоциты располагаются в аденогипофизе в виде небольших групп, реже встречаются одиночные клетки. Как показали наши исследования, гонадотропоциты преимущественно локализуются в краевой зоне заднего и переднего отделов аденогипофиза. При морфологических исследованиях мы учитывали количество и площадь ядер гонадотропоцитов в аденогипофизах свинок. В свою очередь, с учетом кариометрических измерений ядер гонадотропоцитов они были разделены на две группы. В первую группу включали гонадотропоциты, площадь ядер которых колебалась в пределах от 15 до 40 мкм2. Во вторую группу включали клетки с более крупными ядрами, их площадь варьировала от 41 до 55 мкм2. Сравнительный анализ морфометрических показателей, полученных при исследовании аденогипофизов у неполовозрелых и половозрелых свиноканалогов, свидетельствует о том, что у половозрелых животных количество гонадотропоцитов и площадь их ядер были больше, чем у неполовозрелых. Так, у 5-месячных неполовозрелых свинок количество гонадотропоцитов составляло 2,0– 3,7 в 1 поле зрения микроскопа, количество клеток с площадью ядер 15–40 мкм2 – 16,7±0,52, а с площадью ядер 41–55 мкм2 – 10,4±0,29. У половозрелых свинок8 мЕД/мл аналогов эти показатели соответственно составляли 3,0–4,6 в 1 поле зрения микроскопа, количество клеток с площадью ядер 15–40 мкм2 –18,9±0,67, а с площадью ядер 41–55 мкм2 –12,6±0,57. У неполовозрелых 6-месячных свинок количество гонадотропоцитов достигало 2,4–3,6 в 1 поле зрения микроскопа и количество клеток с большой площадью ядер составило 9,9±0,59. У половозрелых свинок-аналогов эти показатели соответственно составляли 3,3–4,9 в 1 поле зрения микроскопа и 13,4±0,92. 3.2.Содержание гонадотропных гормонов в крови свинок в период полового созревания Проведенные нами исследования содержания гонадотропных гормонов в крови ремонтных свинок в период полового созревания показали (рис. 2), 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 5-месячные неполовозрелые свинки 5-месячные половозрелые свинки ФСГ 6-месячные неполовозрелые свинки 6-месячные половозрелые свинки ЛГ Примечание: кровь у половозрелых свинок исследовали на 10 сутки полового цикла. Рис.2. Содержание фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов в крови свинок в период пубертата. что у неполовозрелых животных 5-месячного возраста содержание фолликулостимулирующего гормона составляло 4,4±0,13 мЕд/мл, у неполовозрелых 6-месячных свинок его содержание было несколько меньше (4,1±0,09 мЕд/мл), однако выявленные различия являлись статистически недостоверными (р>0,05). С наступлением полового созревания уровень фолликулостимулирующего гормона в крови свинок достоверно (р<0,05) повысился у 5-месячных свинок в среднем на 2,4 мЕд/мл, а у 6-месячных свинок – на 3,6 мЕд/мл. Содержание лютеинизирующего гормона в крови неполовозрелых свинок также было меньше по сравнению с половозрелыми животными. Так, у неполовозрелых свинок 5-месячного возраста уровень этого гормона в крови составлял 12,4±0,19 мЕд/мл, 6-месячного возраста – 14,3±0,13 мЕд/мл. С наступлением половозрелости содержание лютеинизирующего гормона в крови свинок увеличилось до 16,4±0,17–17,8±0,18 мЕд/мл. Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что наступление полового созревания у свинок сопровождается характерным 9 увеличением в их крови гонадотропных гормонов. Это согласуется с результатами гистологических исследований аденогипофиза, где были выявлены изменения, указывающие на повышение секреторной активности гонадотропных клеток. 