1 - Научно-исследовательском институте морфологии человека
реклама
а правах рукописи Овчарова Анастасия Никитовна МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТОНКОЙ И ТОЛСТОЙ КИШКИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПЕРВИЧНОМ ДИСБИОЗЕ И ЕГО КОРРЕКЦИИ ПРОБИОТИКАМИ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук Научные руководители: член-корр. РАМН доктор медицинских наук Кактурский Лев Владимирович доцент, кандидат биологических наук Серебряков Сергей Николаевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент , ведущий научный сотрудник лаборатории иммуноморфологии воспаления ФГБУ «НИИ морфологии человека РАМН» Кондашевская Марина Владиславовна доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник ФБУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Щербаков Иван Тимофеевич Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» Защита диссертации состоится «22» марта 2012 года в 14.00 ч. на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук (117418, Москва, ул. Цюрупы д.3). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук Автореферат разослан “____” ___________ 2012 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Михайлова Лилия Петровна 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. В желудочно-кишечном тракте человека обитает более 450 видов микроорганизмов, общая биомасса которых у взрослого человека составляет 3-4 кг (Овсянников Д. Ю., 2006). Микробиом рассматривают как дополнительный многоклеточный «орган» человека, состоящий из различных линий клеток, которые взаимодействуют как между собой, так и с организмом хозяина (Martin F.P. et al., 2008). На состав нормальной микрофлоры оказывает влияние ряд факторов: неблагоприятная экологическая обстановка, неправильный рацион питания, психоэмоциональные нагрузки, лекарственные воздействия и др. Дисбиотические состояния выявляют у 80-100% пациентов, страдающих воспалительными заболеваниями кишечника (Friswell M., 2010). Особенно выраженное влияние на микрофлору оказывают химиотерапевтические препараты. Распространение дисбиотических расстройств среди всех возрастных групп населения неуклонно растет. Это приводит к более тяжелому течению соматических заболеваний, изменяет их клинические проявления, затрудняя диагностику и лечение, что диктует необходимость коррекции нарушений состава кишечной микрофлоры. В связи с этим, поиск новых средств и методов коррекции и лечения дисбиотических состояний различного происхождения актуален. Основными средствами коррекции нарушений количественного и качественного состава кишечной положительного микрофлоры являются пробиотические препараты. действия пробиотиков основан на подавлении Механизм патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, нормализации микробного пейзажа за счет продукции биологически активных веществ, влияющих на ферментативную активность желудочно-кишечного тракта и иммунную систему организма хозяина. Наиболее важным свойством пробиотических препаратов является обеспечение колонизационной резистентности, которая определяет характер взаимоотношений пробиотических и индигенных представителей кишечной флоры (Шендеров Б.А., 2001; Бондаренко В.М., Воробьев А.А., 2004;). Механизм этого явления заключается в конкуренции микрофлоры за питательные вещества и участки связывания, а также в выработке нормальной микрофлорой субстанций, ингибирующих рост патогенов (Stecher B. et al., 2010). Применяемые в настоящее время в клинической практике пробиотические препараты, как отечественные, так и зарубежные, в ряде случаев оказываются недостаточно эффективными, так как их действие зачастую носит транзиторный характер (Семёнов В.А., Терехов В.И., 2007). Действие пробиотиков на организм человека изучено недостаточно. В литературе есть данные о случаях осложнений, вызванных применением некоторых пробиотиков (Андреева И.В., 2007). Некоторые исследователи наблюдали 3 воспалительно-реактивные изменения в желудочно-кишечном тракте после длительного приема пробиотика (Хомякова Т.И. и соавт., 2010). В последние годы наблюдается необоснованно широкое использование пробиотических препаратов, их часто добавляют в продукты питания. В связи с этим необходимо более углубленное изучение действия пробиотиков на организм человека. Наиболее распространенным способом оценки действия пробиотиков является микробиологический метод. Однако, он не позволяет в полной мере оценить эффективность действия пробиотиков на макроорганизм. Одним из наиболее объективных методов оценки эффективности действия пробиотиков является морфологическое исследование с количественной оценкой структурных изменений кишечника. В современной литературе сведения о морфологических изменениях желудочно-кишечного тракта при приеме пробиотиков представлены фрагментарно. На качественном светооптическом уровне описано влияние пробиотиков на слизистую оболочку тонкой и толстой кишки, печень, лимфоидные образования кишечника (Щербакова Э.Г., 1998; Калмыкова А.И. и соавт., 2005; Афонюшкин В.Н. и соавт., 2007; Манухина А.И. и соавт., 2001). В литературе отсутствуют работы по комплексной оценке действия пробиотиков на морфологическую структуру тонкой и толстой кишки и органов иммунной системы при первичных дисбиозах. Цель. Изучение морфологических изменений тонкой и толстой кишки, печени, органов иммунной системы и микробиома при экспериментальном первичном дисбиозе и его коррекции пробиотиками. Задачи: 1. Воспроизвести у мышей линии Balb/с первичное дисбиотическое состояние с помощью внутрижелудочного введения смеси антибиотиков канамицина и тетрациклина. 