На правах рукописи Аллянова Марина Сергеевна диссертации на соискание ученой степени
реклама
На правах рукописи Аллянова Марина Сергеевна Роль агглютининов и неагглютинирующих белков Rhizobium leguminosarum в формировании симбиоза 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2012 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Карпунина Лидия Владимировна Официальные оппоненты: Тихомирова Елена Ивановна доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный технический университет им. Ю.А. Гагарина», заведующая кафедрой «Экология» Соболева Елена Федоровна кандидат биологических наук ФГБУН «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН», младший научный сотрудник лаборатории биохимии Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет МСХА им. К. А. Тимирязева Защита диссертации состоится «21» июня 2012 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ». Автореферат диссертации разослан «___»________ 2012 г. Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл.1, ученому секретарю диссертационного совета. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Симбиоз между бобовыми растениями и клубеньковыми бактериями (ризобиями) вносит существенный вклад в баланс азота почвы. Сохранение и повышение почвенного плодородия за счет использования бобоворизобиальных систем составляет основу «биологического земледелия» и на сегодняшний день является одним из перспективных подходов по сравнению с производством и применением минеральных азотных удобрений. Много лет ризобии привлекают внимание ученых благодаря способности взаимодействовать с растениями и при этом специфически модифицировать их развитие (Шумный, 1991; Сидорова, 2006). Значительное внимание в последнее время уделяется вопросам изучения поверхностных структур бактериальных и растительных клеток, с помощью которых осуществляется их взаимодействие при формировании ассоциативных и симбиотических систем, в частности, лектинам бактерий. Имеются сведения о том, что лектины (агглютинины) почвенных азотфиксирующих бактерий проявляют адгезивные свойства и принимают самое непосредственное участие в процессе прикрепления их к корням растений (Карпунина, Никитина, Трихачева, 1989; Никитина, Итальянская, Карпунина, 1989; Никитина и др., 1994; Никитина и др., 1996; Аленькина, Никитина, 1997; Карпунина, Соболева, 2001; Карпунина, 2002). Лектины азоспирилл, бацилл и агглютинины ризобий взаимодействуют с различными компонентами корней растений, для некоторых из них выделены растительные рецепторы (Карпунина, 1995; Никитина и др., 2002; Молекулярные основы…, 2005). Несмотря на это, физиологические, молекулярные и другие механизмы, предшествующие образованию и функционированию азотфиксирующих систем как ассоциативных, так и симбиотических остаются недостаточно изученными. Встречаются публикации относительно влияния поверхностных структур партнеров (экзо- и липополисахаридов) бактерий, а также лектинов растений на нодуляционную активность ризобий и эффективность их симбиоза с растениями (Herouart et al., 2002; Ferguson, Mathesius, 2003; Laus et. al., 2006; Paul et. al. 2006). Практически отсутствуют сведения о влиянии агглютининов ризобий на начальные 4 этапы симбиотических взаимоотношений, в частности, на морфогенез (деформацию) и клубенькообразование корней двудольных растений. В связи с этим исследования, посвященные изучению влияния агглютининов ризобий на начальные этапы процесса образования симбиоза (на деформацию, процессы модуляции проростков корней гороха, формирование и функционирование клубеньков), являются актуальными и представляют значительный научный интерес. Цель работы изучить влияние агглютининов Rhizobium leguminosarum 252 (R1 и R2) и неагглютинирующих белков (R1 и R2) R.leguminosarum 252/7 на формирование симбиоза: деформацию корневых волосков, формирование клубеньков гороха и их ферментативную активность. Задачи исследования: 1. Изучить влияние агглютининов R. leguminosarum 252 (R1 и R2) и неагглютинирующих белков (R1 и R2) R. leguminosarum 252/7 на деформацию корневых волосков гороха (Pisum sativum). 2. Исследовать влияние агглютининов R1 и R2 и неагглютинирующих белков R1 и R2 на процесс образования клубеньков. 3. Определить пектинолитическую, протеолитическую активность, а также активность щелочной и кислой фосфатаз в клубеньках гороха при взаимодействии их с агглютинирующими и неагглютинирующими белками ризобий. 