на правах рукописи - Казанский государственный медицинский
реклама
На правах рукописи Абдуллина Елена Викторовна ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HELICOBACTER PYLORI И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ IL1B И IL10 В ПРОГНОЗЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ У ДЕТЕЙ 14.01.08 – Педиатрия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Казань – 2013 2 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России Научный руководитель: Файзуллина Резеда Абдулахатовна – доктор медицинских наук, профессор Научный консультант: Ахметов Ильдус Ильясович – доктор медицинских наук Официальные оппоненты: Сафина Асия Ильдусовна – доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой педиатрии и неонатологии ГБОУ ДПО КГМА Минздрава России Николаева Ирина Венидиктовна – доктор медицинских наук, доцент кафедры детских инфекций ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России Ведущее учреждение: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Минздрава России Защита диссертации состоится «23» декабря 2013 года в 930 на заседании диссертационного совета Д 208.034.03 при ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49) С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49) Автореферат разослан «20» ноября 2013 года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент Г. Р. Хасанова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Одним из основных этиологических факторов возникновения и развития хронической гастродуоденальной патологии у детей в настоящее время является инфекция H. pylori [Корниенко Е.А. 2011, Хомерики С.Г. и соавт., 2011, Каганов Б.С. и соавт., 2012, Kobayashi I. et al., 2013, Sonnenberg A. et al., 2013]. У больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки она встречается в 87% случаев, а у детей с хроническим гастродуоденитом – в 42% [Корниенко Е.А., 2011, Graham D.Y. et al., 2000]. Высокая распространенность H.pylori не всегда коррелирует с частотой гастродуоденальной патологии, ассоциированной с данным микроорганизмом. В настоящее время установлена связь хеликобактериоза с развитием хронического гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки и рака желудка [Ющук Н.И. и соавт., 2006, Климович А.В., 2010, Щербаков П.Л. и соавт., 2010, Nguyen T.L. et al., 2010, Chen M.Y. et al., 2013]. Различия в восприимчивости к H.pylori могут быть обусловлены особенностями инфекционного агента и иммунореактивностью хозяина, определяемыми вариабельностью генотипов хеликобактера в отношении факторов вирулентности, а также полиморфизмом генов иммунного ответа у носителей инфекционных агентов [Печкуров Д.В., 2002, Родионов В.А. и соавт., 2003, Маев И.В. и соавт., 2008]. Несмотря на то, что проблема H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии у детей, казалось бы, хорошо освещена в литературе, разработаны общенациональные программы по их лечению и профилактике, генетические основы заболеваний гастродуоденальной области остаются малоисследованными. Мнение некоторых ученых сводится к тому, что развитие, особенности течения и частота рецидивов хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии у взрослых могут быть ассоциированы с наличием у индивидов определенных генотипов хеликобактера, в том числе гена cagA [Решетников О.В. и соавт., 2005, Камнева Н.В. и соавт., 2007, Нижевич А.А. и соавт., 2012, Bronte-Tinkew D.M. et al., 2009], а также вариантов полиморфных локусов генов ключевых иммуномедиаторов про- (-511Т/С гена IL1B) и противовоспалительных (-1082G/A гена IL10) реакций [Li J. et al., 2011, 4 Cheng H.H. et al., 2010, Kimang'a A.N. et al., 2012, Tahara T. et al., 2012], но многие из этих положений остаются дискутабельными. Цель исследования Изучить клинико-морфологические особенности хронических гастродуоденальных заболеваний в зависимости от генетического статуса H.pylori и полиморфизма генов IL1B и IL10 для совершенствования диагностики и прогнозирования исходов хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии у детей. Задачи исследования 1. Определить частоту выявления H.pylori и cagA-позитивных штаммов H.pylori у детей с хронической гастродуоденальной патологией г. Казани. 2. Провести оценку диагностической ценности методов выявления H.pylori. 3. Изучить особенности клинических проявлений и морфологических изменений при хронической гастродуоденальной патологии у детей инфицированных cagA+ и cagА- штаммами H.pylori. 4. Оценить взаимосвязь полиморфизмов генов IL1В и IL10 с течением и исходом хронических заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки у детей. 5. Обосновать дифференцированный подход к наблюдению детей с хронической гастродуоденальной патологией, ассоциированной c H.pyloriинфекцией. Научная новизна полученных результатов Впервые проведено исследование взаимосвязи генетических особенностей H.pylori и двух полиморфизмов генов про- и противовоспалительного цитокинов с развитием и течением хронической гастродуоденальной патологии у детей. Впервые установлена частота колонизации cagA-позитивных штаммов H.pylori у детей с гастродуоденальной патологией в г. Казани. Особое внимание уделено вопросам совершенствования диагностики H.pylori-ассоциированных заболеваний у детей. Для повышения чувствительности и специфичности, а также уменьшения доли ложноположительных и ложноотрицательных результатов при верификации H.pylori предложено применение комбинации дыхательного Хеликтеста и ПЦР биоптатов слизистой оболочки желудка. 