3.3. Особенности морфологической структуры яичников у свинок в период пубертата При исследовании яичников было установлено, что у 5-месячных неполовозрелых свинок яичники имели типичную гистологическую структуру. Сверху яичник покрывает однослойный кубический эпителий с большими овальными ядрами. Под слоем покровного эпителия располагается белочная оболочка, которая выглядит в виде тонкого волнистого тяжа, просматривающегося не во всех случаях. Строма коркового вещества яичника состоит из фибробластов, по своей структуре напоминающих гладкомышечные клетки. В строме также встречаются коллагеновые волокна. На периферии коркового вещества располагается большое количество примордиальных фолликулов, количество которых в одном поле зрения микроскопа насчитывалось 26,1±1,9. При большом увеличении в примордиальных фолликулах различается слой плоских фолликулярных клеток, которые окружают яйцеклетку одним слоем. Первичные фолликулы располагаются в несколько рядов, преимущественно по периферии коркового слоя, и представляют собой яйцеклетки, окруженные кубическим или призматическим эпителием. Количество первичных фолликулов у 5-месячных неполовозрелых свинок составляло 15,4±0,9 в 1 поле зрения микроскопа. Во вторичных фолликулах просматривается небольшая полость, фолликулярный эпителий в несколько слоев покрывает яйцеклетку. Количество вторичных фолликулов составляет 2,0±0,14 в 1 поле зрения микроскопа. Третичных фолликулов в яичниках 5-месячных неполовозрелых свинок встречается мало (1,1±0,14 в одном поле зрения микроскопа). Они располагаются в толще коркового слоя ближе к поверхности яичника. Помимо фолликулов в корковом веществе яичников обнаруживались атретические тела на разной стадии формирования, их количество составляло 3,2±0,2 в одном поле зрения микроскопа. У 5-месячных половозрелых свинок общая картина гистологической структуры существенно не отличалась от таковой у неполовозрелых свиноканалогов, за исключением некоторых количественных и морфометрических показателей. Количество в 1 поле зрения микроскопа примордиальных (29,4±0,9), первичных (19,6±0,8), вторичных (2,7±0,2) и третичных фолликулов (1,4±0,2) у половозрелых свинок было больше, чем у неполовозрелых животных. В то же время толщина гранулезы и внутренней теки третичных фолликулов существенных различий не имела (р>0,05). На поверхности яичников половозрелых свинок хорошо были заметны 10 овулировавшие фолликулы, на месте которых формировались желтые тела. У 6-месячных неполовозрелых свинок в яичниках хорошо просматривается структура коркового и мозгового вещества. В корковом веществе, под белочной оболочкой яичника залегает большое количество примордиальных фолликулов, их количество было меньше (23,6±1,4), чем у 5-месячных неполовозрелых свинок. В более глубоких слоях коркового вещества яичников располагаются первичные, вторичные и третичные фолликулы, количество которых соответственно составляло 14,0±0,8, и 2,1±0,2 и 1,0 в 1 поле зрения микроскопа. Толщина гранулезы третичных фолликулов была меньше (37,1±0,5 мкм) по сравнению с таковой у 5-месячных неполовозрелых свинок (40,1±0,7 мкм), а толщина внутренней теки существенных различий не имела (21,6±0,6– 22,9±0,4 мкм). В строме мозгового вещества яичников встречалось много поперечных срезов кровеносных сосудов, которые залегали между коллагеновыми и эластическими волокнами. У 6-месячных половозрелых свинок гистологическая структура яичников характеризовалась хорошо выраженными элементами. Строма коркового вещества преимущественно представлена рыхлой соединительной тканью, в ней находится большое количество фолликулов на разной стадии развития. Вторичные и третичные фолликулы погружены в более глубокий слой коркового вещества, по своей структуре они не отличались от таковой у свинок, не достигших половой зрелости. Однако их количество у половозрелых свинок было больше: содержание вторичных фолликулов составляло 2,9±0,1, а третичных– 1,6±0,2, в 1 поле зрения микроскопа. При этом многие третичные фолликулы выходили за пределы поверхности яичника, в них хорошо просматривалась яйцеклетка и другие элементы, типичные для данной стадии развития фолликула. Толщина гранулезы и внутренней теки в третичных фолликулах соответственно составляла 41,2±0,9 мкм и 22,5±1,4 мкм. По всей строме коркового вещества яичника встречаются атретические фолликулы. Некоторые из них находились на стадии кистозной атрезии, а другие – на стадии облитерационной атрезии. Встречались также фиброзные атретические тела, в которых преобладала соединительная ткань. При осмотре яичников обнаруживались формирующиеся желтые тела на местах овулировавших фолликулов. Количество овулировавших фолликулов в обоих яичниках 6-месячных половозрелых свинок составляло 9,6±0,4, что было больше, чем у половозрелых 5-месячных свинок (8,4±0,4). 