4. Исследовать влияние агглютининов и неагглютинирующих белков ризобий на активность метлегоглобинредуктазы, глутаматсинтетазы и пероксидазы клубеньков гороха. Научная новизна работы Впервые обнаружена способность агглютининов R1, R2 R. leguminosarum и белка R1 R. leguminosarum 252/7 увеличивать количество деформаций корневых волосков корней гороха. Показано, что агглютинирующие и неагглютинирующие белки ризобий оказывают влияние на морфологию корней проростков гороха. Взаимодействие проростков корней гороха с агглютининами (R1 и R2) R. leguminosarum 252 и белками (R1 и R2) R. leguminosarum 252/7 способствуют 5 формированию клубеньков гороха, в основном, эффективных (R1, R2 и R1), а в случае с неагглютинирующим белком R2 неэффективных клубеньков. Впервые показано, что агглютинины ризобий (R1 и R2) и белки мутантного штамма R. leguminosarum 252/7 (R1 и R2) влияют на активность ряда гидролитических ферментов в клубеньках гороха. Агглютинины R1, R2 и R1 способны увеличивать активность пектиназы, протеолитической, щелочной и кислой фосфатазы, а R2 уменьшать их активность. Агглютинин R1, R2 и белок R1 ризобий приводит к увеличению активности метлегоглобинредуктазы, и глутаматасинтетазы, а R2 к уменьшению активности оксидоредуктаз. Пероксидазная активность увеличивалась при взаимодействии с белками R1 и R1 и уменьшалась с R2 и R2 клубеньковкорней гороха. Практическая значимость Полученные результаты по изучению влияния агглютининов R. leguminosarum 252 (R1 и R2) и неагглютинирующих белков R. leguminosarum 252/7 (R1 и R2) на деформацию корневых волосков, клубенькообразование корней гороха и их ферментативную активность расширяют имеющиеся представления о формировании и функционировании бобово – ризобиального симбиоза, что в перспективе может найти применение в агробиценозах в качестве экологически недорогого азотного удобрения. По материалам диссертационной работы опубликованы методические рекомендации «Изучение влияния агглютининов Rhizobium leguminosarum 252 на активность ферментов в клубеньках гороха» для практических занятий студентов старших курсов, а также для работы аспирантов и научных работников, специализирующихся в области микробиологии, биохимии и физиологии растений, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные ученым советом факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (протокол № 41 от 29.04.10 г.). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова». 6 На защиту выносятся следующие положения: 1. Агглютинины R. leguminosarum 252 R1 и R2, и неагглютинирующий белок R1 R. leguminosarum 252/7 приводят к увеличению, а R2 к уменьшению количества деформаций корневых волосков корней гороха (Pisum sativum). 2. Агглютинины и неагглютинирующие белки ризобий оказывают влияние на морфологию корней проростков гороха, приводя к редукции боковых корней и увеличению длины главного корня при их взаимодействии с агглютинином R1 и белком R1. Напротив, при взаимодействии корней проростков гороха с агглютинином R2 и белком R2 – к развитию боковых корней и уменьшению длины главного корня. 3. Агглютинины R1, R2 и белок R1 оказывают воздействие на образование эффективных клубеньков. 4. Под действием агглютининов и неагглютинирующего белка R1 ризобий увеличивается активность ряда гидролитических ферментов (пектиназы, протеазы, щелочной и кислой фосфатазы) в клубеньках гороха. 5. Агглютинины R1, R2 и неагглютинирующий белок R1 приводят к увеличению метлегоглобинредуктазной и глутаматсинтетазной активности оксидоредуктаз, а R2 к уменьшению их активности. Пероксидазная активность в клубеньках гороха увеличивалась при взаимодействии с белками R1 и R1 и уменьшалась c R2 и R2. Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии факультета ветеринарной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» в рамках научноисследовательской темы: «Роль биологически активных веществ (лектины, экзополисахариды) в регуляции метаболизма про- и эукариот». Апробация работы Материалы диссертации были представлены на: конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по итогам научноисследовательской и учебно-методической работы (Саратов, 2003; 2004); Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007); четвёртой Межрегиональных конферен- 7 циях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2008); Всероссийской молодёжной выставке конкурсе прикладных исследований, изобретений и инноваций (Саратов, 2009); конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской, учебно-методической и воспитательной работы (Саратов, 2012). Личный вклад соискателя состоит в подготовке и проведении научных экспериментов, решаемых в рамках диссертационной работы, интерпретации полученных результатов и подготовке публикаций. Публикации По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и экспериментальной части, включающей в себя объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка используемых литературных источников. Работа изложена на 114 страницах, содержит 6 таблиц и 8 рисунков. Список использованных литературных источников включает 232 наименования, в том числе 146 зарубежных. