4 лекция - Учебно-методические комплексы Ташкентской

ТАШКЕНТСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
КАФЕДРА БИОЛОГИЧЕСКОЙ И БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ
ЛЕЧЕБНОГО И МЕДИКО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТОВ
Тема лекции: «БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ»
для студентов 2 курса лечебного, медико-профилактического факультетов
Рассмотрена и одобрена на
учебно-методическом заседании
кафедры от 28 августа 2006 г.
протокол №1
Составитель:
проф. Собирова Р.А., Иноятова Ф.Х.
Ташкент - 2006 г.
2
1. Тема лекции: Биосинтез нуклеиновых кислот
2. Для студентов 2 курса лечебного, медико-профилактического
факультетов.
3. Ознакомить студентов основными этапами биосинтеза ДНК, РНК
и белков, механизмами регуляции этих процессов. Изучение данной темы
даст возможность студентам понять основные механизмы развития
наследственных заболеваний. Нуклеиновые кислоты совместно белками
лежат в основе жизни, являются материальными субстратами жизни.
Согласно современному определению жизни: “Жизнь представляет собой
способ существования белковых тел и нуклеиновых кислот, содержанием
которого являются непрерывный обмен веществ между организмом и
окружающей средой, процессы отражения и саморегуляции, направленные
на самосохранение и самовоспроизводство организмов”.
4. Вопросы, рассматриваемые на данной лекции:
4.1. ДНК и наследственность.
4.2. Биосинтез ДНК (репликация). Репликация – способ
передачи генетической информации.
4.3. Биосинтез РНК (транскрипция) - формирование
информации ДНК в форме РНК.
4.4. Посттранскрипционные изменения – созревание РНК.
10мин
30мин.
30мин.
20мин.
5. Текст лекции:
5.1. ДНК и наследственность. Биосинтез ДНК (репликация).
История изучения строения, биосинтеза и функций ДНК связана с
возникновением
и
решением
общебиологической
проблемы
наследственности.
На рубеже Х1Х и ХХ вв. генетические и цитологические
исследования привели к выводу, что ответственными за передачу признаков
по наслдеству являются хромосомы. При этом можно выделить некоторый
наследственный признак, котрый передается с определенным участком
хромосомы – геном. Всему набору признаков организма соответствует набор
генов всех хромосом – генотип. Объяснение механизма передачи признаков
включало представление о самовоспроизведении (репликации) генотипа; в
результате самовоспроизведения генотип клетки удваивается, и при
последующем делении дочерние клетки получают по полному набору генов.
Это представление обосновывалось картиной удвоения и расхождения
хромосом в процессе митоза.
Поскольку хромосомы содержат белок и ДНК, возник вопрос, какое
из этих веществ участвует в передаче наследственных признаков. В 40-50-е
годы появилось много экспериментальных указаний на то, что передача
наследственной информации осуществляется молекулами ДНК. Одним из
3
наглядных доказательств этого послужило изучение размножения
бактериофагов – вирусов, паразитирующих на бактериях. Бактериофаг Т4,
размножающийся в клетках кишечной палочки, состоит из ДНК и белковой
оболочки с довольно сложной морфологией. Фаг имеет головку
икосаэдрической фориы, в которой тесно упакована одна молекула ДНК, и
полный цилиндрический хвост, от конца которого отходят шесть тонких
нитей. Хвост имеет двойные стенки и представляет собой как бы трубку,
вставленную в трубку большего диаметра. Процесс заражения бактерии
фагом представляет собой сложную последовательность молекулярных
событий. Фаг присоединяется к ее поверхности с помощью хвостовых нитей,
и конец хвоста фиксируется на оболочке бактерии. Прикрепление фага к
бактерии основано на комплементарном взаимодействии белков хвостовых
нитей и конца хвоста с веществами бактериальной стенки. Затем наружная
трубка хвоста сокращается, внутренняя трубка проникает через оболочку
бактерии и через нее из головки внутрь бактерии “впрыскивается” ДНК фага,
тогда как белковая оболочка фага остается на поверхности. Через некоторое
время, измеряемое десятками минут, в бактерии обнаруживается уже
несколько сот фаговых частиц, имеющих и белковую оболочку, и ДНК
внутри нее. Из этого следует, что вся информация с структуре фага
содержится в его ДНК.
