УДК 663.12 ББК 36.87 Министерство образования и науки РФ

УДК 663.12
ББК 36.87
Министерство образования и науки РФ
ФГБУ СЕВЕРО-КАВКАЗСКИЙ ГОРНОМЕТАЛЛУРГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
(ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ)
«БИОТЕХНОЛОГИЯ ДРОЖЖЕЙ
И ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ»
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ
ПОСОБИЕ
для студентов направления подготовки 260100.62
«Продукты питания из растительного сырья»
Разработал:
д.т.н., проф. Бирагова Н. Ф.
асс. Чкареули Л. В.
Владикавказ 2014
Аннотация
В данном учебно-методическом
пособии изложены методы
оптической микроскопии, приёмы фиксации и окраски препаратов клеток,
методы приготовления и стерилизации сред, современные способы их
культивирования, методы выделения и подсчёта микроорганизмов , правила
работы с чистыми культурами микроорганизмов. Ряд разделов содержит
материал по методам выделения и изучения микроорганизмов в спиртовом
производстве,
морфо-физиологической
характеристике
дрожжей,
размножению и основам генетики микроорганизмов. Учебное пособие
содержит материалы для проведения лабораторных работ, предусмотренных
в курсе биотехнологии дрожжей и генетике микроорганизмов. Помогает
приобрести навыки микробиологической работы и знакомит с основными
понятиями изучения микроорганизмов.
ОГЛАВЛЕНИЕ
I. РАЗДЕЛ: «Общие методы экспериментальной микробиологии.
1.1.
Микробиологическая лаборатория, оборудование и правила
работы в ней.
1.2.
Проверка работы с культурами микроорганизмов.
1.3.
Методы стерилизации.
1.4.
Культивирование микроорганизмов.
1.5.
Влияние физико-химических факторов.
1.6.
Микроскопия.
1.7.
Морфология и цитология микроорганизмов.
II. РАЗДЕЛ: «Методы выделения и изучения микроорганизмов в
спиртовом производстве.
2.1. Морфолого-физиологическая характеристика дрожжей.
2.2. Дрожжи.
III РАЗДЕЛ: «Размножение»
3.1 Вегетативное размножение (Митоз)
3.2. Половое размножение (Мейоз и спорообразование)
IV. РАЗДЕЛ: «Основы генетики»
4.1. Предмет генетики.
4.2. Закономерности наследования признаков.
4.3. Законы Менделя.
4.4. Формы изменчивости.
IV РАЗДЕЛ. Лабораторные работы.
I РАЗДЕЛ. ОБЩИЕ МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ
МИКРОБИОЛОГИИ.
1.1. Микробиологическая лаборатория, оборудование и правила
работы в ней.
Микробиологи в своей практике используют, в основном, чистые
культуры, представляющие собой потомство одной клетки микроорганизмов,
поэтому в работе должны соблюдаться определенные правила, а к
лаборатории предъявляются специфические требования - чистота и создание
стерильных
условий.
Лабораторию
и
рабочие
места
периодически
подвергают специальной обработке с целью уничтожения микроорганизмов в
воздухе, на мебели, оборудовании, приборах.
Микробиологическая лаборатория, как правило, размещается в
специально оборудованном помещении с изолированным входом. Комнаты
должны быть просторные и светлые с естественным освещением не менее
110 лк. Стены в лаборатории должны быть гладкими, нижнюю часть их на
высоту 170 см окрашивают светлой масляной или эмалевой краской,
верхнюю часть и потолок белят известью или известковой краской,
впитывающей влагу. Полы покрывают линолеумом, пластиком или какимлибо другим легко моющимся материалом, мебель окрашивают в светлые
тона.
Основные помещения оборудуют столами лабораторного типа,
шкафами и полками для хранения аппаратуры, посуды, реактивов. Столы
должны иметь подводку электроэнергии и снабжены газовыми горелками,
лампами дневного света. В лаборатории необходимо иметь водопровод и
слив.
Стол для микроскопирования располагают перед окнами на северной
стороне. В солнечные дни окна в помещении завешивают белыми шторами
для защиты от прямых солнечных лучей, от действия которых может выйти
из строя микроскоп в связи с размягчением клея (канадского бальзама из
пихтовой смолы), связывающего линзы в оптических системах, а также для
защиты глаз от утомления при микроскопировании. Стол должен быть
устойчивым, поэтому его лучше укреплять на кронштейнах. От окна
микроскоп должен быть расположен на расстоянии около 1 м.
Кроме основного рабочего помещения лаборатория имеет бокс,
стерилизационную, где размещены автоклавы и сушильные шкафы,
термостаты
или
термостатированные
комнаты
для
выращивания
микроорганизмов, помещение для хранения культур, моечную, холодильную
комнату и т.д.
Бокс представляет собой небольшую изолированную комнату,
разделенную на две части перегородкой, и служит для работы с чистыми
культурами микроорганизмов. Вход в основное рабочее помещение бокса
осуществляется через тамбур с раздвижной дверью, что исключает резкое
перемещение воздуха, и, следовательно, занесение извне посторонней
микрофлоры. Оборудование бокса состоит из стола с легко моющейся
поверхностью, стула, газовой горелки и бактерицидной лампы, укрепленной
в специальном штативе или смонтированной на потолке бокса. Удобно иметь
подсобный стол, на котором размещают необходимые во время работы
предметы. Все оборудование бокса, его стены, пол и потолок периодически
моют и протирают дезинфицирующими растворами; перед работой бокс
облучают в течение 40-60 мин ультрафиолетовыми лучами. Бокс может быть
устроен и в основном рабочем помещении, но обязательно отделенным от
остальной комнаты застекленными стенками и застекленным потолком.
При отсутствии бокса-комнаты широко используют настольные боксы
разных конструкций; например, стеклянные настольные шкафы, рамы и дно
которых сделаны из отполированного дерева. В среднем размеры шкафа
составляют: ширина 62, высота 54 и глубина 50 см. Передняя стенка шкафа
поднимается в пазах и может устанавливаться на разной высоте. Перед
работой шкаф стерилизуют разбавленным водой этиловым спиртом с
объемной долей этилового спирта 70-75%. Во время работы шкаф открывают
настолько, чтобы руки работающего могли свободно двигаться.
В настоящее время используют герметически закрытые камеры,
работа в которых осуществляется под отрицательным воздушным давлением
с помощью прикрепленных к передней панели резиновых перчаток. В
некоторых боксах («Ламинарах») чистота атмосферы рабочего пространства
обеспечивается циркуляцией стерильного воздушного потока внутри камеры.
В лабораторных помещениях следует регулярно проводить гигиеническую уборку, чем обеспечивается значительное снижение количества
микроорганизмов в воздухе и на различных поверхностях. Для этого
применяют различные способы дезинфекции (обеззараживания). Иногда
процесс дезинфекции оказывает стерилизующее действие.
Пол, стены и мебель в микробиологической лаборатории обрабатывают пылесосом и протирают растворами различных дезинфицирующих
веществ. Обработка пылесосом обеспечивает освобождение предметов от
пыли и удаление с них значительного количества микроорганизмов. При
многократном - (до 12 раз) проведении щеткой по поверхности предмета
удаляется до 97% микроорганизмов. В качестве дезинфицирующих
растворов чаще всего пользуются 2-3 %-ным раствором соды (бикарбоната
натрия),
3-5 %-ным раствором фенола (карболовой кислоты) или лизола
(препарат фенола с добавлением зеленого мыла), 0,5-3 %-ным водным
раствором хлорамина и другими дезинфицирующими веществами.
Воздух в лаборатории наиболее просто дезинфицировать проветриванием. Длительная вентиляция помещения через форточку (не менее 3060 мин) приводит к резкому снижению количества микроорганизмов в
воздухе, особенно при значительной разнице в температуре между наружным
воздухом и воздухом помещения.
Облучение ультрафиолетовыми лучами с длиной волны от 200 до 400
нм является наиболее эффективным способом дезинфекции воздуха. При
таком способе погибают не только вегетативные клетки, но и споры
микроорганизмов. В зависимости от степени загрязненности воздуха
облучение ведут от 30 мин. до нескольких часов. Связано это с тем, что
ультрафиолетовые лучи обладают слабой проникающей способностью: они
не проходят через обычное стекло, легко поглощаются частицами пыли, а
белая бумага, пластины из полированного алюминия или хрома заметно
отражают
их.
используются
В
качестве
бактерицидные
источника
лампы.
ультрафиолетового
Следует
иметь
в
излучения
виду,
что
ультрафиолетовые лучи могут вызвать тяжелые поражения глаз, поэтому
рекомендуется применять защитные очки. В небольших помещениях при
включенной бактерицидной лампе находиться нельзя. При длительной
работе бактерицидной лампы интенсивность излучения понижается. В этих
случаях облучение целесообразно вести с перерывами.
Рабочее место, где непосредственно проводится работа с культурами
микроорганизмов, требует тщательной обработки. Удобным для работы
является стол с открытой гладкой поверхностью, в нижней части которого
имеется шкаф и несколько выдвижных ящиков. Для протирания поверхности
стола можно использовать растворы лизола, хлорамина, а также 70%-ный
раствор (объемная доля) этилового или: изопропилового спиртов. При
водоотталкивающем покрытии стола удобно использовать лизол. Названные
спирты используют также для дезинфекции рук. При дезинфекции стола
ультрафиолетовыми лучами следует учитывать, что бактерицидное действие
лучей тем выше, чем ближе к источнику излучения облучаемая поверхность.
Рабочий стол следует дезинфицировать как перед началом работы, так и по
окончании ее.
На столе перед началом работы должны находиться только необходимые предметы: газовая горелка или спиртовка, штативы для пробирок,
банка с чистыми предметными стеклами и отдельно с покровными, подставки для препаратов, подставка для микробиологической петли, полоски
фильтровальной бумаги размером 0,5 х 3,0 см для подсушивания препарата, в
капельнице вода и в специальной подставке красители, для отработанных
пипеток и препаратов стеклянный или пластмассовый цилиндр и банка с
крышкой с дезинфицирующим раствором и резиновыми подкладками на дне;
стеклянная или пластмассовая емкость для обгоревших спичек и тампонов.
После работы на столах ничего лишнего не должно оставаться.
В шкафах лаборатории должен храниться определенный запас чисто
вымытой и стерильной посуды.
Для мусора в помещении должно быть ведро с крышкой или контейнер с педалью.
В лаборатории не разрешается курить, хранить и употреблять еду,
напитки, жевательную резинку. Работать следует в белых халатах.
Посуда, специальные приборы, инструменты
Для проведения работ по культивированию микроорганизмов,
приготовлению питательных сред и для других целей пользуются посудой,
которая должна удовлетворять определенным требованиям и в первую
очередь - не должна содержать посторонних веществ. Она должна быть
тщательно вымыта и не должна выделять в среду никаких веществ, например
щелочей, окислов железа, кислот и др.; лучше всего пользоваться
стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой.
Используют посуду из стекла, выдерживающего нагревание при
высокой температуре; для изучения свойств микроорганизмов применяют
стеклянные приборы, стекла для микроскопирования; для извлечения
микроорганизмов и пересевов - иглы и петли.
Подготовка посуды
Мойка стеклянной посуды. Новую стеклянную посуду (пробирки,
чашки Петри и др.), не бывшую в употреблении заливают на ночь 1-2%-ным
раствором соляной или серной кислоты, так как при нагревании новое стекло
выделяет много щелочи и может изменить реакцию питательной среды.
Затем многократно промывают водой, ополаскивают дистиллированной
водой и высушивают. Иногда для работы с микроэлементами, витаминами,
синтетическими и другими средами, требуется особо тщательная очистка
посуды. Натуральные среды можно готовить в эмалированной посуде.
Посуду с отработанными культурами микроорганизмов следует
автоклавировать, чтобы убить клетки и после этого мыть. Культуры на
плотных питательных средах можно заливать на одни сутки дезинфицирующими растворами, после чего среду выбрасывают и посуду моют.
Неаккуратное обращение с культурами микроорганизмов приводит к
возникновению бактериального аэрозоля.
Моют посуду в теплой проточной воде ершами с использованием
кальцинированной
соды,
полужидкого
мыла,
мыльного
раствора
и
синтетических моющих средств, после чего тщательно ополаскивают
водопроводной, а затем дистиллированной водой. Сильно загрязненную
посуду со следами жира обрабатывают хромовой смесью.
Пипетки и другие градуированные приборы должны быть совершенно
чистыми и хорошо обезжиренными. Моют градуированные приборы в
теплом растворе стирального порошка или в мыльной воде в сосудах, где они
могут быть полностью погружены в раствор, ополаскивают теплой
проточной водой, а затем дистиллированной.
При ополаскивании чисто вымытой посуды вода стекает, оставляя на
поверхности стекла ровную водяную пленку. Отдельные капельки воды на
стенках посуды свидетельствуют о том, что она плохо обезжирена. Чисто
вымытую и высушенную посуду закрывают ватными пробками и хранят в
местах, надежно защищенных от пыли, лучше всего в плотно закрываемом
шкафу.
Средства для мытья посуды.
Хромовые смеси. 1. В концентрированную серную кислоту добавляют
около 5% (от объема серной кислоты) размельченного в порошок
кристаллического
двухромовокислого
калия
(К2Сr2О7)
и
осторожно
нагревают в фарфоровой чашке на водяной бане до его растворения.
2. Двухромовокислый калий растворяют в воде, затем в раствор
осторожно добавляют серную кислоту. Смесь готовят из расчета: вода - 100
см3; двухромовокислый калий - 6 г; серная кислота (плотность 1,84)-100 см3.
После многократного употребления темно-оранжевый цвет хромовой
смеси меняется на темно-зеленый. Такая смесь не обладает моющими
свойствами. Хромовой смесью не следует мыть посуду, загрязненную
парафином, керосином, минеральными маслами и другими продуктами
перегонки нефти.
Хромовая смесь интенсивно разрушает ткани животного и растительного происхождения, поэтому работать с ней следует осторожно. Если
она попала на руки или одежду, то пораженное место немедленно обмывают
большим количеством воды, затем разбавленным раствором аммиака или
соды, а затем снова водой.
Спиртовый раствор КОН - также хорошее моющее средство. Его
готовят растворением 40-50 г КОН в 500 см3 воды. После остывания раствора
к нему добавляют спирт в таком количестве, чтобы общий объем составил I
дм3. Для приготовления моющего раствора можно применять спирт-сырец с
объемной долей этилового спирта до 60%.
Посуда, аппараты и вспомогательные предметы
Посуда. В микробиологической практике чаще всего пользуются
пробирками, чашками Петри и колбами разного вида
В микробиологической практике чаще всего пользуются пробирками
и чашками Петри.
Пробирки должны быть без ранта, из прозрачного стекла, размером
18x2,0 см и 18x1,5 см. Чтобы предохранить содержимое пробирок от
попадания из воздуха микробов и культуры от высыхания их закрывают
ватными пробками.
Чашки Петри. Чашка Петри состоит из двух чашек разного диаметра.
В чашку с меньшим диаметром помещают питательную среду, чашка
большего диаметра служит крышкой. Диаметр чашек Петри 8-10-15 см,
высота 1,5-2,0 см.
Стеклянный шпатель Дригальского используют для растирания по
поверхности плотной питательной среды в чашках Петри культуры
микроорганизмов при наращивании биомассы.
Колбы Виноградского - это укороченные конические колбы с широким дном; матрацы - плоские флаконы.
Химическую посуду также используют при выполнении микробиологических работ: конические и круглые плоскодонные колбы объемом 50,
100,250 см3 и 1,2,3,5 дм3; бюретки, цилиндры, химические стаканы, воронки
различных систем, склянки. Вся посуда, служащая для питательных сред и
чистых
культур
микроорганизмов,
закрывается
ватными
пробками
(Изготовление ватных пробок в главе 3).
Пипетки используются как градуированные, так и не градуированные
емкостью 1-5 и 10 см3 длиной около 28 см и пастеровские пипетки с
оттянутым капилляром.