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объект, материалы и методы исследований Объектом исследования являлись агглютинины R1 и R2, выделенные с поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae 252, и неагглютинирующие белки R1 и R2, мутантного штамма R. leguminosarum 252/7. Культура R. leguminosarum 252 была получена из Всесоюзной коллекции ВНИИСХМ (г. Санкт-Петербург-Пушкин). Культуру R. leguminosarum 252 и R. leguminosarum 252/7 выращивали при температуре 26 28 C в термостатированной установке для культивирования микроорганизмов (Шейфер – инкубатор ES – 20) при встряхивании 100 об/мин в течение трёх суток на жидкой синтетической среде Т. М. Ковалевской (1984). Да- 8 лее клетки ризобий трижды отмывали физиологическим раствором (0,85% NaCl) путем центрифугирования при 6000 g 10 мин. Очистку агглютининов проводили осаждением двумя объемами спирт-ацетоновой смеси (1:1), высаливанием сульфатом аммония в концентрации 15-20 %, диализом на холоду против дистиллированной воды в течение 12 часов и гель-фильтрацией на колонке с Тоуореагl НW55. В качестве элюента использовали ацетатный буфер рН = 3,6-3,8. Выход белковой фракции регистрировали на приборе Uvicord S-(LKB) при 278 нм (Карпунина, 2002). Гемагглютинирующую активность белков определяли реакцией агглютинации с самопроизвольным осаждением эритроцитов. Реакцию гемагглютинации проводили в планшетах для иммунологических реакций. Бактериальную взвесь готовили на физиологическом растворе (0,15 М NaCl), предварительно три раза отмыв клетки ризобий при 5000 g в течение 3-5 минут (Луцик, 1981). В работе использовали семена гороха сорта Уладовский юбилейный (Pisum sativum), полученные из ВНИИСХ Юго-Востока г. Саратова. Поверхностную стерилизацию семян гороха Уладовский юбилейный (Pisum sativum) проводили концентрированной серной кислотой (Gerhardt, 1969). Выращивание растений гороха (Pisum sativum) сорта Уладовский юбилейный производили в условиях песчаной культуры в специализированных стерильных сосудах ёмкостью один литр, при поддержании влажности на уровне 60 %. В качестве питательного субстрата использовали среду Г. Гельригеля (рН=5,2), приготовленную на дистиллированной воде, с добавлением смеси микроэлементов А2 по С. Хогланду (Гроздинский, 1964). Подсчет клубеньков производили в фазе бутонизации (фаза зрелого клубенька). Количество эффективных и неэффективных клубеньков определяли по методу В. М. Дригальского (Плешков, 1976). Исследование деформации корневых волосков проводили с помощью слайдовой техники Фареуса, модифицированной С. А. Конновой с соавт. (1995). Учитывали все наблюдаемые деформации: образование симметричных и асимметричных вилочек, ветвления, изгибы, скручивания, утолщения на концах корневых волосков и т.д. Морфологические изменения волосков по отдельным образцам реги- 9 стрировали фотоаппаратом Зенит ЕТ (СССР), надеваемым на окуляр при помощи насадки. Суммарную активность протеолитических ферментов определяли по методу К. Preston et al. (1978). Активность фермента выражали количеством микрограммов аланина, образованного в течение 1 мин при данных условиях опыта (37 °C; pH=4,7). Пектинолитическую активность (К.Ф. 3.2.1.1) клубеньков определяли по реакции восстанавливающих сахаров с арсенмолибдатом (Методы химии…, 1967). Активность фермента выражали в мг/мл/20мин/мг белка. Активность щелочной фосфатазы (К.Ф.3.1.3.1) определяли по количеству образующегося в процессе ферментативной реакции n- нитрофенола по методу (Федусов, Михайлов, Жигалина, 1991). Активность щелочной фосфатазы выражали количеством микромолей n-нитрофенола, образованного в течение 30 мин при данных условиях опыта (37 ° C; pH=9,8). Активность кислой фосфатазы (К.Ф.3.1.3.2) определяли по образованию nнитрофенола в результате гидролиза сложноэфирной связи n- нитрофенилфосфата (Филиппович, Егорова, Севастьянова, 1975). Активность кислой фосфатазы выражали количеством микромолей n-нитрофенола, образованного в течение 30 мин при данных условиях опыта (37 °C; pH=4,7). Метлегоглобинредуктазную активность определяли по методу Р. В. Клукаса (Голубева и др., 1988). Активность фермента выражали в мкМ Lb / мин / мг белка. Глутаминсинтетазную активность (К.Ф. 1.4.1.3) определяли по методу В. И. Яковлевой (2001). Активность фермента выражали в мкМ глу/мин/мг белка. Активность пероксидазы (К.Ф. 1.11.1.6) определяли по методу К.З. Гамбурга (Ракитин, 1966). Активность фермента выражали в мкмоль ала/мин/мг белка. Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики по методу И. Ойвина (1960). 