2. Провести оценку изменений микробиома при первичном экспериментальном дисбиозе, вызванном введением антибиотиков, и при его коррекции пробиотиками энтероцина и колибактерина. 3. Исследовать количественные и качественные морфологические изменения тонкой и толстой кишки при первичном экспериментальном дисбиозе, вызванном антибиотиками, и при его коррекции пробиотиками энтероцином и колибактерином. 4. Изучить морфологические изменения печени и органов иммунной системы при первичном экспериментальном дисбиозе, вызванном антибиотиками, и при его коррекции пробиотиками энтероцином и колибактерином. 5. На основании исследований морфологических изменений тонкой и толстой кишки, печени, органов иммунной системы и микробиома дать сравнительную оценку 4 действия пробиотиков энтероцина и колибактерина при коррекции первичного дисбиотического состояния. Положения, выносимые на защиту: 1. После внутрижелудочного введения антибиотиков широкого спектра действия у половозрелых самцов мышей Balb/с развивается первичное дисбиотическое состояние, которое, по данным морфологического исследования, сопровождается реактивными изменениями тонкой, толстой кишки, печени и органов иммунной системы. 2. Курсовое введение пробиотиков энтероцина или колибактерина частично восстанавливает микрофлору, при этом снижается выраженность реактивных морфологических изменений в тонкой, толстой кишке, печени и органах иммунной системы. 3. В отдаленные сроки исследования при применении пробиотиков нормализуется морфофункциональное состояние тонкой, толстой кишки, печени и органов иммунной системы; при этом, после применения энтероцина происходит восстановление микрофлоры, а после колибактерина дисбаланс просветной микрофлоры сохраняется. Научная новизна. На основании экспериментального морфологического, морфометрического и микробиологического исследования установлено, что развитие первичного дисбиотического состояния, индуцированного введением терапевтических доз антибиотиков широкого спектра действия, сопровождается реактивными изменениями тонкой, толстой кишки, печени, тимуса и селезенки. Впервые проведено сравнительное исследование влияния курсового введения индигенного штамма пробиотика энтероцина и чужеродного данному виду пробиотика колибактерина на тонкую, толстую кишку, печень и органы иммунной системы. Установлено, что индигенный штамм – энтероцин приводит к нормализации микрофлоры, а чужеродный данному виду – колибактерин не нормализует дисбиотическое состояние. При применении обоих пробиотиков сохраняются реактивные изменения тонкой, толстой кишки, печени, тимуса и селезенки, которые через 30 сут после курсового введения препаратов нивелируются, однако реактивные изменения в толстой кишке сохраняются. Практическая значимость. Полученные экспериментальные данные о развитии при первичном дисбиотическом состоянии, индуцированном введением терапевтических доз антибиотиков, реактивных изменений не только толстой, но и тонкой кишки, печени и органов иммунной системы, следует учитывать при разработке лечебных мероприятий по коррекции нарушений микробиоценоза. Данные о морфологических изменениях в органах пищеварительной и иммунной систем организма, а также динамических изменениях микробиома под влиянием 5 пробиотиков следует учитывать при доклинической оценке эффективности новых пробиотических препаратов. Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в работу лаборатории генно-инженерных препаратов Государственного научного учреждения «НИИ пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева» Российской академии сельскохозяйственных наук. Апробация результатов исследования. Основные положения диссертации представлены в докладах на научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2008), международной научной конференции «Пробиотики и пребиотики» (Словакия, 2011), межлабораторной конференции в НИИ морфологии человека РАМН (Москва, 2011). Публикации материалов исследования. По материалам исследования опубликовано 5 научных работ, из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения и четырех глав: обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов и практические рекомендации; выводы и список литературы. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста и проиллюстрирована 17 рисунками и 32 таблицами. Библиографический указатель включает 124 источника (63 отечественных и 61 иностранных). СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования В работе использованы 90 мышей - самцов линии BALB/c массой тела 18–20 г. При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977. На проведение экспериментов было получено разрешение биоэтической комиссии НИИ морфологии человека РАМН (протокол №5 от 15.09.2006). Животные были разделены на 5 экспериментальных групп и 4 контрольных по 10 мышей в каждой группе. Контрольной группе мышей вводили 50 мкл физиологического раствора. С целью моделирования первичного дисбиотического состояния мышам всех 6 экспериментальных групп, кроме контрольной, вводили внутрижелудочно смесь антибиотиков тетрациклина и канамицина в течение 14 дней ежедневно в дозе 250 мг/кг. После курса антибиотиков одну группу мышей выводили из опыта, две другие группы мышей получали пробиотик энтероцин, и