Отчет 3 этап по ГК № П2539 от 20.11 09 - Кабардино
реклама
Министерство образования и науки Российской Федерации УДК 615.015.14; 615.015.154; 615.015.3 ГРНТИ 76.31.33 Инв. № 0000008101 УТВЕРЖДЕНО: Исполнитель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова» (КБГУ) Ректор КБГУ ______________/Карамурзов Б.С./ М.П. НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ о выполнении 3 этапа Государственного контракта № П2539 от 20 ноября 2009 г. и Дополнению от 02 апреля 2010 г. № 1/П2539, Дополнению от 27 июля 2010 г. № 2, Дополнению от 15 февраля 2011 г. № 3 Исполнитель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова» (КБГУ) Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.2.2 Проведение научных исследований научными группами под руководством кандидатов наук. Проект: Создание технологии получения лекарственного биопрепарата с использованием наноматериалов. Руководитель проекта: ______________/Шевченко Анна Александровна/ (подпись) Нальчик 2011 г. СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСПОЛНИТЕЛЕЙ по Государственному контракту П2539 от 20 ноября 2009 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных нужд с дополнительными соглашениями от 02 апреля 2010 г. № 1/П2539, от 27 июля 2010 г. № 2, от 15 февраля 2011 г. № 3 Организация-Исполнитель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова» Руководитель темы: кандидат биологических наук ______________________ 17.06.2011 Шевченко А. А. ______________________ 17.06.2011 Смирнова И.П. Исполнители темы: доктор биологических наук, профессор кандидат химических наук ______________________ 17.06.2011 Шкинев В.М. Аспирант ______________________ 17.06.2011 Анзорова З.З. Аспирант ______________________ 17.06.2011 Сакиева Д.Н. Студент ______________________ 17.06.2011 Борисова А.А. Студент ______________________ 17.06.2011 Андриянова Е.В. ______________________ 17.06.2011 Кольченко Е.А. Нормоконтролер, начальник ОСМО 2 Реферат Отчет 92 с., 25 рис., 5 табл., 93 источника. БИОТЕХНОЛОГИЯ, ФИТОПРЕПАРАТЫ, НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫЙ ЛЕКАРСТВЕННАЯ СУБСТАНЦИЯ, ГЕЛЬ, ЭКСТРАКТ ТРИХОДЕРМЫ, ВЕТЕРИНАРИЯ, РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕЕ СРЕДСТВО. Фермент оксидаза L-лизина (КФ 1.4.3.14), перспективность использования которого была показана японскими исследователями Kusakaba H. и Soda К., синтезируется грибами рода Trichoderma, который относится к низшим растениям. С целью создания отечественного биопрепарата на основе экстракта триходермы для ветеринарии был проведён анализ литературных источников по применению фитопрепаратов для лечения и профилактики различных заболеваний и поиск лекарственной формы экстракта триходермы с целью создания потенциального биопрепарата для ветеринарии. Учитывая стабильность экстракта триходермы, обладающего полиоксидазной активностью, в поисковой работе по созданию биопрепарата для ветеринарии было решено использовать экстракт, который будет входить в наноструктурированную гелевую основу. Созданная лекарственная форма должна пройти испытания, как ранозаживляющее средство Создание потенциальных лекарственных форм начат с изучения возможности использования в ветеринарии экстракта триходермы, как наиболее доступного и дешёвого средства для наружного применения в отличие от чистого фермента, который планируется использовать в наноструктурированных системах в последующих наших исследованиях. Разработаны несколько лекарственных форм с экстрактом триходермы, как на традиционной гелевой основе, так и на основе наноструктурированного геля. Впервые были созданы на основе субстанции в ввиде экстракта триходермы, заключённой в наночастицы, лекарственные формы для исследования 3 ранозаживляющего эффекта биопрепарата для ветеринарии. Лекарственные формы были исследованы на ЯМР. Сделаны рекомендации по созданию лекарственных форм. Однако полученные формы ещё предполагается далее изучить, провести тщательный их анализ и сделать выбор для создания окончательного варианта потенциального ранозаживляющего лекарственного средства для ветеринарии. 4 Содержание Введение .......................................................................................................................................... 7 Глава 1 Аннотированная справка по научным результатам НИР, полученным на I этапе ................................................................................................................................................ 9 Глава 2 Аннотированная справка по научным результатам НИР, полученным на II этапе ............................................................................................................................................ 12 Глава 3 Аналитический отчет о проведении теоретических и экспериментальных исследований ....................................................................................... 16 3.1 Применение экстрактов растительного происхождения для лечения и профилактики некоторых заболеваний .............................................................................. 16 3.1.2 Перспективы использования наноструктурированных форм в создании лекарственных препаратов...................................................................................................... 33 3.2 Материалы и методы .......................................................................................................... 39 3.2.1 Получения экстракта триходермы для создания биопрепарата ..................... 39 3.2.2 Определение активности оксидаз L-аминокислот триходермы ..................... 42 Глава 4 Отчет по обобщению и оценке результатов исследований ........................ 45 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований ...................... 45 4.1.1 Анализ проведённых исследований и выбор исходной субстанции триходермы для создания биопрепарата для ветеринарии ......................................... 45 4.2 Создание лекарственной формы биопрепарата........................................................ 54 4.2.1 Получение и свойства наноструктурированного геля........................................ 54 4.2.2 Получение композиции на основе наноструктурированного геля ................ 58 4.2.3 Проведение испытаний лекарственных форм биопрепарата........................... 58 4.3 Обобщение результатов экспериментальных и теоретических исследований ........................................................................................................................................................... 67 4.4 Оценка эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем .................................................................... 68 4.5 Разработка рекомендаций о возможном использовании результатов проведённых НИР в реальном секторе экономики ........................................................ 69 4.5.1 Рекомендации по получению экстракта из триходермы ................................... 69 5 4.5.2 Рекомендации по созданию лекарственных основ нового биопрепарата для ветеринарии .................................................................................................................................. 70 4.6 Разработка рекомендаций по использованию результатов НИР при создании научно-образовательных курсов ........................................................................................... 72 Глава 5 Публикации результатов НИР ............................................................................... 73 5.1 Заключение экспертной комиссии по открытому опубликованию .................. 73 5.2 Публикация результатов НИР ........................................................................................ 74 Заключение ................................................................................................................................... 81 Список используемых источников ...................................................................................... 83 6 Введение Основная проблема современной фармакологии – низкая селективность лекарственных средств. Обычно только 1% введённой дозы попадает в клеткимишени. Остальное количество препарата распределяется по организму, вызывая побочные действия. Заключение лекарственной субстанции в наночастицы может существенно продвинуть решение проблемы селективности. Преимущество использования наночастиц связано с возможностью увеличения дозы препарата, не вызывая токсических эффектов у животных. Известно, что заключение лекарственной субстанции в наночастицы на время изолирует её от организма, т.е. защищает, с одной стороны, организм от её возможного токсического действия, а с другой – саму субстанцию от воздействия ферментов организма. Другим важным преимуществом использования лекарственных субстанций, заключённых в наночастицы является защита субстанции от преждевременной деградации и постепенному её высвобождению, что приводит к пролонгированному действию. Данный этап исследований связан с созданием некоторых лекарственных форм биопрепарата с использованием разных наноструктурированных систем на основе экстракта гриба триходермы. Выбор экстракта триходермы для создания фитопрепарата обусловлен работами, как японских исследователей, так и нашими исследованиями, которые показали перспективность использования для создания биопрепарата гриба рода триходерма. В настоящее время род Trichoderma является одним из наиболее изучаемых. Это единственный род, каждый вид которого представлен в Генетическом Банке одним геном, а многие виды представлены последовательностью двух и более генов [1]. Такой повышенный интерес к этому роду обусловлен перспективностью практического использования его. Создание потенциальных наноструктурированных лекарственных форм 7 начат с изучения возможности использования в ветеринарии экстракта триходермы, как наиболее доступного и дешёвого средства для наружного применения в отличие от чистого фермента, который планируется использовать в наноструктурированных системах в последующих исследованиях. Лекарственные препараты, основанные на экстрактах растительного происхождения, нашли себе довольно широкое использование [2]. Из литературных источников по созданию лекарственных форм с использованием растительных экстрактов наибольшее количество биопрепаратов предложено на гелевой основе для наружного применения разной терапевтической направленности. Учитывая стабильность экстракта триходермы, обладающего полиоксидазной активностью, в поисковой работе по созданию биопрепарата для ветеринарии было решено использовать экстракт, который будет входить в наноструктурированную гелевую основу. Созданная лекарственная форма должна пройти испытания, как ранозаживляющее средство. 8 Глава 1 Аннотированная справка по научным результатам НИР, полученным на I этапе Поиск лекарственных препаратов осуществляется по двум направлениям: синтез аналогов известных противоопухолевых лекарственных средств и поиск биопрепаратов микробного происхождения. Среди последних, особое место занимают лекарственные онкологических препараты-ферменты. заболеваний человека В использование энзимотерапии их принесло определённые успехи, которые побуждают исследователей продолжать поиск ферментов, обладающих антиопухолевой активностью. Преимуществом энзимотерапии является избирательное каталитическое действие ферментов, то есть высокая специфичность их по отношению к индивидуальному субстрату. Микроорганизмы являются продуцентами разнообразных групп соединений, которые используются для самых разных практических целей. Это многочисленные антибиотики с разным спектром терапевтического действия, стимуляторы роста, витамины, аминокислоты, ферменты- продукты метаболизма микроорганизмов, грибного и бактериального происхождения. Среди испытанных препаратов в энзимотерапии активно вмешивающиеся в аминокислотный обмен и вызывающие необратимый распад незаменимых аминокислот занимают ферменты микробного происхождения. Такими ферментами с антиопухолевой активностью являются глутамин(аспарагин)аза (К.Ф. 3.5.1.38) и L-лизин --оксидаза (К.Ф. 1.4.3.14). Глутамин(аспарагин)аза широко используется в клинической онкологии при лечении лейкозов за рубежом. Японскими исследователями из водного экстракта гриба Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray был выделен новый фермент, который ингибирован рост лейкемических клеток мышей in vivo и in vitro. Фермент был очищен до гомогенного (К.Ф.1.4.3.14). состояния Фермент и идентифицирован катализирует 9 как реакцию L-лизин--оксидаза окислительного дезаминирования L-лизина с образованием -кето--аминокапроновой кислоты. Необратимое ферментативное разрушение глутамина и аспарагина лимитирует не только нормальные, но и в особенности опухолевые клетки амидным азотом, абсолютно необходимым для синтеза ряда биологически активных веществ. L-лизин--оксидаза является также одним из ферментов, разрушающих одну из важных аминокислот- L-лизин, к недостатку которой опухолевые клетки оказываются более чувствительными, чем нормальные клетки. Поиск противоопухолевых ферментов, а также изучение вопроса регуляции биосинтеза и активности оксидаз L-аминокислот в культуре грибов представляет не только практический, но и большой теоретический интерес, поскольку полученные результаты будут способствовать выяснению тонких молекулярных механизмов действия ферментов. В процессе поиска новых биопрепаратов важное место занимает использование простого и безвредного метода определения активности фермента. Показана возможность использования ортофенилендиамина в ферментативном методе определения активности L-лизин-α- оксидазы. В процессе исследований биосинтеза использовались продукты метаболизма микробного происхождения. Показано регулирующее действие биостимуляторов бактериального происхождения на синтез ряда оксидаз Lаминокислот и существование двух оптимальных значений рН для их проявления (5,8-8,4). Добавление бактериальных биостимуляторов к культуре Trichoderma sp. приводит к увеличению удельной активности фермента Lлизин--оксидазы в 2-3 раза. Предложена экономичная физиологически естественная технология получения фермента с использованием недорогих и легкодоступных продуктов микробного происхождения, которая может быть использована для получения фермента. Осуществлён двухстадийный метод выделения и очисти L-лизин-αоксидазы Trichoderma sp., который предполагается усовершенствовать за счёт 10 использования наноматериалов. Таким образом, нами исследован биосинтез и факторы регуляции противоопухолевого разработана фермента лабораторная L-лизин--оксидазы методика получения Trichoderma его, позволяющая sp., в дальнейшем перейти к созданию лекарственного средства. Появление новых оксидазных активностей при культивировании штаммапродуцента с использованием продуктов микробного происхождения позволяют получить новые субстанции, которые могут быть использованы для создания разных форм новых биопрепаратов. 