На правах рукописи - Институт цитологии и генетики СО РАН
реклама
На правах рукописи ГУБАНОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ФОРМИРОВАНИЯ И МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ СБОРКИ-РАЗБОРКИ ЯДЕРНЫХ И ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ПОР В СИНЦИТИАЛЬНЫХ ЭМБРИОНАХ DROSOPHILA MELANOGASTER Гистология, цитология, клеточная биология – 03.00.25 АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск, 2006 Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель: кандидат биологических наук Киселева Елена Владимировна, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Высоцкая Людмила Васильевна, Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск доктор биологических наук Захаров Илья Кузьмич, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Институт систематики и экологии животных СО РАН, Новосибирск Защита диссертации состоится «24» января 2007 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук (Д – 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т/ф (383)333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан « » декабря 2006 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев Актуальность проблемы. Между ядром и цитоплазмой эукариотической клетки постоянно происходит обмен информационными молекулами (мРНК) и белками - регуляторами репликации, транскрипции и трансляции. Дефекты в механизмах этого процесса могут вести к нарушению экспрессии генов, что может иметь серьезные последствия, начиная с отклонения в развитии организма и заканчивая злокачественным перерождением тканей. С этой точки зрения исследование функциональных взаимоотношений между ядром и цитоплазмой имеет не только фундаментальное научное значение, но и является актуальным вопросом, имеющим приложение в современной медицине. Основную роль в регуляции обмена между ядром и цитоплазмой играют ядерные поровые комплексы (ЯПК) – специфические каналы в ядерной оболочке (ЯдО), через которые осуществляется активный и пассивный обмен макромолекул. ЯПК являются сложными надмолекулярными структурами, в формировании которых принимает участие около 30 различных белков, называемых нуклеопоринами. Изучение механизмов формирования ЯПК является одной из актуальных задач в исследовании регуляторных механизмов ядерно-цитоплазматического транспорта. Одним из подходов в изучении формирования ЯПК является анализ особенностей их реорганизации в ходе митоза. Известно, что в начале митоза ЯПК разбираются на отдельные белковые компоненты, ламина деполимеризуется, а ядерные мембраны фрагментируются. После окончания митоза образуется сплошная двухслойная оболочка, в которой de novo формируются ЯПК. Известно, что в эукариотической клетке переход к митозу и его завершение происходят в результате активации и инактивации митотических киназ, что вызывает структурные изменения в цитоплазме и ядре клетки (Arellano, Moreno, 1997). Однако, то, как эти митотические факторы регулируют процессы сборки-разборки ЯПК, остается до сих пор мало изученными. Показано, что в цитоплазме ооцитов и митотически активных клеток, таких, как опухолевые клетки и клетки ранних эмбрионов встречаются необычные мембраны, содержащие структуры, сходные с ЯПК и называемые цитоплазматическими порами (ЦП) или пороподобными комплексами. ЯПК и ЦП сходны по морфологии, белковому составу, а также проявляют синхронность в процессе обратимой реорганизации в митозе. Мембраны, содержащий ЦП, обозначают как пористые пластинки (ПП) или окончатые мембраны. Они могут быть представлены одиночными пластинками или, чаще, стопками пластинок, расположенных в цитоплазме клетки. Существует предположение, что ПП являются запасающим компартментом нуклеопоринов для формирования ЯПК в ЯдО ооцитов амфибий. Функция ПП в соматических митотически активных клетках на сегодняшний день остается недостаточно исследованной. Известно, что малая ГТФ-аза Ran принимает активное участие в ядерноцитоплазматическом транспорте, а также регулирует процессы формирования митотического веретена и ЯдО (Clarke, Zhang, 2004). Недавние исследования продемонстрировали, что Ran контролирует также сборку ЯПК у дрожжей (Ryan et al., 2003) и ЦП в системе in vitro (Walter et al., 2003), однако механизмы этого процесса изучены не достаточно. Наиболее удобным объектом для изучения регуляции митотической реорганизации ЯПК и ЦП являются эмбрионы дрозофилы на стадии синцитиальной бластодермы. В них ядра претерпевают 13 быстрых синхронных делений, что позволяет получать образцы, содержащие ядра на разных стадиях клеточного цикла. В цитоплазме эмбриона присутствуют также ПП, которые синхронно собираются и разбираются в ходе митоза. В дополнение к этому, начиная с 9 цикла деления, ядра разделяются на две популяции: быстро делящиеся на периферии эмбриона бластодермальные ядра, и находящиеся в центре эмбриона и не подверженные делению, полиплоидные желточные ядра. Это предполагает существование различий в митотической реорганизации ядер и расположенной рядом с ними цитоплазмы в центральной и периферической областях эмбриона. Синцитиальные эмбрионы дрозофилы удобны также для манипуляций и наблюдения с помощью конфокальной и электронной микроскопии. На основании этого были сформулированы следующие цель и задачи настоящего исследования. Цель диссертационной работы – изучение регуляции митотической реорганизации ядерных и цитоплазматических пор и анализ их функционального взаимодействия в эмбрионах дрозофилы на стадии синцитиальной бластодермы. В работе решались следующие конкретные задачи: 1. Провести электронно-микроскопический анализ динамики ядерной оболочки и пористых пластинок на разных стадиях клеточного цикла. 