5 Проведен анализ ассоциации риска возникновения и развития основных фенотипических признаков хронических заболеваний гастродуоденальной области с наличием основного гена патогенности H.pylori и полиморфными маркерами, ранее не исследованными у детей. Выявлены особенности клинического течения и морфологической картины слизистой оболочки желудка в зависимости от инфицирования высокопатогенными штаммами H.pylori и полиморфизмов -511Т/С гена IL-1B и 1082G/A гена IL-10. На основании полученных данных разработан алгоритм прогнозирования течения и исхода хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии у детей. Теоретическая и практическая значимость Полученные данные открывают дополнительные возможности в оценке факторов риска развития хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии. Они могут служить объективными критериями для формирования групп риска по заболеваниям желудка и ДПК и разработки индивидуальных программ профилактики с учетом генотипирования. Определение генов патогенности H.pylori и полиморфизмов -511Т/С гена IL-1B и -1082G/А гена исследованиях IL-10 в рекомендовано группах детей с использовать отягощенной при популяционных наследственностью по гастродуоденальной патологии. Основные положения, выносимые на защиту 1. Комбинация дыхательного Хелик-теста и полимеразной цепной реакции при верификации H.pylori-инфекции у детей имеет высокую диагностическую ценность. 2. Инфицирование H.pylori cagA+ повышает риск развития эрозивноязвенных поражений и кишечной метаплазии слизистой оболочки гастродуоденальной области у детей. 3. Полиморфизмы –511Т/С гена IL1B и -1082G/А гена IL10 ассоциируются с особенностями течения и клинических проявлений хронической H.pyloriассоциированной гастродуоденальной патологии, а наличие мутантного аллеля полиморфизма -511Т/С гена IL1B - с повышенным риском развития кишечной метаплазии слизистой оболочки гастродуоденальной области у детей. 6 Апробация результатов работы Основные положения работы доложены на XIV Славяно-Балтийском научном форуме (Санкт-Петербург, 2012); IX Российской конференции «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском федеральном округе», Российской научно-практической конференции «Инфекции и соматическая патология» (Казань, 2013), XV Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2010), где автору было присуждено II место, XVIII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2013), где было присуждено III место. Апробация работы была проведена на совместном заседании кафедр пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета, госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии и постдипломного образования, детских инфекций ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России, педиатрии и неонатологии ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Минздрава России. Публикации по теме диссертации По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 4 – в журналах, рецензируемых Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации. Личный вклад автора Весь объем клинических наблюдений и специальных методов исследования осуществлен при участии диссертанта. Автором составлен дизайн, определены цели и задачи, выбраны методы, спланировано проведение исследования по всем разделам диссертации, проведен обзор научной литературы по исследуемой проблеме. Диссертант самостоятельно провел ПЦР-исследование на базе центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО КГМУ (зав. лабораторией – д.м.н., профессор Семина И.И.) и статистическую обработку полученных данных, сформулировал основные научные положения работы, выводы и представил практические рекомендации. 7 Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения Результаты исследования внедрены в работу 3-го корпуса ГАУЗ «ДРКБ МЗ РТ», педиатрического отделения ГАУЗ «Клиника медицинского университета». Материалы диссертации используются в педагогическом процессе при обучении студентов, интернов, ординаторов на кафедре пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета ГБОУ ВПО «Казанский ГМУ» МЗ РФ. Структура диссертации и ее объем Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 таблицами и 25 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, трех глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 194 источника, в том числе 106 отечественных и 88 зарубежных авторов. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Работа выполнена на клинической базе кафедры пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета ГБОУ ВПО «Казанский ГМУ» МЗ РФ: в гастроэнтерологическом и соматическом отделениях ГАУЗ «Детская городская клиническая больница №2» г. Казани (гл. врач – Нарыков Р.Х.) (с 2013 г. - 3-й корпус ГАУЗ «ДРКБ» МЗ РТ, гл. врач – Шавалеев Р.Ф.). Получение информированного согласия, сбор анамнеза, предварительное обследование и забор биологического материала проводили с разрешения локального этического комитета КГМУ. Под наблюдением находилось 135 детей в возрасте от 7 до 17 лет, в том числе 23 пациента с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБ ДПК), 87 больных хроническим гастродуоденитом (ХГД) и 25 условно-здоровых детей того же возраста (группа контроля). Пациенты с ХГД, вошедшие в исследование, были госпитализированы в периоде обострения заболевания. Большинство детей с ЯБ ДПК (87%) поступили в стационар для получения противорецидивного лечения, у 3 пациентов (13%) заболевание было выявлено впервые (схема 1). 