3.4. Содержание овариальных гормонов в крови свинок в период пубертата Для оценки гормональной активности яичников у неполовозрелых и половозрелых свинок нами были проведены исследования содержания в их крови овариальных гормонов – эстрадиол-17 β и прогестерона. 11 Иммуноферментный анализ показал, что в период полового созревания содержание овариальных гормонов в крови свинок подвергалось существенным изменениям (рис. 3). У неполовозрелых 5- и 6- месячных 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 5-месячные неполовозрелые 5-месячные половозрелые эстрадиол-17β,пмоль/л 6-месячные неполовозрелые 6-месячные половозрелые прогестерон, нмоль/л Примечание: кровь у половозрелых свинок исследовали на 10 сутки полового цикла Рис.3. Содержание эстрадиола-17β и прогестерона в крови свинок в период пубертата. свинок уровень эстрадиола-17β (41,5–45,6 пмоль/л) и прогестерона (20,6–21,8 нмоль/л) был значительно меньше по сравнению с половозрелыми свинкамианалогами, у которых содержание эстрадиола-17β находилось в пределах 77,4±1,3 – 81,5±2,1 пмоль/л, а прогестерона – 26,6±1,9 – 27,4±1,7 нмоль/л. 3.5. Развитие репродуктивных органов у ремонтных свинок в период пубертата С целью изучения развития репродуктивных органов у ремонтных свинок в период пубертата, нами были проведены исследования массы, линейных и объемных параметров матки и яичников. В ходе проведенных исследований было установлено, что с наступлением полового созревания рост репродуктивных органов у свинок значительно активизировался. Так, если у 5- и 6- месячных неполовозрелых свинок длина обоих рогов матки в среднем составляла соответственно – 112,6 см и 138,0 см, то у половозрелых свинок-аналогов она достигала 142,5 см и 166,0 см. Аналогичным образом изменялась и площадь рогов матки. У 5- и 6месячных неполовозрелых свинок она составляла 283,5 см2 и 394,0 см2, а у половозрелых свинок-аналогов соответственно – 397,8 см2 и 551,3 см2. Увеличение массы и площади рогов матки у половозрелых свинок, несмотря на одинаковую массу тела с неполовозрелыми животными, по-видимому, связано с гормональной перестройкой в яичниках половозрелых свинок. Повышение секреции яичниками эстрогенов и прогестерона оказывает стимулирующее влияние на рост и развитие половых органов. Масса яичников у свинок с наступлением полового созревания также увеличилась. Так, у 5- и 6- месячных неполовозрелых свинок она в среднем 12 составляла соответственно 4,6 и 5,1 г, а у половозрелых свинок-аналогов – 5,2 г и 6,1 г. Объем яичников у половозрелых свинок также был выше, чем у неполовозрелых животных. Увеличение массы и объема яичников у половозрелых связано с наличием созревающих фолликулов и желтых тел. 3.6. Гистологическая структура матки у ремонтных свинок в период пубертата Проведенные нами исследования матки у ремонтных свинок показали, что в период пубертата её гистологическая структура претерпевала существенные изменения. При этом данные изменения являлись характерными как для 5-, так и 6-месячных животных. У 5-месячных неполовозрелых свинок слизистая оболочка матки покрыта однослойным призматическим эпителием. Ядра в его клетках имеют овальную форму с четкими контурами, окрашены базофильно. Высота покровного эпителия составляла 26,8±0,94 мкм. Микрорельеф собственно слизистой матки имел как макро-, так и микровозвышения и углубления, характер и размеры которых варьировали довольно в широких пределах. Толщина слизистой матки составляла 2278,0±57,2 мкм. В собственно слизистой залегают маточные железы, о чем свидетельствуют их многочисленные срезы, которые встречаются как в поверхностном, так и глубоком её слоях. При этом в поверхностном слое слизистой оболочки количество маточных срезов было меньше (14,7±0,41), чем в глубоком (38,5±0,56). В то же время диаметр желез поверхностного слоя был больше (33,4±0,79 мкм) по сравнению с диаметром желез глубокого слоя (20,4±0,57 мкм). Миометрий у