10 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Действие агглютининов R. leguminosarum 252 и неагглютинирующих белков R. leguminosarum 252/7 на деформацию корневых волосков и морфологию корней гороха Известно, что одним из наиболее ранних откликов растения на присутствие в окружающей среде бактерий является деформация корневых волосков. По мнению ряда исследователей (Fahraeus, 1957; Ljungren, Fahraeus, 1963; Коннова и др., 1995), деформация корневых волосков проростков может служить количественным показателем отзывчивости растения на инокуляцию. Исследование деформации корневых волосков под влиянием агглютининрующих белков ризобий и клеток мутантного штамма проводили с помощью слайдовой техники Фареуса, модифицированной С. А. Конноновой с соавт. (1995). Трехдневные проростки корней гороха переносили на предметное стекло, корень заливали 0,2 мл минеральной среды (Fahraeus, 1957), содержащей 0,4 % агара, и накрывали покровным стеклом. После застывания агара препараты помещали в пробирки с 5 мл жидкой минеральной среды того же состава (контроль). В опытных образцах в жидкую и полужидкую минеральные среды добавляли агглютинины ризобий (R1 и R2) и неагглютинирующие белки (R1 и R2). Экспериментально были подобраны концентрации агглютининов и агглютинирующих белков, при которых уже наблюдались деформации (не менее 0,1 мг/мл), но еще не происходило их ингибирования (выше 0,3 мг/мл). Исследуемые проростки инкубировали в течение 24 часа в темноте при 25 °С, после чего с использованием светового микроскопа на поляризационно-интерференционном микроскопе Биолар PI подсчитывали количество деформаций на первом сантиметре зоны дифференциации корня. Учитывали все наблюдаемые деформации: образование симметричных и асимметричных вилочек, ветвления, изгибы, скручивания, утолщения на концах корневых волосков. Морфологические изменения волосков регистрировали фотографированием. Проведённые исследования показали (табл. 1), что агглютинины ризобий приводили к увеличению длины главного корня при всех взятых в эксперимент 11 концентрациях (0,1; 0,2; 0,3 мкг/мл), но наибольший результат наблюдался при концентрации 0,3 мкг/мл. Таблица 1 Влияние агглютининов R. leguminosarum 252 (R1 и R2) и неагглютинирующих белков R. leguminosarum 252/7 (R1 и R2) на деформацию корневых волосков проростков гороха Агглютинины и неагглютинирующие белки ризобий, 0,3 мкг/мл R1 Количество деформаций на 1 см длины корня Р 18,9 ± 2,6 < 0,001 R2 3,7 ± 1,0 < 0,001 R1 16,9 ± 2,6 < 0,001 R2 0,8 ± 0,7 < 0,005 Контроль 1,2 ± 1,0 − Деформация корневых волосков при этих концентрациях наблюдалась при взаимодействии корней проростков гороха как с агглютинирующими белками R1 и R2 и составила (при концентрации 0,3 мкг/мл) 18,9 и 3,7 на один см длины корня, так и неагглютинирующими белками и составила для R1 16,9, а с R2, 0,8, что превышало контрольные значения за исключением R'2 (табл. 2). Таблица 2 Влияние концентрации агглютининов R. leguminosarum 252 (R1 и R2) и неагглютинирующих белков R. leguminosarum 252/7 (R1 и R2) на длину главного корня Длина главного корня, мм Концентрация агглютининов ризобий, мкг/мл агглютинины R. leguminosarum 252 с R1 с R2 Р М±m М±m Р неагглютинирующие белки R. leguminosarum 252 с R1 с R2 Р Р М±m М±m 0,1 31 ±1,0 < 0,01 11 ±1,2 < 0,01 64 ± 0,8 < 0,01 11 ±1,2 < 0,01 0,2 64 ±1,1 < 0,01 14 ±0,8 < 0,01 71 ± 1,2 < 0,01 13 ±1,1 < 0,01 0,3 68 ±0,9 < 0,01 14 ±1,1 < 0,01 72 ± 1,1 < 0,01 15 ±0,9 < 0,01 12 Инкубирование корней гороха с агглютининами и неагглютинирующими белками приводило также к изменению морфологии контроль R1 корней проростков гороха. Взаимодействие корней гороха с агглютинином R1 приводило к увеличению длины главного корня в 4,3 ра- 1а за по сравнению с контролем и отсутствию развития боковых корней (рис. 1а). В то время как инукубирование корней гороха с агглютинином R2, напротив, приводило к редукции главного корня, развитию большого количе- контроль R2 ства боковых корней, длина его была меньше, чем в контрольном варианте в 0,8 раза (рис. 1б Рис 1. Влияние агглютининов R1 (а) и R2 (б) на морфологию корней проростков гороха 1б). При добавлении к корням проросткам гороха неагглютинирующих белков (R1 и R2) мутантного штамма R. leguminosarum 252/7 наблюдали аналогичную картину. Было обнаружено, что R1 вызывал увеличение длины контроль R1 главного корня в 4,5 раза по сравнению с контролем, (рис. 2а). а инкубирование корней го- 2а роха с R2 приводило к незначительному уменьшению длины главного корня по сравнению с контролем (табл. 2, рис. 2б). Полученные контроль R2 результаты свидетель- ствуют о том, что агглютинины штамма R. leguminosarum 252 и неагглютинирующие 2б Рис. 2. Влияние неагглютинирующих белков R1 (а) и R2 (б) на морфологию корней проростков гороха белки R. leguminosarum 252/7 по-разному воздействуют на морфологию корней, вызывая их видоизменение. 