Трубки помещают в специальные деревянные или металлические
штативы. Перед посевом закрытое колено надо заполнить средой; если после
стерилизации останется пузырек воздуха, его удаляют, наклоняя трубку.
Вспомогательные предметы.
Для пересева (посева, инокуляции) культуры с одной среды на
другую или для приготовления препарата микроорганизмов, выращенных на
поверхности плотной или в жидкой среде, пользуются бактериологической
петлей или иглой и шпателем Дригальского. Делают их, используя тонкую
(0,4-0,5 мм) проволоку из вольфрама или нихрома. Проволоку длиной 7-8 см
закрепляют в металлическом или стеклянном держателе или впаивают в
стеклянную палочку. Конец проволоки загибают на конце пипетки или
заточенного карандаша в виде петельки (кольца) диаметром 2-4 мм, концы
которой не должны расходиться, иначе жидкость не будет удерживаться.
Ввиду легкости стерилизации такая петля или игла является универсальным инструментом при выполнении различных микробиологических
работ. При работе с мицелиальными грибами используют крючок. Для
посевов на чашках Петри используют стерильный шпатель Дригальского.
1.2. Правила работы с культурами микроорганизмов.
В микробиологической практике постоянно встречается необходимость перенести микроорганизмы из одного сосуда с чистой культурой в
какой-либо
другой
сосуд
со
стерильной
средой,
в
разного
рода
экспериментальные сосуды, то есть произвести посев или пересев. Чтобы
сохранить культуру в живом виде, необходимо ее время от времени
пересевать на свежий субстрат. Необходимо это делать так, чтобы избежать
загрязнения культуры посторонними микроорганизмами. Для этого все
операции пересева производят с помощью бактериологической петли (иглы)
и газовой или спиртовой горелки.
Все операции проводят непосредственно около зажженной горелки
или спиртовки, в пламени которой стерилизуют петли, пинцеты, ватные
пробки, края пробирок; перед посевом следует четко на пробирке (колбе,
чашке Петри) написать название микроорганизма или его шифр и дату
посева. Надпись делают чернилами по стеклу или на наклеенной этикетке.
Прежде, чем петля будет введена в пробирку (колбу, чашку Петри) с
культурой, ее необходимо простерилизовать в пламени горелки, прокаливая
докрасна проволоку и обжигая примыкающую к ней часть держателя,
вводимую внутрь пробирки. При прокаливании петлю следует держать в
пламени горелки почти вертикально, чтобы проволока была раскалена
равномерно на всем протяжении. При прокаливании следует помнить, что
самая высокая температура развивается в верхней и периферической частях
пламени.
Сразу после стерилизации петлю (иглу) вводят в сосуд с микроорганизмами. Прикосновение к культуре слишком горячей петли может
повредить
клетки.
Поэтому
петлю
предварительно
охлаждают,
прикоснувшись ею к внутренней поверхности пробирки или к питательной
среде, свободной от клеток микроорганизмов, и только после этого
захватывают небольшое количество микробной массы.
Техника отбора клеток микроорганизмов
Культуры микроорганизмов, выращенных на плотной или в жидкой
среде, для приготовления препаратов или посева в свежую среду, берут
бактериологической петлей (или иглой).
Пробирку с культурой держат в левой руке так, чтобы поверхность
питательной среды была обращена кверху и хорошо видна. Пробирку держат
за конец большим и указательным пальцами в несколько наклонном
положении. В правую руку берут петлю и держат ее как карандаш,
прокаливают в пламени горелки. Затем не выпуская петли, мизинцем и
безымянным пальцем правой руки вынимают ватную пробку из пробирки и
держат так во время последующих манипуляций. Края открытой пробирки
слегка обжигают в пламени горелки, вводят в пробирку стерильную петлю и,
отобрав немного микробной массы, вынимают петлю, следя за тем, чтобы
переносимый материал не касался стенок или краев пробирки.
Горлышко пробирки снова обжигают, слегка обжигают внутренний
конец ватной пробки, закрывают пробирку и ставят в штатив, а извлеченный
материал используют для приготовления препарата или для посева культуры
в свежую среду.
Если конец ватной пробки загорится, то не следует ее бросать. Ее
нужно ввести в пробирку, где вата сама потухнет. Ни в коем случае нельзя
дуть на загоревшуюся пробку, так как это усилит горение. Если в момент
пересева ватная пробка упадет на стол или на пол, то не следует снова
вставлять ее в пробирку. Нужно взять новую стерильную пробку и начать
всю операцию заново.
Клетки микроорганизмов, оставшиеся на петле после приготовления
препарата, сжигают в пламени горелки. В этом случае прокаливание петли
начинают с участка проволоки, примыкающего к кольцу, чтобы клетки,
оставшиеся на петле, подсохли, так как при быстром нагревании влажной
микробной массы происходит ее разбрызгивание и образуется аэрозоль,
загрязняющий воздух. Затем петлю переводят в вертикальное положение,
прокаливают докрасна и ставят на место.
Клетки микроорганизмов, выросшие в жидкой среде, часто отбирают
стерильной пипеткой. Для этого пипетку за верхний конец вынимают из
бумаги или пенала, в которых ее стерилизовали, и вводят в пробирку с
культурой, соблюдая все правила предосторожности.
Отбирать жидкую культуру пипеткой можно с помощью резиновой
груши. Отобрав часть среды, закрывают сосуд пробкой и используют взятую
пробу для приготовления препарата или посева в свежую питательную среду.
Для отбора точного объема жидкости используют градуированные пипетки.
Использованную пипетку следует немедленно перенести в цилиндр с
дезинфицирующим раствором, например 3-5%-ный водный раствор фенола
или 2%-ный раствор хлорамина, не касаясь ею окружающих предметов.
При пользовании пастеровской пипеткой надо надломить обожженным в пламени пинцетом запаянный ее конец и слегка обжечь всю
пипетку. Затем взять пробирку с культурой в левую руку, а пипетку
захватить большим и средним пальцами правой руки, зажав ее верхнее
отверстие указательным пальцем, вынуть пробку из пробирки, обжечь края,
ввести пипетку, взять культуру, а пробирку закрыть как обычно, обжигая ее
края и только после этого использовать взятый материал по назначению - для
приготовления препарата или для посева. Пипетку после употребления
следует также погрузить в стакан с дезинфицирующим раствором.
Техника посева и пересева культур.
Посевом в микробиологической практике называют внесение в
стерильную питательную среду какого-либо исследуемого материала для
обнаружения микроорганизмов.
Пересев - это перенос выращенных микроорганизмов в свежую
стерильную питательную среду. Посевы и пересевы культур являются одним
из наиболее распространенных приемов в микробиологической практике.
Пересевы производят так, чтобы в питательную среду не попали из
воздуха
или
с
поверхности
окружающих
предметов
посторонние
микроорганизмы. Для этого существуют разные приемы поддержки
пробирок в левой руке: на ладони или между пальцами - большим и
указательным.
Посевы производят непосредственно около зажженной горелки, в
пламени которой стерилизуют петли, пинцеты, ватные пробки, края
пробирок.
Последовательность операций при посеве следующая:
- в левую руку берут две пробирки - одну со стерильной жидкой или
плотной питательной средой (ближе к себе), другую с пересеваемой
культурой (дальше от себя) и держат на ладони, несколько наклонно,
прижимая концы пробирок большим пальцем к указательному и среднему.
Располагают пробирки так, чтобы хорошо была видна поверхность культуры
с жидкой средой, предварительно взболтанной или поверхность плотной
питательной среды с выросшими на ней микроорганизмами;
- правой рукой, поочередно, у пламени горелки вынимают ватные
пробки, сначала из пробирки пересеваемой культуры и держат мизинцем и
ладонью правой руки, затем - из пробирки со стерильной средой, и пробку
держат между безымянным и средним пальцами. Края пробирок обжигают на
пламени. Класть пробирки на стол или на какой-нибудь предмет не
рекомендуется;
- в правую руку берут петлю, прокаливают ее и через пламя вводят в
пробирку с пересеваемой культурой; осторожно, охладив петлю о стенку
пробирки или питательную среду, захватывают каплю с жидкой среды или
небольшое количество культуры с плотной, стараясь не задеть стенок
переносят в стерильную жидкую среду, погружая в нее кольцо петли или
вводят петлю до начала скоса плотной питательной среды и делают по
поверхности среды штрих: зигзагообразную или прямую линию;
- петлю вынимают, обжигают и кладут на место; края пробирок
обжигают и поочередно закрывают пробками у огня, сначала со свежей
средой, затем - с пересеваемой.
Помимо посева на поверхности плотной питательной среды производят посевы уколом, для чего используют не петлю, а иглу. Посев иглой
проводят в такой же последовательности, как и посев петлей, с той разницей,
что
в
толщу плотной
среды
делают
укол.
Среды
должны
быть
свежеприготовленными, так как на пересохших плотных средах образуется
при уколе след или трещины. При посеве уколом пробирку со средой держат
дном
кверху
для
предохранения
от
заражения
посторонними
микроорганизмами из воздуха, а укол делают по оси пробирки, на
одинаковом расстоянии от краев, и доводят иглу почти до дна пробирки
Посев микроорганизмов из жидкой питательной среды на поверхность
стерильной плотной среды в чашке Петри проводят следующим образом.
Приоткрывают крышку чашки Петри и на поверхность плотной среды
наносят каплю или «петлю» жидкой культуры, которую осторожно
распределяют петлей или стеклянным стерильным шпателем Дригальского.
Основные требования к условиям проведения посевов культур.
Все описанные приемы посевов следует проводить около пламени
горелки, но не в пламени, по возможности быстро, чтобы не загрязнить
культуру посторонними микроорганизмами. Не рекомендуется делать резкие
движения и ходить около лица, работающего с чистой культурой, так как
движение воздуха увеличивает вероятность случайного загрязнения.
Посеянные культуры помещают в термостаты или термостатные
комнаты, в которых с помощью терморегуляторов поддерживается постоянная температура.
1.3. Методы стерилизации.
Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов
в микробиологической практике. Стерилизация или обеспложивание - это
прием, обеспечивающий полное уничтожение в питательной среде или
каком-либо другом материале или предмете микроорганизмов и их спор. В
микробиологической лаборатории стерилизуют питательные среды, посуду,
различные инструменты и другие необходимые предметы, с целью
недопущения развития посторонней микрофлоры в исследуемых культурах.
К числу обычно применяемых методов стерилизации относятся.
1. Нагревание:
- влажное:
автоклавирование,
дробная
стерилизация
(тиндализация), пастеризация:
- сухое: стерилизация в печи с помощью горячего воздуха;
- прокаливание в пламени (метод фламбирования).
2. Фильтрование.
3. Стерилизация с помощью различных химических веществ.
4. Облучение ультрафиолетовыми лучами и другими видами
излучений.
Целесообразность и возможность применения того или иного способа
определяется
особенностями
стерилизуемого
материала,
его
физико-
химическими свойствами, а также и целью исследования.
1.4. Культивирование микроорганизмов.
Одним из основных методов изучения в практической микробиологии
является культивирование (выращивание) микроорганизмов. От умения
культивировать микроорганизмы в лабораторных условиях в значительной
степени зависят успехи их изучения и практического применения.
Культивирование микроорганизмов основано на знании физиологии
их
роста
в
питательных
средах,
биохимических
особенностей
микроорганизмов и понимании значения факторов и физико-химических
условий среды, необходимых для их роста и жизнедеятельности. Огромное
значение в микробиологии для культивирования и изучения многогранных
особенностей обмена веществ отдельных представителей микроорганизмов
имеют
известные
методы:
метод
изолирования
микроорганизмов
в
индивидуальных «чистых культурах» (разработан Р. Кохом) и методы
получения
накопительных
культур
микроорганизмов,
обладающих
индивидуальными физиологическими и химическими особенностями обмена
веществ, путем применения элективных условий культивирования, то есть
таких
условий,
которые
благоприятны
для
одних
(или
одного
микроорганизма) и неблагоприятны для большинства других (разработан
С.Н. Виноградским и В.Л. Омелянским).
Для изучения специфических свойств отдельных микроорганизмов
более пригодны синтетические среды, начальный химический состав
которых
в
качественном
и
количественном
отношении
известен
экспериментатору. Это дает возможность исследователям контролировать
изменение среды по ходу развития микроорганизмов, что совершенно
необходимо для правильного понимания изучаемого процесса.
Применение натуральных сложных, не определенных по составу и
нестандартных сред (МПБ - мясопептонный бульон, МПА мясопептонный
агар, солодовое сусло, молоко, молочная сыворотка, дрожжевая вода и
автолизат дрожжей, овощные и плодовоягодные соки, ломтики самих плодов
и овощей), оправдано в тех случаях, когда исследование касается общей
зараженности того или другого материала микроорганизмами или общего
подсчета их, или установления особенности химической активности
некоторых из них.
Для
роста
микроорганизмов,
накопления,
выделения,
культи-
вирования и сохранения культур необходимы питательные среды.
При приготовлении питательных сред следует учитывать требования
микроорганизмов в отношении веществ, необходимых как для поддержания
их жизнедеятельности, так и удовлетворения их потребности в исходных
материалах для биосинтеза и получения энергии, то есть возможности
осуществлять обмен веществ между клеткой и средой в определенных
условиях.
Потребность микроорганизмов в питательных веществах и
факторах роста.
Питательные вещества - это соединения в которых нуждается
микроорганизм и которые он усваивает из окружающей среды, чтобы
удовлетворить свои потребности в исходных материалах. Конструктивные и
энергетические процессы у микроорганизмов очень разнообразны, поэтому
также разнообразны их потребности в питательных веществах.
Основными компонентами среды для культивирования микроорганизмов являются соединения углерода и азота.
Источники углерода. По потребности в углероде микроорганизмы
принято делить на две большие группы - автотрофы и гетеротрофы.
Автотрофные микроорганизмы способны в качестве единственного
источника углерода использовать углекислоту воздуха или карбонаты.
Поэтому в среды для их культивирования вносят бикарбонат натрия
(NaHCO3) или карбонаты, чаще углекислый кальций (СаСО3).
Гетеротрофные микроорганизмы для своего развития в питательных
средах наряду с углекислотой нуждаются в органических добавках
соединений углерода. В зависимости от индивидуальных особенностей
микроорганизмы-гетеротрофы способны использовать различные соединения
углерода -углеводы, спирты, кислоты, углеводороды, ароматические
соединения.
Источники азота. Вторым основным компонентом питательных сред
является источник азота. Для многих микроорганизмов потребности в
источниках азота могут быть удовлетворены различными органическими
азотсодержащими соединениями и минеральными солями (соли азотной
кислоты и аммонийные). Часть из них используют белки и пептоны,
подвергая их предварительному протеолизу и дезаминированию, часть усваивает
нитраты,
многие
-
аммиак,
поэтому
в
среды
вносят
физиологически кислые аммонийные соли NH4C1 или (NH4),SO4, однако
надо помнить, что по мере использования азота кислотность среды заметно
возрастает, что отрицательно влияет на развитие микроорганизмов.
Потребности некоторых микроорганизмов в азоте могут быть удовлетворены
нитратами (KNO, или NaNO3). Это физиологически щелочные соли и
накапливаясь в среде при культивировании нитриты в кислых условиях
токсичны.
Потребности микроорганизмов в некоторых аминокислотах часто, при
составлении сред, удовлетворяют добавлением к среде гидролизатов белка,
используя белки животного или растительного происхождения, а также
клетки микроорганизмов (дрожжи, водоросли, бактерии). Гидролиз проводят
с помощью протеолитических ферментов или кипячением с минеральными
кислотами, либо с крепкими щелочами. Чаще используют гидролизат
казеина.