Такого рода работами завершилась линия исследований,
посвященных выяснению материальной основы наследственности; начало
этой линии восходит к первым наблюдениям и осознанию явления
наследственности, роль которой стала вполне ясной после появления теории
биологической эволюции.
5.2.Репликация – способ передачи генетической информации.
Согласно гипотезе Уотсона-Крика, каждая из цепей двойной спирали
ДНК служит матрицей для репликации комплементарных дочерных цепей.
При этом образуются две дочерние двухцепочечные молекуля ДНК,
идентичные родительской ДНК, причем каждая их этих молекул содержит
одну неизмененную цепь родительской ДНК. Гипотеза Уотсона-Крика была
проверена с помощью остроумных опытов, выполненных Мэтью
Мезельсоном и Франклином Сталем в 1957году. Результаты исследований
показали, что в сторогм соответствии с гипотезой Уотсона-Крика каждый
дочерний дуплекс ДНК после двух циклов удвоения клеток содержал одну
родительскую и одну новообразованную цепь ДНК. Такой механизм
репликации назвали полуконсервативным, поскольку в каждой дочерней
ДНК сохраняется лишь одна родительская цепь. Полученные результаты
полностью исключили консервативный способ репликации, при котором
одна дочерняя ДНК должна была бы содержать обе исходные цепи, а другая
состояла бы из двух новосинтезированных цепей. Опыт Мезельсона и Сталя
позволил также отвергнуть так называемый дисперсивный механизм
репликации, при котором каждая дочерняя цепь ДНК состоит из коротких
4
участков как родительской, так и новообразованной ДНК, соединенных
между собой случайным образом.
Репликация эукариотической ДНК начинается одновременно во
многих точках (число которых, вероятно, превышает тысячу). Из каждой
такой точки одновременно в противоположных направлениях движутся две
репликативные вилки, благодаря чему репликация целой эукариотической
хромосомы может завершиться даже быстро, чем репликация бактериальной
хромосомы.
При репликации участвует фермент ДНК-полимераза I, открытый
Артуром Корнбергом и его коллегами в 1956 г. ОН катализирует
последовательное присоединение дезоксирибонуклеотидных остатков к
концу цепи ДНК с одновременным освобождением неорганического
пирофосфата
Mg
(dNMP)n + dNTP =====(nNMP)n+1 +PP
ДНК
удлинен.ДНК
Если хотя бы один из четырех предшественников отсутствует, то
новая ДНК не образуется, те синтез новой ДНК идет только в присутствии
всех четырех дезоксирибонуклеозидов. Фермент не работает при замене 5 1трифосфатов всех четырех дезоксирибонуклеозидов на соотвествующие 5 1дифосфаты или 5-монофосфаты. А также с рибонуклеозид-5-трифосфатами.
Необходимо наличие ионов Мg+2.
ДНК-полимераза катализирует ковалентное связывание новых
дезоксирибонуклеотидов, которое происходит благодаря присоединению их
-фосфатных групп к свободному 31 –гидроксильному концу
предшествующей цепи ДНК; следовательно синтез цепи ДНК происходит в
направлении 51
31 . Для действия ДНК-полимеразы необходима
предшествуюшя ДНК, она служит затравкой и матрицей.
ДНК-полимераза не в состоянии сама по себе без затравки начать
синтез новой ДНК; она способна только удлинять уже сущестующую цепь,
причем даже это она может делать только в присутствии цепи, играющей
роль матрицы.