11 Глава 2 Аннотированная справка по научным результатам НИР, полученным на II этапе Поиск и создание средств лечения злокачественных новообразований продолжает оставаться актуальной проблемой современной медицины. Особое место среди протвоопухолевых препаратов занимают лекарственные препараты-ферменты. В энзимотерапии онкологических заболеваний человека использование их принесло определённые успехи, которые побуждают исследователей продолжать поиск ферментов, обладающих антиопухолевой активностью. Преимуществом энзимотерапии является избирательное каталитическое действие ферментов, то есть высокая специфичность их по отношению к индивидуальному субстрату. Микроорганизмы являются продуцентами разнообразных групп соединений, которые используются для самых разных практических целей. Это многочисленные антибиотики с разным спектром терапевтического действия, стимуляторы роста, витамины, аминокислоты, ферменты-продукты метаболизма микроорганизмов, грибного и бактериального происхождения. Среди испытанных препаратов в энзимотерапии активно вмешивающиеся в аминокислотный обмен и вызывающие необратимый распад незаменимых аминокислот занимают ферменты микробного происхождения. Такими ферментами с антиопухолевой активностью являются глутамин (аспарагиназа) (К.Ф. 3.5.1.38) и L-лизин --оксидаза (К.Ф. 1.4.3.14). Глутамин (аспарагиназа) широко используется в клинической онкологии при лечении лейкозов за рубежом. Японскими исследователями из водного экстракта гриба Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray был выделен новый фермент, который ингибировал рост лейкемических клеток мышей in vivo и in vitro. Фермент был очищен до гомогенного (К.Ф.1.4.3.14). состояния Фермент и идентифицирован катализирует 12 как реакцию L-лизин--оксидаза окислительного дезаминирования L-лизина с образованием -кето--аминокапроновой кислоты. Необратимое ферментативное разрушение глутамина и аспарагина лимитирует не только нормальные, но и в особенности опухолевые клетки амидным азотом, абсолютно необходимым для синтеза ряда биологически активных веществ. L-лизин--оксидаза является также одним из ферментов, разрушающих одну из важных аминокислот- L-лизин, к недостатку которой опухолевые клетки оказываются более чувствительными, чем нормальные клетки. Поиск противоопухолевых ферментов, создание технологии получения лекарственного биопрепарата с использованием наноматериалов представляет не только практический, но и большой теоретический интерес, поскольку полученные результаты будут способствовать выяснению новых возможностей использования наносистем и наноматериалов в исследовании тонких молекулярных механизмов действия ферментов. Научно-технический отчет по второму этапу посвящен строению наноматериалов и областям их использования, свойствам наночастиц и возможностям применения их в доставке лекарственных средств. Особое значение в связи с решением поставленных задач этого этапа приобретают сведения об использовании нанотехнологии в решении проблем онкологии. В процессе создания новых биопрепаратов важное место занимает также оценка безопасности нанопрепаратов. В настоящий момент имеется недостаточное количество сведений об оценки безопасности использования нанопрепаратов. Так же изучены сведения о современных мембранах, мембранных материалах и мембранных аппаратах. Представлен рисунок автора аппарата проточная система непрерывного мембранного фракционирования с 4 мембранами с последовательно уменьшаемыми размерами пор от 0,2 мкм до 30 kDa, которая была использована в наших исследованиях. В отчете представлены сведения о материалах и методах используемых для разработки мембранного метода выделения и очистки растворов фермента 13 L-лизин--оксидазы, мембран прецизионной пористости с улучшенными эксплуатационными и адсорбционными параметрами, а также методах определения ферментативной активности и количества белка в растворе. Жидкостная экстракция органических соединений широко используется в медицинской, фармацевтической и пищевой промышленности. Однако органические растворители пожароопасные, токсичны и приводят часто к падению биологической активности препаратов. Более перспективным является применение жидкостных экстракционных систем на основе водорастворимых полимеров. В исследованиях были применены кислородосодержащие водорастворимые полимеры винильного ряда. В исследованиях чистоты препарата капиллярный электрофорез. В ходе выполнения НИР использованы разные способы получения оксидазы L-лизина-исходной субстанции для получения биопрепарата. В научно-техническом отчете по второму этапу представлены данные об использовании наноматериалов в выделении и очистке биопрепарата, а также изучении возможности агрегированию фермента различными осадителями. Осуществлён выбор экстракционных систем для доочистки биопрепарата, изучена экстракция фермента и некоторых аминокислот. В отчете представлены данные разработки мембранных методов для разделения белковых компонентов и апробация мембран нового поколения, полученных на основе нанотехнологий. В получении активного биопрепарата существенное значение имеют не только факторы, влияющие на повышение активности исходной субстанции, но и оптимизация режимов выделения и разделения белковой смеси для очистки биопрепарата. В процессе впервые изучены электрофореграммы смесей L-лизин-оксидазы и L-лизин при рН 7,4. Впервые капиллярный электрофорез был использован для изучения кинетики ферментативной реакции, показано, что капиллярный электрофорез может быть использован не только для определения чистоты биопрепарата, но и для определения активности фермента. 14 Разработано и предложено несколько схем выделения и очистки L-лизин--оксидазы с использованием мембран, изготовленных из наноматериалов для масштабирования процесса. Созданы условия для получения разных лекарственных форм с использованием наноструктурированного геля. 15 Глава 3 Аналитический отчет о проведении теоретических и экспериментальных исследований 3.1 Применение экстрактов растительного происхождения для лечения и профилактики некоторых заболеваний Лекарственные препараты растительного происхождения широко используются в медицинской практике для лечения различных заболеваний. Их применение особенно оправданно при хронической форме патологии, поскольку фитотерапию и фитопрофилактику можно проводить длительное время, не опасаясь побочных явлений. Фитопрепараты содержат биологически активные вещества, которые в большинстве случаев не токсичны, не оказывают раздражающего действия на кожу, не вызывают аллергических реакций, а главное - активны в отношении штаммов микроорганизмов и вирусов, уже приобретших устойчивость к антибиотикам и синтетическим лекарственным препаратам [2]. Рациональное вспомогательными сочетание растительных веществами, а также препаратов с использование различными оптимальной технологической схемы изготовления лекарственных форм наружного и внутреннего применения, значительно расширяют терапевтические возможности фитопрепаратов для лечения и профилактики заболеваний. Фитотерапия используется медициной Болгарии, Чехии, Польши, Франции, Китая и Индии. Возрос интерес к фитопрепаратам в США, Канаде, Германии, Японии, в настоящее время новый виток спроса на растительные препараты коснулся и России. Причин повышенного внимания к фитотерапии в нашей стране множество, характер их различен: тупиковая ситуация в лечении многих сложных заболеваний и необходимость поиска новых методов лечения; значительный негативный опыт применения синтетических фармакологических средств – осложнения, недостаточная эффективность, длительный курс лечения; развитие профилактической 16 и восстановительной медицины; дороговизна импортных лекарственных средств, заполнивших рынок; накопление положительного опыта применения фитопрепаратов для лечения различных заболеваний. В дерматологической практике в виде мягких лекарственных форм широко применяется лекарственное растительное сырьё календулы, ромашки, берёзы, ольхи, аронии, солодки, эвкалипта, донника, мелиссы и т.д. Мазь с полиэкстрактом цветков ромашки, содержащая эфирное масло, стерины, флавоноиды, дубильные вещества, полисахариды, обладает выраженным противовоспалительным и антимикробным действием, вследствие чего, эффективна при лечении экзем, дерматитов, в том числе инфицированных. В качестве дополнительной терапии при различных инфекционно-воспалительных заболеваниях кожи; для поддерживающей терапии при экземе, язвах голени, пролежнях; при геморрое, воспалительных процессах кожи и слизистых оболочек в области половых органов. При пелёночном дерматите используется 1% мазь «Камиллозан» (Asta Medica).В состав мази входят сухой экстракт цветков ромашки, шерстный воск, вазелин жёлтый, вода очищенная. В лаборатории фитохимии под руководством В.Ф. Охотникова разработаны состав и технология 0,5% и 1% линимента сангвиритрина, выделенного из рода растений семейства маковых – Маклея сердцевидная и Маклея мелкоплодная. В состав линиментов входят сангвиритрин, твин-80, кислота сорбиновая и другие ингредиенты. Являясь смесью сульфатов двух алкалоидов - сангвинарина и хелетрина, препарат сангвиритрин обладает антимикробной активностью, подавляет бактериальную нуклеазу и рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжеподобных и мицелиальных грибов. Сангвиритрин применяется для лечения инфекционновоспалительных заболеваний кожи и слизистых оболочек, раневых и ожоговых инфекций, длительно незаживающих ран и язв, пиодермий, вагинита, эрозии шейки матки, пародонтита, стоматита, дерматомикозов, кандидомикозов, онихомикозов и других заболеваний. 17 Установлено, что линимент сангвиритрина 1% концентрации по своему лечебному эффекту превосходит мазь леворина 2% концентрации, применявшуюся в терапии кандидозных поражений [3]. Для лечения различных кожных заболеваний (себорея волосистой части головы, псориаз, очаговая алопеция); дерматофитий (руброфития, микроспория, трихофития и т.д.); а также поверхностных форм кандидоза кожи, ногтей и слизистой гениталий широко используется линимент и лосьон анмарина 1% концентрации. Лекарственный препарат представляет собой смесь двух изомеров производных псоралена, выделенных из семян растения амми большая (Ammi mayus), оказывает противогрибковое действие в отношении дерматофитов: Trichophytum rubrum, T. Interdigitale, M. Canis, Candida albicans, и умеренное бактериостатическое – на грамположительные бактерии. По антимикотическому эффекту линимент анмарина не уступает клотримазолу, имея перед ним преимущество по переносимости (в том числе возможность применять при беременности), оказывает также кератолитическое и эпителизирующее действие, стимулирует рост волос [4]. Высокая противовирусная активность в отношении кератогенных и дерматотропных штаммов вирусов герпеса обнаружена у алпизарина гликозида ксантоновой природы, выделенного из нескольких растений рода копеечник ceм. Leguminosae. В виде 2% и 5% мази алпизарин рекомендован к применению при различных вирусных заболеваниях кожи. При простом герпесе экстрагенитальной локализации (единичных высыпаниях) курс лечения –3-5 дней; при распространённых высыпаниях и при наличии лихорадки, лимфаденопатии – 5-14 дней; при герпетиформной экземе Капоши – 7- 21 день, а при генитальном герпесе – 7-10 дней. На кафедре фармацевтической технологии ММА им. Сеченова группой исследователей [5] проведена экспериментальная работа с целью выбора стабильных композиций вспомогательных веществ, для получения ректальных мазей с тыквеолом. Установлено, что введение полиэтиленгликолей повышает тиксотропность и уменьшает коллоидную стабильность мазевых композиций. 18 Указанные характеристики улучшаются после добавления эмульгаторов в количестве до 5%, наиболее оптимальным является твин-80. Основные биологически активные вещества тыквеола более интенсивно и полно высвобождаются из гидрофильных мазевых основ. В то же время дифильные композиции исследованных мазей обеспечивают более высокие технологические и потребительские свойства мазей [5]. Разработка лекарственных сборов, обладающих противовоспалительным, репаративным и противоаллергическим действием, позволила коллективу авторов Башкирского государственного медицинского института предложить эффективный лекарственный препарат для дерматологической практики. Сбор "Экзофит" содержащий 4 вида ЛРС используется не только для полосканий, но и для получения масляного экстракта - аналога каротолина. Экстракт использован в косметических кремах "Альбина" и "Сударыня", обладающих регенерирующим и противоаллергическим действием. Эмульсионная мазь с масляным экстрактом "Экзофита" 25% показала высокую ранозаживляющую, дегидратирующую, регенерирующую активность и успешно применяется в детской практике при послеоперационном лечении гемангиом и лимфангиом, а также рекомендована для лечения нейродермитов и псориаза. Отмечено уменьшение зуда, воспалительных явлений, экссудации при нейродермите, а также - рассасывание папул и уменьшение шелушения при псориазе; 50% мазь эффективна при аллергических дерматозах В Пятигорской Государственной Фармацевтической Академии разработана мазь, включающая тритерпеноидный комплекс, выделенный из внешней коры берёзы. Апробация мази показала высокую эффективность при лечении герпетических проявлений, а также дерматозов различной этиологии. Для приготовления мази с выраженным антимикробным действием на эмульсионной основе использован сок крапивы двудомной, полученный по разработанной ранее сотрудниками академии технологии. На основе фитокомплекса, выделенного из травы астрагала эспарцетного, разработана мазь, обладающая антимикробным, 19 ранозаживляющим и противовоспалительным действием. В состав сырья входят полифенолы, полисахариды, сапонины, аминокислоты и другие БАВ. Оптимальной основой, обеспечивающей выделение рутина, является 5% гель метилцеллюлозы, однако фармакологическое действие выше у 4% эмульсионной мази. Изучено противовоспалительное и ранозаживляющее действие мазей из сухих экстрактов льна посевного, просвирника пренебреженного и крапивы двудомной. Приготовление мазей проводили с учётом растворимости лекарственных веществ в компонентах основы, получая гомогенные или суспензионные системы. Доказана выраженная антимикробная активность лекарственных форм из сухих экстрактов перечисленных растений в отношении ряда штаммов стафилококка, а также споровой микрофлоры [6]. Сотрудниками Пятигорской ГФА экспериментально обоснован состав и технология изготовления мази на основе липофильной фракции плодов рябины обыкновенной, Провидены полученной исчерпывающей микробиологические экстракцией исследования, н-гексаном. подтверждающие ранозаживляющую активность мази. [7]. В институте фитохимии МОН РК (Караганда, Республика Казахстан) проводятся исследования противовоспалительных по и разработке и регенераторных изучению антимикробных, свойств фитокомпозиции этанольных экстрактов и эфирных масел лекарственных растений. Анализ данных эксперимента указывает на выраженную антимикробную активность фитокомпозиции в отношении следующих тест-штаммов: St. aureus, Ps. aeruginosa, C. albicans, E. coli, B. subtilis, S. Agalactiae [8]. Сотрудниками ИОЭБ СО РАН (Улан – Удэ), Е.А. Ботоевой, Л.Б. Бураевой, А.В. Цыренжаповым, изучается влияние экстракта ортилии однобокой на течение воспалительного процесса. Установлена противовоспалительная и антимикробная активность экстракта, обусловленная высоким содержанием перспективность биологически разработки активных лекарственных фитоэкстрактов [9]. 20 веществ; препаратов определена на основе Из шалфея сухостепного получен препарат, названный донелвином. Донелвин содержит очищенную сумму хинонов, относящихся главным образом к производным ройлеанона. Мази, содержащие 0,25%, 0,5% и 1% донелвина, обладают противомикробным, противовоспалительным, противозудным действием при экземах, нейродермитах и других заболеваниях кожи. В результате исследования препаратов из надземной части шалфея сухостепного (Salvia tesquicola) выявлена высокая антибактериальная активность изучаемых образцов в отношении Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa [10]. Методом биотехнологии сотрудниками ВИЛАРа, Фатеевой Т.