Некоторые микроорганизмы, в основном патогенные, для своего
развития нуждаются в белках или продуктах их неполного расщепления пептонах,
представляющих
собой
смесь
поли-
и
олигопептидов,
аминокислот, органических азотных оснований, солей и микроэлементов. В
лабораториях
чаще
всего
используют
ферментативный
пептон,
выпускаемый Семипалатинским заводом. Это гигроскопический порошок
светло-желтого цвета; 1%-ный раствор пептона имеет нейтральную или
слабокислую реакцию, добавляют его от 1 -2 до 20 г на 1 л.
Необходимо иметь в виду, что аминокислоты и пептон микроорганизмы могут использовать не только как источник азота, но и как
источник углерода и энергии.
Источники фосфора. Вносится в среду фосфор в виде солей
фосфорной кислоты, реже - в виде органических соединений (например,
фитина),
или
с
различными
естественными
субстратами
(отварами
растительных тканей, мукой, кукурузным экстрактом). Фосфор является
важным элементом питательной среды, он входит в состав АТФ, АМФ, АДФ
и других соединений, обеспечивающих энергетический обмен в клетке, а
также осуществление главнейших биосинтетических процессов - синтез
белков,
нуклеиновых
кислот,
гликолиз
и
другие
биохимические
превращения.
Факторы роста. К факторам роста относятся витамины, пурины,
пиримидины, аминокислоты. Для некоторых микроорганизмов они являются
необходимым элементом в питательной среде. Многие микроорганизмы
утратили (или никогда не имели) способность синтезировать достаточное
количество этих органических соединений, необходимых для построения
нового клеточного материала. Поэтому для того, чтобы обеспечить рост
микроорганизма, такие соединения необходимо вносить в среду, в связи с
чем
они
и
получили
название
факторов
роста.
Микроорганизмы,
нуждающиеся в каком-то определенном факторе роста, называются
ауксотрофными по этому соединению в отличие от прототрофных
микроорганизмов, которые в данном соединении не нуждаются.
Тот факт, что микроорганизм нуждается в каком-либо факторе роста,
обычно определяется его способностью расти на сложных естественных
средах и отсутствием способности к росту на синтетических средах простого
состава. Некоторые ауксотрофы совершенно неспособны синтезировать то
или иное соединение, которое, таким образом, становится незаменимым
фактором роста. Другие способны синтезировать некоторые из соединений,
но
в
количествах,
потребностей
недостаточных
клетки:
в
таком
для
обеспечения
случае
соединение
метаболических
действует
как
стимулирующий фактор.
Следует обратить внимание на то, что концентрации витаминов,
необходимых для максимального роста микроорганизмов, различны, но в
общем довольно низки и составляют обычно 1-50 мкг/мл. Рибофлавин
требуется в сравнительно больших количествах, в то время как на другом
конце шкалы находится биотин, необходимое содержание которого в среде
чрезвычайно мало (около 0,2 мкг/мл). При составлении питательных сред для
микроорганизмов в соответствии с их потребностями в витаминах и других
факторах роста, готовят растворы и добавляют их к стерильной среде
непосредственно перед ее засевом.
Часто вместо чистых растворов витаминов и других факторов роста,
используют дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, а также кукурузный
экстракт. Дрожжевой экстракт (имеется в продаже) вносят в питательную
среду от 0,05 до 0,5 г на 100 мл; дрожжевой автолизат - из расчета
концентраций аминного азота в среде 5-30 мг на 100 мл среды
(приготовление дрожжевого автолизата в главе 14). Кукурузный экстракт -
готовый продукт крахмалопаточной промышленности - вносят в среды от 0,2
до 5%. В его состав входят аминокислоты, витамины, большое количество
органических кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и минеральные соли.
Минеральные источники. Для нормального роста микроорганизмов
необходимы, хотя и в небольших количествах, элементы минерального
питания.
Концентрации
элементов,
необходимые
для
обеспечения
максимального роста микроорганизмов различны. Некоторые элементы,
например Mg2+, чаще всего нужны организму в сравнительно небольших
количествах (около 103—10 4 М), и они называются макроэлементами. Эти
элементы обычно включают в состав синтетических сред. Другие элементы
относятся к микроэлементам, поскольку их концентрации, необходимые для
развития микроорганизмов, гораздо ниже (около 106-108 М). Даже в синтетические среды, содержащие самые чистые реактивы, микроэлементы
приходится вносить редко, ибо они всегда присутствуют в качестве примесей
к компонентам среды.
Функцией минеральных элементов в метаболизме микроорганизмов
является в основном активация различных ферментов. Все они должны
содержаться в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме.
Потребность разных групп микроорганизмов в сере, фосфоре и других
зольных элементах удовлетворяется обычно I за счет минеральных солей.
Источники энергии. Следует учитывать, что питательные среды для
культивирования микробов кроме соединений, необходимых для процессов
биосинтеза, должны включать и энергетический материал. По способу
получения энергии микроорганизмы делят на две основные группы:
хемотрофы и фототрофы.
Хемотрофы используют энергию окисления различных соединений
(хемотрофы - окисляют неорганические соединения, хемоорганотрофы органические вещества).
Для
хемоорганотрофов
энергетическим
субстратом
служат
органические вещества, которые одновременно являются и источником
углерода и источником энергии. Однако есть микроорганизмы, которые для
конструктивных
и
энергетических
процессов
нуждаются
в
разных
соединениях. Так, гомоферментативные молочнокислые бактерии получают
энергию при сбраживании Сахаров, но почти не используют их в процессе
биосинтеза.
Для
конструктивных
целей
им
необходимы
готовые
аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины.
Фототрофы используют энергию света, их культивируют при
естественном или искусственном освещении.
Питательные среды.
По составу среды для культивирования микроорганизмов делят на
две группы: естественные или натуральные и синтетические. Натуральные
среды. Натуральными называются среды, в состав которых входят продукты
животного или растительного происхождения. К таким средам относятся:
МПБ - мясопептонный бульон, МПА — мясопептонный агар, солодовое
сусло, овощные или фруктовые соки, животные ткани, разведенная кровь,
молоко и молочная сыворотка, воды морей, озер, минеральных источников,
отвары и экстракты, полученные из природных субстратов, различных частей
растений и клеток микроорганизмов. Такие среды имеют сложный
непостоянный химический состав и малопригодны для изучения обмена
веществ микроорганизмов, так как в них невозможно учесть потребление
некоторых компонентов и образование продуктов метаболизма.
К числу натуральных сред, широко применяемых в лабораторной
практике, относятся мясопептонный бульон, неохмеленное солодовое сусло,
виноградное сусло и другие овощные среды.
Синтетические среды. Среды, в которые входят лишь соединения
определенного химического состава и в определенных количествах называют
синтетическими. Их широко используют при исследованиях обмена веществ,
физиологии и биохимии микроорганизмов. Полусинтетические среды. Эти
среды состоят из соединений известного химического состава с включением
веществ неопределенного состава (дрожжевой автолизат, экстракты).
Применяются
они
в
промышленной
микробиологии
для
получения
витаминов, ферментов, антибиотиков, кислот и других важных продуктов
жизнедеятельности микроорганизмов. Однако, не всегда накопление какоголибо продукта связано параллельно с накоплением биомассы, поэтому
подбор концентрации и соотношения компонентов среды определяют
используя методы математического планирования экспериментов.
По назначению различают элективные и дифференциально-диагностические (индикаторные) среды.
Элективные среды (селективные, избирательные, накопительные).
Эти среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или
группы микроорганизмов и менее пригодны или совсем непригодны для
развития других. Элективные среды применяются главным образом для
выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания или для
получения накопительных культур. Понятие «элективные условия» входит в
более широкое понятие «элективные среды».
Дифференциально-диагностические
среды
(индикаторные).
Использование этих сред дает возможность быстро отличить одни группы
микроорганизмов от других или выявить некоторые их особенности.
Например, рост большинства бактерий и актиномицетов подавляется при
низком значении рН среды, поэтому среды для выделения дрожжей
подкисляют до рН 4,5 путем добавления к ним минеральных или
органических кислот. Для синтетических сред наиболее приемлема соляная
кислота, для сусловых - молочная, лимонная или винная. Кислоты добавляют
в жидкую или расплавленную агаровую среду после стерилизации,
непосредственно перед засевом или перед разливкой в чашки Петри.
По физическому состоянию различают жидкие, плотные и сыпучие
среды.
Жидкие среды. Эти среды широко применяются для накопления
биомассы
или
продуктов
обмена,
для
исследования
физиолого-
биохимических свойств микроорганизмов, а также для поддержания и
сохранения культур в коллекциях.
Физиологический раствор. Готовят 0,85%-ный раствор NaCl в
дистиллированной воде. При необходимости стерилизуют 30 мин.
Плотные
среды.
Используются
плотные
(агаризованные)
пи-
тательные среды для выделения чистых культур, в диагностических целях,
установления
морфологии
микроорганизмов,
их
колоний,
для
антагонистических
определения
свойств
и
количества
антибиотической
активности, для хранения культур в коллекциях, для пересылки чистых
культур на производство и в других случаях.
Сыпучие среды. Это разваренное пшено, отруби, кварцевый песок,
пропитанные питательным раствором, применяющиеся для сохранения
культур
микроорганизмов
в
коллекциях
и
главным
образом
-
в
промышленной микробиологии.
Способы уплотнения сред.
Плотные питательные среды готовят из тех же жидких сред с
использованием уплотнителей: агар-агара, желатины и кремнекислого геля.
Агар. Это полисахарид, выделяемый из морских водорослей. В
продажу поступает в виде желтовато-белого порошка или в виде пластин,
стебельков. Обладает рядом полезных свойств, в частности способен
образовывать
в
воде
гели,
плавящиеся
примерно
при
100°С
и
затвердевающие примерно при 45°С. Это несовпадение точек плавления и
гелеобразования характерное для коллоидов, позволяет делать посевы
микроорганизмов в расплавленный агар и выращивать культуры при самой
разнообразной температуре.
Агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не может
использовать его в качестве субстрата, и поэтому он является лишь
уплотняющим средством. Термолабильные вещества не разрушаются, а
живые микроорганизмы не погибают при добавлении к нагретому до 45°С
расплавленному агару, если смесь сразу же охладить. Несколько циклов
плавления и затвердевания при рН 7,0-7,5 не влияют на способность агара
образовывать гель, благодаря чему при крайней необходимости агар можно
регенерировать и после чистки использовать повторно.
К недостаткам агаровых плотных сред следует отнести неполную
прозрачность
их
и
свойство
агара
выделять
после
застывания
конденсационную воду. Вследствие этого при работе с агаром необходимо
или подсушивать среду перед посевом, или переворачивать чашку после
посева и застывания агара (капли конденсационной воды при этом
образуются на крышке чашки и не попадают на поверхность среды).
Агар-агар имеет слегка щелочную реакцию, поэтому его добавление
иногда немного повышает значение рН среды. В кислой среде (рН ниже 5,0)
при продолжительном нагревании, например, при стерилизации агар
частично гидролизуется и теряет способность образовывать гель, то есть не
застывает.
В
случае
создания
плотных
сред
для
кислотолюбивых
микроорганизмов необходимо проводить раздельную стерилизацию агара (в
воде) и жидкой питательной среды, или доведение рН среды до нужного
значения после стерилизации стерильными растворами кислот или щелочи.
Агар добавляют к средам в количестве 1-3%. Если необходимо
получить более влажную среду, вносят 1%, а более плотную - 2-3% агара.
(Для получения достаточно плотного геля одесского агара следует добавлять
в два раза больше, чем архангельского, дальневосточного или импортного).
Для лучшего прилипания агаровых сред к стеклу рекомендуется
добавлять желатину в количестве 10%.
Стерилизуют агаровые среды при 0,5-ти 15-20 мин. или дробно по 20
мин. в кипятильнике Коха.
Питательные среды с агаром готовят стерильными для повседневной
работы и впрок в пробирках и колбах. Если предполагают выращивать
микроорганизмы на скошенной среде в пробирках, то чтобы среда не
подсыхала,
ее
скашивают
перед
посевом.
Для
этого
пробирки
с
расплавленной в кипящей водяной бане средой устанавливают в наклонном
положении и дают среде застыть. Скошенная среда не должна доходить до
ватной пробки на 5-6 см. Среду, предназначенную для культивирования
микроорганизмов в чашках Петри, разливают по 20-25 мл в пробирки
большего объема.
При работе со средами строго определенного состава агар очищают
(«выщелачивают»). Для этого агар помещают в эмалированную или
стеклянную посуду, заливают водопроводной водой и ставят в термостат на
30-37°С. Органические примеси выщелачиваются в воду и разлагаются под
действием развивающихся в ней микроорганизмов. По мере помутнения
воды, ее заменяют новой и так делают до тех пор (обычно 2-3 недели), пока
не исчезнет запах, а вода не перестанет мутнеть. Затем агар помещают в
марлевый мешок (двойной) и 2-3 суток промывают в проточной
водопроводной воде. Раскладывая тонким слоем агар просушивают на
воздухе или в сушильном шкафу при 40-50°С. Существуют и другие более
сложные методы очистки агара.
Каррагенан. Дешевым заменителем агар-агара может служить
каррагенан. Экстрагируют его из определенных видов красных морских
водорослей. Из него готовят гели, устойчивые к температурам до 60°С.
Готовят среды с каррагенаном, как и среды с агаром. После добавления
каррагенана к основной жидкой среде ее кипятят, чтобы полностью
растворить его, а затем автоклавируют. Стерильную среду охлаждают до 5560°С, разливают в пробирки, в чашки, и дают застыть. Для гелей, устойчивых
при 60°С, добавляют 2,4% каррагенана, при 45°С - 2,0%.
Желатина. Это экстракт, получаемый из субстратов, богатых
коллагеном - белком костей, хрящей, сухожилий, чешуи, кожи. Образуемый
желатиной гель плавится при температуре около 25°С, которая ниже
обычной температуры инкубации большинства микроорганизмов (30-37°С).
Кроме
того,
желатин
разжижается
протеолитическими
ферментами
микроорганизмов. Это свойство ограничивает ее применение в качестве
уплотняющего средства.
Используют желатин главным образом в диагностических целях - для
выявления
протеолитической
активности
микроорганизмов
на
мясопептонной среде, а также для получения гигантских и глубинных
колоний дрожжей на сусло-желатине.
Стерилизация желатиновых сред при 0,5-ти 15 мин. или дробно - 3
раза по 20 мин. в кипятильнике Коха. Повторная стерилизация желатиновых
сред, особенно при рН ниже 6,0 или выше 7,3 не рекомендуется, поскольку
желатина частично гидролизуется и теряет свои гелеобразующие свойства.
Хранение сред.
Не следует готовить впрок больших запасов сред, так как они
высыхают, концентрируются и становятся непригодными.
Сохраняют среды в прохладном, защищенном от света и не слишком
влажном помещении. В сырости ватные пробки пропитываются влагой и
через них может прорасти мицелий микроскопических грибов. Каждый сосуд
должен иметь этикетку с обозначением названия (состава) среды и времени
ее приготовления.
В промышленных лабораториях пользуются сухими питательными
средами. Хранить эти среды необходимо в плотно закрытой посуде,
предохраняя от увлажнения. Такие среды могут храниться долго.
1.5. Влияние физико-химических факторов. Температура.
Температура является одним из наиболее важных факторов окружающей среды, влияющих на рост и активность микроорганизмов. По
температурным границам, в пределах которых микроорганизмы могут
развиваться, принято делить их на 3 группы: психрофилы - в интервале
температур 5-10 °С, мезофилы - температурный оптимум, которых 25-37°С,
термофилы - от 45°С до 80-90°С. Отклонения от оптимальной температуры
неблагоприятно влияют на развитие культуры, поэтому выращивание их
ведут в термостатах или в термостатированных комнатах, где с помощью
терморегуляторов
поддерживается
соответствующая
оптимальная
температура. Для выращивания психрофилов используют холодильные
камеры.
Существует группа термотолерантных дрожжей, отличающихся от
типичных
мезофилов способностью размножаться без существенных
изменений скорости роста при температурах на 5-10°С, превышающих
оптимум мезофилов.
