Направленный синтез аминокислот.

реклама
1
Лекция № 11. ТОБ.
Направленный синтез аминокислот.
План лекции
1. Общие закономерности биосинтеза аминокислот.
2. Метаболические пути биосинтеза лизина.
3. Биохимические закономерности направленного синтеза глутаминовой
кислоты.
4. Механизмы направленного синтеза ароматических аминокислот на
примере триптофана.
5. Ферментативное разделение оптических изомеров аминокислот.
В. 1. Общие закономерности биосинтеза аминокислот.
Получение аминокислот является одним из наиболее масштабных
биотехнологических производств. Мировой уровень выпуска аминокислот
достигает нескольких млн. тонн в год. Аминокислоты получают в настоящее
время четырьмя способами.
1.
Химический
или
ферментативный
гидролиз
белков
животного или растительного сырья. Способ экономически не выгоден;
технологически сложно выделить чистые препараты аминокислот.
2.
Химический синтез аминокислот из предшественников.
Способ эффективен, однако полученные продукты представляют смесь
рацетатов.
3.
является
Микробный синтез аминокислот. Преимуществом способа
способность
микроорганизмов
синтезировать
биологически
активные L-изомеры аминокислот.
4.
Химико-микробиологический метод – химический синтез
вещества-предшественника
с
последующей
биотрансформацией
ферментными системами соответствующих штаммов микроорганизмов.
Метод перспективен для получения аминокислот, биосинтез которых из
традиционных углеродных субстратов затруднен или невозможен.
2
Среди
аминокислот,
получаемых
микробиологическим
путем,
наибольший удельный вес имеют лизин и глутаминовая кислота. Триптофан
преимущественно
получают
химико-микробиологическим
способом;
метионин – методом химического синтеза.
В клетках микроорганизмов функционируют механизмы репрессии и
ингибирования ферментов, катализирующих реакции синтеза аминокислот, а
также «барьер проницаемости», препятствующий транспорту аминокислот из
клетки. Эти механизмы обеспечивают поддержание в клетке определенного
уровня аминокислот, необходимого для синтеза макромолекул.
В то же время, некоторые микроорганизмы обладают способностью
накапливать
в
среде
культивирования
значительные
концентрации
аминокислот. Наиболее распространенными продуцентами аминокислот
являются бактерии родов Brevibacterium; Micrococcus; Corinebacterium;
Arthobacter. Активное накопление аминокиислот в среде наблюдается, как
правило, с середины экспоненциальной фазы роста, дастигая максимума к ее
концу.
Сверхпродуцирование аминокислот микроорганизмами может быть
вызвано следующими факторами:
- увеличение степени утилизации субстрата;
- повышение
скорости
образования
и
активности
ферментов
биосинтеза аминокислот;
- ингибирование активности или подавление синтеза ферментов,
связанных с утилизацией культурой продуцированных целевых
аминокислот;
- стимуляцией выделения продукта во внеклеточную среду;
- стимуляцией образования углеродного и азотного предшественников
целевых аминокислот.
В зависимости от метаболического пути биосинтеза аминокислоты,
продуцируемые микроорганизмами, делят на пять групп:
3
1). Ароматические и гетероциклические аминокислоты. Ключевой
реакцией биосинтеза фенилаланина, тирозина и триптофана является
конденсация фосфоенолпирувата и эритрозо-4-фосфата с образованием
шикимовой
кислоты
– общего предшественника этих аминокислот.
Исключением является гистидин, предшественником которого являются
пентозы, образующиеся по гексозомонофосфатному пути.
2). Группа серина (серин, глицин и цистеин) – аминокислоты,
синтезируемые из 3-фосфоглицериновой или глиоксиловой кислот.
3).
Группа
пировиноградной
кислоты
–
валин,
синтезируемый
непосредственно из ПВК; лейцин – через ацетил-КоА; лизин – через
диаминопимелиновую кослоту.
4). Группа α-кетоглутаровой кислоты (глутаминовая кислота, пролин и
аргинин) – синтезируются серез ЦТК на базе α-кетоглутаровой кислоты.
5). Группа аспарагиновой кислоты (аспарагиновая кислота, треонин,
изолейцин, метионин) – общим предшественником этих аминокислот
является щавелевоуксусная кислота.
В. 2. Метаболические пути биосинтеза лизина.
