Исследование динамики формирования и механизмов регуляции сборки-разборки ядерных и

реклама
Исследование динамики формирования и
механизмов регуляции сборки-разборки ядерных и
цитоплазматических пор в раннем эмбриогенезе
Drosophila melanogaster.
Губанова Наталья Владимировна
руководитель Киселева Елена Владимировна
•
Лаборатория морфологии и функций клеточных структур
Структурная организация ядерных пор
Последовательные этапы
сборки ядерных пор in
vitro и in vivo
(Allen et al., 2000)
(Goldberg et al., 1997; Kiseleva et al., 2001)
Цитоплазматические и ядерные поры проявляют сходство и различие в строении
Ядерные поры в ядерной
оболочке ооцита лягушки
Цитоплазматические поры (стрелки)
в пористых пластинках ооцита лягушки
ПЭМ
ПЭM
Поперечный
срез
Со стороны
цитоплазмы
СЭM
ПЭM
Баскет
структуры
Продольный
срез
Со стороны
ядра
СЭМ
ПЭM -просвечивающая ЭМ, СЭМ -сканирующая ЭМ
(Морозова К.Н., Киселева Е.В., 2004 )
Схема развития эмбриона
Drosophila melanogaster на
стадии синцитиальной
бластодермы
(от момента
оплодотворения до
бластулы – 2,5 часа)
Цель: изучить регуляцию митотической реорганизации ядерных и
цитоплазматических пор и их возможное функциональное взаимодействие в
эмбрионах дрозофилы на стадии синцитиальной бластодермы
Задачи :
1.
Провести электронно-микроскопический анализ ультраструктурной динамики
ядерной оболочки и пористых пластинок на разных стадиях митоза синцитиальных
эмбрионов Drosophila melanogaster линии Canton S
2.
С помощью морфометрического анализа оценить количество ядерных и
цитоплазматических пор на разных стадиях синцитиального развития дрозофилы.
3.
Провести количественную оценку уровня отдельных нуклеопоринов на разных
стадиях синцитиальной бластодермы.
4.
Изучить распределение нуклеопоринов в мембранной, ядерной и
цитоплазматической фракциях синцитиальных эмбрионов дрозофилы.
5.
Определить, как влияет на разборку ядерных и цитоплазматических пор
инактивация митотической киназы cdk1, вызываемая:
- инъекцией циклогексимида в синцитиальные эмбрионы Drosophila melanogaster
линии Canton S;
- низким уровнем циклинов в png мутантах Drosophila melanogaster линия png172;
- нарушением функций cdk1 в термочувствительных мутантах Drosophila
melanogaster линии cdk1ts (A171T).
6.
Исследовать влияние ингибирования фосфатаз РР1 и РР2 ( субстрат
специфичных антагонистов митотической киназы cdk1), на процесс сборки
ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах Drosophila
melanogaster линия Canton S.
7.
Определить влияние малой ГТФ-азы Ran на процесс сборки ядерных и
цитоплазматических пор.
Схема развития
эмбриона Drosophila
melanogaster на
стадии синцитиальной
бластодермы
(от момента
оплодотворения до
бластулы – 2,5 часа)
Схема полузакрытого
митоза бластодермальных
ядер в синцитиальных
эмбрионах дрозофилы
(Foe, Alberts, 1983)
Ультраструктура цитоплазматических и ядерных пор в синцитиальных
эмбрионах дрозофилы
Пористые пластинки, содержащие
цитоплазматические поры
Ядерная оболочка с
ядерными порами
Ядерные поры имеют ассиметричные периферические отделы,
а периферические отделы цитоплазматических пор сходны по морфологии
Количественная динамика ядерных и цитоплазматических пор в эмбрионах
на разных стадиях синцитиального развития D. melanogaster (Canton S)
21,2
20
миллионы
количество пор
25
15
10
5
9,6
7,7
5,9
Цитоплазматические
поры
7,4
Ядерные поры
5,7
0,37
2,7
0
7-8 стад.
11 стад.
13 стад.
14Бстад.