Для
определения
термотолерантности
наиболее
целесообразно
пользоваться методом непрерывного культивирования в режиме хемостата.
Активная кислотность (рН) среды.
Для каждого микроорганизма имеется своя оптимальная зона рН, в
пределах которой он может нормально развиваться. Большинство организмов
лучше всего растет, когда концентрация ионов Н+ и ОН" примерно
одинаковы
(рН
7,0),
однако
микроскопические
грибы
и
дрожжи
предпочитают слабокислые среды. Поэтому в приготовленных средах всегда
следует определить значение рН. Измеряют рН электрометрическим
способом на потенциометре. Можно использовать различные жидкие или
бумажные индикаторы.
Следует учитывать, что на точность определения рН с помощью
индикаторов влияет содержание солей и некоторых органических веществ в
среде, например, спирта, а также температура среды.
В процессе стерилизации рН может изменяться, поэтому после
стерилизации требуется дополнительная проверка значения рН среды и
корректирование его с помощью стерильных растворов кислоты (НС1,
H,SO4), щелочей (NaOH, КОН) или солей, имеющих щелочную реакцию
(Na2CO3, NaHCO3).
Микроорганизмы в большинстве случаев при культивировании
изменяют рН среды в результате образования продуктов метаболизма или
неравномерного потребления отдельных ее компонентов. Например, при
сбраживании углеводов в среде накапливаются органические кислоты,
снижающие рН среды: в средах с сернокислым аммонием рН понижается
благодаря более интенсивному потреблению аммония и накоплению ионов
НSО3, поэтому для предотвращения гибели микроорганизмов от их же
продуктов обмена и удержать рН на необходимом уровне, используют
разные приемы. Наиболее часто вводят в среды буферные растворы. Чаще
всего применяют фосфатные буферы.
Противодействие любого буфера изменению рН не беспредельно и
для микроорганизмов, активно изменяющих кислотность среды, часто бывает
недостаточным
или
совсем
неэффективным.
В
таких
случаях
при
культивировании в среду вводят избыточные количества нейтрализующих
веществ,
например
избыточное
количество
мела
или
нейтрализуют
образующиеся кислоты по ходу развития культуры 10%-ным стерильным
раствором
NaHCO2.
К
числу
таких
микроорганизмов
относятся
молочнокислые бактерии.
Свет
Подавляющему большинству микроорганизмов свет для роста не
нужен. Напротив, прямые солнечные лучи отрицательно влияют на их
развитие.
Поэтому
неосвещенных
культивирование
термостатах.
Свет
микроорганизмов
необходим
для
проводится
в
автотрофных
микроорганизмов (фототрофов) и их выращивание ведут в люминостатах - в
камерах, освещенных лампами накаливания или флуоресцентными лампами
дневного света. Контролируют спектральный состав света и освещенность,
которую измеряют с помощью люксметра.
Влажность
Для микроорганизмов необходимы влажные условия. Минимальное
содержание свободной воды, при котором еще возможно развитие, для
большинства
микроорганизмов
равно
примерно
20%.
Плотные
агаризованные среды всегда содержат некоторое количество капельножидкой
воды. Она заметна в виде конденсата. Однако при длительном хранении
культур на плотных средах при комнатной температуре и даже в
холодильнике среды подсыхают, и это может привести к гибели культур.
Поэтому необходимо производить регулярные своевременные пересевы
культур, не допуская подсыхания сред. При длительном культивировании в
термостате чашки или пробирки лучше всего поместить во влажную камеру,
то есть в закрытый объем, где имеется сосуд с водой. Некоторые грибы могут
расти на плотных субстратах без капельножидкой воды, но во влажной
атмосфере.
Методы выделения чистой культуры.
Полученную накопительную культуру используют для выделения
чистой культуры. Чистая культура может быть получена из отдельной
колонии или одной клетки.
Выделение чистой культуры из отдельной колонии
Принцип этого метода заключается в получении чистой культуры из
отдельной колонии, выросшей на плотной питательной среде при рассеве
накопительной культуры.
Рассев в чашки Петри.
Рассевать накопительную культуру можно путем растирания капли в
чашке Петри стеклянным шпателем Дригальского, затем этим же шпателем
протирают поверхность плотной среды последовательно во 2-й, 3-й и 4-й
чашках. Рассевать накопительную культуру можно петлей методом
истощающего штриха. Перед каждым новым штрихом петлю стерилизуют в
пламени горелки.
Засеянные чашки Петри помещают в термостат крышками вниз,
чтобы капли конденсационной воды не размывали колонии. Выросшие
изолированные колонии отсевают петлей в пробирки. Через 2-3 суток
размножается чистая культура.
Чашечным методом не всегда можно получить колонии чистых
культур, так как часть выросших колоний может образоваться не из одной
клетки, а из нескольких, склеившихся между собой или из попавших на
поверхность агара близко одна к другой и давших сначала изолированные
колонии, но вскоре слившихся в одну смешанную. Поэтому необходимо
провести повторный рассев выделенной из отдельной колонии культуры
одним из выше описанных способов, и снова отсеять культуру из
изолированной колонии.
Глубинный посев в чашки Петри. Изолированные колонии
факультативных анаэробов чаще получают методом глубинного посева.
Заранее приготовленные стерильные пробирки с плотной питательной
средой (15-20 мл) перед посевом помещают в кипящую водяную баню и
расплавляют среду. В пробирку с расплавленной и охлажденной до 48-50 °С
средой вносят 0,5-1,0 мл одного из разведений накопительной культуры.
Посевной материал тщательно перемешивают, вращая пробирку между
ладонями. Разведения накопительной культуры готовят с таким расчетом,
чтобы при высеве 0,5-1,0 мл разведения получить изолированные колонии,
обычно высев делают из трех-четырех последних разведений.
Пробирку с посевным материалом с соблюдением правил стерильности у пламени горелки быстро выливают в чашку Петри. По
застывании среды, чашки Петри помещают в термостат. Отдельные колонии,
выросшие в толще среды извлекают петлей (иглой), стерильными
капиллярными трубками или стерильным скальпелем и переносят в жидкую
питательную среду.
Выделение чистой культуры из одной клетки.
Капельный способ Линднера. Суспензию дрожжей разбавляют
суслом до концентрации «100 клеток в 1 мл и стерильным чертежным пером
наносят мельчайшие капельки на не обезжиренное покровное стекло,
простерилизованное
фламбированием
в
пламени
горелки.
Капельки
располагают в определенном порядке, обычно по пять капель в два ряда, то
есть всего 10 капель на стекле. Затем быстро опрокидывают стекло над
влажной
камерой,
(расплавленный
которую
парафин,
запечатывают
вазелин
и
др.).
минеральной
Немедленно
все
смазкой
капли
просматривают под микроскопом и отмечают те из них, которые содержат по
одной единственной клетке. Препараты помещают в термостат при
температуре 25-28°С. Если все капли содержат по несколько клеток, то
увеличивают разбавление суспензии и процедуру повторяют.
Через 24-36 ч. снова просматривают капли и отмечают те, где
образовалась колония. Эту каплю осторожно снимают иглой или полоской
стерильной фильтровальной бумаги, зажатой стерильным пинцетом и вносят
ее в пробирку со стерильным суслом.
Метод Линднера в видоизменении Надсона. Чистое покровное стекло
проводят трижды через пламя горелки и края его обводят мастикой (смесь
равных частей парафина и вазелинового масла). На центральную часть стекла
наносят плоскую каплю прозрачной среды с 10 % желатины и 0,5 % агара. В
теплую и еще не застывшую среду вносят петлей суспензию дрожжей такого
разведения, чтобы в каплю попало всего несколько клеток. Стекло помещают
во влажную камеру и рассматривают препарат при малом увеличении
микроскопа.
Находят ориентиры, которыми могут быть частички взвеси, пузырьки
воздуха или дефекты стекла, и вычерчивают карту с расположенными по
отношению к ориентирам одиночными клетками дрожжей. Через каждые 1020 ч препарат повторно исследуют, зарисовывая все изменения. Когда
отмеченные клетки разрастаются в микроколонии, покровное стекло
переворачивают на предметное и под контролем при малом увеличении
микроскопа переносят иглой материал в пробирки.
Метод
Линднера,
упрощенный
Вучковичем.
Видоизменение
Вучковичем метода Линднера сводится к тому, что капельки суспензии,
содержащие 3-4 клетки дрожжей, снимают петлей, которой предварительно
захватывают стерильную среду, и переносят штрихом на поверхность
плотной среды. Через некоторое время появляются микроколонии, число
которых на одном штрихе должно соответствовать количеству исходных
клеток в отмеченной капельке. Из этих колоний пересевом выделяют чистые
культуры. Таким способом можно сразу получить несколько одноклеточных
культур за короткое время.
Выделение отдельных клеток при помощи микроманипулятора.
Микроманипулятор позволяет производить захват одной клетки
дрожжей специальной микроскопической пипеткой или иглой под контролем
микроскопа.
Микроманипулятор
имеет
два
операционных
штатива
(ассистента), между которыми расположен микроскоп. В держателях
штативов
закрепляются
микропипетки
или
иглы.
Перемещение
их
осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов,
которые позволяют кончики инструментов вводить в висячую каплю и
захватывать ими отдельную клетку. Извлеченные отдельные клетки
переносят в пробирки со стерильной жидкой средой.
К использованию микроманипулятора прибегают главным образом
при необходимости изолировать споры из асков, так как вегетативные клетки
легко повреждаются при микроманипулировании. Аски разрывают либо
механически
обрабатывая
прикосновением
суспензию
игл
микроманипулятора,
препаратом
ферментов
либо
заранее
(например,
из
пищеварительного тракта виноградной улитки Helix pomatia), лизирующих
клеточную стенку дрожжей (приготовление препарата ферментов в гл. 10).
Для
работы
с
микроманипулятором
требуются
специальные
стеклянные микроиглы и влажные камеры. Методика их изготовления и
детали работы при извлечении аскоспор дрожжей описаны в руководстве по
генетике и селекции дрожжей.
Выделение отдельных клеток с помощью микроселектора Перфильева.
Самой существенной частью этого прибора является стеклянный
микрокапилляр, имеющий строго прямоугольное сечение. Благодаря этому
канал капилляра хорошо просматривается под микроскопом даже с
иммерсионным объективом.
Стерильный капилляр заполняют исследуемой суспензией клеток в
агаризованнои питательной среде и при большом увеличении микроскопа
находят участок с одной клеткой. Специальным приспособлением этот
участок капилляра под контролем микроскопа стерильно выбивают в
приемник, из которого затем переносят в стерильную среду. Микроселектор
Перфильева можно использовать для выделения как крупных, так и мелких
микроорганизмов.
Определение чистоты выделенной культуры.
Проверяют чистоту несколькими методами: визуальным, микроскопическим контролем и высевом на питательные среды.
При визуальном контроле роста культуры на поверхности плотной
питательной среды считается чистой культура, если рост по штриху
однородный.
Чистоту культур микроорганизмов обязательно контролируют под
микроскопом,
просматривая
препараты
живых
или
фиксированных
окрашенных клеток. Чистая культура, как правило, морфологически
однородна, возможно незначительное варьирование размеров клеток.
Проверяют чистоту культуры микроорганизмов высевом на питательные среды, благоприятные для их роста. Однородность выросших
колоний является свидетельством чистоты культуры.
Поддержание и хранение культур микроорганизмов.
Длительное поддержание чистых культур микроорганизмов необходимо как при проведении научно-исследовательских работ, так и в
производстве и при хранении в коллекциях.
Обязательным условием работы с микроорганизмами является
правильное поддержание их с целью сохранения не только жизнедеятельности клеток, но и таксономических, а также других свойств, присущих
данной культуре. Общего метода, одинаково пригодного для разнообразных
групп микроорганизмов, пока не существует.
К числу наиболее распространенных и более изученных способов
хранения микроорганизмов относятся периодические пересевы на свежие
питательные среды, сохранение культур на питательной среде под
вазелиновым маслом, хранение клеток в лиофилизированном состоянии.
Другие, менее изученные или недавно разработанные методы можно
рекомендовать лишь для проверки с обязательным дублированием культур,
которые поддерживаются обычными способами.
Жизнеспособность
микроорганизмов
после
различных
сроков
хранения определяют путем высева их на богатые питательные среды с
последующим подсчетом выросших колоний. Процент выживаемости
определяют по отношению числа сохранившихся клеток к первоначальному
числу жизнеспособных клеток (до начала хранения), принятого за 100%.
Периодические пересевы культур.
Обычно культуры поддерживают, пересевая их на плотные или
жидкие питательные среды в двойной повторности. Одна пробирка, которую
после засева совсем не открывают, служит контрольной, а из второй по мере
надобности (для работы) делают отсевы.
Сроки пересевов для многих микроорганизмов, например, дрожжей,
определяют скоростью высыхания среды. Она зависит от температуры,
влажности помещения, где хранят пробирки с культурами.
В Голландской коллекции (Дельфт, CBS, Нидерланды), насчитывающей более 6000 штаммов дрожжей, культуры хранят в специально
предназначенной для этих целей, постоянно проветриваемой комнате, где
температура поддерживается зимой 18 °С, летом 20 °С. Частота пересева при
этих условиях - каждые 5-7 мес. или 5 раз в два года; для некоторых культур
рекомендованы более частые пересевы.
Промежутки между пересевами можно увеличить за счет более
плотного закупоривания пробирок и снижения температуры. Использование
пробирок
с
завинчивающимися
металлическими
крышками,
хотя
и
предохраняет от высушивания, но хуже обеспечивает чистоту культуры.
Поэтому хорошо сделанные ватные пробки (сверху их можно залить
парафином) остаются лучшим средством закрывания пробирок.
Оптимальной температурой хранения считается 15-20°С. Хранение
культур в холодильнике при 4-6°С позволяет увеличить время между
пересевами.
Принято пересевать один раз в 1 -2 месяца при хранении в комнатных
условиях, некоторые микроорганизмы нуждаются в более частых пересевах,
другие - более редких. К недостаткам этого способа хранения относят
возможную утрату некоторых морфологических и физиологических свойств
культур, снижение биохимической активности, существует вероятность
возникновения мутантов и их селекция, а также опасность инфицирования
посторонними микроорганизмами.
Менее распространенные методы хранения культур.
Хранение под минеральным маслом. Заливка агаровых культур
минеральным маслом преследует цель задержать высыхание и тем самым
увеличить сроки пересевов.
Наиболее пригодно высокоочищенное медицинское вазелиновое
масло плотностью 0,8-0,9. Масло стерилизуют в автоклаве в течение 1 ч. при
121 °С, а затем для удаления влаги прогревают в су шильном шкафу при
температуре не выше 150°С или выдерживают при комнатной температуре
не менее 2-3 суток.
Культуры выращивают на благоприятной агаризованной среде. Среду
готовят в пробирках таким образом, чтобы столбик был достаточно высоким,
а скос небольшим. Через 4-10 суток, когда штрих хорошо сформируется,
культуры заливают маслом таким образом, чтобы слой его над верхним
краем агарового косячка не превышал 1 см. После заливки хранят культуры в
вертикальном положении либо при комнатной температуре, либо в
холодильнике при 4-6 °С.
Пересев дрожжей из-под вазелинового масла проводят один раз в год.
Для пересевов используют свежие косяки той же среды, на которой культуры
хранятся.
Этот способ хранения относится к числу лучших. Винные дрожжи при
хранении под вазелиновым маслом с пересевом даже 2-4 года хорошо
выживают и не теряют бродильных свойств.
К недостаткам этого метода хранения относят разбрызгивание масла
при обжигании петли и возможность инфицирования помещения, сложность
очистки от масла использованных пробирок.
Лиофилизация. Это процесс высушивания под вакуумом замороженных клеток. Сохраняют лиофильно высушенные культуры в
ампулах, запаянных под вакуумом. Этот метод позволяет в течение 10-20 и
более
лет
сохранить
без
заметных
изменений
жизнеспособность,
морфологические, физиологические свойства, а также биохимическую
активность клеток.