две группы - колибактерин внутрижелудочно в течение 14 дней ежедневно в дозах 3х109 КОЕ. После курса пробиотиков 10 мышей, получавших колибактерин и 10 мышей, получавших энтероцин, выводили из опыта. Оставшихся мышей после курса антибиотиков и коррекции дисбиоза энтероцином и колибактерином содержали 30 сут в стандартных условиях вивария для изучения пролонгированного действия пробиотиков. Мышей выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира. Забирали кусочки подвздошного отдела тонкой кишки, слепого отдела толстой кишки, печени, органов иммунной системы (тимуса, селезенки). Кусочки тонкой, толстой кишки и печени фиксировали в 10% растворе забуференного формалина, тимус, селезенку – в растворе Буэна, заливали в парафин, изготавливали срезы толщиной 4–5 мк и окрашивали их гематоксилином и эозином, кроме этого, кусочки тонкой и толстой кишки окрашивали ШИФФ-реактивом. Проводили морфометрическое исследование гистологических препаратов тонкой, толстой кишки, печени, тимуса, селезенки. Для количественного и качественного анализа просветной микрофлоры применяли бактериологический метод с использованием селективных питательных сред: среда Эндо, агар Мак-Конки, энтерококк-агар, среда MRS, бифидум-агар. Для обработки полученных данных использовалась программа Statistika 6.0. Статистическая достоверность определялась по t-критерию Стьюдента . Результаты исследования и их обсуждение Состав просветной микрофлоры и морфологические изменения тонкой, толстой кишки, печени и органов иммунной системы после курсового введения антибиотиков Состав микрофлоры толстой кишки у мышей линии Balb/с по качественному и количественному составу нормофлоры отличался от имеющихся в литературе данных для Mus musculus (Гайдеров А.А., 2007; Нечай В.В. и соавт., 2011; Абдулаева С.О. и соавт., 2011). Количество ферментирующих эшерихий колебалось в пределах от 6*104 до 2,5*105 КОЕ/г при высоком содержании неферментирующих форм и других представителей семейства Enterobacteriaceae, тогда как нормальным считается их содержание в пределах 106 – 107 КОЕ/г. Количество энтерококков было увеличено - 1,6*106 -1,2*107 при норме 105 - 106. Число же лактобацилл и бифидобактерий было снижено более чем на два порядка (рис. 1). 7 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 * 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 1- lac - 1 2- lac + 5 2 3 4 Контрольная 3- Энтерококки 1 4- 2 4 3 Антибиотики Бифидобактерии 5- 5 Лактобактерии *- различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой Рис. 1. Качественный и количественный состав просветной микрофлоры мышей BALB/c после курсового введения антибиотиков Полученные результаты можно объяснить высокой степенью индивидуальной специфичности микробиома в зависимости от условий содержания, сезона и возраста животных, а также особенностями иммунной системы мышей линии Balb/с, у которых преобладает T-хелпер 2 (гуморальный) тип иммунного ответа (Трунова Г.В., 2011). Индивидуальные значения количества микроорганизмов, составляющих ядро микробиома, могут значительно отличаться между особями, при этом оставаясь достаточно постоянными в течение всей жизни (Dore J., 2010). Кроме того, микрофлора, оказывая влияние на иммунную систему, находится под ее жестким контролем, в связи с чем следовало ожидать, что нормальные показатели микрофлоры у мышей линии Balb/с будут отличны от таковых у беспородных мышей или мышей других линий. Введение антибиотиков широкого спектра действия канамицина и тетрациклина вызвало значительные изменения состава микрофлоры толстой кишки. Наиболее выраженные изменения выявлялись среди «нормальных» - ферментирующих форм кишечной палочки, которые практически не обнаруживались у экспериментальных животных. Менее выраженные изменения наблюдались среди неферментирующих E. coli и других условно-патогенных энтеробактерий (рис. 1). Причиной большей устойчивости условно-патогенных энтеробактерий к действию антибиотиков является, на наш взгляд, 8 наличие в их геномах генов лекарственной устойчивости, входящих в состав так называемых «островов и островков патогенности» (Бондаренко В.М., 2001). Локализованные на бактериальных плазмидах, «островки патогенности» получили широкое распространение в популяциях патогенных и условно-патогенных микроорганизмов за счет их горизонтального переноса в пределах не только вида, но и между представителями различных родов и даже семейств (Козловский Ю.Е. и соавт., 2007). Выраженные изменения выявлены в группе кокков. Так, энтерококки Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis высевались только у мышей контрольной группы (рис. 1). Выявленные у мышей после применения антибиотиков изменения микробиома коррелируют с изменениями при дисбиозе у человека (Кононенко В.В. и соавт., 1998). Представители других систематических групп – бифидобактерии и лактобациллы, оказались менее чувствительны к действию антибиотических препаратов (рис. 1). Подобная стабильность количественного состава лактобацилл и бифидобактерий и их устойчивость к действию антибиотиков in vivo, наблюдавшаяся нами в эксперименте, соответствует результатам, полученным другими авторами (Колганова Т.В., 2003; Гатаулшин А.