Нуклеотиды присоединяются к цеп-затравке в соответствии с
нуклеотидной
последовательностью
цепи-матрицы
по
принципу
комплементарного спаривания Уотсона-Крика. Где бы ни находился в
матричной цепи остаток тимина, в дочерной цепи в этом месте встраивается
остаток аденина, и наоборот. Аналогичным образом, если в цепи – матрице
состоит остаток гуанина, то напротив него в дочерной цепи будет встроен
остаток цитозина, и наоборот.
Однако, по сей день у нас нет полной и детальной картины процесса
репликации. Все этапы процесса репликации протекают с очень высокой
скоростью и исключительной точностью. Весь комплекс,состоящий более
чем из двадцати репликативных ферментов и факторов называют ДНКрепликазной системой или реплисомой. Существует 3 вида ДНК-полимеразы
5
– I, II, III. За элонгацию цепи ДНК отвечает главным образом ДНКполимераза III.
ДНК-полимераза I
и ДНК-полимеразаIII обладают тремя
ферментативными активностьями. Кроме полимеразной активности они
имеют 51 31 и 31 51 экзонуклеазную активность, т.е. они могут отщеплять
концевые нуклетиды с любого конца цепи ДНК.
Функция ДНК- полимеразы II пока неизвестна. В ходе репликации
большая часть новообразованной ДНК обнаруживается в форме больших
кусков. Эти куски, получившие название фрагментов Оказаки, содержат
приблизительно 1000-2000 нуклеотидных остатков. Эти фрагменты
образуются в результате прерывистой репликации и затем соединются друг с
другом в одну цепь.
Одна из цепей ДНК реплицируется непрерывно в направлении 51 31,
то есть в направлении движения репликативной вилки; эту цепь называют
ведущей. Другая же цепь синтезируется прерывисто с образованием
коротких фрагментов, также за счет присоединения новых мономеров к 3 1
концу, то есть в направлении, противоположном движению репликативной
вилки. Затем фрагменты Оказаки сшиваются с помощью ферментов друг с
другом и образуют отстающую цепь.
Для синтеза фрагментов Оказаки в качестве затравок требуются
короткие отрезки РНК, комплементарные матричной цепи ДНК. Эта РНК
образуется в направлении 51 31 из АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ с помощью
фермента – праймазы. Обычно РНК-затравка состоит всего лишь из
нескольких рибонуклеотиных остатков, к которым затем ДНК-полимераза III
присоединяет 1000-2000 дезоксирибонуклеотидных остатков и образует
фрагмент Оказаки и РНК затравка удаляется. С помошью 51 31
экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы I.
Фрагмент Оказаки присоединяется к отстающей цепи ДНК с
помощью фермента ДНК-лигазы, реакция идет с расходом АТФ, то есть
ДНК-лигаза сшивает фрагменты оказаки комплементарные матричной цепи
ДНК.
Раскручивание двойной спирали и удерживание двух цепей на
некотором расстоянии жруг от друга, чтобы они могли реплицироваться,
осуществляется при помощи нескольких специальных белков.
Фермент хеликаза (helix- спираль) расплетают короткие участки ДНК,
находящиеся непосредственно перед репликативной вилкой. Затрачивается
для раскручивания энергия гидролиза 2 АТФ.
К каждой из разделившихся цепей прочно присоединяется несколько
молекул ДНК-связывающего белка, котрый препятствует образованию
комплементарных пар и обратному воссоединению цепей.
Кратковременные разрывы и воссоединения осуществляются
ферментами – ДНК-гиразой. Она помогает хеликазе раскручивать ДНК для
ее репликации.
6
• Человеческая хромосома состоит из 150 млн. пар нуклеотидов,
скорость репликации составляет 50 нукл/мин. В связи с этим синтез
начинается в нескольких сайтах (ориджинах), растояние между
ориджинами называется репликоном. Так как синтез идет в двух
направлениях, они пересекаются.