Лизин синтезируется микроорганизмами двумя способами.
1 способ. Микромицеты и дрожжи продуцируют лизин из α-кетоглутаровой
кислоты
через
α-аминоадипиновую
кислоту.
Скорость
образования лизина по данной схеме лимитируется стадиями синтеза αкетоглутаровой кислоты и глутаминовой кислоты через цикл Кребса.
4
(СН2)2-СООН
(СН2)3-СООН
║
СО-СООН
СО-СООН
СН3СО~КоА + Н2О
1
L-глутаминовая
5
НS-KoA
α-кетоглутаратовая
(СН2)2-СООН
(СН2)3-СООН
НОС-СООН
СН2-СООН
гомолимонная к-та
Н2О
H2N-CH-COOH
АТФ
6
АДФ+Н3РО4
НАД
(СН2)3-СОН
Н2О
2
α-аминоадипиновая к-та
НАДН
(СН2)2-СООН
H2N-CH-COOH
СН-СООН
α-аминоадипиновый полуальдегид
НО-СН-СООН
L-глутаминовая к-та
7
гомоизолимонная к-та
Н2О
НАДФ
НАДФН
3
COOH
(СН2)2-СООН
NH- CH-(СН2)2-СООН
(CH2)4 – CH-COOH
CH-COOH
CO-COOH
NH2
щавелево-глутаровая
СО2
4
НАДН
НАД
сахаропин
8
НАД
Н2 О
НАДН
α-кетоглутаратовая
H2N- (CH2)4 – CH-COOH
(СН2)3-СООН
CO-COOH
NH2
α-кетоадипиновая
L-лизин
Фермент 1 - гомоцитратсинтаза; 2 - гомоцитратгидролаза;
3 - гомоизоцитрат-редуктаза; 4 - оксалоглутаратдекарбоксилаза;
5
7
-α-кетоадипинатаминотрансфераза; 6
- «сахаропинредуктаза», 8
- α-аминоадипинатредуктаза;
- сахаропин-НАД-оксиредуктаза.
2 способ. Для бактериальных культур, относящихся к родам Brevibacterium; Corynebacterium характерен путь биосинтеза лизина из аспарагиновой
кислоты через диаминопомелиновую кислоту.
5
Помимо лизина по разветвленной схеме биосинтеза из аспарагиновой
кислоты образуются также метионин, треонин и изолейцин:
Аспарагиновая кислота
1
β-аспартил - Р
3
Гомосерин
β-аспартамполуальдегид
4
2
L-метионин
L-треонин
L-лизин
5
L-изолейцин
1
4
- аспартаткиназа;
-гомосеринкиназа;
Исходя
из
2
- дигидродипиколинатсинтаза;
3
-гомосериндегидрогеназа;
-треониндегидрогеназа.
5
приведенной
схемы
повышенная
биосинтетическая
активность микроорганизмов по лизину может быть вызвана следующими
факторами:
- активация фермента
аспартаткиназы (1), ингибирование
которого
осуществляется одновременно лизином и треонином по принципу «обратной
связи»;
- активация фермента дигидродипиколинатсинтазы (2), ингибируемого
треонином, метионином и изолейцином;
- подавление активности ферментов гомосериндегидрогензы (3) и
гомосеринкиназы
(4),
Corynebacterium
в
которые
15
раз
у
диких
выше,
штаммов
чем
Brevibacterium
активность
и
фермента
дигидродипиколинатсинтазы (2). Данный эффект достигается снижением
концентрации фосфат-ионов в среде, воздействием мутагенных факторов
(УФ-излучение; диэтилсульфат, нитрозоэтилмочевина).