2. Выяснить являются ли пористые пластинки запасающим компартментом нуклеопоринов в синцитиальных эмбрионах дрозофилы. 3. Определить, как активность митотических киназ и фосфатаз влияет на сборку-разборку ядерных и цитоплазматических пор. 4. Определить влияние малой ГТФ-азы Ran на процесс сборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах дрозофилы. Новизна и научная ценность работы: С использованием методов электронной микроскопии, морфометрического анализа и микроинъекций впервые показано, что основная часть нуклеопоринов находится в растворенном состоянии в цитоплазме синцития и ПП не являются основным запасающим компартментом для белков ядерных пор. Установлено, что процесс сборки-разборки ЯПК и ЦП регулируется динамическим равновесием между активностью митотической киназы cdk1 и действием фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте. На основании проведенных исследований предложена модель регуляции сборки/разборки ЯПК и ЦП в синцитиальных эмбрионах дрозофилы. Продемонстрировано, что малая ГТФ-аза Ran участвует в формировании ядерной оболочки и ядерных пор и не влияет на формирование цитоплазматических пор. Показано, что синцитиальные эмбрионы дрозофилы являются удобной экспериментальной моделью для изучения процессов регуляции сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор in vivo. Апробация работы Результаты исследований были представлены на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН в 2002 и 2005 гг., ХIX Российской конференции по электронной микроскопии (Москва, 2002), III Международной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы современной биологии и биотехнологии» (Казахстан, Алма-Аты, 2003.), Международном симпозиуме по проблемам мейоза (Санкт-Петербург, 2003), Международном симпозиуме «Ядерная оболочка в передаче информации и генной регуляции» (Дарем, Великобритания, 2004), III съезде ВОГИС (Москва, 2004) и Дальневосточной школе-конференции (Владивосток, 2006). Вклад автора Автором были зафиксированы образцы эмбрионов дрозофилы и приготовлены препараты для световой и электронной микроскопии, проведен качественный анализ электронно-микроскопических образцов, а также выполнен морфометрический анализ количества ЯПК и ЦП. Гель электрофорез, Вестерн-блот анализ, субфракционирование, количественная оценка содержания нуклеопоринов в различных фракциях, конфокальная микроскопия и микроинъекции были проведены Е.А.Онищенко (Содерторнский университетский колледж, Стокгольм, Швеция). Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 214 ссылок. Работа изложена на 144 страницах печатного текста, содержит две таблицы и иллюстрирована 39 рисунками. Материалы и методы Объекты исследования В работе использовались следующие линии Drosophila melanogaster: cdk1ts (A171T), png172 и Canton S - как дикий тип. Мухи содержались на стандартном корме при 220С. Перед отбором эмбрионов проводилась синхронизация откладки яиц. Для получения эмбрионов на 7-8 циклах деления отбор производился через 1 ч. после установки корма, для 11 и 14 циклов - через 2 и 2,5 ч. соответственно, а для более поздних стадий через 4 часа. Электронная микроскопия Эмбрионы фиксировались в растворах глутарового альдегида и тетраоксида осмия согласно методу, описанному ранее (Onischenko, Gubanova et al., 2004, 2005). Затем эмбрионы дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и в ацетоне, после чего заключали в эпоксидную смолу Agar100 и полимеризовали согласно стандартному протоколу. Срезы толщиной 50-80 нм, полученные на ультрамикротоме Ultracut Reichert (Австрия), переносились на медные сеточки и контрастировались растворами уранилацетата и цитрата свинца. Препараты исследовались на электронном микроскопе JEOL 100SX (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Получение, окрашивание и исследование полутонких срезов Перед приготовлением полутонких срезов стачивалось 60 мкм толщины эмбриона, что позволяло достичь его экваториальной области. Полутонкие срезы толщиной 0,5 мкм окрашивались 1 % раствором толлуидинового синего с добавлением 1 % раствора тетрагидробората натрия и анализировались в световом микроскопе. Определение цикла деления синцитиального эмбриона На полутонких срезах, проходящих через экваториальную область эмбриона подсчитывалось