Г.,2005). Таким образом, по данным анализа основных представителей просветной микрофлоры толстой кишки экспериментальных животных после курсового введения канамицина и тетрациклина, становится очевидным, что антибиотики оказали выраженное угнетающее воздействие на микробиоценоз, присущий в норме желудочно-кишечному тракту мышей Balb/с. Наблюдаемые у мышей изменения качественного и количественного состава просветной микрофлоры – элиминация отдельных и снижение численности ряда других представителей нормофлоры, а также частичное замещение их на апатогенную микрофлору можно расценивать, как первичное дисбиотическое состояние. Морфологические дисбиотическим изменения состоянием тонкой кишки характеризовались у мышей гипертрофией с и первичным гиперплазией (увеличением объемной доли) слизеобразующих бокаловидных клеток, повышением показателя содержания нейтрофилов среди клеточных элементов собственной пластинки слизистой оболочки, увеличением количества межэпителиальных лимфоцитов (табл. 1). В толстой кишке мышей после курсового введения антибиотиков при морфометрическом исследовании выявлено достоверное увеличение толщины слизистой оболочки, увеличение числа нейтрофилов в собственной пластинке слизистой оболочки и увеличение объемной доли бокаловидных клеток (табл. 2). 9 Таблица 1. Морфометрическая характеристика слизистой оболочки тонкой кишки мышей Balb/с при первичном дисбиозе и его коррекции пробиотиками № Группа Наблюдений 1 Контроль 2 Антибиотики Пробиотик Энтероцин 4 Пробиотик Колибактерин 5 Через 30 сут после окончания введения Энтероцина 6 Через 30 сут после окончания введения Колибактерина Достоверность 1-2 различий 1-3 1-4 1-5 1-6 3-4 5-6 3 Объемная плотность собственной пластинки слизистой оболочки, (%) Бокаловид- Эпителиаль- Клетки Строма ные клетки ные стромы клетки 0,6±0,2 91,8±0,9 2,0±0,4 5,0±0,5 Кол-во Нейтрофилов в п/з) Кол-во МЭЛ (на 100 эп-в) 1,8±0,4 2,7±0,33 1,3±0,2 90,2±1,9 3,4 ±0,5 5,1±0,9 4,3±0,5 3,9±0,48 0,6±0,2 93,7±0,7 1,5 ±0,4 4,2±0,6 3,9±0,6 8,1±0,45 0,8 ±0,2 92,5±0,7 1,4±0,3 5,3±0,5 3,5±0,7 4,2 ± 0,5 0,3±0,1 92,4±0,6 2,7±0,4 4,6±0,2 2,8±0,6 2,6± 0,3 0,8 ±0,2 92,8±0,4 2,8±0,2 3,6±0,2 1,8±0,4 1,2± 0,1 < 0,01 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 <0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 <0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,01 < 0,05 <0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,01 < 0,01 > 0,05 < 0,01 < 0,01 < 0,01 В печени мышей после курсового введения антибиотиков балочное и дольковое строение сохранено, гепатоциты с зернистой эозинофильной цитоплазмой. При морфометрическом исследовании выявлено достоверное снижение числа внутридольковых лимфоцитов и неэпителиальных клеточных элементов (табл. 3). В тимусе мышей после курсового введения антибиотиков определялось очаговое опустошение коркового слоя, граница между корковым и мозговым слоем была очаговонечеткая. При морфометрическом исследовании показатель отношения коркового слоя к мозговому был достоверно ниже контрольного (табл.4). В селезенке мышей после курса антибиотиков преобладала белая пульпа, часть лимфоидных узелков была со светлыми центрами, зона ПАЛМ выражена слабо. При морфометрическом исследовании селезенки выявлено достоверное увеличение показателя объемной доли светлых центров лимфоидных узелков и снижение зоны ПАЛМ (табл. 5). Эти данные частично совпадают с результатами других исследователей. В исследовании 10 Таблица 2. Морфометрическая характеристика слизистой оболочки толстой кишки мышей Balb/с при первичном дисбиозе и его коррекции пробиотиками № Группа наблюдений 1 Контроль Бокалови дные клетки 2,6±0,4 Объемная плотность (%) Эпителиа Клетки Строма льные стромы клетки 87,1 ±3,4 1,3±0,4 9,0±0,1 2 Антибиотики 8,6±1,5 70,0±4,1 7,4 ±1,4 8,2±0,7 80,6±3,4 5,8 ±0,7 0,7±0,3 Толщина слизистой оболочки в мкм 181,2±6,4 14,0±2,1 3,0 ±0,6 222,6±6,0 3,2 ±0,4 8,0±0,8 3,0 ±0,9 168,1±4.2 81,1±3,0 4,0±0,5 9,1±0,8 2,3 ±0,8 170,0±6,0 4,9±1,0 86,7 ±3,2 3,4±0,2 5,0±0,4 2,7 ±1,1 146,0±3,5 Через 30 сут после оконч.введ. колибактерина 5,2±1,2 84,5±2,0 3,3±0,3 7,0±0,5 2,6 ±0,6 140,0±2,0 Достовернос 1-2 ть различий 1-3 1-4 1-5 1-6 3-4 5-6 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,05 < 0,05 < 0,05 > 0,05 < 0,01 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,01 < 0,01 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,01 > 0,05 > 0,05 < 0,01 < 0,01 > 0,05 > 0,05 3 Пробиотик энтероцин 4 Пробиотик колибактерин 5 Через30сут после окончания введ. энтероцина 6 Кол-во нейтрофилов в поле зрения Э.Г. Щербаковой (1998) при введении больших доз антибиотиков в слизистой оболочке тонкой кишки у крыс наблюдали морфологические признаки токсического энтерита с увеличением числа межэпителиальных лимфоцитов, уменьшением объемной доли бокаловидных клеток. По данным И.А. Дьяченко (2007) при гистологическом исследовании толстой кишки крыс после перорального введения ампициллина в дозе 500 мг/кг в течение 14 сут выявлена картина токсического колита, характеризовавшаяся дистрофией поверхностных эпителиоцитов и полнокровием сосудов. По данным Т.И. Хомяковой с соавт. (2010) при внутрижелудочном введении имипенема мышам отмечались реактивные изменения структуры селезенки: опустошение белой пульпы, уменьшение толщины коркового слоя. В тонкой кишке наблюдались выраженные реактивные изменения: гипертрофия и гиперплазия бокаловидных клеток, отек и инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки лейкоцитами и нейтрофилами. По данным Н.