неполовозрелых 5-месячных свинок имеет компактное строение, его мышечные пучки тесно расположены друг с другом. Тем не менее слои миометрия – внутренний, циркулярный и наружный продольный хорошо дифференцируются. Толщина мышечного слоя составляла 1405,0±30,9 мкм. У 5-месячных половозрелых свинок покровный эпителий так же, как и у неполовозрелых свинок-аналогов, однослойный, призматический. Однако он практически на всем своем протяжении более однородный, клетки бедны цитоплазмой, плотно прилегают друг к другу, границы их выражены нечетко. Ядра в клетках неодинаковые, окрашены базофильно, окраска неравномерная, что указывает на скопление хроматина. В основном преобладают клетки с вытянутыми ядрами, но встречаются также клетки с овальными и округлыми ядрам. При этом располагаются ядра в клетках на разном уровне, их окраска не одинаковая. Ядра вытянутой формы, окрашены более интенсивно по сравнению с ядрами других форм. Структура собственно слизистой матки у половозрелых свинок более рыхлая, особенно в её поверхностной части. Складчатость слизистой хорошо выражена, четко просматриваются как первичные, так и вторичные складки. В глубине слизистой проходят кровеносные сосуды. 13 Количество срезов маточных желез в поверхностном слое (17,1±1,16) было значительно меньше, чем в глубоком слое (47,3±0,78). Однако диаметр желез, залегающих в поверхностном слое, был больше по сравнению с таковым у желез глубокого слоя. Что касается миометрия, то существенных различий у половозрелых и неполовозрелых 5-месячных свинок-аналогов нами выявлено не было, за исключением его толщины. У половозрелых свинок толщина мышечной оболочки матки была больше в среднем на 109,0 мкм, однако выявленное различие было статистически недостоверным (р>0,05). У 6-месячных неполовозрелых свинок гистологическая структура стенки матки не имела существенных отличий от структуры матки у неполовозрелых свинок 5-месячного возраста. Так, высота покровного эпителия была практически одинаковой (26,8±0,94–27,0±1,03 мкм). Другие морфометрические показатели также не имели достоверных различий. У 6-месячных половозрелых свинок слизистая оболочка покрыта однослойным призматическим покровным эпителием. Цитоплазма клеток слабо окрашена. В ядрах наблюдаются хроматиновые глыбки. Границы клеток не на всех участках хорошо просматриваются. В некоторых случаях под эпителием, рядом с базальной мембраной, встречаются единичные лимфоидные клетки. Собственно слизистая матки имеет хорошо выраженную складчатость. Как в поверхностном (18,5±0,58), так и в глубоком (50,6±1,03) слое слизистой располагаются маточные железы. При этом диаметр маточных желез несколько увеличен (23,3±0,79–50,2±0,76 мкм) по сравнению с неполовозрелыми животными. В железах с широкими просветами содержится незначительное количество секрета. Эпителий желез однослойный, цилиндрический, ядра в клетках овальной или округлой формы, лежат базально. Отмечено, что в глубоком слое слизистой оболочки матки ядра железистых клеток преимущественно округлой формы, окраска их более светлая, по сравнению с ядрами клеток желез поверхностного слоя. В некоторых железах ядра расположены на разных уровнях клеток, что создает впечатление двухрядности эпителия. Наличие косых срезов желез указывает на незначительную их извилистость. Количество срезов маточных желез в 1 поле зрения микроскопа, как и у неполовозрелых 6-месячных свинок значительно больше в глубоком слое слизистой (50,6±1,03), чем в поверхностном (18,5±0,58). Просветы желез широкие, в поверхностном слое их диаметр достигает 50,2±0,76 мкм, а в глубоком слое – 23,3±0,79 мкм. На некоторых участках поверхностного слоя слизистой оболочки матки встречаются косые срезы маточных желез. В глубоком слое слизистой срезы маточных желез в большинстве случаев поперечные. Ядра клеток эпителия желез в поверхностном слое слизистой оболочки матки более крупные, чем в глубоком слое. Цитоплазма клеток ячеистая и слабо окрашена. Располагаются ядра в клетках ближе к основанию клеток и занимают примерно одну треть их величины. Границы клеток 14 просматриваются не на всех участках отчетливо. В некоторых просветах желез имеется небольшое скопление секрета. Слои мышечной оболочки плотно прилегают друг к другу. При этом циркулярный слой просматривается более отчетливо и более развит, чем продольный. Толщина миометрия составляла 1341,9±203,9 мкм. 3.7. Гистологическая структура маточно-трубного сочленения у свинок в период полового созревания По данным многих исследований маточно-трубное сочленение у свиней представляет собой структуру, которая выполняет важную роль в репродуктивной системе свиноматок. По данным А. Braden (1953) и Ю.