• Созревание ДНК включает метилирование, удлинение при участии
теломераз и репарацию.
Репарация
• Повреждение молекулы ДНК может быть спонтанным (депуринизация
и дезаминирование) или индуцированным (под воздействием
физических и химических факторов).
• Для репарации депуринизации и химических мутаций идет с участием
ДНК инсертазы, дезаминирования – ДНК-N-гликозидаза, АПэндонуклеаза, ДНК-полимераза β и ДНК-лигаза.
• Образованные под воздействием УФО пиримидиновые димеры
репарируются при участии фотолиазы.
• К наследственным заболеваниям, связанным с нарушением репарации
ДНК, относятся пигментная склеродермия и трихотиодистрофия.
5.3.Биосинтез РНК (транскрипция). Транскрипция как способ
передачи информации ДНК на РНК.
Транскрипцией называется процесс, в результате которого
генетическая информация заключенная в ДНК копируется (переписывается)
в РНК с последующим переносом с РНК к рибосомам. Отрезок ДНК,
подвергающийся транскриции принято называть транскриптоном. Длина
транскриптонов колеблется от 300 до 108 нуклетидов. Отдельные участки
транскриптонов несут разные функции. Одна группа участков относится к
информативным, а другая неинформативным. Во многих структурных генах,
осбенно эукаритов, генетическая информация записана с прерывами.
Участки в структурных генах, несущие информацию, называются экзонами, а
неинформативные интронами. Возможно, интроны играют дополнительную
регуляторную фнукцию для экзонов.
Начальный участок транскриптона с которого начинается
транскрипция, называется промотор. К нему присоединияются белки,
облегчающие начало транскрипции, и фермент РНК-полимераза.
Транскриптон
!
!
!
!
и э и э и
про акцеп.зона
структурные гены
мотор
э и
!
э !
терминатор
С акцепторной или управля.щей зоной взаимодействуют различные
регуляторы, влияющие на транскрипцию. К акцепторной зоне примыкают
7
структурные цистроны или гены, содержащие перемежающие участки
интронов и экзонов.
В конце транскриптона имеется последовательность нуклетидов,
которая является своего рода сигналом об окончании транскрипции –
терминатор.
Для транскрипции необходимы:
1.участок ДНК, подлежащий транскрипции
2.наличие рибонуклеозидтрифосфатов (АТФ, ГТФ, УТФ, ЦТФ)
3.наличие фермента ДНКзависимой-РНК полимеразы.
Механизм транскрипции
Имеет 3 фазы:
1.инициация
2.элонгация
3.терминация
Инициация происходит вследствие присоединения ДНК-зависимой
РНК-полимеразы к промотору. У эукариотов имеется три РНК-полимеразы I,
II, III. Это белки, состоящие из нескольких субъединиц и отличаются друг от
друга по специфичности транскрипции.
РНК-полимераза I ответственна за транскрипцию генов рРНК.
РНК-полимераза II – за тРНК и 5SрРНК.
РНК-полимераза III – за синтез предшественника иРНК.
РНК-полимеразы наращивают цепь всегда в направлении 5 1 31,
поэтому 51 –конец содержит всегда трифосфат (ф-ф-ф), а 31 свободный ОН.
Начинается синтез всех цепей РНК либо с фффА, либо с фффГ.
Элонгация происходит при скольжении РНК полимеразы вдоль
матрицы ДНК. Каждый следующий нуклеотид спаривается с
комплементарным основанием в ДНК матрице, а РНК-полимераза
“скрепляет” его с растущей цепью РНК фософдиэфирными связями.
Скорость элонгации 40-50 нуклеотидов в секунду.
Терминация транскрипции происходит после достижения РНК
полимеразой нуклеотидных последовательностей ДНК, являющихся стопсигналами. Считают, что такими стоп-сигналами в транскриптоне могут быть
поли (А) последовательности. Выделен специальный фактор терминации – Q
фактор, (белок) который обрывает транскрипцию.