В, Н.М. Крутиковой, Л.Д. Шипулиной из корней макротомии красящей получен нафтохинон шиконин. - эффективности 0,5% Проведено мази шиконина изучение на химиотерапевтической модели экспериментальной микроспории морских свинок, которых инфицировали Microsporum canis. В качестве препарата сравнения использовали 1% крем клотримазола ("Польфа", Польша). Установлено, что шиконин в виде 0,5% мази оказывает высокую фунгистатическую активность, значительно сокращая срок излечения животных. Изучены антимикробные свойства шиконина в отношении бактерий рода Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas и Proteus. При этом установлено, что шиконини ингибирует рост не только лабораторных штаммов грам+ и грам бактерий, но и развитие свежевыделенных клинических штаммов отношении патогенных бактерий, современных обладающих химиотерапевтических полирезистентностью средств, в том в числе антибиотиков [11]. Для лечения трофических язв и ожогов 2-3 степени сотрудниками ММА им. И.М. Сеченова, Ж.З. Козловой, И.В. Девяткиным, И.М. Коренской, разработана мазь с маслом амаранта. Выбор компонентов, входящих в состав мазевой композиции определялся необходимостью обеспечить репаративный, осмотический и антисептический эффекты препарата. В ходе исследований были изучены возможные сочетания масла амаранта с полиэтиленоксидами 21 различной молекулярной массы, эмульгаторами №1, ОС-20, твин-80 и др. в различных сочетаниях и количественных соотношениях. Для проведения доклинических испытаний отобраны оптимальные варианты составов мазей, отвечающие требованиям ГФ XI издания к лекарственной форме – мазь. Сотрудниками НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН (Санкт-Петербург), Н.Н. Павловой, В.Б. Веселовым, Е.А. Михниной, изучена эффективность препарата фитостимулин у больных дерматологического и гинекологического профиля. Препарат фитостимулин состоит из водного экстракта пшеницы, содержащего биостимулины и 2-феноксиэтанола, являющегося антисептиком. Биостимулины ускоряют процессы репарации и заживление, 2-феноксиэтанол обеспечивает защиту поверхности от инфекции. Фитостимулин обладает противовоспалительным, репаративным и эпителизирующим действиями, антисептической активностью. На основе препарата разработан Фитостимулин - крем дерматологический, предназначенный для лечения атопического дерматита и крем вагинальный для лечения вульвовагинита. На основе бентонитовых глин Таджикистана разработана мазь "Субинак", содержащая эфирное масло душицы мелкоцветковой и обладающая антимикробной активностью. Исследование стабильности мази в процессе хранения проведено в естественных условиях, при температуре холодильной камеры 4°С и при хранении в термостате (40°С). Результаты проведённого эксперимента показали, что мазь «Субинак» стабильна в течение двух лет. Осуществлена сравнительная оценка противомикробной активности разработанной мази в сравнении с аналогичными по фармакологическому действию мазями (тетрациклиновой и эритромициновой). Показано, что противомикробная активность мази «Субинак» значительно превышает активность известных препаратов [12]. Изучен ранозаживляющий эффект мази для наружного применения «Алхидин», содержащего экстракт Alhagi kirgizorum Schrenk, и доказана эффективность мази, как ранозаживляющего проводилось на беспородных крысах обоего пола. 22 средства. Исследование Проведены реологические и биофармацевтические исследования арглабина гелевой липосомальной формы. Арглабин, сесквитерпеноидный лактон, выделен из эндемического сырья полыни гладкой. В качестве основы для получения гелей использовали полиэтиленоксид с молекулярной массой 400 и 1500 в соотношении 3:2. Скорость высвобождения арглабина из липосомной гелевой формы в опытах in vitro выявляли по Крувчинскому путем диализа препарата из геля через полупроницаемую мембрану с последующим определением его содержания в диализатах посредством ВЭЖХ – анализа [13]. Сотрудниками Алтайского государственного медицинского университета, Федосеевой Л.М., Биндюком М.А разработана мягкая лекарственная форма на основе экстракта листьев лопуха. Разработка состава и технологии мази, предназначенной для применения в стоматологической практике. Состав мази: МЦ, Na-КМЦ, среднемолекулярный, поливиниловый спорт, вода глицерин. очищенная, поливинилпирролидон С целью оказания антимикробного, противовоспалительного, дезодорирующего действия в состав полимерной композиции включили лекарственные средства растительного происхождения: экстракт листьев лопуха, масло мяты перечной, облепиховое масло. Концентрации препаратов подбирались экспериментально, с учетом терапевтической дозы и свойств лекарственных средств [14]. Разработаны технология и нормы качества стоматологического геля на основе биологически активных веществ чаги. При получении экстрактов путем экстрагирования под действием электрических разрядов важной задачей являлось определение числа электрических разрядов, при котором извлекается наибольшее количество суммы БАВ. Гель изготавливали на основе ПЭО 1500 и 400 в соотношении 1:3. Он имел стабильную структуру, сохранял первоначальную консистенцию, цвет и запах. Биологическую доступность (высвобождение БАВ из геля) определяли методом равновесного диализа, а изучение стабильности и установление сроков годности геля проводили методом «ускоренного старения» при температуре 40º С [15]. Разработаны состав и технология получения геля на основе яснотки 23 белой. Экстракт ясности белой получали циркуляционной экстракцией на установке типа «Сокслет». Для получения геля был выбран синтетический гелеобразователь группы РАП «Carbopol 974-P NF». Нейтрализацию вели щелочным агентом - триэтаноламином. В качестве пластификатора выбран кремофор RH [16]. Разработаны составы, технологии получения и методы стандартизации геля и линимента гипорамина для лечения вирусных заболеваний. Экспериментально обоснован выбор вспомогательных веществ, проведено комплексное исследование геля и линимента гипорамина с целью стандартизации препарата и установления сроков его годности, а также разработаны методики подлинности и количественного определения биологически активных веществ (БАВ) в лекарственных формах гипорамина методом ВЭЖХ [17]. Сотрудниками ПГФА, Романцевой Н.А., Шаталовой Т.А., Марковой О.М., Орловской Т.В., разработана технология получения экстракта из цветков робинии псевдоакации и мазей на его основе. При разработке технологии жидкого экстракта флавоноидов в использованы сырье методы определяли реперколяции. методом Содержание дифференциальной спектрофотометрии. Определение оптимальной концентрации действующих веществ в мази проводилось на крысах, с острым венозным застоем в хвосте. На основании результатов физико-химических, структурно-механических и микробиологических исследований разработаны состав и технология геля и крема эвкалимина антимикробного и противовоспалительного действия. Осуществлён выбор и подтверждена эффективность использования в качестве компонентов основы для геля сочетания редкосшитых акриловых полимеров и полиэтиленгликоля-400; для крема эвкалимина – воска эмульсионного, моноглицеридов дистиллированных и полиэтиленгликоля – 400. С помощью метода ротационной вискозиметрии изучена зависимость структурно- механических свойств гелевых основ Карбопола, мАРСа и Ареспола от концентрации полимера, степени нейтрализации, типа нейтрализующего агента 24 и количества вспомогательных веществ, входящих в состав лекарственной формы. Разработаны определения и модифицированы лекарственного вещества методики методом количественного УФ-спектрофотометрии. Относительна ошибка методики определения для геля составила 2,65%, для крема - 2,90%. Разработана методика определения подлинности Эвкалимина методом тонкослойной хроматографии. В соответствии с нормативной документацией осуществлена оценка качества геля и крема эвкалимина, установлена стабильность препаратов в течение 2 лет и 6 месяцев хранения. В результате доклинического изучения специфической активности геля и крема эвкалимина 0,5% лекарственные концентрации, препараты противовоспалительной установлено, обладают активностью. высокой что разработанные антимикробной Проведенные и токсикологические исследования показали хорошую переносимость геля и крема лабораторными животными. Полученные результаты могут служить основанием для проведения клинических испытаний новых мягких лекарственных форм эвкалимина. Проведены технологические исследования по обоснованию состава геля хлорофиллипта, обладающего противовоспалительным действием. Хлорофиллипт - это густой экстракт, полученный из высушенных листьев эвкалипта прутовидного. С целью выбора оптимальной основы проведены биофармацевтические исследования на модельных образцах в опытах in vitroметод диффузии в гель [18]. Сотрудниками ПГФА, Компанцевой Е.В., Марининой Т.Ф., Ващенко Е.С., изучены реологические свойства геля стоматологического. Гель содержит: сок крапивы, сок каланхоэ, глюкозамина гидрохлорид и диметилсульфоскид. В качестве гелевой основы использовали сплав полиэтиленоксидов (ПЭО-400 и ПЭО-4000) и глицерин [19]. Разработан гель противовоспалительного действия с экстрактом донника лекарственного. В качестве экстрагента для получения экстракта из травы донника лекарственного использовали спирт этиловый 95%. В процессе 25 исследования было приготовлено семь образцов геля различного состава (эмульсионная основа, ланолин, вазелин, метилцеллюлоза, флакар, полиэтиленгликоль и карбопол). По результатам биофармацевтической оценки была выбрана основа на карбополе [20]. В ПФГА разработана мазь с двухфазным экстрактом почек тополя черного. Двухфазные экстрагентов экстракты получали экстрагирование - двухфазными растительного сырья системами системами несмешивающихся растворителей различной полярности. Полученный экстракт был использован для ранозаживляющим и получения мази, обладающей противовоспалительным антимикробным, действием, которое экспериментально выявлено в опытах на животных [21]. Осуществлен подбором основы для геля «Дентолипт» с СО2-экстрактами гвоздики и эвкалипта. По результатам изучения осмотической активности, намазывающей и прилипающей способности лучшие показатели были выявлены у акрилового полимера. Для изучения тиксотропных свойств строили кривые кинетики деформации исследуемого геля в координатах: скорость сдвиг а- напряжение сдвига в области изменения градиентов скорости течения от малых к большим и от больших к малым. Полученные кривые образуют петлю гистерезиса, что указывает на способность геля к восстановлению структуры после механического воздействия и сохранению формы [22]. Разработана эмульсионная мазь с экстрактом астрагала серпоплодного, которая может быть использована для лечения гнойных ран во второй и третьей репаративно - восстановительных фазах - стимулируя репаративные процессы, а также для лечения различных поражений кожи при дерматологических заболеваниях [23,24]. Изучена осмотическая активность мази на основе дуба коры экстракта густого. Мазь рекомендована для лечения второй фазы раневого процесса, обладающая создаются умеренными благоприятные Осмотическую активность осмотическими условия для оценивали 26 свойствами, скорейшего по степени благодаря чему заживления раны. диализа через полупроницаемую мембрану с последующим определением масс – гравиметрическим методом через равные промежутки времени [26]. Изучена кинетика высвобождения масла виноградного из мази различных типов. Высвобождение активного вещества из мази проводили методом диализа через полупроницаемую мембрану, а определение содержания в пробах основного компонента виноградного масла жирных кислот проводили методом ГЭЖХ. Наиболее интенсивное высвобождение масла виноградного наблюдается при использовании эмульсионной основы с содержанием эмульгатора Т-2 9% [26,27]. Сотрудниками ВИЛАРа, Абизовой Е.В., Абизовым Е.А., Толкачевым О.Н разработаны состав и технология изготовления таблеток на основе сухого экстракта из листьев лоха узколистного. Экстракт получали с использованием 70% этилового спирта, а для улучшения технологических свойств прессуемых масс в состав таблеток вводили различные количества молочного сахара, глюкозы, кальция карбоната, крахмала и других вспомогательных веществ. Полученную массу гранулировали, опудривали смесью картофельного крахмала и кальция стеарата и прессовали на таблеточной машине ударного типа. Таким образом, подобран оптимальный состав таблеток на основе сухого экстракта из листьев лоха, разработан метод таблетирования, обеспечивающий получение таблеток надлежащего качества [28]. Сотрудниками ВИЛАР РАСХН, Ферубко Е.В., Ажуноой Т.А., Мондодоевым А.Г., ведётся оценка влияния сабельника болотного экстракта сухого (эскабол) на течение острого артрита. Исследование проводили на крысах линии Wistar массой 200-220 г. модель острого артрита воспроизводили методом Френка (субплантарное введение 0,1 мл 2% раствора формалина). В качестве препарата сравнения использовали индометацин. При этом противовоспалительное действие эскабола было аналогичным таковому у препарата сравнения индометацина [29]. Исследована зависимость биофармацевтических характеристик таблеток с сухим экстрактом сабельника болотного от гранулирующего вещества и 27 технологии изготовления. Были использованы методы прямого прессования, сухой и влажной грануляции с добавлением различных вспомогательных веществ. Все полученные образцы, независимо от способа грануляции и используемых в работе вспомогательных веществ, соответствуют требованиям тесту растворения [30]. В Пятигорской государственной фармацевтической академии разработана технология гранул с экстрактом солодкового корня и парацетамолом. Для получения гранул модельных составов компоненты вначале измельчали и просеивали, затем смешивали до получения гомогенных масс, увлажняли спиртовыми растворами связывающих веществ, гранулировали сквозь сито из нержавеющей стали с размером отверстий 3мм, сушили в сушильном шкафу при температуре 35-40 Сº до остаточной влажности не более 2%. Сухую массу протирали сквозь 1,5 мм, упаковывали и оценивали с позиции обеспечения оптимальных технологических характеристик [31]. Сотрудниками Сибирского государственного медицинского университета, Щетининым П.П., Андреевой В.Ю., Смоляковой И.М., получены гранулы и таблетки на основе экстракта манжетки обыкновенной, который оказывает положительное влияние на нормализацию гемореологических свойств крови. Экстракт получали из наземной части манжетки обыкновенной методом многоступенчатого противоточного экстрагирования. Сумму флавоноидов определяли методом дифференциальной спектрофотометрии. Таким образом, была разработана рациональная лекарственная форма, которая обеспечивает стабильность экстрактивного комплекса выделенного из манжетки обыкновенной. Разработаны технологии получения твердых лекарственных форм, содержащих растительные экстракты. Проведены комплексные исследования сублингвальных таблеток гипорамина противовирусного действия, таблеток эстифана иммуностимулирующего действия и таблеток сибектана гепатозащитного действия [32]. Сотрудниками Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченого, 28 Бондарь Д.