13 Анализ приведенных данных позволяет предположить, что при инокуляции корней гороха с R1, R2 и R1 происходит стимуляция ростовых процессов в зоне деления корня, что существенно сказывается на метаболизме и, вероятно, приводит к увеличению фитогормонов в растительных клетках. По мнению некоторых исследователей (Ljungren, Fahraeus, 1963; Коннова и др., 1995), деформации могут быть следствием измененного синтеза полисахаридов в стенках корневых волосков или результатом стабилизации тех же клеточных стенок в процессе их роста. Возможно, что деформация корневых волосков проростков может служить количественным показателем отзывчивости растения на инокуляцию (Gaskins, Hubbell, 1979; Abe et al., 1984). Так, инокуляция пшеницы, сорго и других злаков рядом штаммов Azosprillum приводила к возрастанию числа корневых волосков, разветвлений и латеральных корней (Okon, Kapulnik, 1986), удлинению корней, а также увеличению общей корневой поверхности (Kapulnik, Okon, Henis, 1985). Таким образом, способность агглютининов оказывать воздействие на деформацию корневых волосков проростков гороха, свидетельствует об их положительной роли на начальные этапы формирования симбиоза. Влияние агглютининов и неагглютинирующих белков ризобий на образование клубеньков и морфо-физиологический статус растений гороха Кульминацией взаимодействия ризобий и бобовых растений является образование клубеньков. Активное исследование функций бактериальных лектинов в последнее десятилетие позволило раскрыть некоторые механизмы действия лектина на растительную клетку. Однако роль этих белков как модуляторов процесса формирования и функционирования особой симбиотической системы корневых клубеньков (клубенькообразования) бобовых растений остается недостаточно изученной. Было показано, что контрольные растения, корни проростков гороха которых не обрабатывали агглютининами, образовывали эффективные клубеньки (табл. 3). Они имели правильную сферическую форму, были розоватого цвета, располагались равномерно по всей поверхности корневой системы растения (табл. 3). 14 Таблица 3 Влияние агглютининов (R1 и R2) R. leguminosarum 252 и неагглютинирующих белков (R1 и R2) R. leguminosarum 252/7 на формирование клубеньков Агглютинины и неагглютинирующие белки ризобий Характеристика клубеньков бобовых растений Количество клубеньков Р Вид клубеньков R1 18,0 ± 0,9 < 0,001 эффективные R2 10,0 ± 0,6 < 0,05 эффективные R1 12,0 ± 0,6 < 0,001 эффективные R2 7,0 ± 0,2 < 0,001 неэффективные Контроль 7,0 ± 0,3 – эффективные Корни проростков гороха, обработанные агглютининами R1 и R2, так же приводили к образованию эффективных клубеньков, но их количество было больше по сравнению с контролем: с R1 – в 2,5 раза, а с R2 – в 1,4 раза (табл. 3). Они также имели правильную округлую форму, были розоватого цвета, располагались равномерно по всей поверхности корневой системы растения. Клубеньки образовывались и на корнях растений, обработанных неагглютинирующими белками R1 и R2. Однако с R1 образовывались эффективные клубеньки, и количество их было также выше, по сравнению с контролем в 1,7 раза, а с R2 образовались неэффективные клубеньки, количество которых было таким же, как и в контроле (табл. 3). Эти клубеньки имели цилиндрическую (разветвленную) форму, зеленовато-бурый цвет, были существенно мельче (менее 1 мм) чем в контроле и распределялись в основном на кончиках корневой системы. Результаты исследований показали, что предварительная обработка корней проростков гороха агглютининами ризобий и неагглютинирующими белками мутантного штамма приводила к изменению не только способности растениями образовывать клубеньки разного качества, но и способствовала изменению веса растений и клубеньков (табл. 4). 15 Таблица 4 Влияние агглютининов (R1 и R2) R. leguminosarum 252 и белков (R1 и R2) R. leguminosarum 252/7 на вес растений и клубеньков гороха Агглютинины и неагглютинирующие белки ризобий Характеристика растений Р Вес клубеньков, г Р R1 Вес надземной части растений, г 75,6 ± 3,3 < 0,05 1,3 ± 0,2 < 0,001 R2 41,0 ± 2,2 < 0,001 1,3 ± 0,2 < 0,001 R1 40,5 ± 2,1 < 0,001 1,3 ± 0,2 < 0,001 R2 20,6 ± 1,4 < 0,001 0,2 ± 0,1 < 0,001 Контроль 30,0 ± 1,7 – 0,8 ± 0,1 – Растения, корни проростков которых были обработаны агглютининами ризобий, очень быстро набирали свою биомассу. Вес надземной части растения, корни которых были обработаны агглютининами R1 и R2, превышал вес контрольных образцов в 2,5 и 1,4 раза соответственно (табл. 4). При обработке корней проростков гороха неагглютинирующими белками ризобий мутантного штамма увеличение биомассы гороха наблюдали только при инкубировании только с R1 в 1,4 раза (табл. 4), а при обработке корней R2 происходило уменьшение