Нуклеопорины, запасенные в цитоплазматических порах, не могут обеспечить
достаточный запас белков, необходимый для сборки новых пор в делящихся ядрах.
Относительное количество семи нуклеопоринов в эмбрионах
дрозофилы на разных стадиях эмбрионального развития
Относительное количество нуклеопоринов в эмбрионе не изменяется в процессе
эмбрионального развития
нуклеопорины контроль
цитозоль
Клеточная
бластодерма
мембраны
цитозоль
мембраны
ядра
цитозоль
мембраны
ядра
Эмбрионы
1-13 стадии
Эмбрионы
10-14 стадии
ядра
Синцитиальная бластодерма
Распределение нуклеопоринов
по ядерной, мембранной и
цитоплазматической фракциям,
выделенным из синцитиальных
и бластодермальных
эмбрионов
Gp210 (ЭПР/ядра)
гистон Н3 (ядра/цитозоль)
альфа-тубулин(цитозоль)
p270
p205
p150
Nup88
p67
Nup58
В синцитиальном эмбрионе основное количество нуклеопоринов находится в цитозоле
Электрофоретическая подвижность белка р150 из цитозоля снижена и
восстанавливается после обработки щелочной фосфатазой
цитозоль
мембраны
цитозоль
мембраны
Эмбрионы
10-14 стадии
ядра
цитозоль
мембраны
ядра
Эмбрионы
1-13 стадии
Клеточная
бластодерма
ядра
Синцитиальная бластодерма
р 150
р 150 из
мембранной
фракции
р 150 из цитозоля,
инкубированный в
отсутствии щелочной
фосфатазы
р 150
р150 из цитозоля
р 150 из цитозоля, после
обработки
щелочной фосфатазой
Можно предположить, что нуклеопорины в цитозоле синцитиального эмбриона
фосфорилированы
Морфология ядерной оболочки бластодермальных ядер и пористых
пластинок, расположенных рядом с ними, на стадии профазы и метафазы
Пористые пластинки
Метафаза
Профаза
Ядерная оболочка
Ядерные и цитоплазматические поры синхронно разбираются в процессе митоза
Морфология ядерной оболочки бластодермальных ядер и пористых
пластинок, расположенных рядом с ними, на стадии телофазы
Ядерные и цитоплазматические поры синхронно собираются на стадии телофазы
Морфология оболочки желточных ядер и расположенных вблизи них пористых
пластинок на стадии метафазы
Поры в оболочке желточных ядер и цитоплазматические поры в центре эмбриона,
частично разбираются в метафазе
Морфология пористых пластинок и их расположение в эмбрионе на разных
стадиях синцитиального развития
В процессе синцитиального развития происходит увеличение размеров пористых
пластинок и изменение их локализации
Циклин зависимая регуляция активности
митотической киназы cdk1
Сборка веретена
Циклин В
cdk1
Y
Циклин В
cdk1
T
P
Циклин В
Конденсация
хромосом
cdk1
Y
T
P
P
Y
T
Фосфорилирование
нуклеопоринов,
разборка ядерной
оболочки
P
Деградация
циклина
Циклин В
cdk1
Y
T
Y
Циклин В
cdk1
cdk1
Синтез
циклина
T
Y
T
(модифицировано, из лекции Л.В.Омельянчука)
Влияние инактивации cdk1,вызываемой инъекцией циклогексимида, на разборку
ядерных и цитоплазматических пор
Инъекция циклогесимида в синцитиальные эмбрионы дрозофилы
ингибирует разборку ядерных и цитоплазматических пор
Восстановление активности cdk1, при одновременной инъекции циклогексимида
и недеградируемой формы циклина В (GST циклин В), на разборку ядерных и
цитоплазматических пор
Цитоплазматические поры разбираются при одновременной инъекции циклогексимида и
недеградируемой формы циклина В (GST циклин В)
Влияние инактивации и активации cdk1на сборку цитоплазматических пор в
синцитиальных эмбрионах дрозофилы
7,73
количество пор
миллионы
9
8
7
6
5
4
3
2
1,22
0,41
1
0
1
буфер
2
циклогексимид
(инактивация cdk1)
Циклогексимид
3
+ GST циклин В
(активация cdk1)
Инъекция циклогексимида в синцитиальные эмбрионы вызывает
увеличение количества цитоплазматических пор
Влияние снижения уровня митотических циклинов в png мутантах на сборку
ядерных и цитоплазматических пор
16
количество пор
миллионы
14
12,1
12
10
8
6
4
0,73
2
0
buf. inj.