Синтезированная РНК отделяется от ДНК и она является полной
копией транскриптонов ДНК. Значит в новосинтезированной РНК имеются
информативные и неинформативные участки. Поэтому первичный
транскрипт называют РНК-предшественником.
5.4.Созревание РНК после транскрипции.
Посттранскрипционном периде происходит созревание РНК.
Различают 3 типа предшественников РНК:
1.предшественник мРНК или гетерогенная ядерная РНК (предмРНК
или гяРНК).
2.предшественник рРНК
8
3.предшественник тРНК
В
ядре
все
предшественники
РНК
проходят
стадию
послетранскрипционного созревания или процессинга. Оно включает:
1. вырезание неинформативных участков из пре-РНК
2. сращивание информативных участков “разорванных” генов –
сплайсинг
3. модификация 51 и 31 концевых участков РНК.
Роль малой ядерной РНК (мяРНК) в вырезании интронов и
воссоединении экзонов: основания на концах интрона образуют
комплементарные пары с определенными основаниями мяРНК. Процесс
соединения экзонов сопровождается вырезанием интрона. МяРНК состоит и
100 нуклеотидов.
Сплайсинг – ферментативное соединение кодирующих фрагментов
(экзонов).
Процесс формирования зрелых молекул тРНК помимо “обстригания”
предшественников нуклеазами требует модификации пуриновых и
пиримидиновых основ. Такая модификация включает до 60 и более реакций.
При модификации пуриновых и пиримидиновых оснований
происходит метилирование восстановленной двойной связи (С-5 и С-6) и др.
В качестве примера “обстригания” можно привести случай с тирозиновой тРНК. ЕЕ предшественник содержит 129 нуклеотидов, то есть на 44 больше,
чем в зрелой молекуле т-РНК. Отщепление фрагмента происходит с
помощью нуклеза.
Все зрелые РНК транспортируются из ядра в цитоплазму в комплексе
с белком, который защищает их от разрушения и способствует переносу.
МРНК связывается с особым белком – информофером.
6.Примеры из практики.
6.1. Для того, чтобы данный материал был понятен для студентов
необходимо привести несколько примеров наследственных заболеваний,
встречающихся в детском возрасте: зайчья губа, волчья пасть и другие;
6.2. На примере развития мутаций объяснить механизм развития
наследственных заболеваний.
6.5. На примере универсальности кода разъяснить студентам о
единстве происхождения всех форм жизни на Земле.
7. Демонстрационный материл:
Модель ДНК, таблицы - кода, схема строения тРНК; этапы синтеза
РНК.
8. Заключение
На основание вышеизложенного нуклеиновые кислоты можно назвать
информационными молекулами. При биосинтезе новых молекул
нуклеиновых кислот носителями такой программы являются нуклеиновые
9
кислоты; в этой роли их называют матрицами. Матрица в ходе матричного
синтеза не расходуется и может использоваться многкратно.
9. Вопросы к аудитории:
- Какие 3 этапа передачи генетической информации различают?
- Что такое репликация?
- Что такое транскрипция?
- Какие изменения происходят при созревании РНК?
- Какова функция мяРНК?
- Какой белок переносит иРНК через ядерную мембрану?
10. Использованная литература:
1. Николаев А.Я. Биологическая химия. Москва, 1989.
2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. Москва, 1990.
1. Николаев А.Я. Биологическая химия. Москва, 1989.
2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. Москва, 1990.
3. Ленинжер А. Биохимия,1-3т, Москва, 1990
4. Мельцер Д. Биохимия, 1-3т, Москва, 1990
5. Срайер Л, Биохимия,1985
6. Строев Биохимия, 1981
7. Уайт и др. Биохимия, 1983
8. Хорст А. Молекулярные основы патогенеза болезней, 1982