Режимы замораживания и высушивания в различных лабораториях
различаются в зависимости от имеющегося оборудования.
Запаянные ампулы с культурами хранят в темноте при температуре 46°С.
Реактивацию лиофилизированных культур производят путем переноса
части материала либо сразу же в жидкую питательную среду, либо путем
предварительного 8-часового выдерживания в дистиллированной воде с
последующим пересевом на сусло-агар.
Так как не все микроорганизмы одинаково переносят замораживание
и сушку, то этот метод нельзя считать универсальным.
Хранение при низких и сверхнизких температурах. Этот метод
требует специального оборудования и большой осторожности в работе с
жидким азотом. Клетки замораживают при разных температурах (от минус
10 до минус 196°С). В качестве криопротекторов применяют 10-20%-ный
раствор глицерина, 7-10%-ный раствор диметилсульфоксида или 20%-ный
раствор сахарозы. Суспензию клеток с высокой плотностью (109-10'° клеток в
1 мл) разливают в ампулы, запаивают или во флаконы с завинчивающимися
крышками. После замораживания при минус 70°С переносят в жидкий азот,
где и сохраняют их при минус 196°С. Оттаивание должно быть быстрым,
обычно в течение 2 мин. в водяной бане с температурой 35-45°С.
1.6. Микроскипия.
Правила пользования и уход за микроскопом.
Микроскоп относится к числу приборов тонкой и сложной конструкции, поэтому при пользовании им необходимо знать принципы его
действия и устройство. Обращение с микроскопом также требует навыка,
который
приобретается
практикой,
поэтому
необходимо
усвоение
нескольких основных правил пользования микроскопом.
1. При переносе микроскопа следует брать, его за нижнюю часть
штатива или за ручку и держать прямо перед собой, не опуская вниз, так как
при этом может выпасть из тубуса окуляр, зеркало.
2. В качестве источника света лучше всего использовать рассеянный
дневной
свет.
Для
работы
с
искусственным
светом
используют
низковольтные лампы, мощностью 60-100 Вт. При ярком источнике света
перед конденсором помещают матовый синий или белый светофильтр.
3. Перед началом работы следует очистить от пыли механические и
оптические части микроскопа сухой тканью. Оптических частей микроскопа
не следует касаться пальцами, так как это загрязняет линзы. Если в поле
зрения (без препарата) видны различные контуры, которые при вращении
окуляра передвигаются вместе с ним, то это свидетельствует о загрязнении
окуляра. Пыль с линзы окуляра удаляется специальной мягкой кисточкой и
затем тканью, смоченной в бензине. Если наружная чистка линз окуляра
недостаточна, то осторожно развинчивают линзы и чистят их внутренние
поверхности.
Объективы очищают только с внешней стороны. Ни в коем случае
развинчивать и разбирать их нельзя, так как при этом они могут быть
испорчены. Загрязненные объективы отправляют для чистки в специальные
мастерские.
Металлические части микроскопа следует вытирать сухой замшей или
сухой тряпочкой; если при этом грязь не удаляется, можно смочить замшу
керосином или бензином.
4. При работе с иммерсионными объективами нужно соблюдать
следующие правила: масло наносится на препарат осторожно в виде капли,
объектив осторожно опускается в масло так, чтобы фронтальная линза
объектива была погружена в него. После работы линза объектива должна
быть тщательно очищена от масла мягкой тканью, смоченной в бензине.
5. Для защиты объектива от пыли окуляр микроскопа следует
оставлять в тубусе.
Микроскоп нужно хранить в плотно закрытом ящике или держать под
стеклянным или полиэтиленовым колпаком, чтобы предохранить его от
пыли. Недопустимо хранение вместе с микроскопом кислот, микроскоп
портится также от воздействия высоких температур и водяных паров.
6. Все движущиеся части микроскопа 2-3 раза в год необходимо
смазывать смазочными маслами, свободными от кислот.
При любых микробиологических исследованиях необходимо иметь
точные
сведения
о
морфологических
особенностях
интересующего
организма. Изучение общей организации и тонкой структуры клеток
микроорганизмов, величина которых измеряется в большинстве случаев
микронами (микрометрами) (I мкм = 0,001 мм =103 мм), возможно только с
помощью
специальных
приборов
-
микроскопов,
обеспечивающих
увеличение исследуемых объектов в сотни (световая микроскопия) и десятки
тысяч раз (электронная микроскопия).
Изображение в световом микроскопе формируется вследствие того,
что объект и различные элементы его структуры избирательно поглощают
свет с различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие
изменения фазы световой волны при прохождении света через объект
(фазовый
контраст).
Световая
микроскопия
включает
обычную,
просвечивающую
микроскопию
(светло-
и
темнопольную),
фазово-
контрастную и люминесцентную.
Среди большого разнообразия моделей микроскопов, выпускаемых
отечественной промышленностью и за рубежом, для исследований чаще
всего используются биологические микроскопы (МБИ-1, МБИ-2, Биолам Р11 и др.), которые дают увеличение от 56 до 1350-1800 раз. Пользуясь
обычным световым микроскопом, определяют не только форму клеток
микроорганизмов,
степень
морфологической
гетерогенности,
размер,
подвижность, но и немалое число элементов структуры клеток, используя их
биохимические реакции при окрашивании препаратов.
Микроскоп световой
В конструктивном отношении световой микроскоп состоит из трех
основных частей: механической части, оптической системы, создающей
изображение предмета и осветительной оптической системы.
Механическая часть. Механическая часть микроскопа состоит из
штатива с подковообразным основанием, тубусодержателя с револьвером,
винтов для передвижения тубуса, осветительного аппарата и предметного
столика Нижняя часть штатива более массивна и служит опорой микроскопа.
На штативе укреплен подвижный предметный столик, который
приводится в движение двумя винтами, расположенными по бокам. При
помощи этих винтов препарат вместе со столиком передвигается в разных
направлениях, что значительно облегчает рассматривание препарата в
различных точках.
Кроме подвижных столиков, у современных микроскопов имеются
крестообразные столики с препаратоводителем, с помощью которого
препараты перемещаются в двух взаимно перпендикулярных направлениях.
Две шкалы и нониусы служат для определения координат точек,
представляющих интерес для наблюдателя.
Оптическая система. Качество изображения, даваемого
мик-
роскопом, зависит от правильного применения объективов и окуляров.
Пользуясь различными сочетаниями их, можно получить различные
увеличения.
Определяется
это
объектом,
целями
исследования
и
разрешающей способностью микроскопа. Так, объектив с собственным
увеличением 40х и числовой апертурой 0,65 в комбинации с окуляром 15х
даст увеличение в 600 раз, при этом можно увидеть объекты, величиной
превышающие 0,85 мкм. Такого увеличения достаточно для определения
величины и формы клеток дрожжей и плесневых (мицелиальных) грибов.
Для наблюдения за мелкими объектами, бактериями или изучения
тонкой структуры отдельных клеток употребляют сильный объектив с
собственным увеличением 90х и числовой апертурой 1,25 в комбинации с
менее сильным окуляром 7х или 10х. Общее увеличение микроскопа с
окуляром 7х будет равно 630, т.е. немного выше, чем в первом случае, но
разрешающая способность повышается, позволяя рассматривать объекты
величиной равной 0,44 мкм. При большом увеличении микроскопа - 960 раз,
получаемом при сочетании объектива с собственным увеличением 40х и
числовой апертурой 0,65 с окуляром, имеющим собственное увеличение 24х,
возможно рассматривать объекты до 0,9 мкм.
Выбор предметных и покровных стекол. Необходимо выбирать
предметные стекла толщиной не больше 1,1-1,4 мм. Предметные стекла,
имеющие
большую
толщину,
понижают
разрешающую
способность
микроскопа.
Покровные стекла должны быть не толще 0,15-0,17 мм. Стекла с
большей толщиной ухудшают резкость изображения и малопригодны для
точных микроскопических наблюдений.
1.7. Морфология и цитология микроорганизмов.
Для изучения морфологических особенностей микроорганизмов
используют различные методы микроскопии и способы дифференциальной
окраски, в зависимости от целей исследования. Основу специальных методов
исследования морфологии и цитологии микроорганизмов составляют
способы приготовления препаратов, фиксации и окраски клеток.
Микроскопирование неокрашенных препаратов.
Неокрашенные препараты просматривают при увеличении: объектив
8х, 10х, 40х или иммерсионная система, окуляр Юх. Так как клетки
большинства микробов бесцветны, то при сильном освещении они плохо
заметны. Поэтому поле зрения следует затемнить так, чтобы фон был
сероватым - на нем клетки микроорганизмов видны отчетливо.
Установив поле зрения, на предметный столик помещают приготовленный препарат. Перед началом микроскопирования следует опустить
тубус настолько, чтобы объектив почти касался покровного стекла (заведомо
большее спускание тубуса). Затем, глядя в окуляр, очень медленным
вращением макрометрического винта к себе поднимают тубус вверх. Когда
станут видны неясные очертания клеток, переходят к более точной установке
препарата.
Это
достигается
при
помощи
микрометрического
винта
(допускается вращение его лишь на пол-оборота к себе и от себя). Если тубус
оказался поднятым слишком высоко, то, глядя сбоку, опускают его до
первоначального положения, то есть почти до соприкосновения с покровным
стеклом, и исследование повторяют.
Вначале двигать тубус вниз, не отрывая глаза от окуляра, не
рекомендуется, так как можно легко сломать покровное стекло и тем самым
испортить объектив. Чтобы легче найти микроорганизмы, можно сдвинуть
препарат до края капли (его легче найти), в этом месте большее скопление
клеток микробов (ближе к воздуху).
Наблюдение микроорганизмов в неокрашенном состоянии позволяет
установить форму и величину клеток, и наличие подвижности. При этом
необходимо различать активное движение от пассивного. При наблюдении
активного движения видно движение отдельных клеток в различных
направлениях; при пассивном - движение микроорганизмов в одну сторону,
вызванное током воды.
После просмотра препарата переносят его в банку с водой, а при
работе с патогенными микробами - в раствор сулемы (1:1000), лизола (1-2%)
или карболовой кислоты (2-3%).
Микроскопирование окрашенных препаратов.
Окрашенные препараты можно исследовать с сильными сухими
объективами (8х, Юх, 40х), нанося на препарат каплю воды и покрывая его
покровным стеклом. При пользовании сухими системами препарат можно
просматривать также без воды и покровных стекол.
Чаще всего для просмотра окрашенных клеток микроорганизмов
применяют масляную систему. Препарат помещают на предметный столик и
на мазок наносят каплю кедрового масла. Устанавливают максимальное
освещение (диафрагма полностью открыта, осветитель поднят до уровня
предметного столика). Глядя сбоку, вращением макрометрического винта
опускают тубус микроскопа для соприкосновения объектива с каплей масла.
Затем тубус снова опускают немного вниз и слегка раздавливают каплю
(объектив почти касается предметного столика). При этом положении
микроскопа тубус опущен ниже того положения, которое требуется для
ясной видимости клеток микроорганизмов. Чтобы установить препарат в
фокус, тубус медленно поднимают вверх до появления окрашенного фона.
После
того
как
микрометрическим
фон
будет
винтом,
найден,
с
начинают
помощью
передвигать
которого
тубус
устанавливают
надлежащую резкость очертания клеток.
Если тубус будет поднят слишком высоко (показателем этого является
разрыв соединения кедрового масла с объективом), его необходимо вновь
опустить в первоначальное положение и повторить все операции для
установления препарата в фокус.
Просмотр колоний микроорганизмов.
Колонии
просматривают
при
слабом
увеличении
микроскопа
(объектив - 8х, окуляр - Юх). При этом конденсор (осветитель Аббе) удаляют
или отводят в сторону. При установке освещения, устанавливают высоту, на
которой должен находиться объектив. При просмотре колоний он должен
быть приподнят над предметным столиком приблизительно на высоту 2-3 см.
Указанную высоту объектива устанавливают, глядя сбоку, поворотом
макровинта. После этого смотрят в окуляр и, вращая зеркало, устанавливают
наиболее яркое освещение поля зрения.
Перед просмотром колонию обводят карандашом со стороны дна
чашки Петри. Затем с чашки снимают крышку, а дно ее помещают на столик
микроскопа таким образом, чтобы колония микроорганизма находилась
против объектива (перед тем как поместить чашку на столик, тубус
микроскопа следует немного приподнять).
Затем,
глядя
сбоку,
вращением
макровинта
опускают
тубус
микроскопа настолько, чтобы объектив находился от колонии на расстоянии
около 1 см. При этом положении микроскопа объектив будет опущен ниже
положения, которое требуется для ясной видимости колонии, и поэтому в
дальнейшем необходимо поднять тубус.
Для точной установки микроскопа вращением макрометрического
винта тубус медленно поднимают до тех пор, пока не будут видны очертания
колонии. После этого ясная видимость колонии обеспечивается еще более
медленным
вращением
макрометрического
винта.
Микрометрическим
винтом при просмотре колонии работать не следует. Если намеченная
колония не попала в поле зрения, чашку передвигают так, чтобы колония
расположилась ближе к центру поля.
Таким образом, при микроскопировании неокрашенных и окрашенных препаратов нужно, глядя в окуляр, вначале только поднимать
тубус; спускать же его следует при наблюдении за его движением сбоку.
Поднимать и опускать тубус, не отрываясь от окуляра, можно только после
приобретения достаточных навыков по технике микроскопирования.
Полезно приучить себя во время микроскопирования держать оба
глаза открытыми и пользоваться ими попеременно, при этом меньше
утомляется зрение.
Определение размеров клеток микроорганизмов.
Форму и размер клеток исследуют в культурах, выращенных на
следующих жидких и плотных средах: солодовое сусло с содержанием 10%
СВ; сусло-агар; глюкозо-пептонная среда (глюкоза - 20 г, пептон - 10 г,
дрожжевой экстракт - 5 г, дистиллированная вода - 1 л); глюкозо-пептонный
агар (к глюкозо-пептонной среде добавляют 2% агара).
Размеры клеток определяют микрометром после 2-3 суточного
выращивания культуры при 25-28 °С. Производят не менее 20 замеров клеток
в длину и ширину. Регистрируют крайние значения.
Размеры клеток микроорганизмов (длина и ширина, диаметр) не
превышают тысячной доли миллиметра. Эта величина - 1 микрометр
(микрон), или 103 мм, - и стала «аршином» в микробиологии.
Данные о структуре клетки приводятся в нанометрах: 1 нм = 10 3мкм =
106мм. Размеры дрожжей и простейших находятся в пределах 10 мкм. У этих
малых организмов соотношение между поверхностью и объемом очень
велико. Если куб с длиной граней 1 см (объемом 1 см3) разбить на кубики с
длиной граней 1 мкм, получим 10
12
кубиков объемом по 1 мкм
3
каждый.
Суммарная поверхность этих кубиков в 10000 раз больше, чем поверхность
исходного куба. Объем 1 мкм3 характерен для средней бактериальной клетки.
Клетки микроорганизмов измеряют под микроскопом с помощью окулярной
линейки-микрометра или окулярного винтового микрометра. Размеры клеток
определяют в живой культуре, обычно в 12-18 часовой, когда клетки бывают
однородными. Единицей измерения является микрон (мк), равный 0,001 мм.
Подготовка предметных и покровных стекол.
Предметные стекла чаще всего используют для приготовления
препаратов микроорганизмов при микроскопировании. Вырезают их из
лучшего стекла, края должны быть шлифованными. Размер их 76x26 мм,
толщина не должна превышать 1,2-1,4 мм. Применение более толстых стекол
не позволяет получить резкое изображение краев диафрагмы осветителя в
плоскости препарата, так как оно попадает в толщу стекла, что нарушает
фокусировку конденсора и резко снижает четкость изображения. Чрезмерная
толщина предметного стекла недопустима при работе с иммерсионным
объективом, когда необходимо использовать числовую апертуру системы.