Инъекция
буфера
Инъекция
cycl.B
inj.
GST циклина В
В эмбрионах png мутантов, собираются гигантские стопки пористых пластинок. Инъекция
GST-циклина В вызывает разборку ядерных и цитоплазматических пор.
Влияние инактивации cdk1 в термочувствительных
мутантах cdk1ts
количество
пор
миллионы
миллионы
6
4,66
4,66
5
4
3
2
0,86
0
0,86
0,87
1
0
Cdk1ts при
200С
Cdk1ts при
300С
Canton S
при 300С
Инактивация cdk1 в термочувствительных мутантах
cdk1ts вызывает сборку ядерных и
цитоплазматических пор
Инъекция окадаевой кислоты - специфического ингибитора
фосфатаз РР1 и РР2А - блокирует сборку ядерных и
цитоплазматических пор
Сборка/разборка ядерных и
цитоплазматических пор в эмбрионе на
стадии синцитиальной бластодермы
(окраска пор с помощью WGA-FITC)
Прижизненная конфокальная
микроскопия
Снимки эмбриона после инъекции окадаевой кислоты и WGA
Модель регуляции митотической реорганизации ядерных и
цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах дрозофилы
Дефосфорилированные
нуклеопорины в составе
собранной ядерной поры
Фосфорилированные
нуклеопорины или их
комплексы
Фрагмент мембраны
Ядерная оболочка
Cборка/разборка ядерных, а также цитоплазматических пор, в синцитиальных
эмбрионах дрозофилы регулируется динамическим равновесием между действием
митотической киназы cdk1 и действием фосфатаз, чувствительных к окадаевой
кислоте.
Влияние малой ГТФ-азы Ran на
сборку ядерных и
цитоплазматических пор в
синцитиальных эмбрионах
дрозофилы
В опытах in vitro, показано, что RanГТФ необходим для сборки ядерных
пор (Hughes et al., 1998 )
Инъекция мутантной формы малой
ГТФ-азы Ran (RanT24N) с
последующей инъекцией
циклогексимида, не влияет на
сборку цитоплазматических пор, но
ингибирует формирование
ядерной оболочки и сборку
ядерных пор
Выводы
1. Впервые установлено, что цитоплазматические поры в синцитиальных эмбрионах
дрозофилы содержат лишь небольшую часть нуклеопоринов, и не играют
существенной роли в сборке ядерных пор. При этом основная часть белков пор
присутствует в растворенном виде в цитозоле.
2. Обнаружено, что митотическая киназа cdk1 и циклин В регулируют процесс разборки
ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах дрозофилы.
3. Установлено, что сборка ядерных и цитоплазматических пор регулируется
фосфатазами и ингибируется окадаевой кислотой, блокирующей действие этих
ферментов. Предложена модель митотической реорганизации ядерных и
цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах дрозофилы.
4. Показано, что активность cdk1 снижена в центральной области синцитиальных
эмбрионов, что, возможно, вызывает полиплоидизацию желточных ядер.
5. Продемонстрировано, что малая ГТФ-аза Ran участвует в формировании ядерной
оболочки и ядерных пор и не оказывает влияние на сборку цитоплазматических пор.
Это предполагает существование отличий в механизмах формирования этих
структур.
Благодарность
Автор выражает благодарность
научному руководителю работы Е.В.Киселевой,
а также Е.А.Онищенко за проведенные
молекулярно-биологические исследования
и выполнение микроинъекций в эмбрионы дрозофилы.
Скачать