8 I этап: комплексная клинико-лабораторная оценка состояния здоровья детей в возрасте от 7 до 17 лет, поступивших в ДГБ № 2 г.Казани. Верификация H.pylori с помощью дыхательного Хелик-теста у 162 детей (131 пациент основной группы и 31 ребенок группы контроля) H.pylori – 42 ребенка (11 пациентов с ХГД и 31 ребенок группы контроля) H.pylori + 120 детей ЭГДС с визуальной оценкой состояния гастродуоденальной области и взятием биоптатов слизистой оболочки желудка у 151 ребенка (120 пациентов основной группы и 31 ребенка группы контроля) Верификация инфекции H.pylori с помощью цитологического метода и ПЦР биоптатов слизистой оболочки желудка у 151 ребенка + 10 больных Морфологическое подтверждение патологических изменений, характерных для хронического воспаления, в биоптате слизистой оболочки желудка у 151ребенка. – – основная группа 110 пациентов + группа контроля 25 детей 6 детей II этап: выявление генетических и клинико-морфологических особенностей течения Н.pylori-ассоциированной патологии гастродуоденальной области у 110 детей. исследование биоптатов слизистой оболочки желудка. цитологическое исследование определение уровня цитокинов (ИЛ-8, ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-10) в сыворотке крови с помощью ИФА ПЦР-диагностика гена cagA Н.pylori Схема 1 - Дизайн исследования определение полиморфизма генов цитокинов IL1B, IL10 с помощью метода ПЦР в биоптате слизистой оболочки желудка 9 Критерии включения пациентов в основную группу исследования: - родители и дети, вошедшие в исследование, должны подписать форму информированного согласия, - пациентам должен быть выставлен диагноз хронической гастродуоденальной патологии, подтвержденной морфологически, - хроническая гастродуоденальная патология должна быть ассоциирована с инфекцией Н.pylori. Всем больным проводились общепринятые клинико-инструментальные методы исследования, включающие анализ анамнестических данных из историй развития детей, результатов анкетирования детей и их родителей по специально разработанным анкетам, объективное обследование больного. Параклинические методы обследования включали: общий и биохимический анализ крови, анализ кала на яйца глистов и цисты лямблий, копрологический анализ и анализ мочи. Из инструментальных методов были проведены: эзофагогастродуоденоскопия (ЭГДС), УЗИ органов брюшной полости, ЭКГ и дуоденальное зондирование по показаниям. Для морфологического подтверждения хронического воспаления во время ЭГДС пациентам проводили взятие биопсийного материала слизистой оболочки антрального отдела желудка [Аруин Л.И. и соавт., 1998]. Мазкиотпечатки окрашивали по Романовскому-Гимзе. Выраженность нейтрофильной и лимфоцитарной метаплазии инфильтрации эпителия слизистой оценивали по оболочки, обновленной наличие кишечной Сиднейской системе (Хьюстонский вариант) в баллах: нормальная — 0, легкая — 1, умеренная — 2, выраженная — 3 [Dixon M.F, 1996] (врач-цитолог Ефимова Н.Г.). Специальные методы исследования включали тесты на выявление H.pylori у пациентов: дыхательный Хелик-тест, разработанный ООО «АМА» (г. СанктПетербург), цитологический метод исследования и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) биоптатов с детекцией ureC гена микроорганизма. Для оценки результатов диагностических тестов на определение H.pylori в качестве «золотого стандарта» был принят цитологический метод. Расчет ценности диагностических методов исследования Н.pylori проводили по формулам вероятности расчета чувствительности, хеликобактериоза при специфичности, «+» результате общей и точности, вероятности 10 хеликобактериоза при «-» результате. Дальнейший диагностический поиск был связан с выявлением основного гена патогенности H.pylori cagA и генетических особенностей ребенка (полиморфизмы –511T/C количественным гена IL1B определением и про- -1082G/A (ИЛ-8, гена IL10), ИЛ-1β, а также ФНО-α) и противовоспалительного (ИЛ-10) цитокинов в сыворотке крови методом иммуноферментного анализ (ELISA) с помощью наборов фирмы «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) на базе ФБУН КНИИЭМ Роспотребнадзора (врач-лаборант, к.м.н. Агафонова Е.В.). Ген сagA островка патогенности Н.pylori в биоптатах определяли по стандартной методике с использованием наборов реагентов «Хеликопол» НПФ «Литех» (Россия). Для молекулярно-генетического анализа использовали образцы ДНК пациентов, выделенных сорбентным методом в соответствии с прилагаемой инструкцией с помощью комплекта реагентов для выделения ДНК «Проба-ГС» ООО «НПО ДНК-Технология» (г. Москва). Полиморфизмы –511T/C гена IL1B и -1082G/A гена IL10 определяли методом ПЦР и последующего рестрикционного анализа с использованием двухпраймерной системы (Santtila S., 1998). Статистическую обработку, применяемую для оценки достоверности результатов, проводили при помощи программных пакетов Microsoft Excel 2003, BIOSTATISTICA и «GraphPad InStat». Для оценки связи между признаками непараметрических данных применяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r) и критерий Пирсона для параметрических данных. Для выявления риска развития события в сравниваемых группах применяли расчет отношения шансов (Odds Ratio, OR) и соответствующие 95% доверительные интервалы (ДИ). Сравнительный анализ основывался на определении достоверности разницы показателей по F-критерию Фишера. Критический уровень значимости (p) при проверке статистических гипотез в исследовании принимали равным 0,05. Результаты исследования и их обсуждение В результате проведенного исследования выявлено, что Н.pylori являлся