количество ядер, что однозначно определяло цикл деления эмбриона (Zalokar, Erk, 1976). Так, для 14 цикла, на экваториальный срез приходилось от 160 до 200 ядер, для 13 - от 80 до 100 ядер, для 11 - 20-25 ядер и для 7-8 - от 2 до 4 ядер на срез. Морфометрический анализ Подсчет ЯПК и ЦП проводился на экране электронного микроскопа. Количество ЯПК и ЦП в эмбрионе вычислялось согласно ранее описанному методу (Onischenko, Gubanova et al., 2004, 2005), после чего определялось среднее значение и стандартная ошибка. Вестерн-блот и определение количества белка Белки разделялись при помощи SDS полиакриламидного гель электрофореза и переносились на нитроцеллюлозную мембрану. Блокирования неспецифического связывания производилось по стандартному протоколу с небольшими модификациями (Onischenko et al., 2004). Вестерн-блот проявлялся в ECL-реагенте и анализировался с использованием системы анализа люминесцентных изображений Las1000plus. Для определения количества белка, эмбрионы разделялись по стадиям согласно морфологическим критериям, затем готовился гомогенат 10 эмбрионов, который лизировался в 10 мкл стандартного буфера. После электрофореза и переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану, проводилась инкубация с первичными и вторичными антителами к семи нуклеопоринам. Количество белка в каждом бэнде измерялось при помощи программы ImageGauge 3.1, и выражалось в относительных единицах. Субклеточное фракционирование Субклеточное фракционирование описанному ранее (Meller et al., было 1994) выполнено с согласно небольшими методу, модификациями (Onischenko,Gubanova et al., 2004). Исследование фосфорилирования нуклеопорина р150 Для адсорбции нуклеопорина р150 использовалась аффинная колонка (Pierce; Рокфорд), с соответствующими антителами. Комплекс антител с белками элюировался и обрабатывался двукратным SAP-буфером, содержащем щелочную фосфатазу SAP в течение 1 часа. Реакция останавливалась добавлением эквивалентного объема исходного буфера. Микроинъекции и конфокальная микроскопия на живых эмбрионах дрозофилы Эмбрионы без хориона прикреплялись к предметному стеклу, подсушивались в сухой камере 5-7 мин., а затем покрывались галокарбоновым маслом. Инъекции проводились с помощью вытянутого капилляра на микроинъекторе с воздушным управлением Microinjector 5242 (Eppendorf, США). Концентрация циклогексимида в инъецируемой смеси составляла 1 мкг/мл, GST-циклина В - 7,5 мкг/мл, окадаевой кислоты 150 мкМ. При исследовании действия малой ГТФ-азы Ran производились последовательные инъекции: RanT24N (Sigma-Aldrich) (8 мкг/мл) или RCC1 (SigmaAldrich) (8 мкг/мл), а затем циклогексимида (1 мкг/мл). Для наблюдения ЯПК и ЦП в живых эмбрионах производилась инъекция в них WGA-Alexa594 (0,1 млг/мл). Изображение объектов было получено с использованием конфокального микроскопа Leica TCS-SP, оборудованного программой Leica Cofocal Software 2.61. Результаты и обсуждение Изучение ультраструктурной динамики ядерных и цитоплазматических пор в процессе синцитиального развития эмбриона дрозофилы Из ранее проведенных работ известно, что в интерфазе ЯПК находятся в собранном состоянии и состоят из трех отделов: центрального, содержащего транспортер, и двух ассиметричных периферических – цитоплазматического, с цитоплазматическими фибриллами, и внутриядерного, содержащего баскетструктуру (Kiseleva et al., 1996, 1998, 2001). Наши исследования ультраструктуры ядерных и цитоплазматических пор на стадии интерфазы продемонстрировали, что ЦП и ЯПК имеют сходный вид на гексагональных срезах (Рис. 1 в, г), но различаются на поперечных срезах. ЦП не содержат баскет-структуру (Рис. 1 а), при этом в них наблюдаются два сходных периферических отдела, соответствующих по строению цитоплазматическому отделу ЯПК (Рис. 1 б). В работах других авторов было показано, что ЦП содержат нуклеопорины, характерные для цитоплазматического и центрального отдела ЯПК, в то время как белков, входящих в состав баскет-структуры, в ЦП обнаружено не было (Cordes et al., 1995), что согласуется с нашими наблюдениями. Также известно, что наружная мембрана ЯдО проявляет сходство с мембранами ЭПР, тогда как внутренняя мембрана контактирует с ламиной и содержит специфические белки. Мембраны же ПП обе идентичны мембранам ЭПР, что, возможно, и обуславливает сборку сходных периферических отделов в ЦП, соответствующих цитоплазматическому отделу ЯПК. Рис. 1. Ультраструктура ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах D. melanogaster линии Canton S на стадии интерфазы (Onischenko, Gubanova et al., 2004); а – общий вид стопки пористых пластинок на поперечном срезе; вставка – цитоплазматические поры на большем увеличении (пунктиром обозначены цитоплазматические фибриллы); б – фрагмент ядерной оболочки на поперечном срезе; вставка – ядерные поры на большем увеличении (пунктиром обозначена баскет-структура); в – пористая пластинка на гексагональном срезе; вставка – гексагональный срез цитоплазматических пор на большем