Для того, чтобы капля препарата равномерно расплывалась по стеклу,
а не собиралась в выпуклые, медленно высыхающие капли, поверхность
стекол нужно тщательно очистить и обезжирить. Наиболее надежный способ
обезжиривания - обработка стекол хромовой смесью (6%-ный раствор
двухромовокислого калия в серной кислоте) с последующим ополаскиванием
водой и спиртом, в котором их и хранят. Этот способ слишком громоздок.
Применяют его обычно при выполнении тонких работ, например, при
окрашивании препаратов с целью выявления морфологических особенностей
микроорганизмов.
Обработка предметных стекол по Цветнову. 1. Стекла кипятят 10
мин. в следующем растворе: бихромата калия - 20 г; дистиллированной воды
200 мл; концентрированной серной кислоты - 20 мл.
2. Промывают в течение 5 мин. слабым раствором едкого натрия.
3. Тщательно промывают водой.
4. Промывают этиловым спиртом.
В повседневной работе при отсутствии заранее приготовленных
обезжиренных стекол можно быстро подготовить стекла, тщательно натирая
их в сухом виде хозяйственным мылом, обмыть чистой водой и вытереть
затем чистой хлопчатобумажной салфеткой.
Хорошие результаты получаются также при протирании чисто
вымытых и вытертых стекол ватой, смоченной эфиром (после этого
промывание водой не требуется), или обжиганием поверхности стекол в
пламени горелки (жир при этом сгорает). Кипячение стекол в растворах
щелочей не рекомендуется, так как щелочи разъедают стекло и поверхность
его становится матовой. Хранить чистые обезжиренные стекла можно в
сухом состоянии, аккуратно сложенными по 20-30 штук в пачке,
завернутыми в бумагу, или в этиловом спирте. Покровные стекла также
применяют для приготовления препаратов. Они должны быть тщательно
вымыты и высушены. Покровные стекла квадратные, формат 18x18 мм или
20x20 мм, толщина их не должна превышать 0,15-0,17 мм. Более толстые
стекла резко ухудшают качество получаемого изображения. Хранят
покровные стекла сухими или в 95%-ном спирте, или в смеси спирта и эфира
(1:1) в банках с притертыми пробками. Стекла следует вынимать пинцетом.
Перед использованием их необходимо просушить фильтровальной бумагой и
слегка обжечь над пламенем горелки.
Препараты живых клеток микроорганизмов
Для определения формы клеток микроорганизмов и их сочетаний
(цепочки, пакеты, тетради и др.), их подвижности, физиологического
состояния готовят препараты и ведут прижизненное наблюдение.
Препарат «раздавленная капля». На чистое предметное стекло
стерильной петлей или стерильной пипеткой помещают каплю исследуемой
жидкости и накрывают покровным стеклом. При опускании покровного
стекла на каплю следует прикоснуться ребром его к краю капли и,
постепенно наклоняя, опустить. Иногда под стеклом остаются пузырьки
воздуха. Если они единичные, то они не мешают микроскопированию и ими
можно воспользоваться при отыскании мелких микроорганизмов в поле
зрения микроскопа. Если пузырьков воздуха много, то препарат следует
переделать. Капля должна быть небольшой, чтобы жидкость не выступала за
края покровного стекла. Излишек жидкости, вышедшей из-под покровного
стекла, удаляют полосками фильтровальной бумаги.
Если рассматривают культуру, выросшую на плотной питательной
среде, то на чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и
в нее вводят иглой небольшое количество исследуемой культуры.
Препарат «висячая капля». Для этого используют предметное стекло
со специальным углублением, с луночкой. Висячей каплей удобнее
пользоваться для наблюдения подвижности микроорганизмов, размножения,
прорастания спор.
Препарат готовят так: в центр покровного стекла помещают
небольшую каплю жидкости с микроорганизмами, затем накрывают его
предметным стеклом с лункой, предварительно смазав ее края тонким слоем
вазелина. Предметное стекло осторожно прижимают к покровному и быстро
переворачивают препарат. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и
дна лунки. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла.
Для лучшей сохранности стекла с висячими каплями помещают во
влажные камеры, на дно которых наливают воду или кладут влажную
фильтровальную бумагу.
Микроскопирование висячей капли рекомендуют проводить сначала с
помощью объектива малого увеличения (находят край капли), затем
передвигают каплю в центр поля зрения, устанавливают большее увеличение
и, регулируя микрометрическим винтом, находят лучшее изображение.
Препарат «отпечаток». Из агаризованной среды, на которой
выросли отдельные колонии или сплошной газон микроорганизмов,
вырезают скальпелем кубик, переносят на предметное стекло, а затем к
газону или колонии прикладывают покровное стекло, слегка надавливают
петлей, осторожно снимают и отпечатком вниз помещают на предметное
стекло с каплей воды или красителя. Отпечаток можно получить и на
предметном стекле.
Препарат «микрокультура» или «агаровая пленка». На тонкое,
стерильное и нагретое предметное стекло наносят стерильной пипеткой 0,20,3 мл горячей агаризованной питательной среды и распределяют так, чтобы
получить два тонких участка размером с покровное стекло каждый. Лишний
агар
удаляют.
В
центр
квадратов
наносят
капли
исследуемых
микроорганизмов. Стекло помещают в чашку Петри со слоем мокрой
фильтровальной бумаги (влажная камера) и ставят в термостат.
Перед микроскопированием на пленку с выросшей культурой наносят
каплю красителя или каплю воды, в случае подсыхания пленки, и осторожно
накрывают покровным стеклом.
Этот метод позволяет вести микроскопическое наблюдение за
процессами роста и развития, влиянием токсических и других агентов на эти
процессы.
рения высушивания препарат мазком вверх осторожно прогревают
над пламенем горелки.
Фиксация препарата - важная операция, целью которой является
убить микроорганизмы, (мертвые клетки становятся проницаемыми для
красителей) и закрепить их на стекле. Существует много способов фиксации.
Простейшим из них является фиксация пламенем. Для этого препарат
медленно 3-4 раза проводят над верхней частью пламени грелки таким
образом, чтобы сильно нагреть нижнюю поверхность стекла, чем и
достигается фиксация. Для фиксации также широко применяют растворы
различных химических веществ: этиловый спирт (96% об.) в течение 5-20
мин; смесь равных объемов этилового спирта и эфира - 5 мин; метиловый
спирт - 5 мин; смесь формалина (5 мл) со спиртом (95 мл) - 2 мин. и др.
На фиксированный препарат наносят раствор какого-либо красителя в
зависимости от цели исследования.
Окрашивание препаратов.
Различают простые и дифференциальные способы окрашивания
микроорганизмов. При простом способе окрашивается вся клетка, так что
становятся видны ее форма и размеры. Дифференциальный способ
предполагает окрашивание не всей клетки, а определенных ее структур. С
помощью дифференциального окрашивания выявляют некоторые клеточные
структуры и запасные вещества.
Для
окрашивания
микроорганизмов
применяют
анилиновые
красители. По своим химическим свойствам их разделяют на кислые и
основные красители.
К кислым красителям относятся: эозин, эритрозин, нигрозин, кислый
фуксин (красные и розовые); конго, пикриновая кислота, флуоресцеин
(желтые).
Все
эти
красители
интенсивно
связываются
с
цитоплазматическими компонентами клеток.
К основным красителям относятся: метиленовый синий (синий);
нейтральный красный, основной фуксин, сафранин (красные); генциановый
фиолетовый,
кристаллический
фиолетовый,
тионин
(фиолетовые);
малахитовая зелень, метиленовый зеленый (зеленые). Эти красители
интенсивнее связываются с ядерными компонентами клетки. Высокая
концентрация ДНК и рибосомной РНК в клетке микробов делает ее более
чувствительной к основным красителям. Поэтому в микробиологической
практике применяются почти исключительно основные красители.
Применяют сухие анилиновые красители в виде порошков, из
которых готовят насыщенные спиртовые растворы. Из насыщенных
растворов путем 5-10-кратного разбавления дистиллированной водой готовят
разбавленные
спиртоводные
растворы,
которые
и
используют
для
окрашивания. Для усиления красящей способности к растворам красок
прибавляют анилин, щелочь, карболовую кислоту, формалин, буру, танин и
др.
После приготовления растворы красок фильтруют, разливают в
сосуды с притертыми пробками и хранят в шкафу без доступа света.
Рецепты красителей.
Фуксин
основной,
насыщенный
спиртовый
раствор.
Фуксин
основной - 10 г; этанол 96%-ный - 100 мл.
Фуксин основной карболовый (фуксин Циля). 5%-ный водный
раствор свежеприготовленного фенола - 100 мл; насыщенный спиртовый
раствора фуксина основного - 10 мл. Приготовленную смесь через 48 ч
отфильтровывают. Краситель устойчивый.
Фуксин основной, водный раствор. Карболовый фуксин Циля — 1
мл; вода дистиллированная — 9 мл. Водный фуксин готовят непосредственно
перед употреблением, так как он нестоек.
Метиленовый синий, насыщенный раствор. Метиленовый синий -3
г; 90%-ный этанол - 100 мл. Раствор оставляют на 2-3 суток, несколько раз
перемешивают (взбалтывают), затем фильтруют. Раствор устойчив.
Метиленовый
синий
1:40.
Насыщенный
спиртовый
раствор
метиленового синего - 1 мл; вода дистиллированная - 40 мл.
Метиленовый синий (по Леффлеру). Насыщенный спиртовый
раствор метиленового синего - 30 мл; вода дистиллированная - 100 мл; КОН
1%-ный водный раствор - 1 мл.
Генциановый фиолетовый карболовый.
Раствор 1. Генциановый фиолетовый - 1 г; этанол 96%-ный -10 мл.
Раствор 2. 5%-ный водный раствор свежеприготовленного фенола 100 мл. После полного растворения генцианового фиолетового растворы
смешивают.
Судан III - 0,5 г; молочная кислота концентрированная - 100 мл.
Судан черный В - 0,3 г; этиловый спирт 70%-ный горячий -100 мл.
Раствор выдерживают в течение нескольких часов при 60 °С в закупоренной
склянке, затем охлаждают и фильтруют. Применяют для выявления липидов.
Малахитовый зеленый - 7,5 г; вода дистиллированная - 100 мл.
Раствор Люголя в модификации Грама. Иод кристаллический - 1 г;
калий йодистый - 2 г; вода дистиллированная 300 мл.
В ступку емкостью 30-50 мл помещают навеску йода и йодистого
калия, растирают смесь пестиком, добавляют 1 мл дистиллированной воды и,
продолжая растирать кристаллы, добавляют еще 5 мл воды. Йод растворяется
в йодистом калии. Раствор количественно переносят в склянку и доводят
общий объем до 300 мл. Срок годности раствора не более 30 суток; хранят
его в темной посуде.
Раствор Люголя для выявления гликогена и гранулезы. Иод
кристаллический - 1 г; калий йодистый - 3 г; вода дистиллированная - 300 мл.
Раствор готовят так же, как предыдущий.
Приготовление туши для негативного контрастирования.
Тушь черная - 10 мл; вода дистиллированная - 30 мл.
Разведенную тушь центрифугируют, надосадочный слой сливают в
пробирки и стерилизуют при 0,5-ти. Сохранить тушь можно также, добавляя
к ней раствор Тимерсола (1:1000) в соотношении 1:2 и твин-80 (1:100) - 1
капля на 100 мл раствора.
Прижизненная окраска. Витальная (прижизненная окраска) дает
возможность выяснить некоторые функциональные особенности микробных
клеток. Прижизненной считают такую окраску, при которой окрашенные
организмы длительное время остаются живыми и сохраняют способность к
размножению.
Поскольку красители в какой-то степени токсичны, для живых
микроорганизмов используют их в виде сильно разбавленных растворов (от
0,001 до 0,0001%).
Для прижизненной окраски применяют: нейтральный красный,
крезоловый голубой, везувин, нильблаусульфат, метиленовый синий, раствор
Люголя и др.
Наиболее распространенные методы прижизненной окраски:
-
под покровное стекло приготовленного препарата вводят не
большую каплю раствора красителя:
- на предметное стекло в каплю красителя вносят каплю исследуемой
культуры.
Окраска фиксированных препаратов. Различают простые и
дифференциальные способы окрашивания. При простой окраске препарат
окрашивают одной краской; при дифференциальной - применяют две или
более красок.
Для простого окрашивания фиксированный препарат помещают в
банку с красителем или на стеклянные рейки, лежащие над кюветой и
заливают красителем на 1-3 мин. В случае подсыхания красителя на мазок
наливают новые порции красителя. Затем промывают водой до тех пор, пока
стекающая вода не станет бесцветной. Препарат высушивают на воздухе или
осторожно
промокают
фильтровальной
бумагой,
помещают
каплю
иммерсионного масла и просматривают с объективом 90 х.
Для окрашивания препарата, вместо растворов красителей, можно
использовать фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителями.
В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения
светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов. Фиксировать и
окрашивать можно также и препараты «отпечатки».
Фиксированные окрашенные препараты могут храниться длительное
время.
Для продолжительного хранения препараты заделывают в канадский
бальзам, пихтовый бальзам, в глицериновый желатин или в синтетический
заменитель естественных смол - идитол, предварительно смыв с покровного
стекла иммерсионное масло и сделав надпись на препарате.
Структурно-функциональная организация клетки
Клеточные структуры
Капсулы. Клетки многих микроорганизмов, особенно при росте их на
средах, богатых углеводами, могут быть окружены рыхлым внешним слоем капсулой или слизью. К таким микроорганизмам относятся уксуснокислые
бактерии, некоторые роды молочнокислых бактерий и дрожжей. При
микроскопировании живых клеток эти структуры плохо видны. Химический
состав капсул у разных микроорганизмов неодинаков, поэтому выявить их
каким-либо одним методом окраски невозможно.
Для выявления капсул применяют способ «негативной окраски»
(негативного контрастирования) с помощью жидкой туши. Для этого
небольшое количество клеток с плотной среды помещают в каплю
разбавленного фуксина, смешивают с каплей туши, закрывают покровным
стеклом и просматривают с объективом 40х. На общем темном фоне
препарата хорошо видны бесцветные капсулы, окружающие клетки
микроорганизмов, окрашенные в розовый цвет.
Окраска капсул по методу Гинса. На конец предметного стекла
петлей наносят каплю черной туши, вносят в нее культуру, хорошо
перемешивают и ребром покровного стекла делают мазок по всей
поверхности стекла. Высушивают на воздухе, 5-10 мин. фиксируют смесью
Никифорова или 3 мин. абсолютным метанолом. Затем мазок окрашивают
карболовым фуксином Циля, разбавленным водой в соотношении 1:3. Время
окрашивания - 2-3 мин. Промывают водой, высушивают на воздухе и
микроскопируют с иммерсионной системой. На темно-сером фоне препарата
контрастно выделяются розово-малиновые клетки, окруженные бесцветными
капсулами.
Клеточная стенка. Тонкую структуру клеточной стенки хорошо
видно лишь в электронном микроскопе. Для наблюдения клеточной стенки в
световом микроскопе применяют метод темного поля либо специальную
окраску.
На обезжиренном стекле делают препарат культуры, высушивают на
воздухе,
фиксируют
в
течение
5
мин
5%-ным
раствором
фос-
форомолибденовой кислоты. Затем препарат промывают водой и окрашивают не более 15 с. 0,02%-ным раствором кристалл виолета. Снова
промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной
системой. Клеточная стенка окрашивается в черный, а цитоплазма - в бледно
сиреневый цвет.
Окраска по Граму. С молекулярной организацией и химическим
составом клеточной стенки связывают способность микроорганизмов
окрашиваться по Граму. Она является важным таксономическим признаком и
коррелирует
со
микроорганизмы
многими
по
другими
способности
свойствами
микробов.
окрашиваться
Все
красителями
триметилфенолового ряда с йодом делятся на две большие группы:
грамположительные
и
грамотрицательные.