М. Грачевой с соавт. (2007) при дисбактериозах у человека наблюдается морфологическая картина катарального колита, характеризующегося увеличением числа 11 Таблица 3. Количество лимфоцитов и неэпителиальных клеточных элементов в печени мышей Ваlb/c при первичном дисбиозе и его коррекции пробиотиками № Количество клеточных элементов в поле зрения х 900 Группа Наблюдений 1 Контроль 1,2 ± 0,1 0,6 ±0,2 Неэпителиальные элементы (НПЭ) 11,0 ±1,0 2 Антибиотики 0,3 ± 0,1 1,0 ±0,3 5,0 ±0,6 3 Пробиотик колибактерин Пробиотик энтероцин 2,0 ± 0,1 0,9 ±0,3 12,1 ±0,9 0,5 ± 0,1 0,8 ± 0,1 12,0 ±1,0 0,6 ±0,2 0,2 ±0,1 9,2 ±0,8 0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,1 9,7 ±1,0 < 0,01 > 0,05 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 > 0,05 < 0,01 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,01 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,01 < 0,01 >0,05 > 0,05 4 Через 30 сут после оконч. введения колибактерина 6 Через 30 сут после оконч. введения энтероцина Достоверность 1-2 различий 1-3 1-4 1-5 1-6 2-3 2-4 3-4 5-6 Лимфоциты Нейтрофилы 5 бокаловидных клеток, объемной плотности клеточного инфильтрата в собственной пластинке слизистой оболочки.Таким образом, после курсового внутрижелудочного введения смеси тетрациклина и канамицина мышам Balb/с у них развивалось первичное дисбиотическое состояние, которое характеризовалось изменениями в группах энтеробактерий и энтерококков, при сохранении бифидо- и лактофлоры. Первичное дисбиотическое состояние сочеталось с реактивными морфологическими изменениями тонкой, толстой кишки, печени и иммунной системы. 12 Таблица 4. Морфометрическая характеристика тимуса мышей Balb/с при первичном дисбиозе и его коррекции его пробиотиками № Группа наблюдений 1 Контроль 2 Антибиотики 3 Пробиотик энтероцин 4 Пробиотик колибактерин 5 Через30 сут после оконч. введения энтероцина 6 Через 30 сут после оконч. введения колибактерина 1-2 Достоверность 1-3 различий 1-4 1-5 1-6 3-4 5-6 Объемная доля функциональных зон тимуса (%) Корковый слой Мозговой слой 72,5 ± 2,3 27,5 ± 2,3 63,6 ±1,3 36,3± 1,3 63,5 ± 1,4 36,5 ±1,4 73,3 ± 2,1 26,7±2,1 68,4 ±1,4 31,6 ± 1,5 Соотношение К/М 2,9 ±0,4 1,8± 0,1 1,8 ± 0,1 3,0 ±0,3 2,3 ±0,1 67,0 ±1,5 33,0 ± 1,4 2,1±0,1 < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 Таблица 5. Морфометрическая характеристика функциональных зон селезенки мышей Balb/с при первичном дисбиозе и его коррекции пробиотиками Группа наблюдений № 1 Контроль 2 Антибиотики 3 Пробиотик Энтероцин 4 Пробиотик колибактерин 5 Через30сут после оконч.введ. энтероцина 6 Через30сут после оконч.введ. колибактерина Достовер- 1-2 ность 1-3 различий 1-4 1-5 1-6 3-4 5-6 Объемная доля функциональных зон селезенки Лимфоидны Светлый ПАЛМ Красная е фолликулы центр пульпа Соотношение БП/КП 35,9±2,0 40,0 ±1,9 42,8± 3,3 9,6±0,9 17,2± 1,2 18,3 ±1,5 19,3±1,3 14,7± 1,7 13,4± 0,9 44,8± 2,1 45,3± 2.0 43,8± 2,9 1,2 ± 0,2 1,2±0,1 1,3±0,3 35,6 ±1,5 21,9± 1,2 15,3± 0,6 49,1± 2,3 1,0±0,2 37,6± 4,6 18,8 ±3,3 16,3 ±1,4 46,1± 2,2 1,1±0,1 37,8 ±5,9 22,2± 2,1 15,7± 1,1 46,5± 2,5 1,1±0,03 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 >0,05 >0,05 <0,05 <0,01 <0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 >0,05 >0,05 > 0,05 > 0,05 13 Состав просветной микрофлоры и морфологические изменения тонкой, толстой кишки, печени и органов иммунной системы после курсового введения пробиотиков После коррекции первичного дисбиотического состояния пробиотиками энтероцин и колибактерин состав просветной микрофлоры мышей изменился: нормализовалось количество энтеробактерий, появились ферментирующие эшерихии, что отражает частичное восстановление микробиома (рис. 2). 1,00E+09 * 1,00E+08 * * * 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 * * 1,00E+04 * * * 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Контроль 1- lac - 2- lac + 1 2 3 4 5 Антибиотики 3- Энтерококки 1 2 3 4 5 Энтероцин 4- Бифидобактерии Колибактерин 5- Лактобактерии *- различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой Рис. 2. Количественный и качественный состав просветной микрофлоры мышей BALB/c после курсового введения антибиотиков и после коррекции первичного дисбиоза пробиотиками энтероцин и колибактерин На основании полученных данных нельзя сказать, что введенные мышам Balb/с пробиотические штаммы колонизировали кишечник, поскольку их способность к колонизации в суспензионной форме подвергается сомнению (Del Piano M., 2010). В связи с этим, определяемые в фекалиях ферментирующие энтеробактерии могут в действительности иметь источником пробиотический штамм, который, проходя через желудочно-кишечный тракт, активно выделяет метаболиты, позитивно действующие на барьерную функцию кишечника. Тем не менее, после курса пробиотиков, количество ферментирующих эшерихий в составе просветной микрофлоры практически сравнялось с таковым в контрольной группе животных. Возросло количество бифидобактерий и 14 лактобацилл после введения колибактерина, после энтероцина количество как бифидо-, так и лактобактерий снижалось. Неоднозначные результаты были получены среди представителей рода Enterococcus. У животных контрольной группы статистически достоверные изменения качественного и количественного состава энтерококков на всех стадиях эксперимента не фиксировались. В группе животных, получавших пробиотик энтероцин, наблюдалось восстановление количества энтерококков. В группе мышей, получавшей колибактерин, представители рода Enterococcus в составе просветной микрофлоры обнаружены не были (Рис. 2), что может быть связано наличием антагонистических взаимодействий между ними и пробиотическим штаммом. Данные в пользу этого предположения были получены в опытах in vitro при длительном совместном культивировании в бинарных культурах на плотной питательной среде штамма E.coli M17 (штамм, на основе которого был создан колибактерин) и индигенных энтерококков (Чертович Н.