РАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО

РАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК
HBV И РНК HDV В КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
Коновалов А.С., Карандашова И.В., Куевда Д.А.
ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия
Введение. Вирусный гепатит В (ВГВ) – широко распространенная инфекция
человека, вызываемая ДНК-содержащим вирусом, относящимся к семейству
Hepadnaviridae. Заражение вирусом гепатита В происходит при непосредственном
попадании вируса в кровь (при парентеральных вмешательствах или при
гемотрансфузиях) или через слизистые оболочки, повреждения кожного покрова (при
половых контактах, вертикальной передаче, тесном бытовом контакте).
Вирусный гепатит В представляет собой серьезную проблему здравоохранения
ввиду его повсеместного распространения. Выявление ДНК HBV и определение вирусной
нагрузки в плазме крови являются ценными диагностическими тестами, которые
используются в совокупности с другими серологическими маркерами и биохимическими
методами для диагностики вирусного гепатита В и мониторинга терапии.
Однако, весьма важно распознавание HDV-инфекции на фоне гепатита В,
поскольку течение болезни, терапевтические подходы и прогноз при гепатите D
отличаются от таковых при ВГВ.
Вирус гепатита D (HDV) является РНК содержащим, гепатотропным вироидом
(несовершенным вирусом), относящимся к семейству Deltavirus. HDV нуждается в
хелперной функции вируса гепатита В, который обеспечивает вирус гепатита Дельта
белками поверхностной оболочки (HBsAg). Поэтому HDV способен к эффективной
репликации только в присутствии HBV.
Пути передачи HDV-инфекции аналогичны путям передачи гепатита В. В мире
насчитывается около 500 миллионов человек, инфицированных вирусом гепатита В. Их
инфицированность HDV в эндемичных районах может достигать 60%. В России
максимум регистрации ВГД приходится на зоны, эндемичные по HBV - Туву, Якутию.
Коинфекция - одновременное заражение вирусами гепатитов B и D носит характер
острого тяжелого заболевания с высоким риском развития фульминантного гепатита (до
20%). Заражение вирусом гепатита D больного хроническим гепатитом В или носителя
вируса гепатита В (суперинфекция) в 70-80% случаев ведет к быстрому развитию цирроза.
Для диагностики дельта-инфекции наиболее целесообразно использовать тестсистемы на основе ПЦР. РНК HDV является первым диагностическим маркером,
обнаруживаемым в крови пациента, антитела к D-Ag появляются на 2-3 недели позже, к
тому же, наблюдается высокая частота серонегативной HDV-инфекции. Выявление РНК
HDV c помощью ПЦР позволяет надёжно и максимально рано обнаруживать возбудителя.
Вирус гепатита D подавляет репликацию вируса гепатита В. Как правило,
показанием к исследованию на наличие HDV является отсутствие ДНК вируса гепатита В
или низкая концентрация ДНК HBV в плазме крови у хронически инфицированного
пациента при наличии синдрома цитолиза (или других признаков поражения печени)..
Из вышесказанного следует, что всех пациентов с вновь выявленным ВГВ,
необходимо тестировать на наличие HDV. Наиболее логичным и правильным является
формат одновременного выявления ДНК HBV и РНК HDV как с целью скрининга, так и
дифференциальной
диагностики.
Данный
формат
максимально
оперативен,
информативен, позволяет более точно определить прогноз течения заболевания и
немедленно внести коррективы в схему лечения.
Целью данной работы является разработка и апробация набора реагентов для
одновременного выявления ДНК HBV и РНК HDV в клиническом материале.
Результаты. В ЦНИИ Эпидемиологии был разработан набор реагентов
«АмплиСенс HBV/HDV-FL». Данный набор реагентов предназначен для одновременного
выявления РНК вируса гепатита D и ДНК вируса гепатита В в одной пробирке методом
полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. ДНК HBV,
РНК HDV и экзогенный внутренний контроль детектируются независимо по 3 каналам.
Реакция обратной транскрипции совмещена с реакцией амплификации, что упрощает
процесс работы врачей-лаборантов и сокращает количество ошибок при подготовке
реакционных смесей. ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме
реального времени позволяет добиться максимальной чувствительности и специфичности
выявления.
Набор реагентов адаптирован под универсальную программу амплификации, что
позволяет одновременно проводить в одном приборе любое сочетание тестов (например,
совместно с тестами для количественного определения ДНК HBV, выявления РНК HCV,
генотипирования HCV и др.). Набор реагентов «АмплиСенс HBV/HDV -FL» адаптирован
под автоматические станции пробоподготовки и неавтоматизированные методы
выделения нуклеиновых кислот (сорбционные и преципитационные) с различным
объёмом исследуемого образца от 100мкл до 1000мкл.
Аналитическую чувствительность разработанного набора реагентов определяли на
международной панели стандартов NIBSC (в случае HBV) и на стандартном образце
предприятия (СОП) HDV (концентрация СОП измерена методом лимитирующих
разведений). Аналитическая чувствительность «АмплиСенс HBV/HDV-FL» указана в
Таблице 1.
Таблица 1. Определение аналитической чувствительности набора реагентов
«АмплиСенс HBV/HDV-FL»
Аналитическая
чувствительность
Объём образца для
Метод выделения
выделения, мкл
HBV,
HDV,
МЕ/мл копий/мл
Ручное выделение с реагентами
100
100
100
«РИБО-сорб» и «РИБО-преп»
Ручное выделение с реагентами
200
50
50
«МАГНО-сорб»
Ручное выделение с реагентами
«МАГНО-сорб»
1000
10
10
Автоматические станции
пробоподготовки
Аналитическую специфичность набора реагентов исследовали посредством
добавления в реакцию нуклеиновых кислот следующих организмов и вирусов: вирус
гепатита А, вирус гепатита С, вирус иммунодефицита человека, цитомегаловирус, вирус
Эпштейна-Барр, вирус простого герпеса типы 1, 2, вирус ветряной оспы, вирус герпеса
человека типы 6, 8, парвовирус В19, вирус клещевого энцефалита, вирус лихорадки
западного Нила, аденовирус типы 2, 3, 7, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Homo sapiens и др. Перекрестные реакции
для указанных организмов и вирусов зарегистрированы не были.
Клинические испытания проводились на образцах ранее протестированных
референс методами. В качестве референс тест-систем использовали наборы реагентов
разрешенные к производству и применению на территории РФ «АмплиСенс HBV-FRT» и
«АмплиСенс HDV-EPh".
Испытания диагностической специфичности набора реагентов «АмплиСенс
HBV/HDV-FL» проводили на 70 образцах здоровых доноров, не содержащих РНК HDV и
ДНК HBV. Для всех 70 образцов положительные сигналы зарегистрированы не были
(отсутствовали значения пороговых циклов (Ct)). Таким образом, специфичность
исследуемого набора реагентов составила 100%.
Испытания диагностической чувствительности проводили на 75 образцах
положительных по содержанию ДНК HBV и РНК HDV. Из 75 исследуемых образцов 35
содержали только ДНК HBV, 11 только РНК HDV (не детектируемый уровень ДНК HBV)
и 29 образцов содержали одновременно ДНК HBV и РНК HDV. Дискордантных
результатов с референс методами обнаружено не было. Таким образом, чувствительность
исследуемого набора реагентов составила также 100%.
Вывод. Таким образом, разработанный во ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора набор
реагентов «АмплиСенс HBV/HDV-FL» представляет собой удобный и надежный
инструмент для выявления и оценки устойчивого ответа на лечение как моноинфекции
HBV, так и коинфекции/суперинфекции с HDV.