веса в 1,5 раза по сравнению с контролем (табл. 4). Аналогичная закономерность наблюдалась при измерении веса клубеньков. Вес клубеньков, образованных на корнях гороха и обработанных агглютининами R1 и R2, составил 1,3 г, что в 1,6 раза превышало контрольные значения; инкубирование корней гороха с R1 также способствовало увеличению веса клубеньков в 1,6 раза, а с R2 приводило к уменьшению веса клубеньков в 4 раза по сравнению с контролем (табл. 4). Физиологический статус растений «опытных» и «контрольных» в течение эксперимента также существенно отличался между собой. Стадия бутонизации наступила раньше у бобовых растений, обработанных агглютининами R1 и R2 на 16 31-й день, у растений, корни которых инкубировали с белками R1 на 33-й, с R2 – на 34-й день эксперимента, а в контроле – на 36-й день. Анализ приведенных данных подтверждает наше предположение о том, что агглютинины R1, R2 и R1 способствуют стимуляции ростовых процессов в зоне деления корня, что существенно сказывается на метаболизме и, как следствие, приводит, по-видимому, к увеличению фитогормонов в растительных клетках и тем самым способствует повышению биомассы растения. Исследование гидролитической активности в клубеньках гороха при взаимодействии их с агглютининами и неагглютинирующими белками ризобий Исследовано влияние агглютининов ризобий родительского и мутантного штамма на активность некоторых гидролитических ферментов в клубеньках бобовых растений, таких как пектиназа, суммарная протеиназа, а также щелочная и кислая фосфатаза. В результате проведённых исследований было показано, что инкубирование корней проростков гороха с агглютининами R1 и R2 родительского штамма приводило к увеличению пектинолитической активности клубеньков и составило в случае с R1 2,48 мг/мл/20мин/мг белка и с R2 – 1,23 мг/мл/20мин/мг белка, что в 4,3 раза и 2,2 соответственно превышало контрольные значения (табл. 5). При взаимодействии агглютинина R1 с проростками корней гороха также происходило увеличение ферментативной активности в 3,5 раза, а при инкубировании с R2 наблюдали уменьшение ферментативной активности в 13 раз по сравнению с контрольными значениями. При исследовании суммарной протеолитической активности при взаимодействии с агглютининами R. leguminosarum 252 происходило увеличение активности с R1 в 6,4 раза, с R2 в 1,2 раза по сравнению с контрольными значениями (табл. 5). Взаимодействие проростков корней гороха с белками мутантного штамма приводило к увеличению протеолитической активности только в случае с R1 в 3,8 раза, а при взаимодействии с R2, наоборот, происходило уменьшение суммарной протеолитической активности в 0,07 раза по сравнению с контролем как видно из таблицы 5. 17 Таблица 5 Влияние агглютининов и неагглютинирующих белков ризобий на активность гидролитических ферментов в клубеньках гороха Агглютинины и неагглютинирующие белки ризобий Ферментативная активность Пектинолитическая (мг/мл/20 мин/мг белка) (М ± m) Р Протеолитическая (мкг/мин/ 1 мг белка) Р (М ± m) Щелочная фосфатаза (мкМ/30 мин/ 10мг белка) (М ± m) Р Кислая фосфатаза (мкМ/30 мин / 10 мг белка) (М ± m) Р R1 2,48 ± 0,06 < 0,001 1,87±0,03 < 0,001 2,36 ± 0,08 <0,001 2,54 ± 0,07 <0,001 R2 1,23 ± 0,08 < 0,001 0,36±0,03 < 0,001 0,82 ± 0,03 < 0,01 1,12 ± 0,03 < 0,01 1,98 ± 0,07 < 0,001 1,09±0,02 < 0,001 1,22 ± 0,03 < 0,001 1,34 ± 0,05 < 0,001 R1 R2 Контроль 0,042 ± 0,01 < 0,001 0,023±0,007 < 0,001 0,004 ± 0,01 < 0,001 0,035 ± 0,092 < 0,001 0,57 ± 0,04 − 0,29±0,03 0,27 ± 0,01 − 0,79 ± 0,04 − Интересно, также было исследовать влияние агглютининов ризобий родительского и мутантного штамма на активность других гидролитических ферментов, к которым относятся кислая и щелочная фосфатаза. Поскольку известно, что эти ферменты присутствуют во всех растительных организмах и играют важную роль в клеточном метаболизме, участвуя в обмене углеводов, нуклеотидов и фосфолипидов, а также в образовании многих тканей и клубеньков в том числе (Gilboa-Garber, Garber, 1989; Spaink et al., 1989; Kijne, Diaz, Pate, 1992; Kouchi, Hata, 1993; Борисова, 1999). Активность щелочной фосфатазы в клубеньках, обработанных агглютининами родительского штамма, составила для R1 2,36 мкМ/30мин/10мг белка, а для R2 0,82 мкМ/30мин/10мг белка, что в 8,7 и 3,0 соответственно превышало контрольные значения. Активность этого фермента в клубеньках, обработанных неагглютинирующими белками мутантного штамма, составила для R1 1,22 мкМ/30мин /10мг белка, а для R2 0,004мкМ (табл. 5). При исследовании активности кислой фосфатазы было обнаружено, что при 18 обработке корней проростков гороха агглютининами R1 и R2 происходило увеличение активности ферментов в 3,2 и 1,4 соответственно по сравнению с контрольными значениями (табл. 