этиологическим фактором заболеваний желудка и ДПК у 83,9% обследованных 11 больных (у 110 из 131 пациентов): у 100% больных, страдающих ЯБ ДПК, и 80,5% - ХГД), что соответствует распространенности хеликобактериоза у детей с хронической патологией гастродуоденальной области г. Казани, равной 73,6% – 94,2% (р<0,05), а у пациентов с ХГД – 66% – 95% (р<0,05). Сравнительный анализ детей с ЯБ ДПК и ХГД выявил факторы риска развития язвенного дефекта: - мужской пол (среди пациентов с ЯБ ДПК мальчики встречались в 78,3%, а девочки – в 21,7% (р˂0,05), - пубертатный период (средний возраст пациентов с ЯБ ДПК составил 15,4±3,5 лет, а детей с ХГД - 13±2,9 лет), - наследственная свидетельствовать, отягощенность кроме по генетических язвенной болезни, особенностей, о что может существовании внутрисемейных очагов хеликобактериоза (родственники, больные язвенной болезнью были выявлены у 60,9% пациентов с ЯБ ДПК и 19,5% больных ХГД, (р˂0,05). Также показано, что при отсутствии семейной предрасположенности к ЯБ ДПК даже развившийся ХГД протекал чаще в форме поверхностных изменений слизистой оболочки желудка и ДПК. Это свидетельствует об особенностях реагирования организма ребенка на инфекцию H.pylori, что может быть запрограммировано генетически. Сравнение данных, полученных при диагностике H.pylori, показало, что наибольшее количество ИП результатов выявлено при исследовании с помощью дыхательного теста (ИП=110), меньше – при диагностике ПЦР (ИП=103). При исследовании с помощью ПЦР было обнаружено наибольшее число ИО результатов (ИО=31) в отличие от Хелик-теста (ИО=25). ЛП данные чаще всего были получены при исследовании дыхательным тестом (ЛП=21), реже – при ПЦР (ЛП=10). При диагностике сравниваемыми методами было выявлено большое количество ЛО ответов (при применении Хелик-теста ЛО=6, при ПЦР ЛО=7 соответственно). Таким образом, дыхательный Хелик-тест и ПЦР при верификации инфекции H.pylori показали одинаково высокую Se (94,8% и 93,6% соответственно), но низкую Sp (80,6% и 79,5% соответственно) и высокую вероятность хеликобактериоза при отрицательных результатах методов (19,4% и 18,4% 12 соответственно). Было выявлено, что общая точность и прогностическая ценность положительного ответа при диагностике с помощью ПЦР (88,7% и 91,2% соответственно) выше, чем у Хелик-теста (83,3% и 84% соответственно) (таблица 1). Таблица 1 - Характеристика методов диагностики Н.pylori – инфекции при хронической гастродуоденальной патологии у детей Показатели Хелик-тест ПЦР Хелик-тест + ПЦР 94,8% 80,6% 84% 93,6% 79,5% 91,2% 98,3% 93,5% 96,6% 9,4% 18,4% 6,4% 83,3% 88,7% 96% Чувствительность Специфичность Вероятность хеликобактериоза при положительном результате Вероятность хеликобактериоза при отрицательном результате Общая точность В связи с выявлением низкой Sp (Хелик-тест = 80,6%, ПЦР = 79,5%) и высокой вероятности H.pylori-инфекции при отрицательных результатах методов (Хелик-тест = 19,4%, ПЦР = 18,4%) было решено оценить диагностическую ценность тестов при их комбинации. Сравнительный анализ выявил, что ИП результат при диагностике с помощью комбинации методов обнаружен у 116 пациентов. Это выше, чем при верификации инфекции с помощью Хелик-теста (ИП=110) и ПЦР (ИП=103). При исследовании двумя методами было выявлено меньше ЛО (2) и ЛП (4) данных в отличие от диагностики с помощью дыхательного теста (ЛО=6, ЛП=21) и ПЦР (ЛО=7, ЛП=10). Анализ диагностической ценности комбинации Хелик-теста и ПЦР при верификации инфекции H.pylori показал более высокую Se (98,3%), Sp (93,5%), общую точность (96%), а также вероятность хеликобактериоза при положительном результате (96,6%) и низкую вероятность при отрицательном результате (6,4%) методов исследования (таблица 1). Поэтому для первичной диагностики инфекции H.pylori лучше использовать комбинацию тестов (Хеликтест и ПЦР биоптатов слизистой оболочки желудка), что уменьшит долю ЛП и ЛО результатов. Микроскопия мазков-отпечатков является высокоинформативным тестом, 13 так как по его результатам можно судить не только о наличии или отсутствии H.pylori в биоптате, но и о степени обсемененности, выраженности воспалительных и дистрофических изменении, а также нарушении процессов клеточного обновления (метаплазии и атрофии). Корреляционный анализ выявил достоверную взаимосвязь между степенью обсемененности и вариантом поражения слизистой оболочки гастродуоденальной области (r=0,31, р˂0,05), а также степенью обсемененности и выраженностью лимфоцитарной и нейтрофильной инфильтрации слизистой оболочки антрального отдела желудка (r=0,44, p<0,01). Поэтому мы склонны утверждать, что одним из факторов, определяющих интенсивность воспалительных изменений и вариант течения гастродуоденальной патологии, является степень обсемененности H.pylori слизистой оболочки желудка, что согласуется с мнением ряда авторов [Денисюк Т.А., 2005, Александрова С.Л., 2007, Базрова Ф.