А., Бондарь А.А., Барабановым Е.И. изучено влияние жидкого экстракта травы лядвенца рогатого на цитотоксичность лимфоцитов мышей. Исследования проводились на линейных мышах. В опытах in vivo мышам вводили подкожно по 0,5 мл суспензии опухолевых клеток 199 с 40 мкг/мл гентамицина, по 750 тыс.кл./мышь. Мышиные лимфоциты выделяли из селезенки, мишенями служили как аутологичные опухолевые клетки, так и клетки долгосрочных культур. Инкубация в течение 18 часов лимфоцитов мышей с экстрактом в максимально не цитотоксичной концентрации 0,5 мг/кг достоверно увеличивает киллерные свойства лимфоцитов против клеток меланомы В-16,EL-4 [33]. Проведено изучение влияния масляного экстракта корня лопуха на функциональное состояние печени при циклофосфановом гепатите, вызванного цитостатиками. Введение животным масляного экстракта на фоне токсического гепатита выявило снижение активности АлТ и АсТ на 28% и 30% в крови и на 40% и 46% в гомогенате печени, что говорит о гепатопротекторной активности [34]. Исследованы химический состав и влияние комплекса биологически активных веществ экстракта травы манжетки на центральную нервную систему и кровь. По результатам была выявлена высокая концентрация действующих веществ, которые не оказывают нейротоксического действия и нормализуют состав крови, включая лимфоциты, и уменьшает количество эозинофилов, что позволяет отнести данный препарат к категории безопасных [35]. Произведена сравнительная оценка антигипоксических свойств водного и углекислотного экстрактов вегетативной части кипрея узколистного. Выявление активности проходили на белых беспородных половозрелых мышах, работоспособность животных повышалась по сравнению с контрольной группой уже на 7 день. Углекислотный экстракт проявлял более выраженные антигипоксические свойства по сравнению с водным экстрактом, что связано с особенностью технологии процесса экстрагирования, позволяющей экстрагировать большее количество биологически активных веществ кипрея 29 узколистного в нативном виде. Сотрудниками Башкирского государственного медицинского университета, Клыш Е.А., Пупыкиной К.А., разработаны оптимальные условия получения экстракта из растительного сбора, которые позволят облегчить процедуру приготовления, увеличить срок годности и точность дозирования. Таким образом, были определены оптимальные условия получения сухого экстракта из сбора: экстрагент – вода очищенная, температура 80-85С, соотношение сырьё - экстрагент 1:10, трёхкратная экстракция в течение 120 минут [36]. Исследована противовоспалительная активность экстракта из листьев липы сердцевидной. В качестве экстрагента выбран спирт этиловый 20% и разработан способ получения жидкого экстракта из листьев липы по ресурсосберегающей технологии. Опыты проведены на крысах линии Вистар массой 180-200 г. Проведенное исследование убедительно доказывает, что курсовое цитокинов, введение экстракта что к ведет липы сердцевидной уменьшению массы блокирует действие гранулематозной ткани. Выявленное торможение отечности экспериментальной гранулемы на фоне спирта этилового 20% свидетельствует, что определенный вклад в воспалительное действие объекта исследования вносит экстрагент, уменьшая образование как цитокинов, так и медиаторов воспаления [37]. Сотрудники ПГФА, Постникова Н.В., Вдовенко-Мартынова Н.Н., Степанюк С.Н., изучают антибактериальное действие гравилата городского экстракта сухого. Антибактериальное действие определяли методом «колодцев», который основан на диффузии испытуемых веществ из «колодцев» в питательный агар, засеянный различными тест-культурами. Для исследований использовали гравилата городского экстракт сухой, его 5% водный раствор и 5% спиртовой раствор (70%). В качестве тест-культур использовали: стафилококки, энтеробактерии и споровые культуры [38]. В Научно-исследовательском институеа фармакологии г. Томска изучены химический состав и ноотропные свойства экстрактов черники обыкновенной. 30 Качественный состав экстрактов побегов черники обыкновенной и его фракции исследовали с помощью качественных реакций, хроматографии в тонком слое и на бумаге с применением достоверных образцов и хромато-масс- спектрометрии. Исследование выявили следующее распределение БАВ и их представителей по фракциям: простые фенолы, флавоноиды, органические кислоты, гидроксикумарины, дубильные вещества гидролизуемой формы, тритерпеновые соединения, стерины, аминокислоты, макро- и микроэлементы [39]. Изучены состав биологически активных компонентов и структура организации золя водного извлечения чаги, а также получены коллоидные системы и экстракты, превосходящие по биологической активности водные извлечения чаги [40]. Сотрудники ВИЛАР, Гнутов В.Б., Бортникова В.В., Крепкова Л.В., занимаются изучением острой токсичности и иммуномодулирующего свойств элеутерококка колючего экстракта сухого. Острую токсичность элеутерококка экстракта сухого изучали на мышах линии СВА и нелинейных белых крысах при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введении водных растворов. Влияние на гуморальное звено иммунитета определяли по количеству антителообразующих клеток в селезенке и титру антител к эритроцитам барана в сыворотке крови в микротесте гемагглютинации [41]. Сотрудниками ВИЛАР, Крутиковой Н.М., Вичкановой С.А. проведены клинические исследования пассифлоры экстракта жидкого (ПЭЖ), по результатам которых было выявлено, что применение ПЭЖ приводило у всех пациентов к последующим восстановлению улучшением сна, снижению настроения, раздражительности повышению с активности, работоспособности. ПЭЖ разрешен к медицинскому применению в качестве седативного средства. Сотрудниками ПГФА, Папаяни О.И., Доркиной Е.Г., Саркисян К.Х., изучено противоязвенное действие сухого экстракта из цветков бархатцев распростертых при геликобактерноподобном повреждении желудка у крыс. Сухой экстракт в дозе 100 мг/кг обладает выраженным противоязвенным 31 действием при геликобактероподобном повреждении СОЖ, сто сравнимо с таковым таурина в дозе 30 мг/кг [42]. Получен и стандартизован густой экстракт из листьев лещины обыкновенной, а на её основе разработаны суппозитории. Густой экстракт получали, используя в качестве экстрагента спирт этиловый 40%, стандартизацию проводили в соответствии с ФС по показателям: подлинность и содержание действующих веществ (дубильные вещества и флавоноиды), влага, тяжелые металлы. Суппозитории готовили на липофильной основе - масло какао. Полученные результаты не превышали допустимые отклонения основных показателей НД [43]. Разработана технология сухого экстракта из липы сердцевидной цветков, обогащённого комплексом БАВ (флавоноиды и кумарины), и суппозитории на его основе. Экстракт из липы сердцевидной обладает противовоспалительным, обезболивающим и антигипоксическим действиями, что является перспективной субстанцией для использования в фармации [44]. Сотрудниками Санкт-Петербургской, Ожиговой М.Г., Болдиной С.В., химико-фармацевтической академии разработана технология суппозиториев на основе экстракта листьев крапивы двудомной, которые имеют прочность на сжатие 3 кг, температуру деформации - около 38Сº [45]. Разработаны технология и анализ рациональной лекарственной формы, содержащей комплексный экстракт из листьев шалфея лекарственного, для профилактики и лечения пародонтитов, гингивитов и других инфекционновоспалительных заболеваний полости рта. В результате была получена жидкая лекарственная форма, заключенная во флакон с дозирующим распрыскивающим устройством в виде спрея [46]. Представленные научные данные, об эффективном использовании фитопрепаратов при лечении и профилактики ряда заболеваний, могут служить предпосылкой для дальнейшего изучения и разработки лекарственных форм содержащих фитокомплексы лекарственных растений. 32 3.1.2 Перспективы использования наноструктурированных форм в создании лекарственных препаратов В настоящий момент на этапе развития медицины появляются всё новые возможности вмешательства в процессы жизнедеятельности человека. Об этом свидетельствует значительное количество публикаций, которые подтверждают интерес исследователей к решению проблем здравоохранения и разработке в качестве доставки лекарственных препаратов с помощью наночастиц [47-57]. Основные требования, которые предъявляются к наноносителям – это отсутствие токсичности, иммуногенности, способность переносить достаточное количества лекарственного препарата и высвобождению его в оптимальной дозе [58-68]. Вполне понятно, что внимание исследователей обращено в первую очередь к поиску средств лечения самых опасных заболеваний [69]. Эффективность воздействия наноструктурированных форм в создании лекарственных препаратов связана с размером наночастиц. Каплун А.П., Безруков Д.А.[70], Duncan R. [71] считают, что для эффиктивного поглощения клеткой молекулярная масса полимера не должна превышать 100кДа. Однако при некоторых заболеваний в зоне воспаления размер пор капилляров существенно больше. Авторы считают, что если ввести наночастицы диаметром 100-200нм, то они смогут выйти из кровотока в тех зонах, где наблюдается воспаление. Это явление называют «пассивное нацеливание». Эффект проявляемого действия снижается из-за поглощении нано-частиц макрофагами. В дальнейшем оказалось, что не только размеры наночастиц в проявляемом эффекте имеют значение, но и их форма. Скорость движения наночастиц определяется их формой [72]. Были изучены не только сферические наночастицы, но и несферические. Это даёт возможность исследователям рассматривать их как инструмент для изменения их свойств. Наибольший эффект в создании противоопухолевых нанопрепаратов даёт 33 применение пассивного нацеливания [73]. Наибольший эффект был обнаружен при лечении солидных опухолей. Концентрация лекарства в опухоли оказалась в 15 раз выше, чем при введении лекарственного препарата в форме раствора [74]. Молекулы фосфолипидов имеют амфифильное строение и способны самопроизвольно формировать в жидких средах несколько типов наноструктур - липосомы (везикулы), мицеллы, мицеллярные лецитиновые органогели и жидкие кристаллы. Все эти структуры могут найти или уже нашли применение для транспорта лекарственных веществ. Липосомы рассматриваются не только как возможные носители лекарственных веществ, но и как средства их адресной доставки. Разработано большое количество препаратов на основе фосфолипидных липосом, ряд их них находятся на стадии клинических испытаний и сертификации, некоторые препараты уже выпускаются. Основу липосом (везикул) составляет липидный бислой. В соответстии с их размерами и количеством фосфолипидных бислоёв делят на несколько на несколько групп: малые моноламеллярные везикулы-диаметр 20-50 нм; большие моноламеллярные везикулы- диаметр 50-200 нм и выше; многослойные (мультиламеллярные) везикулы- диаметр 5000-10000 нм и могут иметь даже сотни липидных бислоёв. Считают, что большие моноламеллярные липосомы наиболее удобны в качестве доставки лекарственных веществ. Липосомы дают возможность направленно доставить в клетки лекарственные вещества, защитить лекарственное вещество от организма, защитить организм от лекарственного вещества. Особенностью распределения липосом в организме является их относительно небольшое время циркуляции в кровяном русле и захват липосом клетками ретикулоэндотелиальной системы и их накопление в этих органах (печени, селезёнке, лимфоузлах, костном мозге). Например, было обнаружено 34 следующее распределение меченых атомов через24 часа после введения липосом: печень -50-80%; селезёнка-10-30%; костный мозг-1-10%; легкие-1-5% ; кровь –около 0%; почки-1-2%. Рассматривая липосомы, как контейнеры для доставки лекарственных веществ, следует подчеркнуть достоинства использования их. К этим достоинствам относятся то, что они нетоксичны, облегчают проникновение веществ в клетку. Кроме того, вещество внутри липосомы защищено от воздействия ферментов, следовательно, можно вводить меньше дозы лекарственных веществ. Другим важным моментом является то, что лекарственные вещества высвобождаются из липосомы постепенно и поэтому увеличивается срок действия лекарственных средств. Как указывалось выше, при «пассивном нацеливании» имеет значение следующий фактор: соотношение размеров липосом и диаметра пор в каппилярах. Размер липосом больше диаметра пор капилляров в здоровых тканях, тогда как в очагах воспаления, например, в раковых опухолях размеры пор в капиллярах увеличены, и липосомы проникают сквозь них в поражённые ткани («пассивное нацеливание»). Это свойство очень привлекательно при создании препаратов, действие которых направлено на участки или органы тканей, которые поражены инфекцией. Перспективы использования некоторых наноструктурированных форм в создании лекарственных препаратов зависят от целей и задач исследователя. Если действующее лекарственное вещество, например, какой-либо антибиотик, 35 обладающий множеством побочных действий быстро дезактивируется в организме, то, чтобы повысить его эффективность разрабатывают его липосомальную форму. Такой препарат может применяться как для инъекций (внутривенно, внутримышечно, подкожно), так и виде ингаляций или наружного применения. Иногда в цель исследователя входит задача не только увеличить время «жизни» лекарственного средства в кровяном русле и снизить его токсическое действие, но и добиться его доставки к очагу поражения, например к раковой опухоли. В таком случае с липидами оболочки липосом ковалентно связывают компонент, обладающий избирательным сродством к рецепторам на поверхности опухолевых клеток (векторный компонент липосом). С целью стабилизации липосом, в случае использования их внутривенно их дополнительно покрывают гидрофильным агентом, например гидрофильным полимером. Обычно этот полимер представляет полимерную цепь, и имеют 1-2 липидных «хвоста», которые встаиваются в липидный бислой. Получаются стерически стабилизированные липосомы. При этом молекулы полиэтиленгликоля экранируют липосому от действия белков крови и клеточных мембран за счёт создания избыточного осмотического давления. Такие стерически стабилизированные липосомы становятся «невидимыми» для клеток печени и селезёнки. И, таким образом, не разрушаются и не накапливаются в этих клетках. Можно сказать, что такое объединение, включающее создание полимерной оболочки для стабилизации липосомы в кровяном русле и применение некоторых векторных компонентов для направленного транспорта, позволит создать «идеальную липосому». Считают, что можно создавать препараты, специально предназначенные для доставки лекарственных веществ в печень или селезёнку, так как в этих органах избирательно накапливаются липосомы. Это необходимо делать при грибковых и внутриклеточных микробных инфекциях. В случае поражения именно этих тканей и органов. 36 Есть сведения, что липосомные препараты можно применять ингаляционно (в форме аэрозоля) для лечения заболеваний легких, например туберкулеза. Результаты проведённых таких испытаний показали безвредность введения фосфолипидных липосом в форме аэрозолей. При этом отмечена их избирательная кумуляция в лимфатической системе легких. Тем самым обеспечивается депонирование лекарственного вещества в легких, его пролонгированное действие и адресная доставка. Есть сведения о том, что на основе липосом можно создавать поливалентные вакцины, которые предназначены для создания иммунитета одновременно против нескольких инфекций (например, против гепатита А и В, гриппа). В таком случае действующие вещества (антигены) не вводят внутрь липосомы, а закрепляют на её поверхности. В качестве антигенов выступают белки вирусов, к которым у организма должен выработаться иммунитет. Такие вакцины будут избирательно поглощаться печенью, селезёнкнй и лимфатической систеой, т.