Т. Техвера (1968) сочленение регулирует поступление спермиев в яйцепровод и переход яйцеклеток в матку. К.И. Левин (1990) предполагает, что маточнотрубное сочленение осуществляет не только количественный, но и качественный контроль спермиев, поступающих в яйцепровод. Учитывая физиологическую роль маточно-трубного сочленения, нами были проведены исследования по изучению его гистологических особенностей в период пубертата. С этой целью были изготовлены гистосрезы из средней части данного участка половых органов свинок. Анализ гистологических исследований показал, что в период пубертата у 5-месячных неполовозрелых свинок слизистая оболочка маточно-трубного сочленения покрыта однослойным цилиндрическим эпителием, высота которого достигала 15,4±1,34 мкм. Собственно слизистая оболочка состоит из рыхлой соединительной и ретикулярной тканей с незначительным количеством гладкомышечных клеток. Толщина слизистой оболочки сочленения составляла 25,9±1,28 мкм. Складки слизистой оболочки сложные, их высота достигала 1687,0±61,86 мкм, а толщина мышечной оболочки –364,9±5,97 мкм. У 5-месячных половозрелых свинок слизистая оболочка маточнотрубного сочленения собрана в крупные разветвленные складки. Она покрыта однослойным призматическим эпителием. Высота эпителия слизистой матки составляет 18,9±0,89 мкм, что достоверно больше (р<0,05), чем у неполовозрелых свинок-аналогов (15,4±1,34 мкм). Собственная пластинка слизистой оболочки представлена рыхлой волокнистой соединительной тканью. По сравнению с неполовозрелыми свинками она была более толстой (38,2±1,37 мкм). Складки слизистой были хорошо выраженными, относительно высокими (1834,43±56,31 мкм), межскладчатые пространства глубокие. Мышечная оболочка маточно-трубного сочленения у половозрелых 5месячных свинок представлена хорошо заметными мышечными волокнами, её толщина составляла 397,0±5,16 мкм. У 6-месячных неполовозрелых свинок стенка трубно-маточного сочленения складчатая. Слизистая имеет высокие складки (1614,4±84,13 мкм), покровный эпителий не отличается от такового у 5-месячных животных. 15 Толщина мышечной оболочки составляла 517,4±10,44 мкм. У 6-месячных половозрелых свинок слизистая оболочка покрыта однослойным призматическим эпителием, высота которого была выше (19,5±0,61 мкм), чем у неполовозрелых животных (17,0±0,53 мкм). Слизистая маточно-трубного сочленения имеет складчатость, которая представлена сложными «ветвящимися» складками, с высотой 1902,7±57,24 мкм. Толщина собственно слизистой сочленения была больше (42,7±0,82 мкм) по сравнению с таковой у неполовозрелых свинок (34,5±0,71 мкм). Между складками имеются пространства, которые берут начало практически от основания слизистой оболочки. Слои мышечной оболочки плотно прилегают друг к другу. При этом циркулярный слой просматривается более отчетливо, чем продольный. Толщина мышечной оболочки маточно-трубного сочленения у 6-месячных половозрелых свинок составляла 589,7±17,15 мкм. 3.8. Функциональная и морфологическая взаимосвязь аденогипофиза, яичников и матки у ремонтных свинок в период пубертата Для выяснения связи и установления характера зависимости между показателями, полученными в ходе проведенных морфологических и гормональных исследований, нами был определен коэффициент корреляции (R), а также установлена степень вероятности (достоверности) между выявленными связями. Как показал биометрический анализ, в большинстве случаев между изучаемыми показателями существует корреляционная зависимость. Наиболее тесная связь