В., 2011, Azevedo M. et al., 2008]. Дальнейший диагностический поиск был связан с выявлением взаимосвязи генетических особенностей H.pylori (ген cagA) и полиморфизмов генов про- и противовоспалительного цитокинов (полиморфизм –511T/C гена IL1B и -1082G/A гена IL10) с развитием и течением хронической гастродуоденальной патологии у детей. Анализ cagA-статуса пациентов показал, что около половины детей, вошедших в исследование, инфицированы cagA-позитивными штаммами H.pylori. При этом у больных ЯБ ДПК H.pylori сagA+ встречался значимо чаще, чем у пациентов с ХГД (73,9%±9,2 и 40,2%±5,2 соответственно). При поверхностных и гипертрофических изменениях слизистой оболочки желудка и ДПК цитотоксические штаммы H.pylori были выявлены примерно с одинаковой частотой (38,1%±6,1 и 36,8%±11,1 соответственно), при эрозивных процессах H.pylori cagA+ обнаружен в 80%±17,8 (р<0,05). Следовательно, H.pylori сagA+ в большей степени ассоциирован с эрозивноязвенными поражениями желудка и ДПК, а при поверхностных и гипертрофических гастродуоденитах выявляется чаще H.pylori сagA-. При инфицировании высокопатогенными штаммами H.pylori риск развития эрозивно- 14 язвенных поражений гастродуоденальной области выше (OR=4,21, ДИ=1,5111,73), чем при заражении H.pylori сagA-. В литературе остается дискутабельным вопрос о тяжести и характере течения хронической гастродуоденальной патологии в зависимости от штаммов H.pylori. Одни авторы считают, что в развитии хронических заболеваний желудка и ДПК основополагающую роль имеют генетические особенности микроорганизма [Мишкина Т.В. и соавт., 2007, Сарсенбаева А.С., 2007, Нижевич А.А. и соавт., 2012]. Другие, напротив, отвергают эту точку зрения, считая, что ген cagA не является определяющим в проявлении микроорганизмами своих вирулентных и патогенных свойств [Чуков С.З. и соавт., 2001, Чернова О.А. и соавт., 2005]. В результате исследования установлено, что наличие гена cagA у H.pylori не влияло на особенности клинического течения гастродуоденальной патологии. Одинаково часто у пациентов с высокопатогенными штаммами и с H.pylori cagAвстречались болевой абдоминальный (96,2% и 96,6% соответственно) и диспепсический синдромы (94,2% и 94,8% соответственно); не было найдено отличий в характере и интенсивности жалоб у пациентов. При инфицировании высокопатогенными штаммами H.pylori риск развития более частых рецидивов ЯБ ДПК и ХГД увеличивался в 2 раза (OR=2,3, ДИ=1,4-3,9). У всех детей, независимо от сagA-статуса, была выявлена сопутствующая патология в стадии ремиссии, но различий в частоте встречаемости заболеваний также выявлено не было. Сопоставление результатов, полученных во время микроскопии мазковотпечатков, обнаружило, что у пациентов с H.pylori cagA– значимо чаще встречалась слабая степень обсемененности. У детей, инфицированных высоко патогенными штаммами чаще, чем у больных с H.pylori cagA–, преобладала сильная обсемененность, что свидетельствовало о наибольшей устойчивости цитотоксических штаммов H.pylori в агрессивной кислой среде желудка. Кроме того, у больных с H.pylori cagA+, в отличие от детей с H.pylori cagA-, чаще были диагностированы признаки кишечной метаплазии слизистой оболочки антрального отдела желудка и при инфицировании детей высокопатогенными штаммами H.pylori риск развития кишечной метаплазии возрастал в 5 раз (OR=5,2, ДИ=2–13,5). 15 Не было лимфоцитарной обнаружена определено инфильтрации тенденция, лимфоцитами значимых что чаще у различий больных инфильтрация отмечалась у в частоте сравниваемых слизистой выявления групп. оболочки пациентов Однако желудка инфицированных высокопатогенными штаммами H.pylori. Это свидетельствовало о том, что при инфицировании H.pylori сagA+ воспалительная реакция слизистой оболочки антрального отдела желудка более выражена, чем при H.pylori сagA- (таблица 2). Таблица 2 - Показатели микроскопии мазков-отпечатков в зависимости от cagA-статуса Н.pylori у детей с хронической патологией гастродуоденальной области (M±σ) Показатели H.pylori сagA+ n=52 Обсемененность слизистой оболочки Н.pylori: «+» 50%±6,9 «++» 7,7%±3,7* «+++» 42,3%±6,9* Лимфоцитарная инфильтрация 61,5%±6,7 Кишечная метаплазия 86,5%±4,7* * - достоверность разницы результатов с группой детей, cagA- (р˂0,05) (критерий Фишера) H.pylori сagAn=58 р 60,4%±6,4 р>0,05 24,1%±5,6 р<0,05 15,5%±4,8 р<0,05 48,3%±6,6 p>0,05 55,2%±6,5 р<0,05 инфицированных H.pylori При проведении корреляционного анализа были выявлены положительные взаимосвязи между cagA-статусом H.pylori и степенью обсемененности (r=0,37, р˂0,01), наличием лимфоцитарной инфильтрации (r=0,36, р˂0,01) и кишечной метаплазии слизистой оболочки антрального отдела желудка (r=0,55, р˂0,01). Таким образом, можно утверждать, что cagA-позитивные штаммы вызывают более выраженные воспалительные и дистрофические изменения с нарушением процессов клеточного обновления и развитием кишечной метаплазии гастродуоденальной области, обладая при этом значительной устойчивостью против факторов защиты слизистой оболочки желудка. Анализ количества спонтанных про- (ИЛ-8, ИЛ-1β и ФНО-α) и противовоспалительного (ИЛ-10) интерлейкинов сыворотки крови у детей с хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологией показал, 16 что повышение содержания в крови провоспалительных цитокинов – ИЛ-8, ИЛ-1β и ФНО-α было более значительным, чем уровня противовоспалительного интерлейкина – ИЛ-10, который остался в пределах нормального диапазона у всех пациентов. Подобные изменения иммунного статуса описаны и другими исследователями, и характеризуют ответ организма на инфекцию H.pylori [Ющук Н.И. и соавт., 2002, Корниенко Е.А., 2011]. Сравнение уровня интерлейкинов у пациентов с ЯБ ДПК и ХГД достоверной разницы не выявило, что не соответствует данным литературы [Матвеева Л.