увеличении; г – гексагональный срез ядерной оболочки; вставка – гексагональный срез ядерных пор на большем увеличении. Наши исследования продемонстрировали синхронность сборки-разборки ЯПК (Рис. 2 а) и ЦП (Рис. 2 б) в митозе, что полностью совпадает с данными ранее опубликованных работ (Zatsepina et al., 1977; Stafstrom, Staehelin, 1984). Дополнительно было установлено, что, если ЯПК в течение митоза разбираются не полностью, как это имеет место в центральной области эмбриона, где расположены желточные ядра, то и расположенные около них ЦП, демонстрируют сходную динамику (Рис. 2 в). Рис. 2. Ультраструктура ЯдО и ПП в эмбрионе на стадии метафазы бластодермальных ядер; а – отсутствие ЯПК в оболочке бластодермального ядра; б – отсутствие ЦП в ПП около бластодермальных ядер; в – компоненты ЯПК (черные стрелки) в оболочке желточного ядра и компоненты ЦП (белые стрелки) в ПП около желточного ядра. По нашим наблюдениям, в телофазе, ЦП собираются более активно и формируют стопки ПП, при чем с той стороны ядра, где еще не сформирована ЯдО, т.е. в экваториальной области веретена деления (Рис. 3 а, б). Рис. 3. Бластодермальные ядра и пористые пластинки на стадии телофазы в синцитиальных эмбрионах дрозофилы. а, б - вид ядер в телофазе и расположенных вблизи них пористых пластинок. Видно, что ядерные поры (черные стрелки) распределены в ядерной оболочке неравномерно, стопки пористых пластинок (белые стрелки) расположены преимущественно с той стороны ядра, где ядерная оболочка не сформирована. ХР – хроматин, Я -ядро. При исследовании синцитиальных эмбрионов на стадии интерфазы бластодермальных ядер мы обнаружили гетерогенность в распределении и морфологии ПП. Наши исследования показали, что на 7-8 циклах деления стопки ПП имеют небольшие размеры и гомогенно распределены по цитоплазме эмбриона. На более поздних циклах деления - 11, 13 и 14, распределение ПП гетерогенно, они представлены крупными стопками в центральной области эмбриона, где располагаются полиплоидные желточные ядра, небольшими - в средней области цитоплазмы, и единичными ПП вблизи быстро делящихся бластодермальных ядер. Эти наблюдения позволили предположить существование общего фактора, который регулирует процессы сборки-разборки ЯПК и ЦП, но имеет разную активность в различных участках цитоплазмы эмбриона. Ранее было показано, что активность митотической киназы cdk1 на 11-14 циклах деления снижена в центральной области эмбриона и повышена на периферии (Su et al., 1998). Мы предположили, что именно этот фактор может воздействовать на сборку-разборку ЯПК и ЦП, и влиять на морфологию ПП. Исследование функции пористых пластинок в синцитиальных эмбрионах дрозофилы Известно, что в ооцитах Xenopus laevis на VI стадии оогенеза основное количество нуклеопорина Nup62 находится в составе ЦП ПП (Cordes et al., 1995). На основании этого, а также других исследований (Kessel et al., 1992; Stafstrom, Staehelin, 1984) предполагалось, что фундаментальной функцией ПП является сохранение и запас избыточных нуклеопоринов. Рис. 4 Диаграмма, демонстрирующая количество ядерных и цитоплазматических пор на эмбрион на 7-8, 11, 13 и 14 циклах деления эмбриона D. melanogaster линия Canton S (Onischenko, Gubanova et al., 2004). Для того, чтобы проверить, могут ли ПП в ранних эмбрионах дрозофилы выполнять такую функцию, мы провели сравнительное морфометрическое исследование количества ядерных и цитоплазматических пор на разных циклах синцитиального развития дрозофилы (Рис. 4). Наши данные показали, что количество ЦП от 7-8 до 14 цикла деления остается примерно на одном уровне и составляет 6-7 миллионов ЦП на эмбрион, тогда как количество ЯПК увеличивается в геометрической прогрессии примерно от 0,4 до 23 млн. ЯПК/на эмбрион (Onischenko, Gubanova et al., 2004). Эти данные свидетельствовали, о том, что количество нуклеопоринов, содержащихся в ЦП, является не достаточным для сборки новых ЯПК в делящихся ядрах на стадии синцитиальной бластодермы. Проведенный далее молекулярно-биологический анализ показал, что семь исследованных нами нуклеопоринов представлены в цитозоле, ПП и ЯдО, при чем основное их количество находится в растворенной форме в цитозоле синцития, тогда как ЦП и ЯПК содержат лишь незначительную часть этих белков. Таким образом, результаты наших исследований опровергают фундаментальность функции пористых пластинок как запасающего компартмента (Onischenko, Gubanova et al., 2004). Отличие в распределении нуклеопоринов, обнаруженное нами в синцитиальных эмбрионах дрозофилы, по сравнению с тем, что было описано для ооцитов Xenopus laevis на VI стадии оогенеза (Cordes et al., 1995б), можно объяснить различными условиями, при которых белки собираются в ЯПК. В ооцитах амфибий, на VI стадии развития, ЯдО прекращает свой рост, и, возможно, поэтому нет необходимости иметь большой запас растворенных нуклеопоринов в цитоплазме для сборки ЯПК. В синцитиальных эмбрионах дрозофилы, где ядра делятся каждые 9 минут (Foe, Alberts, 