была выявлена между содержанием эстрадиола-17β и длиной рогов матки, толщиной эндометрия и миометрия. Показано, что у свинок с более высоким содержанием в крови эстрадиола-17β рога матки были более развитыми: они имели большую длину, а эндометрий и миометрий был более толстым. Имелась определенная связь между содержанием фолликулостимулирующего гормона в крови свинок и массой яичников. Масса яичника, как правого, так и левого, в большинстве случаев была больше у свинок, в крови которых концентрация фолликулостимулирующего гормона была относительно высокой. Выявлена также положительная связь между содержанием эстрадиола17β в крови свинок и морфологической структурой маточно-трубного сочленения, что свидетельствует о его связи с функциональной активностью яичников. В свою очередь отмечено, что выявленная связь между изучаемыми показателями имела более выраженный характер у свинок, достигших половозрелости. 3.9. Способ получения препарата половых феромонов хряка и его использование для стимуляции полового созревания у свиней В качестве исходного сырья для получения препарата половых феромонов хряка использовали семенники и мочу половозрелых хряков, а 16 также корень сельдерея корневого и корень пастернака, содержащие стероиды 5-андрост-16-ен-3-он и 5-андрост-16-ен-3-ол, являющиеся основой половых феромонов хряка. Технологический процесс включал следующие основные этапы: грубое измельчение исходного сырья, гомогенизацию тканей до однородного состояния в присутствии фермента протосубтилина, инкубацию при 37–39ºС, добавление мочи, отжим массы прессом, расфасовку во флаконы и сублимацию, проверку препарата на стерильность и токсичность. После проведения всех этапов технологического процесса препарат представлял собой сухую пористую массу, буроватого оттенка со специфическим запахом. Флаконы с препаратом закрывали резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками. Хранили препарат при температуре не выше 20С, срок хранения 24 мес. Проверку препарата на стерильность проводили с использованием сред МПА и Эндо с последующей инкубацией в термостате. Местнораздражающее действие и токсичность препарата определяли на лабораторных животных и свиньях крупной белой породы 5-месячного возраста. Условно изготовленный препарат был назван НФР – натуральные феромоны хряка с растительным компонентом. Апробацию изготовленного препарата проводили на ремонтных свинках крупной белой породы. Было проведено два научнопроизводственных опыта. В первом опыте использовали препарат феромонов для стимуляции полового созревания у 6-месячных неполовозрелых свинок. Во втором опыте феромоны применяли для индуцирования полового созревания у 2-месячных свинок с задержавшейся половозрелостью. Для проведения первого опыта было сформировано две группы ремонтных свинок крупной белой породы по 20 голов в каждой. Свинки первой группы подвергались стимуляции препаратом НФР. Применяли препарат половых феромонов в дозе 0,5 мл в расчете на одно животное путем распыления пульверизатором на уровне носового зеркала, ежедневно в течение 10 дней. Свинки второй группы являлись контрольными, их обрабатывали дистиллированной водой. Содержались опытные и контрольные животные в одном помещении и получали одинаковый рацион, сбалансированный по питательным и минеральным компонентам. Половую охоту у свинок определяли с использованием хряка-пробника. Результаты первого научно-производственного опыта показали (табл. 1), что после стимуляции неполовозрелых ремонтных свинок 6-месячного возраста препаратом НФР у большинства животных в первые 10 суток после стимуляции проявилась первая половая охота (85%), а у контрольных животных она значительно задерживалась и за 30-суточный период наблюдений проявилась только у 40% свинок. 