Грамположительные
удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом при обработке
препарата
спиртом
и
поэтому
окрашиваются
в
фиолетовый
цвет.
Грамотрицательные не обладают такой способностью и обесцвечиваются
спиртом; при последующей обработке фуксином или сафранином они
приобретают розовую окраску.
Способность удерживать краситель зависит от физиологического
состояния микроорганизмов, поэтому красить по Граму следует всегда
клетки молодых культур. У некоторых бактерий, например, после
прекращения активного роста утрачивается способность окрашиваться по
Граму.
Один из многочисленных вариантов метода окрашивания по Граму
заключается в следующем.
На одном обезжиренном стекле делают мазки разных микроорганизмов: в центре - мазок клеток исследуемой культуры, слева и справа контрольных культур. Клетки одной контрольной культуры должны быть
грамположительными,
(стрептококки,
например,
палочки),
дрожжи,
другой
-
молочнокислые
грамотрицательными,
бактерии
например,
уксуснокислые бактерии.
Мазки
следует
готовить
тонкими,
чтобы
клетки
равномерно
распределялись по поверхности стекла и не образовывали скоплений.
Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и
окрашивают
в
течение
1-2
мин.
карболовым
генциановым
или
кристаллическим фиолетовым. Затем краситель сливают и, не промывая
мазок, обрабатывают его 1-2 мин. раствором Люголя до почернения.
Сливают раствор Люголя, препарат обесцвечивают 0,5-1,0 мин. 96%-ным
этиловым спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окрашивают
1-2 мин. водным фуксином. Краситель сливают, препарат промывают водой,
высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. При правильном
окрашивании грамположительные микроорганизмы имеют сине-фиолетовый,
а грамотрицательные - розово-красный цвет.
Красящиеся по Граму (грамположительные) - дрожжи, молочнокислые бактерии;
некрасящиеся
по
Граму (грамотрицательные)
-
уксуснокислые бактерии.
Жгутики. Способность к движению у большинства микроорганизмов
обусловлена
наличием
жгутиков.
Отдельный
бактериальный
жгутик
настолько тонок, что не различим в световом микроскопе, если он не
окрашен особым способом, который увеличивает кажущуюся толщину
жгутиков.
Окраска жгутиков требует тщательной подготовки клеток и аккуратности в работе, так как жгутики легко обламываются, даже при
взбалтывании суспензии. В работу берут культуру молодую, 12-16 час. с
плотной питательной среды ( не более 1,5% агара). Существует много
способов окраски жгутиков, но особенно надежен способ Леффлера.
Способ Леффлера в модификации Пешкова. Клетки осторожно берут
петлей и переносят в пробирку с водой, подогретой до температуры, при
которой их выращивали. Под микроскопом определяют их подвижность и
плотность - 5-10 клеток в поле зрения.
Предметные стекла должны быть тщательно обезжирены. Непосредственно перед приготовлением препарата его 3-4 раза проводят через
пламя горелки. На остывшее стекло пастеровской пипеткой или петлей
наносят 3-4 маленьких капли.
Капли должны хорошо растекаться по стеклу и быстро высыхать.
Высушенный мазок заливают протравой, которая не должна подсыхать.
Через 15 мин. протраву смывают дистиллированной водой, и препарат
окрашивают в течение 5 мин. разбавленным фуксином Циля, погружая его
мазком вниз в раствор красителя. Затем препарат промывают водой,
высушивают на воздухе и исследуют с иммерсионной системой.
По методу Рыжковой препарат заливают протравой через воронку с
фильтром и трижды в течение 3-5 мин. подносят стекло к пламени горелки до
появления паров. Затем протраву сливают и препарат заливают раствором
Циля на 5-10 мин.
Ядро, нуклеоид. Микробные клетки эукариот содержат оформленное
ядро, отделенное от цитоплазмы двухслойной мембраной (нуклеолеммой,
нуклеомембраной), связанной с эндоплазматическим ретикулумом. Ядро
содержит ДНК и основные белки - гистоны.
В клетках прокариот в цитоплазме ядро (нуклеоид) представлено в
виде замкнутой нити с высоким содержанием ДНК.
Основные красители, избирательно окрашивающие хроматин ядер
эукариотических клеток, равномерно и интенсивно окрашивают всю
прокариотную клетку.
Для избирательного окрашивания нуклеоида фиксированные клетки
предварительно обрабатывают рибопуклеазой или разбавленной соляной
кислотой,
чтобы
разрушить
рибосомальную
РНК.
Последующее
окрашивание основным красителем позволяет выявить нуклеоид в виде
плотных тел, имеющих неправильные очертания и расположенных в центре
или на обоих полюсах клетки.
Способ выявления нуклеоида. На предметном стекле делают мазок
суточной культуры, высушивают на воздухе и фиксируют в течение 2-3 мин.
в парах 2%-ного раствора осмиевой кислоты. Для этого на дно чашки Петри
наносят 2-3 капли фиксатора, а предметное стекло помещают мазком вниз на
отрезки стекла. По окончании фиксации препарат опускают на 2-3 мин. в
стаканчик с раствором 1М НС1 для гидролиза рибосомальной РНК. Стакан
держат на водяной бане при 60°С. После гидролиза препарат немедленно
промывают водой. Затем препарат помещают на 15 мин. в 1%-ный раствор
формалина, вновь промывают водой и окрашивают в течение 1-2 мин. 0,11,0%-ным водным раствором основного фуксина. Препарат промывают,
высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Цитоплазма
окрашивается в розовый цвет, нуклеоид - в ярко-малиновый.
Споры у дрожжей. Для определения способности дрожжей к
спорообразованию производят посев 2-3 суточной культуры дрожжей на
сусло-агар (среду, богатую элементами питания) и выдерживают при 25 °С в
течение суток. Из этой суточной культуры наносят штрих на поверхность
питательной
среды
бедной
углеводами.
Можно
использовать
среду
Городковой, мясопептонный агар, гипсовые блоки, морковь, картофель.
Посев выдерживают при температуре 15-20°С. Ежедневно проверяют на
наличие спорообразования при микроскопировании. В сомнительных
случаях готовят окрашенные препараты.
Способ окрашивания спор у дрожжей. Фиксированный препарат
окрашивают карболовым фуксином (100 мл насыщенного спиртового
раствора основного фуксина на 100 мл 5%-ной карболовой воды) в течение 510 мин., при нагревании; при этом споры и вся остальная часть клетки
окрашивается в красный цвет. Препарат погружают на 0,5-1 мин в кислый
спирт (спирт + 3% соляной кислоты), в котором все части клеток теряют
окраску,
споры
же
ее
сохраняют.
Такой
препарат
окрашивается
дополнительно при нагревании разбавленным раствором метиленовой сини,
и при этом вся остальная часть клеток и клетки без спор окрашиваются в
светло-голубой цвет, а споры остаются красными. Отмечают количество спор
в аске, их форму, общий вид.
Споры бактерий. Для обнаружения способности клеток к спорообразованию лучше использовать старые культуры. Споры можно
обнаружить при наблюдении живых клеток, а также путем дифференциального
окрашивания
спорообразования
цитоплазмы
(бациллярный,
и
споры.
клостридиальный,
Определяют
тип
плектридиальный),
расположение споры в клетке (центральное, эксцентральное или полярное),
форму свободных спор (круглая, овальная или продолговатая) и их размеры.
Способ окрашивания спор (по методу Пешкова). Споры и цитоплазму
окрашивают при нагревании. Промывание препарата водой ведет к
обесцвечиванию цитоплазмы, тогда как спора прочно удерживает краситель.
1. На обезжиренном предметном стекле готовят мазок, высушивают
его на воздухе, фиксируют в пламени горелки и заливают раствором
метиленового синего по Леффлеру. Краситель доводят до кипения (стекло
над пламенем горелки), по мере испарения красителя добавляют новые
порции. Продолжительность окраски с момента закипания 10-20 с.
2.
Предметное стекло охлаждают, смывают водой и ведут
докрашивание в течение 30 с 0,5%-ным водным раствором нейтрального
красного или сафранина.
3. Краситель сливают, препарат промывают водой и просматривают
под микроскопом с иммерсионной системой.
При правильном окрашивании клетки имеют красный, а споры -синий
цвет. Вместо метиленового синего можно использовать малахитовый
зеленый. В этом случае препарат, фиксированный в пламени горелки,
заливают на 7-10 мин. 7,5%-ным раствором малахитового зеленого.
Окрашивание проводят с подогревом, помещая препарат над сосудом с
кипящей водой или над пламенем горелки. По окончании окраски
предметное стекло охлаждают, промывают препарат водой и докрашивают
клетки 0,25%-ным водным раствором.
Запасные вещества.
Многие
микроорганизмы
в
определенных
условиях
образуют
запасные вещества, которые обнаруживаются в клетке в виде гранулярных
цитоплазматических включений. Чаще всего это полисахариды, липиды,
полифосфаты, сера и др.
Гранулы углеводной природы (полисахариды). Выявляются при
обработке клетки раствором Люголя. Для этого к капле суспензии клеток на
предметном стекле добавляют каплю раствора Люголя. Препарат накрывают
покровным стеклом и микроскопируют. Гранулы крахмалоподобных веществ
- гранулезы - окрашиваются в синий, а гранулы гликогеноподобных
полисахаридов - в красновато-коричневый цвет. Реакция на гликоген хорошо
идет только в кислой среде, поэтому перед выявлением в клетках гликогена
среду, в которой выращивали микроорганизмы, подкисляют. Гранулы
гликогена при окраске Люголем легко выявляются у дрожжей.
Липидные гранулы. У дрожжей и мицелиальных грибов запасные
липиды представлены нейтральными жирами, которые обнаруживаются в
живых клетках без методов окраски в виде сильно преломляющих свет
капель.
Бактерии в качестве запасных липидов образуют поли-3-оксимасляную кислоту. Гранулы поли-р-оксибутирата хорошо заметны при
микроскопировании живых бактериальных клеток с фазово-контрастным
устройством, однако чаще для их выявления препарат окрашивают
липофильными красителями - Суданом III или Суданом черным. Готовят
тонкий мазок клеток, высушивают на воздухе и фиксируют в пламени
горелки. Поверхность мазка заливают раствором Судана черного и оставляют
краситель на 5-15 мин. Избыток красителя сливают, препарат высушивают
фильтровальной бумагой, просветляют в ксилоле, погружая в него несколько
раз предметное стекло (не более 1 мин). Затем препарат дополнительно
окрашивают в течение 10 с 1%-ным водным раствором сафранина. Более
длительная обработка сафранином нежелательна, так как маскируется основная краска. Гранулы поли-Р-оксибутирата окрашиваются в темный цвет,
остальная часть клетки - в розовый.
Полифосфаты (волютин, метахроматин). В клетках эукариот волютин
находится в вакуолях, в клетках прокариот - в цитоплазме. Окрашенные
гранулы волютина хорошо видны у дрожжей и молочнокислых бактерий.
Окраска основана на свойстве метахромазии - способности вызывать
изменение цвета некоторых красителей (метиленовый синий, толуидиновый
синий).
II РАЗДЕЛ. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ИЗУЧЕНИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ В СПИРТОВОМ ПРОИЗВОДСТВЕ.
2.1.
Морфолого-физиологическая характеристика дрожжей.
Форма клеток. Клетки дрожжей имеют разнообразную форму:
шаровидную, полушаровидную, овальную, яйцевидную, цилиндрическую,
лимоновидную (апикулятную), вытянутую, эллиптическую, стреловидную,
серповидную. У некоторых дрожжей форма бывает настолько характерной,
что она может служить для установления их родовой принадлежности.
Например, цилиндрические клетки у Schizosaccharomyces, стреловидные - у
Brettanomyces.
Многие дрожжи, обитающие в природных субстратах, особенно
бедных доступными питательными веществами, формируют на поверхности
клеток капсулы, толщина которых варьирует от едва заметного слоя,
обнаруживаемого только под электронным микроскопом, до размеров,
превышающих в несколько раз диаметр самой клетки. Обычно клетка бывает
равномерно покрыта капсульным материалом; у штаммов с овальными
клетками он более обилен по полюсам.
В качестве вспомогательного признака при диагностике дрожжей
можно
использовать
их
способность
образовывать
внутрицитоплазматические характерного вида включения - резервные
вещества разного химического состава. Так, у видов Lipomyces бывает
столько жира, что вся клетка заполнена им, у других - при жиронакоплении
липидные капли не сливаются в одну. Мелкогранулярная структура клеток
является результатом скопления многочисленных зерен гликогена.
Размеры клеток. Размеры клеток дрожжей варьируют в широких
пределах: наиболее мелкие клетки имеют диаметр 1,5-2 мкм, длину 3-5 мкм;
диаметр крупных клеток 8-10 мкм, длина 11-18 мкм; вытянутые клетки могут
достигать 20-25 мкм.
Мелкие клетки, например у видов Pichia и Hansenula, родов
Hanseniaspora
и
Kloeckera;
крупные
клетки
имеют
сахаромицеты,
липомицеты, крупные лимоновидные - у родов Nadsonia, Saccha-romycodes.
Структура дрожжевых клеток.
В настоящее время предложены новые концепции структурной
организации
дрожжевой
клетки,
выявляемой
методами
электронной
микроскопии. Структура клеток у отдельных видов дрожжей неодинакова и
значительно изменяется в зависимости от условий культивирования.
Клеточная стенка. От внешней среды дрожжевая клетка ограничена
прочной эластичной стенкой (оболочкой), толщина которой составляет 70350 нм. Клеточная стенка содержит гемицеллюлозы (60-70% сухой массы), в
состав которых входят глюканы, маннаны и хитин, у некоторых видов
базидиомицетов обнаружены ксиломаннаны.
Маннаны и глюканы являются основными полимерами клеточной
стенки и составляют обычно 60-80% сухой массы стенки. Содержание
хитина у почкующихся аскомицетовых дрожжей незначительно (1-2% сухой
массы клеточной стенки) и находится он главным образом в почечных
рубцах;
у
дрожжей
Schizosaccharomyces
хитин
отсутствует;
у
базидиомицетовых дрожжей основными компонентами клеточной стенки
являются р-глюкан и хитин.
Оболочка клетки содержит белки (6-13%), липиды (2-9%), неорганические
полифосфаты.
Белки
богаты
серусодержащими
амино-
кислотами и находятся в виде комплексных соединений с полисахаридами.
Обнаружен гликоген.
Функции клеточной стенки многогранны: отделяет клетку от среды и
придает ей форму, является динамичным компонентом, изменяющимся в
зависимости от условий роста; устойчива к механическим повреждениям,
несет электрический заряд, поддерживает внутриклеточное давление,
регулируя поступление в клетку через поры солей и низкомолекулярных
веществ.
Маннопротеины, входящие в состав стенки, играют роль рецепторов,
которые воспринимают сигналы, поступающие из среды, участвуют в
осуществлении контактов между организмами.
В периплазме (область, которая находится между внутренней
поверхностью
клеточной
стенки
и
внешней
поверхностю
цитоплазматической мембраны) локализуются ряд гидролитических ферментов: мелибиаза, мальтаза, инвертаза, кислая фосфатаза, аминопептидаза и др.
Сосредоточены в стенке транзитные соединения такие как феромоны и
киллертоксины.
На поверхности клеток обнаруживаются круглые кратерообразные
выступы стенки - почечные рубцы, почечные шрамы, число которых
характеризует физиологическое состояние клетки.
Цитоплазматическая мембрана (плазмолемма). Под клеточной
стенкой находится цитоплазматическая мембрана, в состав которой входит
одинаковое количество липидов и белков и значительно меньше углеводов,
обычно связанных с липидами и белками, то есть присутствуют в виде
гликолипидов или гликопротеидов.
Цитоплазматическая мембрана выполняет множество функций. Она
содержит ферменты, одни из которых взаимодействуют с субстратами,
находящимися с наружной стороны мембраны, другие - с субстратами
внутри пространства, ограниченного мембраной. Включает транспортные
системы,
которые
обеспечивают
перенос
специфических
молекул
органических питательных веществ, а также активируемой АТФазой
транспорт ионов К+ и Na+.