1983) требуется, вероятно, наличие большого количества резервных белков, готовых к непосредственному использованию для быстрой сборки новых ЯПК. Мы предположили, что при таком быстром обороте белков ЯПК, нуклеопорины поддерживаются в цитоплазме в растворенном виде, что, возможно, обеспечивает их эффективное использование для сборки ЯПК в ядрах синцитиальных эмбрионов дрозофилы. Cdk1 и фосфатазы, чувствительные к окадаевой кислоте, являются ключевыми регуляторами сборки/разборки ядерных и цитоплазматических пор в митозе Известно, что в эукариотической клетке переход к митозу происходит в результате активации митотических киназ. На стадии профазы митотическая киназа cdk1 фосфорилирует множество белков в цитоплазме и ядре клетки, в результате чего происходят структурные изменения цитоскелета, ЯдО и хроматина. Известно, что для активации cdk1 необходимы циклины – регуляторные белки, которые синтезируются в интерфазе и, связываясь с cdk1, переводят ее в активное состояние. Особенностью циклинов является наличие специализированного сайта – бокса деструкции, обеспечивающего их быструю деградацию, что позволяет своевременно инактивировать cdk1 в конце митоза (Arellano, Moreno, 1997). Для изучения влияния активности митотической киназы cdk1 на процесс сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор, мы использовали ранние эмбрионы дрозофилы на 9-13 циклах деления синцитиальной бластодермы. Для инактивации cdk1 использовалось несколько подходов: 1) снижение концентрации циклинов и 2) инактивация непосредственно самой митотической киназы. Нарушение синтеза циклинов вызывалось инъекцией циклогексимида, блокирующего синтез белков на стадии трансляции. В результате проведенного воздействия в эмбрионах наблюдалась остановка клеточного цикла на стадии интерфазы. Эмбрионы характеризовались крупными ядрами неправильной формы с интактными ЯПК, ПП имели нормальные ЦП, и их количество составляло около 8 млн. (Рис. 5). Рис. 5. демонстрирующая Диаграмма, изменение количества цитоплазматических пор на эмбрион (D. melanogaster линии Canton S) после инъекции циклогексимида, циклогексимида и GST-циклина В или буфера (Onischenko, Gubanova et al., 2005). При одновременной инъекции в эмбрионы циклогексимида и недеградируемой формы циклина В (GST-циклина В), в цитоплазме синцитиальных эмбрионов наблюдались ЯдО без ЯПК и ПП с разобранными ЦП, количество которых во всем эмбрионе было значительно снижено (Рис. 5). При исследовании png-мутантов, характеризующихся сниженным уровнем митотических циклинов А и В, были зарегистрированы ядра гигантского размера с нормальными ЯПК и крупные стопки ПП в цитоплазме эмбрионов. Морфометрический анализ количества ЦП в мутантных эмбрионах показал, что в одном эмбрионе насчитывается около 12 млн. ЦП. При введении в эти эмбрионы GST-циклин В наблюдалась разборка ЦП и уменьшение их количества до 0,73 млн. ЦП/эмбрион (Рис. 6 ). Рис. 6. демонстрирующая Диаграмма, изменение количества цитоплазматических пор на эмбрион, в png-мутанте (D.melanogaster линия png172) после инъекции буфера или недеградируемой формы циклина В (GST-циклин В). (Onischenko, Gubanova et al., 2005). Сходная картина была обнаружена нами при ультраструктурном исследовании мутантных эмбрионов, несущих термочувствительную мутацию в гене cdk1, которая инактивировала киназу при повышении температуры. Эмбрионы на 9-13 циклах деления выдерживались при температуре 300С, а затем подвергались ультраструктурному анализу, показавшему, что ядра имеют более крупный размер по сравнению с нормой, а ЯдО образует инвагинации и содержит нормальные ЯПК. При этом в цитоплазме эмбрионов обнаруживались стопки ПП с ЦП, характерными для стадии интерфазы, в количестве около 5 млн. (Рис. 7). Таким образом, наши исследования наглядно продемонстрировали, что активность митотической киназы cdk1 регулирует процесс сборки-разборки ЯПК и ЦП в синцитиальных эмбрионах дрозофилы. Рис. 7. Диаграмма, демонстрирующая изменение количества цитоплазматических пор на эмбрион в термочувствительном мутанте D.melanogaster линия cdk1ts (A171T) после инкубации при 300С; при 220С и D.melanogaster Сanton S при 300С (Onischenko, Gubanova et al., 2005). Согласно данным, полученным Е.А.Онищенко in vitro, комплекс cdk1/циклин В, вызывает диссоциацию пяти нуклеопоринов из ЯПК, при этом один из пяти нуклеопоринов – белок р150, находится в фосфорилированном состоянии (Onischenko, Gubanova et al., 2005). Эти данные позволяет предположить, что митотическая киназа напрямую или опосредовано вызывает фосфорилирование некоторых нуклеопоринов и нарушает их взаимодействие с другими белками, входящими в состав ЯПК, что инициирует разборку порового комплекса. Недавно полученные данные показали, что до разборки ЯдО в ооцитах Xenopus laevis, комплекс - cdk1-циклин В в неактивном состоянии локализуется на ЦП пористых пластинок (Beckhelling et al., 2003). Это позволяет предполагать, что комплекс cdk1циклин В в синцитиальных эмбрионах дрозофилы способен