В. и соавт., 2013]. Это можно объяснить тем, что среди детей с ЯБ ДПК, обследованных нами, не было больных с обострением заболевания. Все дети поступили в стационар в стадии рубцевания язвенного дефекта при сохраняющемся дуодените. При проведении корреляционного анализа были обнаружены прямые ассоциации между длительностью, интенсивностью болевого абдоминального синдрома на момент поступления и уровнями интерлейкинов сыворотки крови. Определены ассоциации между количеством цитокинов и наличием симптомов диспепсии у обследованных пациентов. Обнаружены достоверные связи между уровнями ФНО-α, ИЛ-10 и отрыжкой, изжогой, тошнотой и рвотой. То есть чем больше количество интерлейкинов вырабатывается в ответ на инфицирование H.pylori, тем более выражена клиническая картина хронической гастродуоденальной патологии, в том числе и моторных нарушений (таблица 3). Таблица 3 - Взаимосвязь основных клинических синдромов и уровней интерлейкинов сыворотки крови у обследованных пациентов Характеристика жалоб Интенсивность болевого синдрома Длительность болевого синдрома Изжога Отрыжка Тошнота Рвота Цитокины ИЛ-8 (r=0,47, p˂0,01); ФНО-α (r=0,51, p˂0,01) ИЛ-8 (r=0,35, p˂0,05); ИЛ-1β (r=0,34, p˂0,05) ФНО-α (r=0,34, p˂0,05) ФНО-α (r=0,4, p˂0,01); ИЛ-10 (r=0,4, p˂0,01) ФНО-α (r=0,42, p˂0,01); ИЛ-10 (r=0,43, p˂0,01) ФНО-α (r=0,4, p˂0,01); ИЛ-10 (r=0,4, p˂0,01) ФНО-α (r=0,5, p˂0,01); ИЛ-10 (r=0,4, p˂0,01) В настоящее время доказано, что уровень продукции интерлейкинов напрямую зависит от наличия или отсутствия структурных особенностей в ДНК человека. Проведенный анализ спонтанных уровней ИЛ-1β и ИЛ-10 сыворотки 17 крови в зависимости от полиморфизмов -511Т/С гена IL1B и -1082G/А гена IL10 статистически значимых различий не выявил, но обнаружил тенденцию, что при наличии в генотипе мутантного аллеля количество интерлейкинов в сыворотке крови выше, чем у пациентов с нормальным генотипом, что согласуется с данными литературы [Громова А.Ю. и соавт., 2005, Маев И.В. и соавт., 2008]. Анализ полиморфных локусов генов -511Т/С IL1B в зависимости от характера гастродуоденальной патологии показал, что чаще других у пациентов с ЯБ ДПК и ХГД встречался гетерозиготный мутантный генотип Т/С, в отличие от детей группы контроля, у которых чаще выявлен нормальный гомозиготный генотип С/С. Рассмотрение частоты встречаемости C- и Т-аллелей выявило, что мутантный Т-аллель был определен у половины пациентов с ЯБ ДПК. Обнаружено, что среди больных ЯБ ДПК носители мутантного Т-аллеля встречались статистически значимо чаще, чем среди детей группы контроля (рисунок 1). полиморфизм -511Т/С гена IL1B 76% 80% 66,1% 70% 56% 60% 50% 40% 30% 41,4% 56,5% 54,3% 49,4% 40,0% ЯБ ДПК 45,7% 33,9% 26,1% 24% ХГД группа контроля 17% 20% 9,2% 4% 10% 0% С/С С/Т генотипы Т/Т С Т аллели Рисунок 1 - Сравнительный анализ распределения генотипов и частот аллелей полиморфизма -511Т/С гена IL1B в группах сравнения. Аллель Т полиморфизма -511Т/С IL1B ассоциирована с повышенным риском развития ЯБ ДПК (OR = 3,606, 95% ДИ = 1,06 – 12,23). Анализ генотипов и аллелей полиморфных локусов гена -1082G/А IL10 у пациентов, страдающих ЯБ ДПК и ХГД и детей группы контроля статистически значимых различий не выявил (рисунок 2). Во всех группах чаще остальных 18 встречался мутантный гетерозиготный генотип G/А (р˂0,05). Мутантный гомозиготный (A/А) и нормальный (G/G) генотипы были выявлены с одинаковой частотой. Анализ частоты встречаемости G- и А-аллелей полиморфизма -1082G/A IL10 статистически значимых различий среди пациентов сравниваемых групп также не выявил. Как среди больных с патологией H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной области, так и в группе контроля с одинаковой частотой встречались носители нормального G-аллеля и мутантного А-аллеля. полиморфизм -1082G/A гена IL10 73,9% 65,5% 80% 64% 70% 57,9% 54,3% 52% 60% 50% 48% 45,7% 43,1% 40% 30% 20% 24,1% 17,4% ЯБ ДПК ХГД группа контроля 20% 10,4% 16% 8,7% 10% 0% G/G G/A A/A G A генотипы аллели Рисунок 2 - Сравнительный анализ распределения генотипов и частот аллелей полиморфизма -1082G/A IL10 в группах сравнения. Анализ клинических особенностей течения хронической гастродуоденальной патологии в зависимости от генетических особенностей ребенка выявил, что при наличии мутантного Т-аллеля в генотипе IL1B заболевание протекает с более выраженным болевым и диспепсическим синдромами. Большинство же пациентов с умеренными и незначительными жалобами имели нормальный генотип С/С и среди них было больше носителей С-аллеля. Корреляционный анализ обнаружил взаимосвязь между полиморфизмами генов IL1B и IL10 и интенсивностью, длительностью и характером болевого абдоминального синдрома. Найдена ассоциация между частотой возникновения болей в гастродуоденальной области и наличием мутаций в полиморфном локусе гена IL10. Выявлена ассоциация между наличием жалоб на тошноту, рвоту и полиморфизмом -511Т/С гена IL1B, а также между отрыжкой, рвотой и полиморфизмом -1082G/А гена IL10 (рисунок 3). 19 длительность болевого абдоминального синдрома r=0,36, p˂0,01 интенсивность болевого абдоминального синдрома r=0,32, p˂0,01 полиморфизм -511С/Т IL1B r=0,4, p˂0,01 полиморфизм -1082G/A гена IL10 r=0,3, p˂0,01 r=0,3, p˂0,01 тошнота рвота r=0,35, p˂0,01 r=0,3, p˂0,01 характер болей r=0,33, p˂0,01 r=0,4, p˂0,01 частота возникновения болевого абдоминального синдрома Рисунок 3 - Корреляционная плеяда взаимосвязей полиморфизмов гена IL1B и IL10 и клинического течения хронической гастродуоденальной патологии На основании результатов анализа взаимосвязи полиморфизмов генов IL1B и IL10 и данных, полученных при цитологическом методе исследования, выявлена ассоциация генов цитокинов с характером и интенсивностью воспалительной реакции в ответ на повреждение H.pylori слизистой оболочки гастродуоденальной области (для IL1B r=0,3, p<0,001, для IL10 r=0,31, р˂0,01), а также