е. органами, отвечающими за выработку иммунитета. В перспективе липосомы могут использоваться как средства доставки генетического материала для генной терапии. Такая липосома состоит из фосфолипидной оболочки и генетического материала в форме плазмидыкольцевой молекулы ДНК, по сути является «искусственным вирусом». Хотя вышеперечисленные направления являются перспективными, однако, существует недостаток липосом-малая стабильность при хранении. Нестабильность липосомных препаратов вызвана двумя факторамиокислением фосфолипидов на воздухе и оседанием липосомной суспенции. Суспензии липосом являются лиофобными коллоидными системами, то есть не являются термодинамически устойчивыми. Малая стабильность липосомных форм стимулировала поиск других фосфолипидных наноструктур, как средств доставки лекарственных веществ. Этот недостаток липосом стимулировал поиск форм более стабильных. Такими формами явились лецитиновые органогели (т.е. гели в 37 органическом растворителе). Лецитиновые органогели существуют в трёхкомпонентных системах: лецитин- неполярный органический растворитель-вода в области высоких концентраций масла и низких концентраций воды. Пространственная структура лецитинового органогеля построена из нитевидных (цилиндрических) наночастиц-мицелл лецитина диаметром 2-3 нм и длиной десятки нм. Лецитиновые органогели образуются самопроизвольно при смешивании необходимых компонентов. Гелеобразователем в таких системах является природное поверхостно-активное вещество с низкой молекулярной массой- лецитин (фосфатидилхолин). Гидрофобные компоненты будут растворяться в масляной фазе органогеля, гидрофильные – солюбилизироваться в водном ядре мицеллы. В мицеллах лецитинового органогеля можно солюбилизировать ферменты без потери их медицинского применения предлагаются циклогексан, изопропилпальмитат, вазелиновое масло. Важной особенностью, достоинством таких лецитиновых органогелей является их стабильность, возможность одновременно вводить водо- и маслорастворимые вещества, а также способность ускорять трансдермальный транспорт лекарственных веществ и простота получения. Эти особенности делают лецитиновые органогели более перспективными в плане применения в медицине и косметике. На их основе можно создавать препараты для подкожного или внутримышечного введения и для местного нанесения на кожу. В последнее время исследователей привлекают внимание другие структуры фосфолипидов- лиотропные жидкие кристаллы.(рисунок 1). Лиотропные жидкие кристаллы являются термодинамически устойчивыми структурами фосфолипидов, которые могут существовать в бинарных системах фосфолипид- полярный растворитель и в тройных системах фосфолипид –вода-масло в области высоких концентраций поверхостноактивных веществ и средних концентраций воды и масла. 38 Жидкий кристалл Рисунок 1 – Жидкий кристалл. Жидкие кристаллы образуются самопроизвольно при смешивании необходимых компонентов системы. Они способны солюбилизировать значительные количества водо- и маслорастворимых биологически активных соединений. Молекулы водорастворимых веществ будут находиться внутри водной прослойки, маслорастворимые компоненты будут встраиваться между углеводородными « хвостами» молекул фосфолипидов. Весьма важно, что высокая вязкость жидких кристаллов способствует медленному высвобождению лекарственных веществ, что даёт возможность создания средств пролонгированного действия. Таким образом, можно сказать, что наноматериалы на основе фосфолипидов, имея такие качества, как нетоксичность и биосовместимость, возможность солюбилизации биологически активных веществ, способность ускорять транспорт через кожу и пролонгированность действия имеют значительно большую перспективу применения для медицины в качестве носителей лекарственных веществ. 3.2 Материалы и методы 3.2.1 Получения экстракта триходермы для создания биопрепарата С целью получения экстракта для создания наноструктурированного биопрепарата использовался штамм триходермы, обладающий оксидазной 39 активностью в отношении ряда аминокислот. Штамм Trichoderma на среде сусло-агар образует колонии быстрорастущие. Мицелий гриба бесцветный, септированный, распростертый. На 4-е - 5-е сутки роста появляются дерновинки с конидиеносцами, подушковидные, сначала белые, со временем желто или темно-зеленого цвета. Фиалиды бутыльчатые /9-12μ/, расположены мутовками по 3 и более. На каждой фиалиде образуются конидии, склеенные в головку. Конидии гриба округлые, гладкие, мелкие /3-5μ/, в проходящем свете бледно-зеленые, а в массе - темные. На агаризованной среде Чапека колонии штамма-продуцента быстрорастущие, но слабо спороносящие. Штамм хорошо растет на среде Чапека, однако лучший рост наблюдается на среде сусло-агаре. Агар и желатину не разжижает, молоко не пептонизирует. Аэробный гриб. Температурный оптимум +28-+29°С. На картофельно-декстрозном агаре наблюдается снижение интенсивности роста, образование воздушного мицелия и спороношения. Оптимальные условия роста гриба при рН 4-6, однако, может расти и при рН от 1,5 до 9. Trichodermа в одинаковой степени усваивает, как аммонийные, так и азотнокислые соли. Лучшим источником азота из органических соединений является пептон. Хорошо растет на средах с аспарагином и с глутаминовой кислотой. Лучшими источниками углерода являются ксилоза, глюкоза, сахароза, лактоза, галактоза, маннит, крахмал. На средах с этими сахарами наблюдается интенсивный рост. Слабо усваиваются спирты метиловый, этиловый, дульцит. Хорошо усваивает в качестве источника углерода пшеничные отруби. Инокулят гриба, выросший на среде с пшеничными отрубями, даёт положительный результат при использовании его при ферментации на средах разного состава. Как было показано в предшествующем этапе исследований, появление оксидазных активностей у триходермы наблюдалось при различных условиях культивирования. Ниже мы представили варианты получение экстракта гриба, 40 обладающего аминоксидазным комплексом разными способами. Первые два способа (Вариант № 1 и Вариант № 2) осуществляются при длительном выращивании гриба (до 14 дней). Вариант № 3- культивирование триходермы с биостимулятором Brevibacterium sp. осуществляли глубинным способом. Как нами было показано ранее, появление аминоксидазных активностей (Вариант № 3) происходило на 3-4 сутки роста культуры. Последний способ более экономичен, так как увеличивает активность фермента в 2-2,7 раза и сокращает время получения экстракта. Вариант № 1 Культуру гриба выращивали на среде сусло-агар в пробирках в течении 78 суток в термостате при 280С. Полученную культуру со средой ( 1-1,5см) вносили в колбу на 250 мл. со средой следующего состава: 7 мл. 11,4% NaNO3, 10 г. пшеничных отрубей, 10 мл Н2О. Культивирование осуществляли в течение 14 дней при температуре 280 С. Затем в колбу добавляли 100 мл. Н2О, в течение 2 часов встряхивали и полученную биомассу отжимали через марлю. Полученный водный экстракт использовали для приготовления биопрепарата. Вариант № 2 Культуру гриба триходермы выращивали вышеописанным способом в течении 14 суток. Полученный водный экстракт использовали (первая экстракция) в опыте, а к оставшейся биомассе добавляли стерильную воду, доращивали культуру в течении 3-4 суток в термостате при 280С (вторая экстракция), а затем вновь использовали (третья экстракция) для получения фермента в лабораторных условиях. Полученный водный экстракт использовали для приготовления биопрепарата. Вариант № 3 Культуру гриба выращивали на среде сусло-агар в пробирках в течении 78 суток в термостате при 280С. Полученную культуру со средой ( 1-1,5см) вносили в колбу на 250 мл. со средой следующего состава: 7 мл. 11,4% NaNO3, 10 г. пшеничных отрубей, 100 мл Н2О. Культивирование осуществляли в течение 3-4 дней в ферментёре или на качалках при температуре 280 С с 41 добавлением стерильной культуральной жидкости биостимулятора Brevibacterium sp. в количестве 5% от объёма среды культивирования. Затем культуральную жидкость центрифугировали, отделяли биомассу. Полученный водный экстракт использовали для приготовления биопрепарата. 3.2.2 Определение активности оксидаз L-аминокислот триходермы Активность оксидаз в экстракте культур рассчитывали по приросту Н2О2, количество которой определяли спектрофотометрическим микрометодом. Сущность метода заключается во взаимодействии всей образующейся в реакции Н2О2 с ортодианизидингидрохлоридом и измерении интенсивности образовавшегося окрашенного раствора. Инкубационная смесь для определения субстратной специфичности оксидаз L-аминокислот коллекции грибов содержала в конечном объёме (1мл.): 20 мкг пероксидазы; 250 мкг о-дианизидингидрохлорида; 0,1-0,5 мг белка; 10 мм L-лизин; 0,7 мл фосфатного буфера, рН 5,8. После 10 мин инкубирования пробы в термостате при 37 оС охлаждали до 4оС и добавляли 1 мл концентрированной HCl, до t=0-4оС. Оптическую плотность окрашенных растворов опытной и контрольной (без субстрата) проб измеряли спектрофотометрически при 540 нм против второй контрольной пробы (без пероксидазы). Для построения свежеприготовленного калибровочной раствора Н2О2 кривой, определяли молярность перманганатометрией (рисунок 2). Субстратами служили L-лизин и DL-лизин (фирма «Reanal», Венгрия); L-фенилаланин (фирма «Servant», Germany); L-метионин (фирма «Servant», Germany); L-лейцин (фирма «Servant», Germany). 42 О-дианизидингидрохлорид получали перекристаллизацией из основания о-дианизидина. Это позволило использовать краситель не в спиртовом, а в водном растворе. В качестве катализатора пероксидазной реакции использовали пероксидазу фирмы «Reanal», Венгрия, а в качестве донора протонов брали ортодианизидингидрохлорид фирмы «Merk», Germany. 250 200 D, нм 150 100 50 0 0 50 100 150 200 Н2O2, нм/мл Рисунок 2 - Калибровочный график для определения Н2О2 ортодианизидингидрохлоридом спектрофотометрическим микрометодом. Активность оксидаз L-аминокислот определяли спектрофотометрически по количеству образующейся в процессе ферментивной реакции Н2О2. За единицу активности фермента принимали количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоль Н2О2 за минуту при 37оС. Удельную активность фермента выражали числом единиц активности на 1 мг белка или на 1 мл водного экстракта культуры. Определение белка по Лоури Белок определяли по модифицированному методу Лоури. В качестве стандарта использовали 0,05% раствор кристаллического бычьего альбумина (фирма «Reanal», Венгрия). Концентрацию белка в пробе определяли колориметрически на ФЭК-56М при светофильтре №8 в кюветах с d=1 см. Для построения калибровочной кривой использовали раствор сывороточного 43 альбумина (5 г. на 25 мл. воды) (рисунок 3 ). 100 90 80 70 D 60 50 40 30 20 10 0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Белок, /мл Рисунок 3 - Калибровочный график для определения белка по Лоури. Определение активности оксидаз в отношении деструкции L- аминокислот оуществляли с учётом оптимальных условий проявления активности (рН,t,времени инкубации, концентрации субстрата). 44 Глава 4 Отчет по обобщению и оценке результатов исследований 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований 4.1.1 Анализ проведённых исследований и выбор исходной субстанции триходермы для создания биопрепарата для ветеринарии На основании анализа проведённых исследований сделаны выводы, что при электрофоретическом исследовании активных фракций присутствуют белки с молекулярным весом 50 кДа и 60 кДа, что в исходном экстракте триходермы имеются две изоформы L-лизин-α-оксидаза, различающиеся величиной проявляемой активности (рисунок 4). Удалось определить удельную активность изоформ: 27 Е/мг и 3,4 Е/мг, разделить их и дать частичную характеристику. Оказалось, что обе формы преимущественно действуют на L-лизин и в меньшей степени на Lфенилаланин и некоторые другие L-аминокислоты. Рисунок 4 - Изоформы фермента экстракта триходермы. 45 В предварительных опытах были исследованы сорбенты, содержащие Lлизин и гексаметилендиамин в качестве лигандов. Установлено, что эти сорбенты позволяют получить фермент с высоким выходом. Однако, оксидаза на всех изученных сорбентах удерживалась достаточно слабо, хотя любой из них мог быть использован в общей схеме очистки фермента. В последующих экспериментах было использовано новое мембранное устройство. Для доочистки и концентрирования фермента оксидазы была применена последовательная непрерывная или каскадная ультрафильтрация с использованием наноструктурированых мембран. Выбор размеров пор в мембранах определялся известными из литературы размерами молекул фермента. На первом этапе с использованием мембраны с размерами пор 0,22 мкм проводилась условная стерилизация раствора и удаление механических примесей. Затем удаляли примеси белком с размером молекул более 500 kDa, после этого проводили более тонкую очистку раствора с мембранами 300 kDa и на последней стадии концентрировали фермент и промывали его фосфатным буферным раствором с использованием мембран с порами менее 50 kDa . Данный процесс осуществлялся как в каскадном варианте, так и режиме непрерывной проточной фильтрации. Получены сходные результаты с предыдущим вариантом выделения и очистки фермента. Нами активностей проведён двух анализ экстрактов: исследования оксидаз экстракта, полученного Lбез аминокислот добавления метаболитов бактериального происхождения (Вариант №1) и экстракта, полученного с добавления метаболитов бактериального происхождения (Brevibacterium sp., Вариант №2). Результаты проведённого анализа представлены в таблице 1. Добавление метаболитов бактериального происхождения вызывало увеличение активности фермента, как было показано нами ранее в 2,5-2,7 раза, а субстратная специфичность оксидазы триходермы, как видно из таблицы, практически мало менялась. Это важный вывод позволяет в перспективе 46 использовать метаболиты бактериального происхождения для увеличения активности оксидазы триходермы. Таблица 1 - Оксидазные активности L-аминокислот экстрактов триходермы. Относительная активность,% L-аминокислота Вариант № 1 Вариант № 2 (контроль). (с Brevibacterium sp.,) L- Лизин 100,0 100,0 L- Фенилаланин 6,5 8,6 L- Тирозин 1,4 1,9 DL- Лейцин 2,5 2,5 L- Гистидин 0,2 0,2 L- Метионин 0,6 0,6 L- Аргинин 0,7 0,8 L- Цистеин 0 * L- Триптофан 0 * L- Аспарагин 0 * Примечание:*-следы оксидазной активности. Наше внимание было уделено неочищенному экстракту триходермы. Для ветеринарии на первых этапах создания лекарственной формы решено было использовать в создании лекарственной формы зкстракт триходермы. А в последующих этапах перейти к созданию лекарственной формы с гомогенным ферментом. С этой целью мы исследовали сопутствующие оксидазы L-аминокислот экстракта, условий их проявления (влияния рН, концентрации S), Km для каждой оксидазы и термостабильность ферментативной активности. При изучении зависимости величин оксидазных активностей от рН среды (рисунки 5,6,7) установлено, что L-лизин-, L-фенилаланин- и L-тирозин-окисдазные активности наиболее высоки в кислой зоне (рН 5,8), в то время как оксидазная активность в отношении L-метионина, L-лейцина, L-гистидина и Lаргинина оказалась максимальной в щелочной зоне (рН 8,4) (рисунки 8,9,10,11). Вместе с тем все 7 исследованных оксидазных активностей были стабильными 47 и достаточно высокими при физиологических значениях рН среды. Рисунок 5 - L-лизин-α-оксидаза. Рисунок № 6 - L-фенилаланин-α-оксидаза. 