5). Инкубирование проростков корней гороха с неагглютинирующими белками приводило к изменению активности кислой фосфатазы: при взаимодействии с R1 к увеличению в 1,7 раза (1,34 мкМ/30мин/10мг белка) и уменьшению с R2 в 22 раза (0,035 мкМ/30мин/10мг белка) по сравнению с контролем. Аналогичное воздействие только растительных лектинов в отношении некоторых ферментов мы встречаем в работе I. Lorenc-Kubis с соавт. (1981). Авторами было показано, что некоторые лектины растений могут активировать или ингибировать работу литических ферментов. Так, кислая фосфатаза, выделенная из травы мятлика лугового, активировалась при взаимодействии с маннозоспецифичным лектином – Koн А. Очевидно, при связывании кислой фосфатазы с лектином, сайт связывания Koн А локализовался вблизи активного центра фермента, что и способствовало увеличению сродства фермента к субстрату. Авторы предположили, что активация фермента связана с тем, что лектин способствует более чёткому выявлению активных центров фермента, и они становятся оптимальными для взаимодействия с субстратом. Вполне возможно, что и в нашем случае активация фермента агглютининами R1 и R2 и неагглютинирующим белком R1 связана с увеличением сродства фермента с активным центром. Таким образом, экспериментальные данные показали, что агглютинины и неагглютинирующий белок R1 ризобий играют важную роль в формировании симбиоза, увеличивая активность пектиназы, протеолитической активности, а также щелочной и кислой фосфатазы в клубеньках гороха. Возможно, этим и объясняется появление клубеньков гораздо раньше в «опыте», чем в «контроле». Действие агглютининов и неагглютинирующих белков ризобий на активность оксидаз в клубеньках гороха Для дальнейшего выяснения влияния агглютининов ризобий на эффективность исследуемого нами симбиоза проводили определение активности в клубеньках бобовых растений ферментов класса оксидаз: метлегоглобинредуктазы, пероксидазы и глутаматсинтетазы (табл. 6). 19 Таблица 6 Влияние агглютининов и неагглютинирующих белков Агглютинины и неагглютинирующие белки ризобий ризобий на активность оксидоредуктаз в клубеньках гороха Метлегоглобинредуктазная активность (мкМ Lb/мин / мг белка) Р М±m Глутаматсинтетазная активность (мкМ глу /мин/мг белка) Р Пероксиданая активность (мкМ ала/мин/ мг белка) Р М±m M±m R1 2,14 ± 0,02 <0,001 3,26 ± 0,03 < 0,001 1,42 ± 0,01 < 0,001 R2 0,44 ± 0,02 < 0,001 0,55 ± 0,03 < 0,001 0,18 ± 0,04 < 0,05 R1 1,23 ± 0,01 < 0,001 2,08 ± 0,02 < 0,001 1,09 ± 0,03 < 0,001 R2 0,035±0,003 < 0,001 0,08 ± 0,003 < 0,001 0,02± 0,003 < 0,001 – 0,21 ± 0,01 Контроль 0,40 ± 0,03 – 0,66 ± 0,05 – Необходимым компонентом азотфиксирующих клубеньков является гемсодержащий белок леггемоглобин продукт симбиоза высшего растения и ризобий. Леггемоглобин в клубеньках обеспечивает регулируемый доступ кислорода к азотфиксирующим бактероидам (Ridge, Kim,Yoshida, 1992; Van Brussel et al., 1992), необходимый для окислительного фосфорилирования, в процессе которого образуется АТФ, требуемая для функционирования нитрогеназы (Brewin, 1991; Ridge, Kim,Yoshida, 1992). Эта гипотеза получила поддержку в работах ряда исследователей (Ridge, Kim,Yoshida, 1992; Van Brussel et al., 1992; Diaz, Spaink, Kijne, 2000). Однако она все еще остается не полностью доказанной. Поэтому изучение процессов в клубеньках, поддерживающих леггемоглобин в активной «ферро-форме», представляет несомненный интерес. Результаты исследований метлегоглобинредуктазной активности показали, что обработка корней проростков гороха агглютининами ризобий значительно активизировала работу фермента в 5,4 раза с R1 и в 1,1 раза с R2 по сравнению с контрольными значениями. Инкубирование проростков корней гороха с агглютининами дефектными по геммагглютинирующей активности приводило к увеличению метлего- 20 глобинредуктазной активности при взаимодействии с R1 в 3 раза (1,23 Lb/мин/мг белка), а с белком R2 было сопоставимо с контрольными значениями и составила 0,035 Lb / мин/мг белка. Определение активности глутаминсинтетазы при обработке корней проростков гороха агглютининами R1 и R2 приводило к увеличению активности фермента в 15,5 и 2,6 раза по сравнению с контрольными значениями. Инкубирование корней проростков гороха с неагглютинирующими белками приводило к увеличению глутаматсинтетазной активности только при взаимодействии с белком R1 в 9,9 раза (2,08 мкМ глу/мин/мг белка), а с R2 к уменьшению в 0,3 раза (0,08 мкМ глу/мин/мг белка) по сравнению с контролем. Далее нами была определена активность пероксидазы. В результате проведённых нами исследований было показано, что ферментативная активность в клубеньках составила с R1 1,42 мкМ ала/мин/мг белка, что в 2,1 раза больше контрольного значения, а для R2 − 0,18 мкМ ала/мин/мг и поэтому, наоборот оказалось меньше контроля в 0,3 раза (табл. 6). Инкубирование корней проростков гороха с неагглютинирующими белками ризобий оказывало аналогичное действие на активность исследуемых ферментов, т.