выраженностью кишечной метаплазии и геном IL1B (r=0,3, р˂0,05). Таким образом, выявление отягощенной наследственности по ЯБ ДПК, частых рецидивов хронической гастродуоденальной патологии в анамнезе, эндоскопической картины в виде эрозивно-язвенных процессов желудка и ДПК, сильной обсемененности H.pylori и кишечной метаплазии при морфологическом исследовании указывают на инфицирование высокопатогенными штаммами H.pylori и наличие мутантного аллеля полиморфизма -511Т/С гена IL1B. Учитывая, что при обнаружении H.pylori cagA+ и мутантного аллеля в генотипе IL1B в 4 раза увеличивается риск развития эрозивно-язвенных изменений, а при наличии цитотоксических штаммов в 5 раз возрастает риск кишечной метаплазии, детям с H.pylori cagA+ и мутантным аллелем полиморфизма гена IL1B необходимо проведение регулярной оценки морфологических особенностей слизистой оболочки желудка для выявления метаплазии и атрофии (схема 2). 20 Прогнозирование течения и исхода хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии у детей - отсутствие родственников первой линии, больных язвенной болезнью желудка или ДПК - слабая степень обсемененности слизистой оболочки желудка H.pylori - выявление штаммов cagA- H.pylori обнаружение гомозиготного нормального генотипа С/С полиморфизма -511Т/С гена IL1В - отягощенная наследственность по язвенной болезни желудка или ДПК - высокая степень обсемененности слизистой оболочки желудка H.pylori - выявление гена cagA при генотипировании H.pylori - обнаружение мутантного аллеля Т полиморфизма -511Т/С гена IL1B Течение хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии с благоприятным прогнозом (выздоровление или с редкими рецидивами и длительной клиникоэндоскопической ремиссией) Эрадикационная терапия с диспансерным наблюдением и противорецидивной терапией Течение хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии с неблагоприятным прогнозом: частые рецидивы, риск прогрессирования заболевания с развитием атрофии и метаплазии слизистой оболочки желудка Проведение регулярной оценки морфологических особенностей слизистой оболочки желудка для выявления возможной метаплазии и атрофии Схема 2 - Алгоритм прогнозирования течения и исхода хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной генетических особенностей H.pylori и пациента патологии на основании 21 Выводы 1. Н.pylori являлся этиологическим фактором заболеваний желудка и ДПК у 83,9% обследованных детей г. Казани: у 100% пациентов, страдающих ЯБ ДПК и 80,5% - ХГД. Обнаружено, что 47,3% детей с хронической гастродуоденальной патологией инфицированы cagA-позитивными штаммами H.pylori. Больные ЯБ ДПК заражены H.pylori cagA+ достоверно чаще, чем пациенты с ХГД (73,9%±9,2 и 40,2%±5,2 соответственно). 2. Дыхательный Хелик-тест и ПЦР при диагностике инфекции H.pylori показали одинаково высокую чувствительность (94,8% и 93,6% соответственно), но низкую специфичность (80,6% и 79,5% соответственно), а также высокую вероятность хеликобактериоза при отрицательных результатах (19,4% и 18,4% соответственно). Использование комбинации этих методов исследования позволяет уменьшить долю ложноположительных и ложноотрицательных результатов, повысить чувствительность до 98,3%, специфичность до 93,5% и уменьшить вероятность инфекции H.pylori при отрицательных результатах тестов до 6,4%. 3. При инфицировании H.pylori cagA+ заболевание желудка и ДПК протекает с частыми рецидивами (OR=2,3, ДИ=1,4-3,9), риск развития эрозивноязвенных поражений возрастает в 4 раза (OR=4,21, ДИ=1,51-11,73), а кишечной метаплазии – в 5 раз (OR=5,2, ДИ=2–13,5). Морфологическая картина при инфицировании cagA-позитивными штаммами H.pylori характеризуется сильной обсемененностью (42,3%±6,9), лимфоцитарной инфильтрацией (61,5%±6,7) и признаками кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка (86,5%±4,7). 4. Обнаружение мутантного аллеля полиморфизма -511Т/С гена IL1B является фактором риска развития ЯБ ДПК (OR=3,606, р<0,05). Выявлена ассоциация между полиморфизмом -511Т/С гена IL1B и длительностью (r=0,36, p˂0,01), интенсивностью (r=0,32, p˂0,01), характером болевого абдоминального синдрома (r=0,35, p˂0,01), наличием тошноты (r=0,3, p˂0,01) и рвоты (r=0,3, p˂0,01), а также развитием деструктивных изменений слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки (r=0,3, p˂0,05). 5. Наличие наследственной отягощенности по ЯБ ДПК, высокой степени обсемененности слизистой оболочки желудка H.pylori, H.pylori cagA+ при 22 генотипировании, мутантного аллеля полиморфизма -511Т/С гена IL1B являются маркерами неблагоприятного ассоциированной течения гастродуоденальной и исхода патологии, хронической что H.pylori- обосновывает необходимость дифференцированного подхода к диспансерному наблюдению. Практические рекомендации 1. Для повышения диагностической ценности методов при первичной верификации H.pylori-инфекции у детей рекомендовано применять комбинацию дыхательного Хелик-теста и ПЦР. 2. С целью оценки факторов риска развития и прогрессирования хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии у детей в качестве дополнительных критериев диагностики рекомендовано проведение генотипирования H.pylori и полиморфизма -511Т/С гена IL1B. 3. Рекомендовано использовать в качестве генетических факторов риска развития ЯБ ДПК ген cagA H.pylori и полиморфизм -511Т/С гена IL1B. 4. Детям с отягощенной наследственностью по ЯБ ДПК, высокой степенью обсемененности слизистой оболочки желудка H.pylori, H.pylori cagA+, мутантным аллелем полиморфизма -511Т/С гена IL1B на этапе диспансерного наблюдения рекомендовано проведение оценки морфологических изменений слизистой оболочки желудка для выявления возможной метаплазии и атрофии. Список научных работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Файзуллина Р.