48 Рисунок 7 - L-тирозин-α-оксидаза. Рисунок 8 - L-аргинин-α- оксидаза. Рисунок 9 - L-метионин -α- оксидаза. 49 Рисунок 10 - L-лейцин-α- оксидаза. Рисунок 11 - L-гистидин-α- оксидаза. В последующих экспериментах нами исследовались зависимости величин оксидазных активностей от концентрации субстрата. Нами установлено, что насыщение L-лизин-α-оксидазы субстратом происходит при 0.1М концентрации L-лизина; величина Кm L-лизин-α-оксидазы составила 1,11103М. (рисунок 12). Для оксидазных активностей в отношении деструкции L- фенилаланина и L-тирозина было характерно насыщение субстратом при 10 и 20мМ (рисунок 13), а значения Кm составили соответственно 1,3 10-3М и 0,07 10-3М. Обнаружено,что оптимальная 50 концентрация субстратов в инкубационной смеси является 120 мМ L-лейцина, 80 мМ L-гистидина, 200 мМ L-аргинина и 200 мМ L-метионина (рисунок 14). Наиболее низкими значениями Кm обладали оксидазные активности в отношении L-аргинина, L-метионина, L-гистидина, L-лейцина. Установлена (таблица 2) высокая степень их сродства к субстрату, что является одним из основных требований к ферментам, рекомендуемым к применению в онкологической практике. В дальнейших наших исследованиях определение оксидазной активности в отношении L-аминокислот проводили в оптимальных условиях с учётом полученных результатов (рН, t, концентрации S). Рисунок 12 - Зависимость величины активности L-лизин-α-оксидазы от концентрации субстрата. Рисунок 13 - Зависимость величины активности оксидаз L-аминокислот. от концентрации субстрата. 1- L- фенилаланин --оксидазная активность. 2- L-тирозин--оксидазная активность 51 Рисунок 14 - Зависимость величины активности оксидаз L-аминокислот от концентрации субстрата. 1- L-лейцин--оксидазная активность. 2- L-аргинин--оксидазная активность 3- L-метионин--оксидазная активность 4- L-гистидин--оксидазная активность. Таблица 2 - Кm основных и сопутствующих оксидазных активностей в отношении ряда L-аминокислот в экстракте триходермы. Оксидазнае активности в отношении ряда Lаминокислот. L-Лизин L-Фенилаланин L-Тирозин L-Аргинин L-Лейцин L-Гистидин L-Метионин Кm, М(10-3 ) 0,110 0,300 0,070 0,006 0,004 0,004 0,004 В последующей серии опытов мы изучали термостабильность экстракта триходермы. Исследование термостабильности экстракта проводили при 80°С и в течении небольшого периода термообработки (таблица 3). 52 Инкубация экстракта при 80°С приводила к снижению активности Lлизин-α-оксидазы через 150 секунд. Оксидазная активность в отношении Lметионина не определялась через 90 секунд, а в отношении L-фенилаланина и L-тирозина-через 60 секунд. Причём, снижение величин этих активностей происходило с большей скоростью, чем уменьшение L-лизин-α-оксидазной активности. Известно, что концентрация ферментов в экстракте невысока по сравнению с очищенными ферментными препаратами. Из литературы известно, что тепловая инактивация ферментов прямо пропорциональна их концентрации. Существенную роль в этом процессе играет необратимая агрегация молекул, сопровождающаяся образованием между денатурированными молекулами белка дисульфидных мостиков, водородных и других связей). Таблица 3 - Величина удельной оксидазной активности в отношении Lаминокислот в зависимости от продолжительности термообработки экстракта гриба при 80°С. Продолжительность Величина удельной оксидазной активности, % к исходной. термообработки, L-лиз L-фен L-тир L-арг D,LL-гис L-мет секунды. 0 30 60 90 120 150 100 73 53 33 13 0 100 86 0 0 0 0 100 88 0 0 0 0 100 88 63 0 0 0 лей 100 93 63 0 0 0 100 62 46 0 0 0 100 90 53 0 0 0 Кроме того, в экстракте гриба могут присутствовать вещества, стабилизирующие белковые молекулы и утрачивающиеся в процессе очистки ферментов, например, неорганические соли и соли некоторых аминокислот. Предполагают, что высокая стабильность оксидаз к процессам термической 53 инактивации может быть объяснена также диссоциацией молекул ферментов на субъединицы и последующей необратимой агригацией отдельных субъединиц. В любом случае, проведённые эксперименты по термоинактивации ферментов экстракта Trichoderma, позволяют сделать заключение, что изучаемые активности обладает высокой устойчивостью к процессам термической инактивации и их снижение при термообработке происходит с разной скоростью. Во-вторых из термостабильных литературы и хорошо термофильных известно ферментов о в преимуществах промышленных производственных процессах, например, при получении D-аминокислот из рацемической смеси. В третьих экзофермент оксидаза L-аминокислот триходермы способна проявлять энзиматическую активность довольно в широком диапазоне температур- до 43° C и выше с небольшим снижением. Таким образом, учитывая вышесказанное вполне понятно, что экстракт гриба триходермы, обладающий спектром L-аминоксидазных активностей, может быть использован в создании лекарственной формы для ветеринарии. 4.2 Создание лекарственной формы биопрепарата 4.2.1 Получение и свойства наноструктурированного геля Первым этапом создания биопрепарата для наружного применения в ветеринарии явилось приготовление наноструктурированного геля. Наноструктурированный гель содержит в своём составе n-3 полиненасыщенные жирные кислоты, α-токоферола-ацетат, фосфолипидныйконцентрат, щёлочь, воду и масло вазелиновое. Средство наноструктурировано за счёт формирования фосфолипидного (лецитинового) органогеля. При этом фосфолипидный концентрат включает фосфатидилхолин 22 %, фосфатидилэтаноламин 20%, фосфатидилинозитол 54 14%, жирные кислоты 18%, гликолипиды 15%, натуральные углеводы 8%, стабилизатор 3%. Лецитиновые органогели – это наноструктурированные среды, существующие в системах лецитин - неполярный органический растворительвода в области низких концентраций воды. Пространственная структура лецитиновых органогелей образована из переплетенных между собой цилиндрических агрегатов диаметров единицы и длиной десятки и сотни нанометров - обратных мицелл лецитина [75,76]. Благодаря такой структуре лецитиновые гели обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционно исползуемыми эмульсиями и липосомами. Достоинства лецитиновых органогелей, как материалов для медицины, биотехнологии – термодинамическая устойчивость, возможность введения биологически активных веществ как гидрофильной и амфифильной (засчёт солюбилизации в мицеллах), так и гидрофобной (за счёт растворенияв органической фазе) природы, способность ускорять транспорт веществ через кожу [77] и простота получения. Формирование наноструктуры геля происходит при солюбилизации щелочи и воды в растворе лецитина в вазелиновом масле. При этом щелочь вступает в реакцию нейтрализации с содержащимися в системе жирными кислотами. Образующиеся соли жирных кислот способствуют формированию наноструктуры органогеля. В качестве источника лецитина был использован очищенный фосфолипидный концентрат (ФЛК) из соевого масла. Навеску концентрата растворяли в медицинском вазелиновом масле при температуре 40°С и перемешивали в течении трёх часов. В полученный раствор добавляли воду или водный раствор NaOH. Солюбилизация водной фазы происходила при температуре 40°С и перемешивании в течении трёх часов. После образования гомогенной системы 55 образец охлаждали до комнатной температуры. Макроскопическим критерием образования наноструктуры геля является значительное возрастания вязкости. Вязкость измеряли с помощью ротационного вязкозиметра «Rheotest 2» (Германия) при температуре 20°С (при термостатировании и различных скоростях сдвига. Влияние солюбилизированных компонентов (воды и щелочи) на вязкость системы представлены в таблице 4. Таблица 4 - Влияние воды и NaOH на вязкость образцов. Состав образца (масс.%) ФЛК-40,0% Ваз.масло 57,3% Вода-2,7%. ФЛК-40,0% Ваз.масло 57,0% Вода-3,0%. ФЛК-40,0% Ваз.масло 56,7% Вода-3,3%. ФЛК-40,0% Ваз.масло 56,67% Вода-3,0 %. NaOH- 0,33% ФЛК-40,0% Ваз.масло 56,5% Вода-3,0%. NaOH- 0,50% ФЛК-40,0% Ваз.масло 56,33% Вода-3.0%. NaOH- 0,67% Вязкость при различных скоростях сдвига, Пас 3с¯¹ 9с¯¹ 27с¯¹ 81с¯¹ 243с¯¹ 729с¯¹ 0,160 0,118 0,117 0,111 0,110 0,107 0,213 0,177 0,160 0,148 0,148 0,146 0,177 0,188 0,195 0,197 0,177 0,175 0,383 0,337 0,299 0,293 0,278 0,263 0,585 0,514 0,484 0,465 0,420 0,352 0,744 0,631 0,593 0,563 0,501 0,408 56 Как видно из таблицы 4, изменение концентрации воды в системе фосфолипидный концентрат - вазелиновое масло - вода, не содержащей NaOH, незначительно влияет на вязкость и не приводит к гелеобразованию. В то же время введение NaOH в систему фосфолипидный концентрат - вазелиновое масло – вода в малых (доли %) количествах вызывает существенное, в несколько раз, возрастание вязкости и образование наноструктурированного лецитинового геля. Наноструктурированный гель существует в системе фосфолипидный концентрат - вазелиновое масло – вода при содержании водной фазы (раствора NaOH) ниже, чем определённые граничные значения. При более высоких концентрациях водной фазы наблюдалось помутнение и расслаивание геля. Значение концентрации водной фазы в образцах, при которой наблюдалось помутнение и расслаивание геля (граница области существования геля), приведены в таблице № 5.Водная фаза представляла собой 10%-ный раствор NaOH. Таблица 5 - Граница области существования геля (по содержанию водной фазы). Исходная концентрация ФЛК в вазелиновом масле, мас.% Концентрация водной фазы (10%-ный р-р NaOH)в образце, мас.% 10 20 30 40 50 2,32 3,07 5,25 5,65 6,65 Таким образом, для формирования наноструктурированного геля в системе фосфолипидный концентрат - вазелиновое масло – вода на основе фосфолипидного концентрата, содержащего значительные количества жирных кислот, необходимо присутствие определённых количеств воды и щёлочи. Достоинство такой композиции в термодинамической устойчивости, возможности введения биологически активных веществ, как гидрофильной и 57 амфифильной, так и гидрофобной природы, способность ускорять транспорт веществ через кожу и простота получения. Соотношение инградиентов в геле, мас.%: n-3 полиненасыщенные жирные кислоты-3,5-50 α-токоферола-ацетат -0.05-1.0 фосфолипидный концентрат -9,0- 45,0 щелочь (NаOH или KOH) - 0,1-1,0 вода -1,0-6,0 масло вазелиновое - остальное. 4.2.2 Получение композиции на основе наноструктурированного геля В качестве источника лецитина был использован очищенный фосфолипидный концентрат (ФЛК) из соевого масла.120 г фосфолипидного концентрата растворяли в 137 мл медицинского вазелинового масла при температуре 40°С и перемешивали в течении двух часов. После растворения фосфолипидного концентрата в раствор вводили 194 мл препарата nполиненасыщенной жирных кислот и после перемешивания добавляли 10мл 10%-ного водного раствора NaOH. Водную и органическую фазы перемешивали при той же температуре до полной солюбилизации воды и NaOH и получения вязкой гомогенной системы. В полученный наноструктурированный гель добавляли 3мл 30%-ного раствора α-токоферолаацетата в масле. Компоненты перемешивали и затем охлаждали до комнатной температуры. Полученный гель устойчив и может храниться в закрытом сосуде при температуре 3-6°С в течении нескольких месяцев. 4.2.3 Проведение испытаний лекарственных форм биопрепарата Созданные лекарственные формы: наноструктурированная (Н), с использованием в качестве основы очищенный фосфолипидный концентрат 58 (ФЛК) с добавлением концентрата экстракта триходермы и ненаноструктурированная основа с карбаполом (К) с добавлением концентрата экстракта триходермы, которая использовалась в качестве контроля. Дополнительным контролем к каждому варианту была соответсвующая основа без добавления концентрата экстракта триходермы. Количество концентрата экстракта триходермы составляло 1% в каждом варианте эксперимента. Цель эксперимента: исследование скорости выведения препарата из исследуемой основы. В исследовании использовался Я́ дерный магни́тный резона́нс (ЯМР) — резонансное поглощение электромагнитной энергии веществом, содержащим ядра с ненулевым спином во внешнем магнитном поле, обусловленное переориентацией магнитных моментов ядер. Явление магнитного резонанса было открыто двумя независимыми группами ученых. Вдохновителями этого открытия были Ф. Блох и Э. Пёрселл [78]. Одни и те же ядра атомов в различных окружениях в молекуле показывают различные сигналы ЯМР. Отличие такого сигнала ЯМР от сигнала стандартного вещества позволяет определить так называемый химический сдвиг, который обусловлен химическим строением изучаемого вещества (Химический сдвиг хлороформа 7,25 ррм, химический сдвиг ДМСО 2,5 ррм). В методиках ЯМР есть много возможностей определять химическое строение веществ, конформации молекул, эффекты взаимного влияния, внутримолекулярные превращения. Методом ЯМР было исследовано 5 образцов гелеобразный и жидких субстанций: №1 – Гель ненаноструктурированный, контроль № 2 - Гель -жидкий кристалл, опыт. №3 - Гель-жидкий кристалл, контроль № 4 - Гель ненаноструктурированный с концентратом экстракта, опыт 59 № 5 – Концентрат экстракта. Подготовка образца для регистрации спектров ЯМР проводилась следующим образом. Образцы под номерами 1 и 4 в количестве 50 мг растворялись в дейтерохлороформе в количестве 650 мл. Тщательно взбалтывались и подогревались для лучшей растворимости до 40 ОС. Далее образец переливался в ампулу ЯМР диаметром 5 мм. Образцы под номерами 2,3 и 5 в количестве 50 мг растворялись в дейтеродиметилсульфоксид (ДМСО-D6) в количестве 650 мл. Тщательно взбалтывались и подогревались для лучшей растворимости до 60 ОС. Далее растворенный образец переливался в ампулу ЯМР диаметром 5 мм. Для всех образцов на ЯМР спектрометре JNM ECS 400 производства JEOL (Япония) были зарегистрированы спектры ЯМР 1Н в идентичных условиях: Частота резонанса протонов – 400 МГц Длительность импульса – 5 мс для (45 градусного импульса) Количество накоплений – 64 Задержка между импульсами – 5 с Число пустых сканов – 4 Частота вращения ампулы с образцом – 15 Гц Число считанных точек – 32768 Ширина спектрально окна - 15 ррм Левая граница спектра – 12,5 ррм Правая граница спектра - 2,5 ррм Центр спектра – 5 ррм Диаметр ампулы с образцом - 5 мм Температура образца – 30 ОС Результаты и их обсуждение 60 Рисунок 15 - Спектр ЯМР 1Н Образца № 1. На рисунке 15 представлен спектр ЯМР 1Н Образца № 1. Исходя из спектра видно, интегральный состав геля. Практически все сигналы образца располагаются в области 0,5 – 2,5 ррм (рисунок 16). В области 7.25 ррм виден сигнал растворителя (хлороформа). Также присутствуют 2 незначительных сигнала в районе 5.0 и 3.5 ррм. В остальных областях спектра сигналов не обнаружено. Рисунок 16 - Область 0 – 3 ррм спектра ЯМР 1Н Образца № 1. 61 Рисунок 17 - Спектр ЯМР 1Н Образца № 4. На рисунке 17 представлен спектр ЯМР 1Н Образца № 4. Исходя из сравнения спектра образца № 1 (рисунок 15) и спектра образца №4 (рисунок 17) видно, что помимо геля в образце присутствуют сигналы препарата. Сигналы образца № 1 и № 4 в области 0,5 – 2,5 ррм (рисунок 18) практически совпадают. В области 7.25 ррм виден сигнал растворителя (хлороформа) и сигналы препарата 6.8 и 8.0 ррм (рисунок 19). Также присутствуют 2 сигнала препарата в районе 3.8 и 4.8 ррм. Содержание препарата в гелеобразной субстанции не более 5 %. В остальных областях спектра сигналов не обнаружено. Рисунок 18 - Область 0 – 3 ррм спектра ЯМР 1Н Образца № 4. 