непосредственно связываться с поровыми комплексами в цитоплазме и ЯдО. Вместе с тем, показано, что в гифах мицелия гриба Aspergillus nidulans, где митоз протекает по закрытому типу – без разборки ядерной оболочки, фосфорилирование нуклеопоринов производится серин-треониновой киназой NIMA, которая активируется cdk1. Хотя гиперэкспрессия NIMA в клетках млекопитающих может индуцировать разборку ЯПК (Lu, Hunter, 1995), найти гомолог этого фермента у высших эукариот так и не удалось. Возможно, NIMA играет специфическую роль в реорганизации поровых комплексов при закрытом митозе. Эти данные свидетельствуют о том, что, кроме cdk1, в разборке поровых комплексов могут принимать участие и другие киназы. Если для разборки ЯПК и ЦП необходимо фосфорилирование нуклеопоринов, то для их сборки требуется обратный процесс – дефосфорилование. Для исследования роли фосфатаз в процессе пост-митотической сборки пор, в синцитиальные эмбрионы дрозофилы была инъецирована окадаевая кислота в концентрации, которая специфически ингибирует белковые фосфатазы РР1 и РР2А. В результате этого, в эмбрионах происходила разборка пор в профазе, но их сборка не наблюдалась. Полученные данные позволяют сделать вывод, что фосфатазы (одна или обе) необходимы для пост-митотической сборки ЯПК и ЦП. Предполагаемое участие РР1 и РР2А в сборке ЯПК согласуется с множеством данных о роли фосфатаз в активации пост-митотических изменений в клетке. Так, например, на культуре клеток показано, что избыток РР1 стимулирует выход из митоза, тогда как микроинъекция антител к фосфатазе РР1, блокирующих ее действие, приводит к задержке клеток в митозе (Fernandez et al., 1992). Имеются также свидетельства участия РР1 в пост-митотической сборке ламины (Thompson et al., 1997; Steen et al., 2000), тогда как РР2А играет ключевую роль в постмитотической сборке аппарата Гольджи (Lowe et al., 2000). Таким образом, наши исследования, в совокупности с данными других авторов, показали, что фосфатазы, чувствительные к окадаевой кислоте, необходимы для пост-митотической сборки ядерных и цитоплазматических поровых комплексов. На основании этого мы предложили модель, согласно которой сборка/разборка ядерных и цитоплазматических пор в ранних эмбрионах дрозофилы регулируется динамическим равновесием между действием митотической киназы с cdk1, одной стороны, и действием фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте, с другой стороны (Рис. 8). Рис. 8. Схематическая модель регуляции сборки /разборки ЯПК и ЦП в синцитиальных эмбрионах дрозофилы (Onischenko, Gubanova et al., 2005) Известно, что до 13 цикла деления в синцитиальных эмбрионах дрозофилы активность cdk1 регулируется через концентрацию циклинов и в частности циклина В (Edgar et al., 1994). Поэтому можно предположить, что увеличение концентрации циклина В активирует cdk1, в результате чего инициируется процесс фосфорилирования нуклеопоринов, и поры разбираются. Деградация циклина В происходит локально на микротрубочках веретена деления. В этой области cdk1 инактивируется, и под действием фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте, происходит дефосфорилирование белков пор, что приводит к сборке ЯПК и ЦП. Предложенная нами модель, позволяет объяснить динамику ЯПК и ЦП в процессе клеточного цикла и синцитиального развития эмбриона. Наши наблюдения показали, что, в телофазе ПП расположены в экваториальной зоне веретена деления бластодермальных ядер. Ранее было продемонстрировано, что инактивация митотической киназы в телофазе регистрируется в районе веретена деления бластодермальных ядер (Su et al., 1998), что, как мы предполагаем, и вызывает сборку ПП. Мы установили также, что на 7-8 циклах деления, в интерфазе, стопки ПП имеют небольшие размеры и гомогенно распределены по цитоплазме эмбриона. Так как до 8 цикла деления ядер уровень циклина В в цитоплазме эмбриона постоянно высок, предполагают, что и активность cdk1 повышена на протяжении всего клеточного цикла (Edgar et al., 1994). Эти данные согласуются с нашими наблюдениями и позволяют предположить, что малые размеры стопок ПП на этих циклах деления обусловлены повышенной активностью cdk1. Согласно нашим наблюдениям, на 13-14 циклах деления синцитиальной бластодермы, ЯПК в желточных ядрах и ЦП около них разбираются в митозе не полностью (Рис. 2 в), и в центре эмбриона наблюдаются крупные ПП. Подобная динамика ЯПК и ЦП может быть обусловлена сниженной активностью cdk1 в центральной области эмбриона. Наше предположение подтверждается литературными данными, которые показали, что в желточных ядрах не происходит фосфорилирования гистона Н3 (Su et al., 1998). Поскольку он является субстратом для cdk1, это может свидетельствовать о сниженной активности митотической киназы в центре эмбриона. Совокупность наших наблюдений и литературных данных позволяют предположить, что снижение активности cdk1 приводит к укрупнению ПП и неполной разборке ЯПК и ЦП в митозе. Возможно, снижение активности cdk1 обусловлено