Ф. с соавт., 2008). В слизистой оболочке тонкой кишки мышей после коррекции дисбиоза при гистологическом исследовании патологических изменений не выявлялось. При морфометрическом исследовании показатель объемной доли бокаловидных клеток достигал контрольных значений. Число межэпителиальных лимфоцитов в группе мышей, получавших энтероцин, статистически значимо увеличивалось, а в группе, получавшей колибактерин, достоверно не изменялось, число нейтрофилов в собственной пластинке слизистой оболочки достоверно не менялось относительно мышей после курса антибиотиков (табл. 1). Это отражает реактивные изменения тонкой кишки в ответ на введение пробиотика и коррелирует с данными других исследователей (Калмыкова А.И. с соавт., 2005). В слизистой оболочке толстой кишки мышей после курсового введения пробиотиков при гистологическом исследовании выявлялось большое количество бокаловидных клеток, в собственной пластинке слизистой оболочки определялась слабо выраженная очаговая инфильтрация клеточными элементами. По данным морфометрического исследования толщина слизистой оболочки толстой кишки после курса обоих пробиотиков была достоверно ниже, чем в группе мышей после курса антибиотиков, показатели достоверно не отличались от контроля. Показатель объемной доли бокаловидных клеток у мышей, получавших энтероцин, достоверно не изменялся; у мышей, получавших колибактерин, достоверно снижался, но не достигал контрольных значений. Число нейтрофилов статистически значимо не отличалось от такового у мышей после курса антибиотиков (табл. 2). По данным В.Н. Афонюшкина с соавт. (2007) у крыс после введения пробиотика SL-бактерина на фоне антибиотик-индуцированного дисбиоза 15 наблюдалась гипертрофия и гиперплазия бокаловидных клеток в тонкой кишке, увеличивалась толщина слизистой оболочки толстой кишки и отмечалась воспалительная инфильтрация ее стромы. В исследовании И.Т. Щербакова (1999) при применении пробиотика бифидумбактерина у человека при острых кишечных инфекциях различной этиологии выявилась нормализация показателя толщины собственной пластинки слизистой оболочки толстой кишки, числа межэпителиальных лимфоцитов, уменьшалась выраженность воспалительной инфильтрации слизистой оболочки. В печени мышей после коррекции дисбиоза пробиотиками энтероцином и колибактерином выявлялась умеренно выраженная гиалиново-капельная дистрофия гепатоцитов, преимущественно периферических отделов долек. При морфометрическом исследовании число внутридольковых лимфоцитов в группе мышей, получавших энтероцин, было достоверно ниже контрольных значений, а в группе, получавшей колибактерин, статистически значимо не изменялось. Показатель содержания неэпителиальных клеточных элементов по ходу печеночных балок по сравнению с группой мышей, получавших антибиотики, достоверно возрастал и не отличался от контроля (табл. 3). В тимусе после коррекции нарушений состава микрофлоры энтероцином, выявлялось очаговое опустошение коркового слоя, а после применения колибактерина отмечалось его расширение. При морфометрическом исследовании тимуса после применения энтероцина показатель отношения коркового слоя к мозговому был достоверно ниже контрольных значений, и не отличался от группы мышей после курса антибиотиков. В группе мышей, получавшей колибактерин, этот показатель достигал контрольных значений (табл. 4). В селезенке при гистологическом исследовании после применения пробиотика энтероцина преобладала белая пульпа, большая часть лимфоидных узелков была со светлыми центрами, зона ПАЛМ слабо выражена. После применения колибактерина, в селезенке также преобладала белая пульпа, в большинстве лимфоидных узелков определялись крупные зародышевые центры, зона ПАЛМ, также как и в группе, получавшей энтероцин, была выражена слабо. При морфометрическом исследовании после применения энтероцина объемная доля светлых центров и зоны ПАЛМ не отличалась от группы, получавшей антибиотики. После применения колибактерина увеличивался показатель объемной доли светлых центров лимфоидных узелков, показатель объемной доли зоны ПАЛМ достоверно не менялся по сравнению с мышами после курса антибиотиков (табл. 5). 16 Состав просветной микрофлоры и морфологические изменения тонкой, толстой кишки, печени и органов иммунной системы через 30 сут после курсового введения пробиотиков При изучении действия пробиотиков энтероцина и колибактерина через 30 сут после окончания коррекции первичного дисбиотического состояния в составе просветной микрофлоры мышей произошли следующие изменения: в группе мышей, получавших энтероцин, качественный и количественный состав микрофлоры нормализовался (рис. 3). Тогда как у мышей, получавших колибактерин, не обнаруживались характерные для нормофлоры представители рода Enterococcus. В обеих группах мышей, получавших энтероцин и колибактерин, наблюдалось замещение условнопатогенных неферментирующих энтеробактерий нормальными, ферментирующими эшерихиями, но в группе, получавшей энтероцин, количество последних было на порядок больше, чем в группе, получавшей колибактерин (рис. 3). Объяснением этому факту может служить то, что оба