17 Таблица 1. – Наступление полового созревания у ремонтных свинок, подвергавшихся стимуляции препаратом натуральных половых феромонов хряка НФР Группа n Выявлена половозрелость у свинок в течение суток после стимуляции 1-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 Всего (%) 1 опытная 20 6 8 1 2 – – 17 (85%) 2 контрольная 20 – – 3 2 – 3 8 (40%) Для проведения второго опыта отобрали свинок-аналогов крупной белой породы, достигших 8-месячного возраста с развитием, соответствующим возрастному периоду, но у которых половое созревание не наступало. Из отобранных животных было сформировано две группы по 18 голов в каждой. Свинок первой группы стимулировали препаратом НФР. Стимуляцию проводили ежедневно в течение 15 суток, доза препарата составляла 0,5 мл/гол. Свинки второй группы были контрольными и стимуляции не подвергались. Наблюдали за подопытными животными в течение 30 суток. Результаты второго научно-производственного опыта показали (табл.2), что после стимуляции изготовленным препаратом у 12 (67%) свинок наступало половое созревание. У животных контрольной группы за 30суточный период наблюдений половозрелость была выявлена только у 4 (22%) свинок. Таблица 2. – Наступление полового созревания у ремонтных свинок с задержавшейся половозрелостью после стимуляции препаратом натуральных половых феромонов хряка НФР Группа n Выявлена половозрелость у свинок в течение суток после стимуляции 1-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 Всего (%) 1 опытная 18 4 7 1 – – – 12 (67%) 2 контрольная 18 – 2 – 2 – – 4 (22%) Таким образом, результаты проведенных опытов показали, что изготовленный нами препарат натуральных половых феромонов хряка обладает выраженным стимулирующим действием на половую функцию свинок и его можно рекомендовать к использованию в практике свиноводства. 18 ВЫВОДЫ 1. 2. Период пубертата у ремонтных свинок характеризуется увеличением в аденогипофизе гонадотропных клеток. В краевой зоне аденогипофиза их количество находилось в пределах 4,6±0,20–4,9±0,30, а в центральной зоне – 3,0±0,22–3,3±0,18 в 1 поле зрения микроскопа. У неполовозрелых свинок-аналогов количество гонадотропоцитов было меньше и составляло соответственно 3,6±0,20–3,7±0,29 и 2,0±0,30–2,4±0,48 в 1 поле зрения микроскопа. При этом у половозрелых свинок количество гонадотропоцитов с большой площадью ядер (12,6±0,57–13,4±0,92) превышало таковое (10,4±0,29–13,4±0,92) у неполовозрелых животных. Функциональная активность аденогипофиза у свинок в период пубертата повышается. Содержание ФСГ в крови у половозрелых свинок находилось в границах 6,8±0,08–7,7±0,11 мЕд/мл, а ЛГ – 16,4±0,17– 17,8±0,12 мЕд/мл. В крови неполовозрелых свинок содержание этих гормонов соответственно составляло 4,1±0,09–4,4±0,13 мЕд/мл и 12,4±0,19–14,3±0,13 мЕд/мл. 3. В период пубертата морфофункциональное состояние яичников у свинок существенно изменяется. У половозрелых животных увеличивается количество первичных (18,5±1,2–19,6±0,8), вторичных (2,7±0,2–2,9±0,1), третичных (1,4±0,2–1,6±0,2) фолликулов и обнаруживаются овулировавшие фолликулы (8,4±0,4–9,6±0,4). При этом в крови половозрелых свинок регистрировалось более высокое содержание эстрадиола-17β (77,3±1,27–81,5±2,11 пмоль/л) и прогестерона (26,6±1,91–27,4±1,70 нмоль/л) по сравнению с неполовозрелыми свинками-аналогами (41,5±0,98–45,6±1,16 пмоль/л; 19,7±1,15–21,8±1,23 нмоль/л). 4. До полового созревания масса матки, линейные параметры и площадь рогов матки у ремонтных свинок увеличивались медленно. После пубертата рост репродуктивных органов резко активизировался: масса матки находилась в пределах 215,0±5,4–286,8±3,9 г; длина рогов матки – 70,0±0,5–86,5±0,5 см; площадь рогов матки – 190,5±3,5–281,4±1,1 см². У неполовозрелых свинок-аналогов эти показатели соответственно составляли – 110,4±3,5–144, ±5,7 г; 54,6±0,3–70,0±2,4 см; 138,5±3,4– 200,0±6,1 см². 5. Гистологическая структура рогов матки у свинок в период пубертата характеризуется хорошо сформировавшимся эндометрием и миометрием. У половозрелых животных показатели высоты покровного эпителия, толщины собственно слизистой, количества маточных желез и их диаметра, толщины миометрия были больше по сравнению с неполовозрелыми свинками-аналогами. 