недостатком циклинов А и В. Работы проведенные на синцитиальных эмбрионах дрозофилы показали, что мутация по циклину А приводит к эндорепликации хроматина бластодермальных ядер (Sauer et al., 1995), что является характерным для желточных ядер в норме. Можно предположить, что низкая концентрация циклинов А и В, необходимых для активации cdk1, обусловлена низким уровнем их синтеза в этой области эмбриона, так как в конце синцитиального развития центр клетки в основном заполнен желтком и фосфолипидами, и содержит лишь небольшое количество шероховатого ЭПР. В то же время, нельзя исключить возможность существования другой причины снижения концентрации циклинов вблизи желточных ядер. Влияние Ran на сборку ядерных и цитоплазматических пор Недавние исследования, проведенные in vitro и in vivo показали, что малая ГТФ-аза Ran оказывает влияние на процесс сборки ЯдО, ЯПК и ПП (Ryan et al., 2003; Walther et al., 2003). Неактивная форма Ran - Ran-ГДФ локализуется в цитоплазме клетки, где специфический фактор RanGAP, инициирует гидролиз RanГТФ до Ran-ГДФ. Неактивная форма Ran транспортируется в ядро, где затем переходит в активную форму - Ran-ГТФ - при участии белка RCC1 (Regulate Chromosom Condensation), который локализуется на хроматине и необходим для его деконденсации в телофазе. Ran-ГТФ осуществляет отщепление импортируемого комплекса от ЯПК и сборку экспортируемого комплекса, вместе с которым он затем транспортируется в цитоплазму. Белки RCC1 и RanGAP поддерживают компартментализацию активной и неактивной формы Ran в клетки: Ran-ГТФ - в ядре, а Ran-ГДФ - в цитоплазме (Clarke, Zhang, 2004). Исследования, проведенные in vitro на грубом экстракте из ооцитов Xenopus laevis, показали, что повышение концентрации Ran-ГТФ инициирует сборку ЦП. Это позволило предположить, что для сборки ЯПК необходим Ran-ГТФ, который, возможно, освобождает нуклеопорины от транспортных факторов, что делает их доступными для сборки пор (Harel et al., 2003; Walther et al., 2003). Существуют также данные о том, что цикл Ran необходим для формирования ЯПК у дрожжей (Ryan et al., 2003). Для выяснения влияния Ran на процесс сборки ЯПК и ЦП в синцитиальных эмбрионах дрозофилы, нами были предприняты попытки изменить компартментализацию активной и неактивной формы Ran в синцитиальных эмбрионах дрозофилы. Наши исследования показали, что в результате последовательных микроинъекций мутантной формы Ran (RanT24N), который блокирует функцию RCC1 и не способен связываться с ГТФ, а затем циклогексимида (см. выше) блокируется сборка ЯПК (Рис. 9 б). При этом наблюдался компактный хроматин, окруженный прерывистой двухслойной оболочкой, в которой не содержались ЯПК (Рис. 9 б). В то же время, данная инъекция не влияла на сборку ПП (Рис. 9 а), которые располагались в цитоплазме эмбриона в виде стопок и содержали ЦП нормального строения (Губанова и др. 2006). Рис. 9. Влияние инъекций RanT24N и циклогексимида на сборку ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах D.melanogaster линии Canton S. а – вид стопки пористых пластинок и цитоплазматических пор; б- фрагменты ядерной оболочки (черная стрелка указывает на разрыв оболочки). Я – ядро. Согласно последним данным, для инициации сборки новых ядерных пор в интактной ЯдО необходим комплекс Nup107-160, который выявляется в участках формирования новой ЯПК в ЯдО, как с ядерной, так и с цитоплазматической стороны (D`Angelo et al., 2006). Параллельно было показано, что для встраивания ЯПК требуется также присутствие Ran-ГТФ в ядерном и цитоплазматическом отделе поры (D`Angelo et al., 2006). Известно, что белок Nup107 связывается с транспортным фактором импортином β и расположен во внутриядерном отделе ЯПК (Walther et al., 2003). Можно предположить, что Ran-ГТФ освобождает комплекс Nup107-160 от связывания с импортином β, что делает этот комплекс доступным для инициации формирования ЯПК. В этом случае отсутствие Ran-ГТФ, вызванное инъекцией мутантной формы Ran, может нарушать процесс формирования ЯПК на стадии инициации этого процесса. Тот факт, что инъекции RanT24N и циклогексимида не влияет на сборку ЦП, не является удивительным. В нормальных клетках Ran-ГДФ находится в цитоплазме клетки, а Ran-ГТФ в ядре, что не предполагает его участие в процессе сборки ЦП. Поскольку данных о присутствии белка Nup107 в ЦП нет, это позволяет предположить, что их сборка происходит по отличному от сборки ЯПК механизму. Рис. 10. Влияние инъекций RCC1 и циклогексимида на сборку ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах D.melanogaster линии Canton S. а - фрагмент участка цитоплазмы с радиально расположенными пористыми пластинками (белые стрелки), б - пористая пластинка, ассоциированная с микротрубочкой (черные стрелки указывают на микротрубочку). Согласно нашим данным, микроинъекция RCC1 с последующим введением циклогексимида вызывала формирование необычно длинных, радиально расположенных микротрубочек (Рис. 10 а), с которыми были ассоциированы ПП (Рис. 10 б). При