62 Рисунок 19 - Область 6.0 – 9.0 ррм спектра ЯМР 1Н Образца № 4. Рисунок 20 - Область 0 – 1 ррм спектра ЯМР 1Н Образца № 3. На рисунке 20 представлен спектр ЯМР 1Н Образца № 3. Гель представляет собой многокомпонентную смесь. На рисунках 20 и 21 представлены области 0-1 ррм и 1-6 ррм соответственно. В области 2.5 ррм виден сигнал растворителя ДМСО. 63 Рисунок 21 - Область 1.0 – 6.0 ррм спектра ЯМР 1Н Образца № 3. Рисунок 22 - Спектр ЯМР 1Н Образца № 2. На рисунке 22 представлен спектр ЯМР 1Н Образца № 2. Гель представляет собой многокомпонентную смесь. На рисунках 23 и 24 представлены области 0-1 ррм и 1-6 ррм соответственно. В области 2.5 ррм виден сигнал растворителя ДМСО. Исходя из сравнения спектров, образцы № 2 64 и № 3 практически не отличаются. Рисунок 23 - Область 0 – 1 ррм спектра ЯМР 1Н Образца № 2. Рисунок 24 - Область 1 – 6 ррм спектра ЯМР 1Н Образца № 2. 65 Рисунок 25 - Спектр ЯМР 1Н Образца № 5. На рисунке 25 представлен спектра ЯМР 1Н Образца № 5. В области 2.5 ррм виден сигнал растворителя (хлороформ). В области 3.5 ррм имеется сигнал воды. Содержание экстракта в образце № 5 менее 1%. Исходя из сравнения спектров, образцы № 2 и № 3 жидкий кристалл практически не отличаются. Ввиду большого количества сигналов и сложной структуре кристаллической формы обнаружить препарат методом полученной методом спектроскопии ЯМР 1Н не представляется возможным. Исходя из спектральной информации спектроскопии ЯМР 1Н для образцов № 1 и №4, можно обнаружить препарат в области 6,5 – 8,0 ррм. Вследствие неполной растворимости гелевой формы в растворителе концентрация препарата оказывается завышенной. Таким образом, нами получены предварительные результаты исследования, которые следует продолжить: провести дополнительные опыты по подбору растворителя, в котором будет полное растворение гелевой формы,так как можно с высокой точностью методом спектроскопии ЯМР 1Н определять концентрацию препарата в гелевой форме. 66 Однако, следует далее провести эксперименты по совместимости субстанции и наноструктурированной основы для выяснения условий проявления оптимального биологического эффекта. 4.3 Обобщение результатов экспериментальных и теоретических исследований Фермент оксидаза L- лизина триходермы, как нами было показано, обладает при определённых физиологических условиях, ферментативной активностью не только в отношении L- лизина, но и деструкцией ряда аминокислот. Нами изучены условия повышения активности фермента с использованием биостимуляторов грибного и бактериального происхождения. Активность оксидазы L-лизина триходермыы увеличилась в 2,5 раза. Разработанный нами способ выделения и очистки фермента осуществлён с использованием наноструктурированных мембран, что расширяет возможности получения фермента в гомогенном состоянии. Создание гомогенного наноструктурированного биопрепарата для внутривенного введении предполагается проводить после создания наноструктурированного биопрепарата для наружного применения. Нами осуществлён поиск субстанции для создания лекарственной формы для ветеринарии. В качестве субстанции препарата для ветеринарии на первых этапах разработки был выбран экстракт гриба триходермы, наделённый ферментативной активностью, достаточно термостабильной и не требующий дополнительной технологии для создания лекарственного препарата, более дещёвый и экономически более выгодный. В качестве основы препарата использовался наноструктурированная гелевая форма на основе фосфолипидов,так как из литературных источников показано,что наноматериалы на основе фосфолипидов, имея такие качества, как нетоксичность и биосовместимость, возможность солюбилизации биологически 67 активных веществ, способность ускорять транспорт через кожу и пролонгированность действия имеют значительно большую перспективу применения для медицины в качестве носителей лекарственных веществ. 4.4 Оценка эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем Рациональное сочетание растительных препаратов с различными вспомогательными веществами, а также использование оптимальной, современной технологической схемой изготовления лекарственных форм их получения, значительно расширяет терапевтические возможности фитопрепаратов. Нами впервые предложен для создания лекарственного препарата для ветеринарии экстракт гриба триходермы, обладающий термостабильностью и с оксидазной активностью в отношении ряда аминокислот. Экстракт впервые был использован для создания наноструктурированной лекарственной формы в качестве ранозаживляющего средства в ветеринарии. В качестве основы выбраны жидкие кристаллы, которые образуются самопроизвольно при смешивании необходимых компонентов системы. Они способны солюбилизировать значительные количества водо- и маслорастворимых биологически активных соединений. Весьма важно, что высокая вязкость жидких кристаллов способствует медленному высвобождению лекарственных веществ, что даёт возможность создания средств пролонгированного действия. Таким образом, можно сказать, что наноматериалы, которые были выбраны нами на основе фосфолипидов, имея такие качества, как нетоксичность и биосовместимость, возможность солюбилизации биологически активных веществ, способность ускорять транспорт через кожу и пролонгированность действия, имеют значительно большую перспективу применения для медицины в качестве носителей лекарственных веществ и, 68 таким образом, созданное нами средство, будет более эффективным в сравнении с современным научно-техническим уровнем. Однако, следует далее провести эксперименты по совместимости субстанции и наноструктурированной основы для выяснения условий проявления оптимального биологического эффекта. 4.5 Разработка рекомендаций о возможном использовании результатов проведённых НИР в реальном секторе экономики 4.5.1 Рекомендации по получению экстракта из триходермы В настоящее время одним из наиболее изучаемых грибов является род Trichoderma. Это единственный род, каждый вид которого представлен в Генетическом Банке последовательностью одним двух геном, а более генов.Это и многие виды представлены обусловлено большой практической значимостью этого рода [1]. В процессе изучения культивирования и биосинтеза специфической оксидазы нами была показана термостабильность фермента экстракта из триходермы. Это весьма важное обстоятельство, так как позволяет рассматривать экстракт, как самостоятельную субстанцию в создании лекарственных форм, которые могут быть использованы как в фармацевтической промышленности, так и в косметологии, в качестве, как нами было показано на животных, ранозаживляющего средства. Экстракт полученный проявлением из в триходермы, разные деструкции сроки обладающий оксидазной культивирования, L-аминокислот и, обладает активностью, различным по-видимому, разной биологической активностью. Это обстоятельство необходимо учитывать при создании средств, как в косметологии, так и при создании биопрепарата для ветеринарии. 69 Вполне понятно, что обсуждаемые формы, в связи с использованием негомогенного фермента, а экстракта триходермы, содержащего неопределённый состав, могут рекомендоваться только для наружного применения. Экстракт триходермы, обладающий L-лизиноксидазной активностью может быть использован в электрохимических датчиках, в биосенсорных системах, для определения концентрации лизина в различных объектах, как при создании искусственных сред, так и при получении аминокислоты L- лизина, как добавки в корм для повышения мясной продуктивности животных [79]. Как показали наши исследования на животных, растительный экстракт триходермы может быть использован также в создании нового эффективного лекарственного биопрепарата для ветеринарии, в качестве ранозаживляющего средства. 4.5.2 Рекомендации по созданию лекарственных основ нового биопрепарата для ветеринарии Создание технологий получения лекарственных препаратов нового поколения для ветеринарии связана с конструирование высокоэффективных наноструктурированных систем, разработки основ, которые используются для доставки лекарственных средств. На основе полученных результатов проведённых научных исследований по проблеме «Создание технологии получения лекарственного биопрепарата с использованием наноматериалов» нами проведена поисковая работа по выбору наноструктурированной основы, анализ известных основ и выбор её. Перспективы использования наноструктурированных форм в создании лекарственных препаратов зависят от целей и задач исследователя. Целью данного исследования было создание такой основы, с помощью которой лекарственное средство могло бы применяться как для инъекций (внутривенно, внутримышечно, подкожно), так и виде ингаляций или наружного применения. 70 Известна малая стабильность при хранении липосомальных препартов. Они не являются термодинамически устойчивыми. Поэтому наше внимание привлекли фосфолипидные наноструктуры, как наиболее стабильные. Нами успешно впервые апробированы лиотропные жидкие кристаллы. Лиотропные жидкие кристаллы являются термодинамически устойчивыми структурами фосфолипидов, которые могут существовать в бинарных системах фосфолипид- полярный растворитель и в тройных системах фосфолипид –вода-масло в области высоких концентраций поверхостноактивных веществ и средних концентраций воды и масла. Нами впервые апробирована тройная система: фосфолипид –вода-масло, которая составляла основу нового биопрепарата для ветеринарии. Эту основы мы использовали в создании препарата с экстрактом триходермы для ветеринарии в качестве ранозаживляющего средства. Но и для гомогенн0й оксидазы L-лизина она также может быть рекомендована. Фермент полифункционален, поэтому лиотропные жидкие кристаллы могут быть рекомендованы для создания лекарственных форм разного назначения в фармацевтической промышленности. Такая перспектива обоснована на научных исследованиях, которые доказали возможность использования этого фермента ранее. Рекомендации сфер использования лиотропных жидких кристаллов в качестве основы в создании лекарственных препаратов с ферментом в фармацевтической промышленности: в онкологии; при химиотерапии вирусных заболеваний; как ранозаживляющего средства; как иммуномодулятора; в комбинации с другими лекарственными средствами. Наноматериалы на основе фосфолипидов, имея такие качества, как нетоксичность и биосовместимость, возможность солюбилизации биологически активных веществ, способность ускорять 71 транспорт через кожу и пролонгированность действия имеют значительно большую перспективу применения для медицины в качестве носителей лекарственных веществ. 4.6 Разработка рекомендаций по использованию результатов НИР при создании научно-образовательных курсов С этой точки зрения исследования, выполненные по проблеме «Создание технологии получения лекарственного биопрепарата с использованием наноматериалов» безусловно, представляют интерес, так как является новыми и более эффективными. В настоящий момент на этапе развития медицины появляются всё новые возможности вмешательства в процессы жизнедеятельности человека. Об этом свидетельствует значительное количество публикаций, которые подтверждают интерес исследователей к решению проблем здравоохранения и разработке в качестве доставки лекарственных препаратов с помощью наночастиц. При создании научно-образовательных курсов данные, полученные при выполнении научно-исследовательской работы создания нового перспективного препарата для ветеринарии, могут быть использованы. Обоснованность этого подтверждается, как новизной использования экстракта триходермы, как субстанции в создании перспективного лекарственного средства, так и созданием и апробированием новой лекарственной основы с использованием жидких кристаллов. Полученные экспериментальные данные представляют интерес, как для микробиологов, биохимиков, химиков, биотехнологов, так и для фармацевтов. 72 Глава 5 Публикации результатов НИР 5.1 Заключение экспертной комиссии по открытому опубликованию 73 5.2 Копия статьи, опубликованной в журнале ВАК 74 75 76 77 78 79 80 Заключение Получение эффективных биопрепаратов с использованием достижений нанотехнологий - одно из важнейших направлений развития биотехнологии. Однако, следует обратить внимание на то, что создание биопрепаратов на основе достижений нанотехнологий складывается из двух разработок: выбора перспективной субстанции, обладающей определённым фармакологическим эффектом, ранее доказанным, и выбора наноструктурированной основы, которая может быть трудносовместимой с выбранной субстанцией и в связи с этим возникает необходимость отработки условий проявления активности фермента. При создании нового биопрепарата для ветеринарии из триходермы открываются две перспективы использования исходной субстанции: очищенной, требующей дополнительного оборудования и реактивов и технологии с неочищенным ферментом (концентратом экстракта), который не требует дополнительных временных и материальных затрат. Учитывая анализ проведённых исследований, мы на первом этапе создания лекарственной формы для ветеринарии остановились на создании лекарственной формы с использованием концентрата экстракта триходермы. С этой целью проведено исследование литературных источников по лекарственным формам фитопрепаратов, которые созданы с использованием гелевых основ. Как видно из литературных источников использование гелевых форм концентратов растительного происхождения весьма перспективно. Целью последующего этапа исследований по лекарственного биопрепарата для ветеринарии проблеме создания нового наружного применения был поиск наноструктурированной основы. Как показали наши исследования, более перспективны в плане применения в медицине лецитиновые органогели. На их основе можно создавать препараты для подкожного или внутримышечного введения и для местного нанесения на кожу. 81 Жидкие кристаллы образуются самопроизвольно при смешивании необходимых компонентов системы. Они способны солюбилизировать значительные количества водо- и маслорастворимых биологически активных соединений. Высокая вязкость жидких кристаллов способствует медленному высвобождению лекарственных веществ, что даёт возможность создания средств пролонгированного действия. Нами создана лекарственная форма на основе жидких кристаллов и проведено предварительные испытание на ЯМР. В ходе работ были сделаны выводы: 1. Проведён анализ исследований и выбрана субстанция для создания лекарственной формы биопрепарата для ветеринарии. 2. Осуществлён выбор наноструктурированной лекарственной основы для создания лекарстенного средства. 3. Создана наноструктурированная основа лекарственного биопрепарата. 4. Проведены некоторые испытания созданного лекарственного средство на основе наноматериалов на ЯМР. 5. Даны рекомендации по созданию лекарственной формы биопрепрата. 82 наноструктурированной Список используемых источников 1. Алимова С.Ф. - Промышленное применение грибов Триходерма, Казань, 2006 2. Сакович Г.С., Колхир В.А., Лескова Т.Е. Фармакологические свойства линимента, содержащего экстракты лекарственных растений // VI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» 19-23 апреля 1999 года: Тез. докл. – М.: Российский фонд «Здоровье человека», ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 466 3. Вичканова С.