Схема биосинтеза лизина по данному пути приведена ниже:
6
HOOC-CH2-CH-COOH
NH2
АТФ
1
АДФ
POOC-CH2-CH-COOH
β-аспартилфосфат
NH2
НАДН
АДФ
2
НАД
АТФ
OНC-CH2-CH-COOH
β-аспартатполуальдегид
NH2
ПВК
3
Н2О
СН
Н2С
СН
НООС-НС
С-СООН
НАДФН
дигидропиколиновая кислота
N
4
НАДФ
СН2
Н2С
СН2
НООС-НС
N
Сукцинил-КоА
5
С-СООН
пиперидин-2,2-дикарбоксилат
Н2О
L-глутамат
НS-KoA
α-кетоглутаровая кислота
Янтарная кислота
NH2
NH2
НООС-СН-(СН2)3 – СН – СООН диаминопимениловая к-та
6
СО2
H2N-(CH2)4 – CH - COOH
NH2
лизин
7
Ферменты: 1 - аспартаткиназа; 2 - аспартилфосфатдегидрогеназа;
- дигидропиколинат циклогидролаза; 4 - пиперидиндикарбоксилат3
дегидрогенеза; 5
- комплекс ферментов : сукцинил-КоА-трансфераза +
сукцинилдиаминопимелинат-аминотрансфераза + сукцинилдиаминопимелатлиаза; 6 - диаминопимелинатдекарбоксилаза.
Данный способ нашел широкое практическое применение. Наиболее
активными
продуцентами лизина являются мутированные штаммы
Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum. Оптимальные условия
биосинтеза
лизина
культурами
этих
микроорганизмов
следующие:
температура 28-30оС; рН 7,0-7,5; интенсивная аэрация среды.
Альтернативным является ферментативный способ, предусматривающий
введение в среду культивирования Brevibacterium, предшественника лизина –
диаминопимелиновой кислоты, получаемой химическим синтезом. Метод не
нашел широкого применения вследствие дороговизны диаминопимелиновой
кислоты.
В. 3. Биохимические закономерности направленного синтеза
глутаминовой кислоты.
Поскольку метаболическим предшественником глутаминовой кислоты
является α-кетоглутаровая кислота, важным условием биосинтеза данной
аминокислоты является постоянное восполнение в клетках продуцентов
ресурсов промежуточных метаболитов цикла Кребса. В связи с этим, для
продуцентов глутаминовой кислоты характерны:
1 – функционирование глиоксилатного шунка или других альтернативных путей синтеза промежуточных продуктов ЦТК;
2 – высокая потребность в кислороде на реокисление восстановленных
форм НАД и ФАД;
3 – высокая активность фермента глутаматдегидрогеназы, катализирующего реакцию восстановительного аминирования α-кетоглутаровой
кислоты:
8
СООН
NH3
НАДФН
НАДФ
Н2О
СООН
С=О
СН – NH2
(СН2)2
(СН2)2
СООН
α-кетоглутаровая
СООН
кислота
также
может
вступать
в
реакцию
переаминирования с аминокислотами, катализируемую трансамидазами
(кофермент – пиродоксальфосфат).
Коэнзим НАД-фосфат, участвующий в реакции восстановительного
аминирования, также специфичен для фермента изоцитратдегидрогеназы,
катализирующего образование α-кетоглутаровой кислоты в ЦТК. Таким
образом, необходимый для синтеза глутаминовой кислоты кофермент
постоянно регенерируется в цикле Кребса:
Изоцитрат
α-кетоглутаровая
кислота + СО2
НАДФ
НАДФН
L-глутаминовая к-та
α-кетоглутаровая к-та + NH3
4- подавление активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, превращающей
α-кетоглутаровую кислоту в сукцинил-КоА.
5 – подавление активности НАДФ-зависимой оксидазной системы,
катализирующей окисление глутаминовой кислоты.
Важным условием сверхсинтеза глутаминовой кислоты является
обеспечение ее интенсивного выделения из клетки. Такие условия создаются
при лимите в среде биотина, добавлении в культуральную среду некоторых
антибиотиков.
При направленном синтезе глутаминовой кислоты продуцентами
Corynebacterium glutamicum максимальный
выход целевого продукта
достигается при следующих условиях: температура (28÷30)оС; рН –(7,0÷7,5);
интенсивная аэрация среды.
Перспективным методом получения L-глутаминовой кислоты является
биотрансформация α-кетоглутаровой кислоты. Для этих целей могут быть
использованы бактериальные культуры родов Pseudomonas и Escherichia.
9
В. 4. Механизмы направленного синтеза ароматических
аминокислот на примере триптофана.
Биосинтетическую активность в отношении ароматических аминокислот
проявляют бактерии родов Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus и
Escherichia. Их характеризует способность ассимилировать моносахара по
гексозомонофосфатному пути с образованием общего предшественника –
шикимовой кислоты.
Общая схема биосинтеза аминокислот.