е. увеличивалась при взаимодействии с R1 и составило 1,09 мкМ ала/мин/мг белка, а в неэффективных клубеньках, под влиянием агглютинина R2 происходило уменьшение пероксидазной активности в 2,6 раза по сравнению с контролем. Активность пероксидазы может служить показателем метаболических изменений фитогормональной системы в процессе установления эффективного симбиоза в результате её увеличения при взаимодействии с агглютининами R и R . Таким образом, экспериментальные данные показали, что агглютинины R1, R2 и неагглютинирующий белок R1 ризобий играют важную роль в образовании симбиоза, способствуя увеличению числа деформаций корневых волосков, оказывая влияние на формирование эффективных клубеньков гороха и их функционирование, увеличивая активность ферментов класса гидролаз и оксидаз, способствуя тем самым, возможно, более быстрому протеканию и регуляции многих метаболических процессов в клубеньках, что эффективно сказывается на процессе азотфиксации. 21 Выводы 1. Показано, что агглютинины R. leguminosarum 252 (R1 и R2) в большей степени, чем неагглютинирующие белки R. leguminosarum 252/7 (R1 и R2) способны увеличивать количество деформаций корневых волосков корней проростков гороха и изменять их морфологию. 2. Выявлено, что агглютинины R1, R2 и неагглютинирующий белок R1 приводят к образованию эффективных клубеньков, а R2 неэффективных клубеньков корней гороха. 3. Установлено, что агглютинины R1 ,R2 и неагглютинирующий белок R1 способствуют увеличению биомассы растения, оказывая воздействие на физиологический статус и приводя к более ранней бутонизации бобовых растений. 4. Впервые показано, что агглютинины и неагглютинирующий белок R1 ризобий приводят к увеличению протеолитической, пектинолитической, кислой и щелочной фосфатазы в клубеньках бобовых растений и их уменьшению при взаимодействии с неагглютинирующим белком R2. 5. Обнаружено, что взаимодействие корней проростков гороха с агглютининами R1, R2 и неагглютинирующим белком R1 приводило к увеличению ферментативной активности метлегоглобинредуктазы и глутаматсинтетазы, а при инкубировании с R2 – к её уменьшению. Увеличение пероксидазной активности происходило при взаимодействии корней проростков гороха с агглютинином R1 и неагглютинирующим белком R1, а с агглютинином R2 и белком R2 – к её уменьшению в клубеньках корней проростков гороха. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Смиян М.С. (Аллянова), Карпунина Л.В. Исследование морфологии корневых волосков двудольных растений при взаимодействии их с агглютининами ризобий // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой. Вторая региональная конференция молодых ученых: Тезисы докладов 26 28 октября 2004. – Саратов, 2004. С. 25 26. 22 2. Смиян М.С. (Аллянова), Карпунина Л.В. Влияние ризобиальных агглютининов на морфологию и ферментативную активность корней двудольных растений // Учебнопрактическая конференция профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2004 г. 21 – 25 февраля 2004. Саратов, 2004. С. 56. 3. Аллянова М.С., Карпунина Л.В. Влияние агглютининов ризобий на образование клубеньков гороха и их ферментативную активность // Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем: Материалы Всероссийской конференции с международным участием. 2527 сентября 2007. – Саратов, 2007. – С. 97. 4. Аллянова М.С., Карпунина Л.В. Изменение ферментативной активности клубеньков бобовых растений под воздействием агглютининов ризобий // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Материалы IV межрегиональной конференции молодых ученых 14 16 октября 2008. Саратов, 2008. – С. 54. 5. Карпунина Л.В., Аллянова М.С. Исследование гидролитической активности в клубеньках бобовых растений при взаимодействии их с агглютининами ризобий родительского и мутантного штамма // Всероссийская молодежная выставка-конкурс прикладных исследований, изобретений и инноваций: Сборник материалов. 27-28 октября 2009. – Саратов, 2009. С. 45. 6. Аллянова М.С., Карпунина Л.В. Влияние агглютининов ризобий на морфологию корневых волосков гороха, образование клубеньков и их ферментативную активность // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. – 2010. – № 8. – С. 7 11. 7. Аллянова М.С., Карпунина Л.В. Действие агглютининов и неагглютинирующих белков ризобий на формирование и функционирование клубеньков гороха // Аграрная наука в XXI веке; проблемы и перспективы: Сборник статей VI Всероссийской научнопрактической конференции 20 – 25 февраля 2012. Саратов, 2012. Ч. I С. 231 232.