этом основная часть ПП наблюдалась в цитоплазме эмбриона, ЯдО отсутствовала, а декомпактизованный хроматин диффузно располагался в цитоплазме синцития. В работах, проведенных ранее, показано, что Ran-ГТФ вызывает формирование длинных микротрубочек, а присутствие Ran-ГТФ на хроматине определяет направление их роста (Gruss et al., 2001; Wiese et al., 2001; Nachury et al., 2001). Эти данные подтверждают, что проведенные нами инъекции увеличивают содержание Ran-ГТФ в цитоплазме эмбриона, в результате чего, возможно, нарушается формирование веретена, ЯдО и ЯПК. Присутствие же в цитоплазме ПП с нормальными ЦП, свидетельствует о том, что ни Ran-ГТФ, ни Ran-ГДФ, вероятно, не оказывают влияния на сборку ЦП (Губанова и др. 2006). Совокупность изложенных данных позволяет сделать вывод, что, несмотря на существование общих факторов, контролирующих процессы сборки-разборки ЯПК и ЦП в митозе, на сборку ЯПК влияют дополнительные факторы, например, компартментализация активной и неактивной формы Ran, и сборка ЯПК представляет более сложно регулируемый процесс по сравнению со сборкой ЦП. Выводы 1. Установлено, что цитоплазматические поры в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster содержат лишь небольшую часть нуклеопоринов. При 2. 3. 4. 5. 6. этом основная часть белков ядерных пор присутствует в растворенном виде в цитозоле. Обнаружено, что активность митотической киназы cdk1 регулирует процесс сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster . Установлено, что для сборки ядерных и цитоплазматических пор необходима активность фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте. Предложена модель регуляции митотической сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster, согласно которой этот процесс регулируется динамическим равновесием между активностью cdk1 и действием фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте. Получены данные, свидетельствующие о взаимосвязи между укрупнением пористых пластинок и снижением активности cdk1 в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster. Продемонстрировано, что малая ГТФ-аза Ran участвует в формировании ядерной оболочки и ядерных пор и не влияет на формирование цитоплазматических пор и пористых пластинок. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. 2. 3. 4. 5. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Динамика и функция окончатых мембран в ранних эмбрионах Drosophila melanogaster // Тезисы докладов Х1Х Российской конференции по электронной микроскопии. Черноголовка, РАН. 2002. С. 210. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Динамика окончатых мембран в раннем эмбриогенезе Drosophila melanogaster. Ультраструктурные исследования и морфометрический анализ. // Тезисы докладов Ш Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной биологии и биотехнологии». Алма-Аты, Казахстан. 2003. С. 151. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Электронно-микроскопический анализ динамики окончатых мембран в раннем эмбриогенезе у Drosophila melanogaster. Ультраструктура пороподобных комплексов в процессе митоза. // Тезисы докладов Международного Симпозиума по проблемам мейоза. СанктПетербург, Цитология. 2003. Т.45(9). С. 252. Onischenko E.A., Gubanova N.V., Kiseleva E.V., Hallberg E. Downregulated assembly of annulate lamellae in syncytial Drosophila embryos // International Symposium: Communication and gene regulation at the nuclear envelope. The University of Durham, Great Britain. 2003. P. 26. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Сравнительный анализ структурно-функциональной организации окончатых мембран и ядерной оболочки в раннем эмбриогенезе дрозофилы // Тезисы докладов. III съезд ВОГиС. «Генетика в XXI: современное состояние и перспективы развития», Москва, Россия. 2004. Т. II С. 281. 6. Onischenko EA, Gubanova NV, Kieselbach T, Kiseleva EV, Hallberg E Annulate lamellae play only a minor role in the storage of excess nucleoporins in drosophila embryos. // Traffic. 2004. V. 5. Р. 152-164. 7. Onischenko E.A., Gubanova N.V., Kiseleva E.V., Hallberg E. Cdk1 and оkadaic acid-sensitive phosphatases control assembly of nuclear pore complexes in Drosophila embryos. // Mol. Biol. Cell. 2005. V. 16. Р. 5152-5162. 8. Морозова К.Н., Губанова Н.В., Киселева Е.В. Структурная организация и возможная функциональная роль пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры. // Цитология. 2005. Т. 47(8). С. 667-678. 9. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Малая ГТФ-азы Ran влияет на сборку ядерных пор, но не участвует в сборке цитоплазматических поровых комплексов. // Тезисы докладов. X Международная молодежная Школаконференция, Владивосток, Россия. 2006. С. 132. 10. Губанова Н.В., Морозова К.Н., Киселева Е.В. Структурная организация и функция ядерных пор. // Цитология. 2006. Т. 48(11). С. 887-899. 11. Губанова Н.В., Киселева Е.В. Структурная организация и функция ядерной оболочки // Цитология. 2007. Т. 49(3) (в печати).