СНО
СООН
СНОН
СО~ Р
СНОН
СН 2
СН2О Р
Эритрозо-4- Р
ФЕП
СООН
1
С=О
СН2
(СНОН)3
СН2О ~ Р
3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7- Р
COOH
COOH
OH
HO
OH
3
шикимовая кислота
HOOC
O=CH2
COOH
OH
хоризмовая кислота
CH 2-CO-COOH
2
COOH
4
5
OH
NH2
префеновая кислота
NH2
CH2-CH-COOH
Серин
NH2
CH2-CH-COOH
CH 2- CH-COOH
NH 2
OH
L-тирозин
NH
L-фенилаланин
L-триптофан
10
Ферменты: 1 - дезоксиарабиногептулозофосфатсинтаза; 2
- антранилатсинтаза; 3 - префенатсинтаза;
- префенатдегидрогеназа; 5 префенатдегидратаза
4
Исходя из схемы, обеспечение сверхсинтеза триптофана возможно при
следующих условиях:
- снятие репрессии синтеза фермента дезоксиарабиногептулозофосфатсинтаза (1) триптофаном и антраниловой кислотой;
-
повышение
устойчивости
фермента
антранилатсинтаза
(2)
к
ингибированию L- тирозином и L- фенилаланином;
- подавление активности ферментов пути биосинтеза L- тирозина и Lфенилаланина
(префенатсинтазы
(3),
префенатдегидрогеназы
(4),
префенатдегидратазы (5)).
Схема биосинтеза триптофана приведена ниже.
Оптимальные условия биосинтеза L-триптофана штаммами Bac.subtilis:
температура 37-380С; рН 7,0-7,2; интенсивная аэрация среды.
Разработан метод биотрансформации антраниловой кислоты в Lтриптофан ферментными системами клеток дрожжей Can.utilis. Процесс
осуществляется при температуре 28-300С; рН 7,5-8,0.
11
COOH
HO
O-C=CH 2
хоризмовая кислота
глутамин
COOH
антронилсинтетаза
глутаминовая к-та
ПВК
COOH
NH 2
антраниловая кислота
ФРПФ
пирофосфат
2-фосфотрансфераза
COOH
NH-CH-(CHOH) 2- CH-CH 2OP
N-фосфорибозил-1-антраниловая к-та
O
лактоназа
COOH
NH-CH=COH-(CHOH) 2-CH 2OP
дегидрогеназа
енол-карбоксифениламино-1дезонсирибулозофосфат
Н2О
СО2
(CHOH) 2CH 2OP
инол-3-глицерофосфат
NH
L-серин
3-ФГА
CH 2-CH-COOH
NH 2
NH
триптофан
Схема биосинтеза триптофана
12
В. 5. Ферментативное разделение оптических изомеров
аминокислот.
Перспективным методом получения L-аминокислот является разделение
рацематов аминокислот путем ассиметричного гидролиза их производных с
использованием
микроорганизмов,
обладающих
специфической
L-
ацилазной, L- амидазной, L- эстеразной активностью.
Ферментативное разделение рацематов аминокислот с L-ацилазами
основано на избирательном гидролизе ацилированных производных Lаминокислот. При отщеплении ацильной группы L-аминокислоты становятся
более
растворимыми
и
легко
отделяются
от
малорастворимых
ацилированных D-аминокислот.
Некоторые
протеолитические
ферменты,
например,
химотрипсин,
проявляют высокую L-эстеразную активность. Амидазы гидролизуют амиды
аминокислот
с
образованием
L-аминокислот.
Не
прореагировавшие
производные D-аминокислот могут быть подвергнуты рацемизации и вновь
использованы для ферментативного разделения.
При культивировании микроорганизмов с ацилазной, амидазной и
эстеразной
необходимо
активностью
вводить
в
для
повышения
среду
выхода целевого
культивирования
продукта
индукторы
синтеза
соответствующих ферментов. Индукторами в ряде случаев являются
вещества, близкие по природе к субстрату действия ферментов. Например,
для ацилазы лизина – ε-ацетил-L-лизин.
У многих микроорганизмов, прежде всего грибных и дрожжевых
культур, ацилазы являются внутриклеточными ферментами. Поэтому для их
использования
дезинтеграции.
клетки
необходимо
предварительно
подвергать
Скачать