А. Факторы заболеваемости болезнями органов пищеварения у детей: мнение врачей и родителей / Файзуллина Р.А., Абдуллина Е.В. // Сборник материалов к XV Всероссийской научно-практической конференции «Молодые учёные в медицине», Казань, 2010. – С. 171-172. 2. Файзуллина Р.А. Предотвратимые потери здоровья детей при заболеваниях органов пищеварения / Файзуллина Р.А., Абдуллина Е.В., Хасанова А.М. // Сборник материалов к II Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке», том 1, Казань, 2010. – С. 12. 3. Файзуллина Р.А. Родители о состоянии здоровья детей с заболеваниями органов пищеварения / Файзуллина Р.А., Абдуллина Е.В., Хасанова А.М. // Сборник тезисов «Практическая медицина». – 2010. - №7 (46). – С. 131. 4. Файзуллина Р.А. Значимые факторы предотвратимости заболеваемости болезнями органов пищеварения у детей / Файзуллина Р.А., Абдуллина Е.В., Хасанова А.М. // Сборник материалов к XVI Российской Гастроэнтерологической неделе. – Москва, 2010. – С. 115. 5. Файзуллина Р.А. Мнение родителей о качестве и доступности гастроэнтерологической помощи, оказываемой их детям / Файзуллина Р.А., 23 Абдуллина Е.В. // Сборник материалов IX Российского конгресса «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии». – Москва, 2010. – С.78. 6. Файзуллина Р.А. Факторы патогенности и вирулентности Helicobacter pylori и их роль в развитии хеликобактер-ассоциированной гастродуоденальной патологии / Файзуллина Р.А., Абдуллина Е.В. // Практическая медицина. – 2010. №1 (48). – С. 74-78. 7. Файзуллина Р.А. Эндоскопические особенности поражения желудка и двенадцатиперстной кишки у детей / Файзуллина Р.А., Абдуллина Е.В. // Сборник материалов VI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые учёные в медицине». – Казань, 2011. – 76. 8. Файзуллина Р.А. Питание детей, как фактор, предрасполагающий к развитию хронической гастродуоденальной патологии / Файзуллина Р.А., Абдуллина Е.В., Гатауллина Е.Н. // Сборник материалов XVIII конгресса детских гастроэнтерологов России и стран СНГ «Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей». - Москва, 2011. – С. 59-60. 9. Файзуллина Р.А. Клинические особенности хронической гастродуоденальной патологии у детей в зависимости от возраста / Файзуллина Р.А., Абдуллина Е.В., Номина Э.И. // Сборник материалов XVIII конгресса детских гастроэнтерологов России и стран СНГ «Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей». Москва, 2011. – С. 59-60. 10. Файзуллина Р.А. Микроскопия мазков-отпечатков слизистой оболочки антрального отдела желудка детей с H.pylori-ассоциированной патологией гастродуоденальной области / Файзуллина Р.А., Абдуллина Е.В. // Сборник материалов к IX Российской конференции с международным участием «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском федеральном округе». - Казань, 2012. – С. 112. 11. Абдуллина Е.В. Особенности цитокинового статуса сыворотки крови при H.pylori-ассоциированной хронической гастродуоденальной патологии у детей / Абдуллина Е.В., Агафонова Е.В., Файзуллина Р.А. // Сборник материалов к IX Российской конференции с международным участием «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском федеральном округе». - Казань, 2012. – С. 9. 12. Диагностическая значимость методов обнаружения H.pylori у детей с хронической патологией гастродуоденальной области / Файзуллина Р.А., Ахметов И.И., Абдуллина Е.В., Ефимова Н.Г. // Вопросы диагностики в педиатрии. 2012. - №1, Т. 4. – С.28-31. 13. Файзуллина Р.А. Характеристика диагностических методов выявления и роль вирулентных штаммов H.pylori при хронической патологии гастродуоденальной области у детей г. Казани / Файзуллина Р.А., Ахметов И.И., Абдуллина Е.В. // Сборник научных статей III Международного конкурса научноисследовательских работ «Диагностика заболеваний желудочно-кишечного тракта по выдыхаемому воздуху». – Санкт-Петербург, 2012. – С. 71-77. 14. Влияние полиморфизма -511Т/С гена интерлейкина-1В на развитие и течение хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной 24 патологии у детей / Файзуллина Р.А., Ахметов И.И., Абдуллина Е.В., Архипова А.А. // Вопросы детской диетологии. – 2012. - №2. Т. 10. – 5-10 15. Абдуллина Е.В. Особенности течения хронической H.pyloriассоциированной гастродуоденальной патологии у детей в зависимости от генетических особенностей микроорганизма / Абдуллина Е.В. // Практическая медицина. – 2012. - №3 (58). – С. 41-44. 16. Файзуллина Р.А. Характеристика диагностических методов выявления H.pylori при хронической патологии гастродуоденальной области у детей / Файзуллина Р.А., Абдуллина Е.В. // Сборник материалов 87 Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 155-летию содня рождения Л.О. Даркшевича. - Казань, 2013. – С. 277 Список сокращений ДПК – двенадцатиперстная кишка H.pylori - Helicobacter pylori ЭГДС – эзофагогастродуоденоскопия ПЦР – полимеразная цепная реакция ЯБ ДПК – язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки ФНО- α – фактор некроза опухоли- α IL1B – ген интерлейкина 1β IL10 – ген интерлейкина 10 ХГД – хронический гастродуоденит Se – чувствительность Sp- специфичность ИП – истинно положительный ИО – истинно отрицательный ЛП – ложно положительный ЛО – ложно отрицательный ДИ – доверительный интервал