пробиотика обладают значительным антагонизмом по отношению к систематически близким энтеробактериям и способны эффективно вытеснять их из состава микробиоты. В то же время, штамм E. coli M 17, на основе которого создан колибактерин, в отличие от штамма E. coli EB 429, послужившего основой для разработки энтероцина, не обладает достаточной адгезией к эпителию кишечника мыши и постепенно элиминируется из желудочно-кишечного тракта подопытных животных. Следствием этого было более низкое содержание ферментирующих эшерихий в группе мышей, получавших колибактерин. Количество бифидобактерий и лактобактерий в группе, получавшей энтероцин, достигло контрольных значений, в группе, получавшей колибактерин, количество бифидо- и лактобактерий понизилось. При гистологическом исследовании слизистой оболочки тонкой кишки на 30-е сут после курсового введения колибактерина и энтероцина, показатели объемной доли бокаловидных клеток нормализовались. Число межэпителиальных лимфоцитов после применения энтероцина соответствовало контрольным значениям, а после применения колибактерина этот показатель был меньше контрольных значений. Показатель числа нейтрофилов после коррекции дисбиоза энтероцином и колибактерином нормализовался (табл. 1). В слизистой оболочке толстой кишки реактивные изменения сохранялись – толщина слизистой оболочки была ниже контрольных значений, выраженность гиперплазии бокаловидных клеток значительно уменьшалась, однако не достигала контрольных значений, сохранялась слабо выраженная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки лимфоцитами, гистиоцитами и единичными нейтрофилами (табл. 2). 17 1,00E+09 1,00E+08 * * 1,00E+07 1,00E+06 * 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 1- lac - 1 2 3 4 Контрольная 2- lac + 5 1 2 3 4 5 Энтероцин ч/з 30 сут после оконч 1 4- Бифидобактерии 3- Энтерококки 2 3 4 5 Колибактерин ч/з 30 сут после оконч 5- Лактобактерии *- различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой Рис. 3. Количественный и качественный состав просветной микрофлоры мышей BALB/c через 30 сут после окончания курсового введения пробиотиков энтероцина и колибактерина В печени при использовании обоих пробиотиков дистрофические изменения не выявлялись, морфологическая картина печени не отличалась от таковой у мышей контрольной группы. Тимус мышей, получавших энтероцин и колибактерин, имел нормальное строение и не отличался от такового в контрольной группе. В селезенке показатель объемной доли зоны ПАЛМ соответствовал контрольным значениям, а светлых центров лимфоидных узелков оставался выше контрольных значений (табл. 5). Таким образом, пробиотические штаммы, несмотря на многочисленные благоприятные эффекты, не эквивалентны собственной индигенной микрофлоре и не способны размножаться в кишечнике. Одной из причин этого может быть бионесовместимость с резидентными бактериями хозяина (Глушанова Н.А., Блинов А.И., 2005). Даже наиболее эффективные пробиотики действуют только во время курса лечения и обнаруживаются в кале лишь в течение 3–7 сут после его окончания (Катт М.A., 2001). Поэтому, для достижения устойчивого терапевтического эффекта, во-первых, необходим длительный или даже постоянный прием пробиотиков, во-вторых, желательно, чтобы 18 пробиотический препарат представлял собой штаммы нормобиоты, максимально совместимые с резидентными штаммами (Корниенко Е.А., 2007). Курсовое введение канамицина и тетрациклина приводит к нарушению состава микрофлоры кишечника. При коррекции дисбиотического состояния пробиотиками энтероцином и колибактерином произошла нормализация микрофлоры, однако эффект пробиотика энтероцин выражен в большей степени, чем пробиотика колибактерин, о чем свидетельствует более высокое содержание ферментирующих эшерихий, нормализация количества энтерококков у мышей, получавших энтероцин, и отсутствие энтерококков у мышей, получавших колибактерин. Введение антибиотиков вызывает реактивные изменения тонкой и толстой кишки, характеризующиеся гиперплазией бокаловидных клеток, увеличением содержания межэпителиальных лимфоцитов и нейтрофилов, это коррелирует с данными Калмыковой А.И. и соавт, (2005). После коррекции первичного дисбиоза пробиотиками энтероцином и колибактерином сохраняются структурные изменения слизистой оболочки тонкой кишки в ответ на введение пробиотика. Выявленные структурно-функциональные изменения тимуса и селезенки после введения антибиотиков и пробиотиков являются неспецифической реакцией, развивающейся в ответ на их введение и с функциональной точки зрения указывают на активацию иммунной системы. Через 30 сут после коррекции дисбиотического состояния пробиотиками энтероцин и колибактерин морфологическая картина в тонкой кишке, печени, тимусе и селезенке практически не отличались от контроля, но сохранялись реактивные морфологические изменения слизистой оболочки толстой кишки. Это, видимо, обусловлено тем, что основная масса бактерий находится именно в толстой кишке, поэтому восстановление ее микрофлоры под действием пробиотиков сочетается с длительно сохраняющимися реактивными морфологическими изменениями ее слизистой оболочки. ВЫВОДЫ 1. Курсовое введение канамицина и тетрациклина в терапевтических дозах (250 мг/кг) вызывает у самцов мышей линии Balb/с развитие первичного дисбиотического состояния, реактивных морфологических изменений слизистой оболочки тонкой и толстой кишки, печени и органов иммунной системы. 