6. Маточно-трубное сочленение у половозрелых свинок имеет более 19 высокий покровный эпителий (18,9±0,89–19,5±0,61 мкм), толщину собственно слизистой оболочки (38,2±1,37–42,7±0,82 мкм), высоту складок слизистой оболочки (1614,4±84,1–1902,7±57,2 мкм) и толщину мышечной оболочки (397,0±5,16–589,7±17,1 мкм) по сравнению с неполовозрелыми животными, у которых данные показатели соответственно составляли 15,4±1,34–17,0±0,53 мкм; 25,9±1,28–34,5± 0,71 мкм; 1614,4±84,13–1687,0±61,86 мкм; 364,9±5,97–517,4±10,44 мкм. 7. В период пубертата у свинок между изучаемыми морфологическими и гормональными параметрами корреляционная зависимость была выше, чем у неполовозрелых животных. 8. Технология изготовления препарата натуральных половых феромонов хряка НФР не требует дорогостоящего оборудования и химических реактивов, что позволяет её применять в лабораторных условиях. 9. После стимуляции неполовозрелых 6-месячных свинок препаратом половых феромонов хряка НФР, изготовленного по разработанному способу, у большинства животных в первые 10 суток наступала первая половая охота (85%), а у контрольных животных она задерживалась и за 30-суточный период наблюдений регистрировалась только у 40% свинок. 10. При стимуляции свинок 8-месячного возраста с задержавшейся половой зрелостью препаратом натуральных половых феромонов хряка НФР у 67%, животных наступала половозрелость, что было значительно больше, чем у свинок, которые стимуляции не подвергались (22%). ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 1. Использовать технологию изготовления препарата натуральных половых феромонов НФР из тканей и экскретов половозрелых хряков, корневищ пастернака и сельдерея. Применять препарат половых феромонов для стимуляции полового созревания у ремонтных свинок. 2. Полученные интерьерные показатели у ремонтных свинок крупной белой породы как физиологические нормативы могут быть использованы при разработке новых способов и средств биологической стимуляции репродуктивной функции свиноматок, а также в клинической практике и в учебных целях при подготовке специалистов ветеринарного профиля. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Кононова, М.С. Особенности роста и развития матки и яичников у свиней в период формирования половой функции / М.С. Кононова, И.М. Умеренков // Обеспечение продовольственной безопасности России. Если не мы, то кто? 20 (материалы международной научно-практической конференции, посвященной 140-летию со дня рождения профессора Ильи Ивановича Иванова, г. Курск, 25-26 ноября 2010 г.).– Курск: ООО АПИИТ «ГИРОМ», 2010.–С. 166–172. 2. Кононова, М.С. Особенности гипофизо-овариальных связей у свиней в период становления половой функции / М.С. Кононова / Наука и инновации в сельском хозяйстве (материалы Международной научно-практической конференции, 26–28 января 2011г., г. Курск, ч. 3).–Курск: Изд-во Курской государственной сельскохозяйственной академии, 2011.– С. 197–200. 3. Сеин, Д.О. Индуцирование полового созревания у ремонтных свинок с использованием препарата PG-600 и ФСГ / Д.О. Сеин, М.С. Кононова, И.М. Умеренков // Бюллетень научных работ № 21.– Белгород, 2010. –С. 62–65. 4. Сеин, Д.О. Задержка половой зрелости у ремонтных свинок и её индуцирование гонадотропными препаратами / Д.О. Сеин, М.С. Кононова // Материалы II международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения». – Ульяновск, 2010 .– С.172–173. 5. Сеин, О.Б. Особенности фолликулогенеза у свиней в период пубертата / О.Б. Сеин, Д.О. Сеин, М.С. Кононова // Вестник Курской сельскохозяйственной академии. - 2010. - №1. – С.76 – 79. 6. Сеин, Д.О. Гистологическая структура эндометрия у свиней в период становления половой функции / Д.О. Сеин, М.С. Кононова // Научное обеспечение инновационного развития животноводства: материалы Международной научн.- практ. конф. – Ижевск, 2010.– С. 358–360. 7. Сеин, Д.О. Гистологическая структура эндометрия у свиней в период становления половой функции / Д.О. Сеин, М.С. Кононова // Вестник Курской сельскохозяйственной академии. - 2010. - №4. – С.67 – 70. 8. Сеин, Д.О. Гистологическая структура гипофиза и яичников у свиней в период пубертата / Д.О. Сеин, М.С. Кононова, И.М. Умеренков // Вестник Курской сельскохозяйственной академии. - 2011. - №2. – С.65 – 67. 21