А., Колхир В.К., Крутикова Н.М. Доклиническое экспериментальное исследование 0,5% линимента сангвиритрина // X Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тез. докл. – М.: Минздрав. России, Общероссийский фонд «Здоровье человека», 2003. – С. 590 4. Крутикова Н.М., Вичканова С.А. Клинические исследования пассифлоры экстракта жидкого // Сборник материалов Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Выпуск 16. –М.2009.-С. 683 5. Цепков А.С., Чеботарёва Т.И., Михалёв В.Ю. Получение и исследование ректальных мазей с тыквеолом // VIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» 2-6 апреля 2001 года: Тез. докл. – М.: Минздрав. России, Общероссийский общественный фонд «Здоровье человека», 2001 . – С. 633-634 6. Мичник О.В., Мичник Л.А., Колпак А.М. Разработка технологии лекарственных форм обладающих противовоспалительным и ранозаживляющим действием // X Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тез. докл. – М.: Минздрав. России, Общероссийский общественный фонд «Здоровье человека», 2003. – С. 636 7. Никитина Н.В., Степанюк С.Н., Эфимова-Филипчик В.И. Моделирование липосомалиной мази с метронидазолом и облепиховым маслом // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».-Москва,2005.-С. 218-220 83 8. Кулатаева А.К., Снопкова В.А., Пак Р.Н. Изучение антимикробных и регенераторных свойств фитокомпозиции // IX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тез. докл. – М.: Минздрав. России, Общероссийский общественный фонд «Здоровье человека», 2002 – С. 645-646 9. экстракта Ботоева Е.А., Бураева Л.Б., Цыренжапов А.В. Влияние сухого ортилии однобокой на течение воспалительной реакции в экспиременте // IX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тез. докл. – М.: Минздрав. России, Общероссийский общественный фонд «Здоровье человека», 2002 . – С. 588 10. Хайдукова Е.В., Коссиор Л.А., Теслов Л.С. Антимикробная активность препаратов из надземной части шалфея сухостепного // IX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тез. докл. – М.: Минздрав. России, Общероссийский общественный фонд «Здоровье человека», 2002. – С. 715 11. Фатеева Т.В., Крутикова Н.М., Шипулина Л.Д. Антимикробная активность шиконина, полученного биотехнологическим путём // X Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тез. докл. - М.: Минздрав. России, Общероссийский общественный фонд «Здоровье человека», 2003. – С. 575 12. Холназаров Б.М. Разработка и исследование мази из эфирного масла душицы мелкоцветковой на основе бентонита: Автореф. дис. к.ф.н., - М., 2004. – C. 22 13. Тихонова Е.В., Итжанова Х.И. , Адекенов С.М. Реологические и биофармацевтические исследования арглабина гелевой липосомальной формы // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».-Москва,2005.-С. 234-236 14. Федосеева Л.И., Биндюк М.А. Разработка мягкой лекарственной формы с лопуха листьев экстрактом // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции»-Москва, 2005.-С. 242-244 84 15. Гюльбякова Х.Н., Казуб В.Т., Маринина Т.Ф. Разработка технологии и норм качества стоматологического геля на основе биологически активных веществ чаги // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».-Москва,2005.-С. 306-308 16. Пучкова Е.М., Сименко М.В., Буракова М.А. Разработка состава и технологии геля на основе яснотки белой // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».Москва,2005.-С. 223-225 17. Джавахян М. А. разработка составов и технологии мягких лекарственных форм гипорамина: Автореф. дис. на соиск. учен. степ. Канд. фармацевт. наук. – М.,-2006 18. Теунова Е.А., Хаджиева З.Д. Технологические исследования по обоснованию состава геля хлорофиллипта // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».Москва, 2005.-С. 232-233 19. Компанцева Е.В., Маринина Т.Ф., Ващенко Е.С. Изучение реологических свойств геля стоматологического // // Научные труды 10 международного конгресса «Инновационные технологии «Здоровье в и биологии образование и в 21 веке» медицине».-Москва,2009.- С. 721-722 20. Степанова Э.Ф., Музалёва Н.В., Домунян А.М. Мази противовоспалительного действия, содержащие различные фитокомплексы // IX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тез. докл. – М.: Минздрав. России, Общероссийский общественный фонд «Здоровье человека», 2002. – С. 703 21. Никитина Н.В., Беловолова Е.А., Степанюк С.Н., Клишина И.И., Арчинова Т.Ю., Дуккардт Л.Н., Макарова А.Н. Технология и анализ мазей противовоспалительного и антимикробного действия , содержащих фитокомплексы // Сборник материалов Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Выпуск 16. –М.2009.-С. 708 85 Кульгав 22. Е.А. Изучение реологических характеристик геля «Дентолипт» // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».-Москва,2005.-С. 204-205 Гужва Н.Н., Зайцев В.П., Гужва Л.Б., Науменко А.Г. Разработка 23. гранул с сухим экстрактом астрагала серпоплодного, обладающих адаптогенным действием // // Научные труды 10 международного конгресса «Здоровье и образование в 21 веке» «Инновационные технологии в биологии и медицине».-Москва,2009.-С. 708-709 24. Гужва Н.Н., Погорелов В.И., Зайцев В.П., Науменко А.Г. Разработка состава и технологии эмульсионной мази с экстрактом астрагала серпоплодного // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».-Москва,2005.-С. 179-183 25. Буряк М.В., Хохленкова Н.В. Изучение осмотической активности новой мази на основе дуба коры экстракта густого // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».Москва,2005.-С. 172-173 26. Сагиндыкова Б.А., Анарбаев Р.М., Исабекова Д.С. Разработка пролонгированной формы экстракта сухого виноградных косточек // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».-Москва,2005.-С. 229-232 27. Сагиндыкова Б.А., Анарбаева Р.М., Сагинбазарова А.Б. Изучение кинетики высвобождения масла виноградного из мази // Сборник материалов Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Выпуск 16. – М.2009.-С. 731 28. Абизова Е.В., Абизов Е.А., Толкачев О.Н. Разработка состава и технологии таблеток на основе сухого экстракта из листьев лоха узколистного // Сборник материалов Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Выпуск 14. –М.2007.-С. 789 29. Ферубко Е.В., Колхир В.К., Мондодоев А.Г., Николаев С.М. Экспериментальное исследование общих 86 фармакологических свойств сабельника болотного экстракта сухого // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».Москва,2005.-С. 520-523 30. Климова Е.И., Охотникова В.Ф., Сокольская Т.А. Влияние технологии получения таблеток сухого экстракта сабельника болотного на их биофармацевтические характеристики // Сборник материалов Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Выпуск 14. –М.2007.-С. 828 31. Шевченко А.М., Шатило В.В. Разработка технологии гелеобразующих гранул с экстрактом солодкового корня и парацетамолом // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».-Москва,2005.-С. 252-254 32. Качалина Т.В. Разработка получения твердых лекарственных форм, содержащих растительные экстракты: Автореф. дис. на соиск. учен. степ. Канд. фармацев. наук. - М., 2005 33. Бондарь Д.А., Бондарь А.А., Барабанов Е.И. Влияние жидкого экстракта травы лядвенца рогатого на цитотоксичность лимфоцитов мышей // Сборник материалов Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Выпуск 14. –М.2007.-С. 803 34. Жолмурзаева А.А. Влияние масляного экстракта корня лопуха на функциональное состояние печени при циклофосфановым гепатите // Сборник материалов Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Выпуск 14. –М.2007.-С. 822 35. Зорина Е.В., Олешко Г.И., Юшкова Т.А. Исследование химического состава и фармакологической активности экстракта травы манжетки // Сборник материалов Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Выпуск 14. –М.2007.-С. 824-825 36. Клыш Е.А., ПупыкинаК.А. Разработка условий получения экстракта из растительного сбора // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».-Москва,2005.-С. 196-198 37. Погорелый В.Е., Акопов А.А., Макарова Л.М. Исследование 87 противовоспалительной активности экстракта из листьев липы сердцевидной // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».-Москва,2005.-С. 488-489 38. Постникова Н.В., Вдовенко-Мартынова Н.Н., Степанюк С.Н., Андрюшина Д. К вопросу о антибактериальном действии гравилата городского (Geum urbanum L.) экстракта сухого // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».-Москва,2005.С. 489-490 39. Шилова И.В. Химический состав и ноотропные свойства экстрактов черники обыкновенной // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».-Москва,2005.-С. 523-524 40. Хабибрахманова В. Р. Состав и свойства дисперсной фазы золя водных извлечений чаги: Автореф. дис. на соиск. учен. степ. Канд. хим. наук. – Казань,-2008 41. Гнутов В.Б., Бортникова В.В., Крепкова Л.В. Изучение острой токсичности и иммуномодулирующих свойств элеутерококка колючего экстракта сухого // Сборник материалов Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Выпуск 16. –М.2009.-С. 639-640 42. действие Папаяни О.И., Доркина Е.Г., Саркисян К.Х. Противоязвенное сухого экстракта из бархатцев распростертых при геликобактероподобном повреждении желудка у крыс // Сборник материалов Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Выпуск 16. – М.2009.-С. 715 43. Тираспольская С.Г. Разработка технологии и оценка качества суппозиториев на основе густого экстракта из листьев лещины обыкновенной / Тираспольская С.Г. и др. // Научные труды 10 международного конгресса «Здоровье и образование в 21 веке» «Инновационные технологии в биологии и медицине».-Москва,2009.-С. 712-714 44. Медведева Т.М., Сорокин В.В., Каухова И.Е., Болотова В.Ц. Разработка технологии сухого экстракта из липы сердцевидной цветков, 88 обогащённого комплексом БАВ, и суппозиториев на его основе // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».-Москва,2005.-С. 211-213 45. Ожигова М.Г., Болдина С.В. Разработка технологии суппозиториев на основе экстрактов листьев крапивы двудомной // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».Москва,2005.-С. 220-221 46. Романцова Н.А., Шаталова Т.А., Маркова О.М., Орловская Т.В. Разработка технологии и анализа экстракта из цветков робинии псевдоакации и мазей на его основе // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».-Москва,2005.-С. 225-227 47. Salata O.V. Applications of nanoparticles in biology and medicine // Joum. Nanobiotechnology. 2004. V. 2. P. 3-8 48. Morrow К J., Bawa H, Wti C. et al. Recent advance in basic and clinical nanomedicine //Med. Clin. N. Am. 2007. V. 9. P. 805-843 49. McNeil S.E. Nanotcchnotogy for the biologist // Journ. Leucocyte Biol. 2005. V. 78. P. 535-594 50. Neumaier C.T., Baio C, Ferrini S. MR and iron magnetic nanoparticles. Imaging opportunities in preclinical and translational research // Tumori. 2008. V. 94. P. 226-233 51. . BakryR., Valiant ЯМ., Najam-ul-HagM. et al. Medicinal application of fullerens //Int. Journ. Nanomedicine. 2007. V. 2. P. 639-649 52. Kraij M., Pavelic K. Medicine on a small scale // EMBO Rep. 2003. V. 4. P. 1008-1012 53. Singh I., Rehni A.K., Karla R. Dendrimers and their pharmaceutical applications //Pharmazie. 2008. V. 63. P. 491-496 54. Satton D., Nasongkla N.. Blanco E., Gao J. Functionalized miceliar systems for cancer targeted drug delivery // Pharmaceutical Res. 2007. V. 24. P. 10291046 55. Immordino M.L., Dosio F., Cartel L. Stealth liposomes: review of the 89 basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential // Int. Journ. Nanomedicine. 2006. V 1. P. 297-315 56. Goyal A.K., Khatri K., Mishra N. et al. Aquasomes-A nanoparticulate approach for the delivery of antigen // Drug Dev. Ind. Pharm. 2008. V. 10. P. 1-9 57. Kabanov A. V. Polymer genomics: An insight into pharmacology and toxicology of nanomedicines // Adv. Drug Deliv. Rev. 2006. V. 58. P. 1597-1621 58. Liu W. - T. Nanoparticles and their biological and environmental applications // Journ. Biosci. Bioengineering. 2006. V. 102. P. 1-7 59. Alexis F., Pridgen E., MolmrL.K., Farokhzad O.C. Factors affecting the clearance and biodistribut ion of polymeric nanoparticles // Molec. Pharmaceutics. 2008. V. 5. P. 505-515 60. Peer D., Karp J.M., Hong S. et al. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy // Nat. Nanotechnology. 2007. V. 2. P. 751-760 61. Cuenca A.G., Jiang H., Hochward S.N. et at. Emerging implications of nanotechnology on cancer diagnostics and therapeutics // Cancer. 2006. V. 107. P. 459466 62. Romberg В., Hennink W.E., Storm G. Sheddable coatings for long- circulating nanoparticles// Pharmaceutical Res. 2008. V. 25. P. 55-71. 63. Sinha R, Kim G.J., Nie S., Shin D.M. Nanotechnotogy in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticles tor drug delivery // Mol. Cancer Then 2006. V. 5. P. 1909-1917 64. MaedaH., WuJ., Sawa T. et al. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review//Journ. Control Release. 2000. V. 65. P. 271-284 65. Torchilin V.P. Targeted Pharmaceutical nanocarriers for cancer therapy and imaging //AAPS Journ. 2007. V. 9. P. 128-147 66. . Ishii D., Kinbara K., Ishida Y. et al. Chaperonin-mediated stabilization and ATP-triggered release of semiconductor nanoparticles // Nature. 2003. V. 423. P. 628-632 67. Gao X., Chen J., Tao W. et al. UEA I-bearing nanoparticles for brain 90 delivery following intranasal administration // Int. Journ. Pharm. 2007. V. 340. P. 207215 68. Moghimi S.M., Hunter A.C., Murray J.C. Nanomedicine: current status and future prospects // The FASEB Journ. 2005. V. 19. P. 311-330 69. Lammers N., Hennink W.E., Storm G. Tumour-targeted nanomedicines: principles and practice // Cancer. 2008. V. 99. P. 392-397 70. Каплун А.П., Безруков Д.А., Швец В.И. Рациональный дизайн нано- и микроразмерных лекарственных форм биологически активных субстанций .//Биотехнология,2010, №6, С.9-18 71. Duncan R. Effect of molecular size of 125-labelled poli (vinylpyrrolidone) on its pinocytosis by rat visceral yolk sacs and rat peritoneal macrophages // Biochem.J.-1980.-V.196.-P.49-55 72. Champion.J.A. Particle shape: A new design parameter for micro- and Nanoscale drug delivery carries//J. Contr.Release.-2007.-V.121.-P. 3-9.56 Doshi N. Flow and adhesion of drug carriers in blood vessels depend on their shape: A study using model synthetic microvascular networks// J.Contr.Release.-2010.-146.-P.196200 73. Huang S.K. Pharmacokinetics and Therapeutics of Sterically Stabilized Liposomes in Mice Bearing C-26 Colon Carcinoma.//Cancer Res.-1992.- V.52.P.6774-6781 74. Papahadiopoulos D. Sterically stabilized liposomes:Improvements in pharmacokinetics and antitumor therapeutic efficacy //Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991-V.88.-P.11460-11464 75. Luisi P.L., Scartazzini R. ,Haering G., Schurtenberg P. Organogels from water-in-oil microemulsions // Сolloid Polimer Sci.1990.V.268.P.356 76. Щипунов Ю.А. Самоорганизующиеся структуры лецитина // Успехи химии.-1997.- т. 66, № 4.- С.128-352 77. Williman H.-L., Luisi P.L.Lecithin organogels as matrix for the transdermal Transport of drugs// Biochem.Biophys.Research Communications.1991, 177, №3,897-900 91 78. . Абрагам А. Ядерный магнетизм. — М.: Издательство иностр. лит., 79. Wang X, Yang L., Chen Z, Shin D.M. Application of nanotechnology in 1963. cancer therapy and imaging // CA Cancer Journ. Clin. 2008. V. 58. P. 97-110. 92