2. Первичное дисбиотическое состояние, индуцированное у мышей Balb/с курсовым введением антибиотиков широкого спектра действия, характеризуется качественным и количественным нарушением состава микрофлоры 19 с уменьшением числа неферментирующих энтеробактерий, исчезновением ферментирующих энтеробактерий и энтерококков, сохранением лакто- и бифидофлоры. 3. При первичном дисбиозе реактивные изменения слизистой оболочки тонкой и толстой кишки характеризуются статистически значимым увеличением объемной доли бокаловидных клеток и абсолютного числа нейтрофилов. В толстой кишке, кроме того, определяются гиперплазия и лимфоидно-гистиоцитарная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки, в тонкой кишке увеличивается показатель числа межэпителиальных лимфоцитов. В печени снижается абсолютное число неэпителиальных клеточных элементов и внутридольковых лимфоцитов. 4. Развитие первичного дисбиоза сопровождается изменением морфофункционального состояния органов иммунной системы. В тимусе уменьшается объемная доля коркового слоя, в селезенке снижается объемная доля периартериолярных лимфоидных муфт и увеличивается доля светлых центров лимфоидных узелков. 5. При коррекции микробиоценоз первичного дисбиоза желудочно-кишечного колибактерином тракта у мышей и энтероцином Balb/с частично восстанавливается. При применении индигенного пробиотика энтероцина наблюдается восстановление видового состава нормофлоры и количества одного из основных компонентов При микробиома – бифидобактерий. использовании препарата колибактерина среди видового состава нормофлоры не происходит восстановления группы энтерококков. 6. После коррекции первичного дисбиотического состояния пробиотиками энтероцин и колибактерин выраженность реактивных морфологических изменений в тонкой и толстой кишке, в целом, уменьшается. В тонкой кишке показатель объемной доли бокаловидных клеток нормализуется, показатель числа нейтрофилов в строме слизистой оболочки снижается. Число межэпителиальных лимфоцитов при использовании пробиотика энтероцин статистически значимо увеличивается. В слизистой оболочке толстой кишки отмечается нормализация показателя толщины слизистой оболочки, снижение выраженности лимфоидно-гистиоцитарной инфильтрации стромы, а показатели объемной доли бокаловидных клеток и числа нейтрофилов остаются повышенными. 7. После коррекции первичного дисбиотического состояния пробиотиком энтероцин объемная доля коркового слоя тимуса остается сниженной, а после применения колибактерина этот показатель нормализуется. После применения обоих пробиотиков по сравнению с контрольной группой мышей реактивные изменения в селезенке сохраняются: показатели объемной доли периартериолярных лимфоидных муфт остаются ниже контрольных значений, а светлых центров лимфоидных узелков – выше. 20 8. Выявлены принципиальные отличия взаимодействия с микробиомом пробиотиков колибактерина и энтероцина в отдаленном периоде (30 сут) после их применения. Индигенный пробиотик энтероцин приводит к восстановлению качественного и количественного состава всех групп бактерий, за исключением ферментирующих эшерихий, количество которых превышает показатели контрольной группы. При использовании для коррекции дисбиоза колибактерина восстановления энтерококков не происходит, количество лакто- и бифидобактерий по сравнению с контролем достоверно снижается и дисбиотические изменения сохраняются 9. По данным морфометрического исследования через 30 сут после коррекции дисбиоза обоими пробиотиками реактивные изменения сохраняются только в толстой кишке и селезенке. В толстой кишке сохраняется увеличение показателей объемной доли бокаловидных клеток и числа нейтрофилов в собственной пластинке слизистой оболочки. В селезенке сохраняется увеличение объемной доли светлых центров лимфоидных узелков. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Овчарова А.Н., Алексанкин А.П., Тихонова Н.Б., Козловский Ю.Е, Серебряков С.Н. Сравнительная оценка эффективности действия пробиотиков Энтероцин и Колибактерин при экспериментальном дисбактериозе. //Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы клеточного пушного звероводства России», Москва, 2007.- с.223-227. 2. Овчарова А.Н. Морфологическая характеристика иммунной системы мышей BALB/с при нарушении состава микрофлоры и коррекции его пробиотиками «Энтероцин» и «Колибактерин» //Материалы научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии, Москва, 2008. - с.118-122. 3. Овчарова Козловский А.Н., Михайлова Л.П., Серебряков Ю.Е., Матевосян К.Ш., Тихонова С.Н., Н.Б. Макарова О.В., Морфологическая характеристика иммунной системы мышей Balb/c при нарушении состава микрофлоры и коррекции его пробиотиками «энтероцин» и «колибактерин» //Российский медико-биологический вестник им. академика И.П. Павлова, 2009. №1 - с. 8-18 4. Кактурский Л.В., Михайлова Л.П., Овчарова А.Н., Козловский Ю.Е., Серебряков С.Н., Тихонова Н.Б.. Морфологическая характеристика тонкой и толстой кишки мышей Balb/c при 21 нарушении состава микрофлоры, индуцированном антибиотиками.// Морфологические ведомости, 2011. - №2. - с. 36-43 5. Хомякова Т.И., Хомяков Ю.Н., Козловский Ю.Е., Макарова О.В., Овчарова А.Н., Михайлова Л.П. Морфологические изменения слизистой оболочки тонкой и толстой кишки при первичном дисбиозе и его коррекции пробиотиками //Материалы международной научной конференции по пробиотикам и пребиотикам, Словакия, 2011, с. 43. Соискатель А.Н. Овчарова 22