Клеточная мембрана участвует в преобразовании трансмембранной
разности электрических потенциалов в химическую энергию, запасаемую в
форме АТФ.
Цитоплазматическая мембрана способна к пиноцитозу, образуемый
пиноцитозный
пузырек
транспортирует
поглощенные
вещества
по
цитоплазме к вакуоли, где они подвергаются воздействию ферментов.
Установлено, что проникновение многих веществ в дрожжевую
клетку в значительной степени регулируется липидным остатком мембраны
и зависит от их растворимости в липидах и степени диссоциации.
Анаэробиоз увеличивает содержание в мембране нейтральных липидов, а
также насыщенных жирных кислот, в аэробных условиях обнаруживается
больше ненасыщенных жирных кислот, главным образом пальмитолеиновой
и олеиновой, а также эргостерола.
Цитоплазма. Состоит цитоплазма из воды, белков, углеводов,
липидов, низкомолекулярных органических соединений и минеральных
веществ, придающих ей высокую вязкость. Цитоплазма выполняет функции,
связанные с ростом клетки, процессами транспорта и метаболизма веществ
на первых этапах дыхания и гликолиза. В молодых клетках цитоплазма
гомогенна и слегка преломляет свет.
В цитоплазме содержатся структурные компоненты - органеллы
(органоиды), каждая из которых выполняет определенные физиологические и
биохимические
функции.
К
органеллам
клетки
относятся:
ядро,
митохондрии, рибосомы, аппарат Гольджи, сеть внутриклеточных мембран
(эндоплазматический
ретикулум),
лизосомы,
вакуоли,
микротельца,
фаголизосомы, микротрубочки.
Включения в цитоплазме - гликоген, жир, трегалоза, метахроматин и
др. - это временные образования в процессе метаболизма.
Митохондрии
-
высокоспециализированные
органеллы.
Их
обнаруживают на различных стадиях роста и развития клеток, в почках и в
спорах. Форма их сферическая, в виде палочек, утолщенных нитей. В
зависимости от условий культивирования насчитывают от 1 до 50
митохондрий.
Каждая
митохондрия
ограничена
двойной
мембраной:
наружная гладкая, внутренняя образует гребнеподобные выступы - кристы,
суммарная поверхность которых пропорциональна дыхательной активности
митохондрий. Функция митохондрий заключается в освобождении энергии
путем окисления субстратов и накоплении этой энергии в форме АТФ.
Поэтому митохондрии называют «силовыми станциями клетки».
Ферменты, содержащиеся в митохондриях, участвуют также в
воспроизведении
митохондриальной
ДНК,
биосинтезе
фосфолипидов,
стеринов, активации жирных кислот.
Рибосомы.
Это
ультрамикроскопические
плотные
сферические
гранулы нуклеопротеидной природы размером около 20 нм.
Для дрожжей характерны SOS-рибосомы. На долю их приходится до
трети массы клетки. В состав рибосом входит РНК (около 40-44%) и белок
(60-56%).
Рибосомы играют основную роль в синтезе белков. Количество
рибосом в клетке зависит от условий культивирования и стадий роста: в
молодых клетках их обычно больше.
Аппарат Гольджи. В клетках дрожжей аппарат Гольджи выявляется
очень
редко.
Состоит
он
из
пузырьков
и
пятислойных
мембран,
располагающихся в виде параллельно упакованных дисковидных пластин.
Эти мембраны морфологически связаны с ядерной мембраной и мембранами
эндоплазматического ретикулума. Служит аппарат Гольджи для секреции
продуктов метаболизма клетки.
Эндоплазматическая сеть (ретикулум). Эта органелла представляет
собой систему мембранных пластин, канальцев, пузырьков и цистерн,
окруженных элементарной мембраной, которая тоньше цитоплазматической
мембраны и зрелых мембран Гольджи. Отмечают непосредственную связь
эндоплазматического
ретикулума
с
ядерной
оболочкой
и
цитоплазматической мембраной.
Лизосомы - внутриклеточные органеллы, содержат большой набор
ферментов, гидролизующих белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты.
Элементарная
мембрана,
ограничивающая
лизосому,
предотвращает
действие ферментов, вызывающих внутриклеточное переваривание. При
разрыве ее ферменты освобождаются и вызывают автолиз клетки.
Микротельца - сборное понятие для обозначения
органелл,
называемых пероксисомами, глиоксисомами. Пероксисомы содержат много
каталазы
и
пероксидазы.
Метаболическая
функция
микро-телец
осуществляется во взаимодействии с другими клеточными компонентами митохондриями, цитозолем, эндоплазматическим ретикулумом - и связана с
включением в обмен источников углерода или азота, либо обоих
компонентов вместе.
Ядро. В живых клетках дрожжей ядро можно наблюдать, используя
фазово-контрастную и люминесцентную микроскопию на фиксированных и
окрашенных препаратах, а также при электронной микроскопии. Обычно
ядро имеет сферическую форму, но может деформироваться и становиться
серповидным или веретеноподобным.
Диаметр ядра 1-2 мкм. Оно отделено от цитоплазмы двухмемб-ранной
оболочкой (нуклеолеммой), снабженной порами и соединяющейся с другими
мембранными структурами клетки.
Внутренняя коллоидная фаза ядра называется нуклеоплазмой. В
неделящемся ядре различают две субстанции: оптически плотную, округлой,
овальной или серповидной формы, содержащей хроматин (ДНК) и
ахромотиновую часть, называемую ядрышком, которая содержит РНК.
Ядрышко является местом синтеза рибосомальной РНК, и размеры его
коррелируют с интенсивностью белкового синтеза в клетках.
В ядрах клеток обнаруживаются хромосоцы - нуклеопротеидные нити
толщиной около 10 нм, содержащие ДНК. Считается, что в ядре у
Saccharomyces в гаплоидном состоянии число хромосом 17; в диплоидном
состоянии их число удваивается.
Ядро является главным для жизнедеятельности среди всех органелл,
так как в нем содержится почти вся генетическая информация клетки,
закодированная в ДНК хромосом.
Вакуоли. Размеры и форма вакуолей в дрожжевых клетках нео-
динаковы. Обычно в клетке содержится одна или две вакуоли. Вакуоли
играют большую роль в явлениях осмоса благодаря способности накапливать
в значительном количестве ионы Na\ K+, Ca2+, Mg2+, C1", SO42" и РО43". В
вакуолях содержатся протеазы, рибонуклеазы, эстеразы и другие ферменты,
что свидетельствует о наличии в них гидролитических процессов.
В старых клетках в вакуолях появляются сферические образования из
полиметафосфатов и полифосфатов (волютина) и липоидные включения.
Внутриклеточные включения и запасные вещества.
В цитоплазме и в вакуолях содержатся скопления трегалозы,
гликогена, метахроматина (волютина), липидов, серы, Сахаров, кристаллов
кислот. Они обычно не растворимы в воде и находятся в клетке в
осмотически инертной форме.
Гликоген (полисахарид из структуры близкой к крахмалу растений) и
трегалоза
(нередуцирующий
дисахарид)
содержатся
в
клетках
в
значительных количествах и являются запасными веществами.
2.2. Дрожжи.
К. активно сбраживающим сахара (спиртообразующим) относятся
дрожжи родов Saccharomyces и Schizosaccharomyces.
Род Saccharomyces.
Клетки дрожжей округлые, овальные или удлиненные, эллиптические.
Размеры (10,5-18) х (3,5-10,5) мкм.
Вегетативное
размножение
почкованием.
С
наступлением
не-
благоприятных условий возникают более стойкие покоящиеся формы - сумки
со спорами (аскоспоры).
Сумки со спорами возникают партеногенетически из прекративших
почкование клеток. Образуется 1-4 и редко до 8 спор. Споры шаровидные и
слегка эллипсовидные с гладкими оболочками.
При благоприятных для вегетативного развития условиях споры снова
превращаются в почкующиеся клетки. Этому предшествует разбухание и
затем копуляция или двух прорастающих спор непосредственно или их
первых почек. Вегетативное поколение дрожжей рода Saccharomyces всегда
диплоидно. Образующиеся при прорастании спор зиготы долго сохраняют в
культуре характерную гантелеобразную форму.
Дрожжи этого рода не используют нитраты, живут и разножаются
только в сахаросодержащих субстратах - природных и искусственно
приготовленных человеком с количеством сахара не превышающим обычно
30-32%. Обладают высокой способностью использования Сахаров при
сбраживании и образования из них наибольшего количества этилового
спирта, от 10 до 19 % по объему.
Вид - Saccharomyces cerevisiae Hansen известен в десятках синонимов,
которые в настоящее время в определителе Крегерван Рая рассматриваются
как производственные расы, но не самостоятельные виды и по Д. Ярроу
рассматриваются как производственные расы, но не самостоятельные виды.
Saccharomyces vini (син. S. Cerevisiae) — это наиболее распространенный вид дрожжей при сбраживании соков плодов и ягод. Среди всех
дрожжей рода Saccharomyces, развивающихся при брожении соков, S. vini
составляет 80 %. Сбраживаемая среда покрывается пеной; характер
дрожжевого осадка зависит от расы: он пылевидный, легко взмучивающийся
или хлопьевидный (конгломератный) - легко осаждающийся.
На сусло-агаре формируют колонии круглой формы с выпуклым
центром и ровными краями, желтовато-белого цвета, маслянистые, гладкие
или складчато-шероховатые, морщинистые. Для S. vini наиболее эффективны
следующие ростовые вещества: пантотеновая кислота, биотин, мезоинозит, в
меньшей степени - тиамин и пиридоксин.
Расы дрожжей вида S. vini обладая индивидуальными особенностями
по спиртообразующей способности (предельная объемная доля образуемого
спирта 14-16%), сульфитовыносливости, по биосинтезу летучих компонентов
и других продуктов быстро становятся доминирующими в брожении вина,
придают ему характерный букет и вкус, определяют состав.
В осадках старых вин дрожжи этого вида встречаются редко, так как
они по окончании брожения сусла вытесняются более спиртовыносливыми
дрожжами. Брожение сладких вин всегда вызывают дрожжи более
спиртовыносливые и устойчивые к диоксиду серы.
Saccharomyces oviformis (син. 5. cerevisiae) - выделены из самозабродившего виноградного сусла, но обнаруживаются в нем реже, чем S.
vini. Часто встречаются в шампанском производстве.
В чистых культурах S. oviformis хорошо развиваются в виноградном
сусле, сбраживая почти полностью содержащиеся в нем сахара, образуют
около 18% спирта. В отличие от 5. vini не сбраживают галактозу.
Потребности в факторах роста у них аналогичные S. vini. В начале брожения
размножаются медленнее, чем S. vini, но вследствие большей устойчивости к
спирту содержание их непрерывно растет в ходе брожения. При
использовании этих дрожжей в виноделии получают хорошие результаты в
случае сбраживания сусла с высоким содержанием Сахаров при получении
сухих столовых вин.
Вследствие широкого распространения, высокой спиртообразующей
способности и устойчивости к этанолу S. oviformis в основном вызывает
брожение вин, содержащих сахара. Дрожжи шампанского производства
часто принадлежат к этому виду.
Хересные дрожжи, образующие на поверхности вина пленку,
являются разновидностью S. oviforvis.
Saccharomyces oviformis var. cheresiensis - вызывают энергичное
брожение Сахаров с образованием до 17,6% спирта. После окончания
брожения на этом же вине они развиваются в виде пленки. В результате
окисления спирта с образованием ацетальдегида (до 700 мг/дм3) и
параллельного накопления ацеталей и эфиров придают вину хересный тон.
Наиболее благоприятной температурой для развития хересных дрожжей в
виде пленки является температура 18-20°С при обязательном доступе
кислорода воздуха. Н.Ф. Саенко рекомендует применять хересные дрожжи
для исправления больных вин, содержащих уксусную и молочную кислоты и
обладающих мышиным тоном.
Saccharomyces uvarum (син. 5. cerevisiae). Дрожжи этого вида в
виноделии встречаются часто, по морфологии неотличимы от других видов
дрожжей-сахаромицетов.
При
брожении
образуют
12-13%
спирта.
Отличаются от других видов высокой холодостойкостью. Образуют плотный
невзмучиваемый
осадок,
не
дают
пены,
синтезируют
повышенные
количества глицерина.
Saccharomyces carlsbergensis (син. S. cerevisiae). Морфологически
мало
отличается
от
других
видов
этого
рода.
Способность
к
спорообразованию слабая. Хорошо развивается при низкой температуре (510°С). На дрожжах этого вида ведется производство пива методом низового
брожения.
Saccharomyces cerevisiae (син. S. cerevisiae). Почти неотличимы от
других видов рода Saccharomyces. В виноградном соке и в вине дрожжи
этого вида встречаются редко, поэтому практически их роль в виноделии
незначительная. Применяются в основном в производстве дрожжей и при
получении этилового спирта.
Род Schizosaccharomyces
По
форме
клетки
дрожжей-шизосахаромицетов
имеют
слабо
эллиптическую или цилиндрическую форму с закругленными концами и
размерами (3-5) х (6-16) мкм. Размножаются они делением, а не
почкованием.
Сумки формируются из копулирующих клеток. Аскоспоры круглые
или овальные. Могут освобождаться от сумок на ранних стадиях. С раствором Люголя дают реакцию на крахмал. Активно сбраживают сахара,
нитраты не ассимилируют. Эти дрожжи развиваются не только за счет
глюкозы и сахарозы, широко распространенных в природных субстратах, но
и за счет осажденных крахмалистых субстратов - мальтозы и декстринов,
образуют осадок пылевидный или хлопьевидный, на поверхности среды
иногда образуют кольца.
Окислительная способность у дрожжей этого рода развита очень
слабо. Усваивают источники углеродистого питания главным образом в
процессе брожения, способны сбраживать сахара с образованием спирта
(этанола) до 12%; яблочную кислоту сбраживают в спирт и углекислоту при
наличии в среде хотя бы небольших количеств (1-2%) сахара. Чрезвычайно
устойчивы к сернистому ангидриду, без вреда для своей жизнедеятельности
выносят содержание в среде SO7 до 1000 мг/дм3 и более. При низких
температурах (10-15°С) развиваются значительно медленнее, чем S. vini.
Оптимальная температура их развития 30 °С.
По систематике В.И. Кудрявцева род Schizosaccharomyces включает
два вида Schiz. pombe и Schiz. acidodevoratus; близким по свойствам является
род Octosporomyces, (с 8 бобовидными аскоспорами) включающий виды japonicus и octosporus.
В систематике Крегера ван Рая по Ярроу род Schizosaccharomyces
имеет 4 вица: japonicus, malidevorans, octosporus, pombe.
Дрожжи - сорняки брожения.
К посторонней микрофлоре (дикие дрожжи, сорняки брожения)
относятся дрожжи слабо бродящие, вызывающие заболевания и пороки вин,
сопровождающиеся посторонними тонами во вкусе и аромате. К таким
относятся
дрожжи
следующих
родов:
Bhettano-myces,
Candida,
Hanseniaspora, Hansenula, Kloeckera, Kluyveromyces, Mycoderma, Pichia,
Rhodotorula.
Род Brettanomyces
Клетки дрожжей этого рода имеют разнообразную форму: овальную,
удлиненно-продолговатую, иногда со стреловидно-заостренными концами,
сильно удлиненные, палочковидной формы, чаще соединенные по 2 и
больше, псевдомицелий - рудиментарный. Почкование двустороннее и
множественное. Спор не образует. Размножается на сусле и сусло-агаре
очень медленно. На поверхности вина образует тонкую, гладкую, сероватобеловатую пленку. Рост медленный, культуры быстро отмирают из-за
образования уксусной кислоты в токсической концентрации. Совершенные
формы, образующие споры, классифицируются в роде Dekkera.
Для изоляции и улучшения роста видов Brettanomyces и Dekkera к
комплексным средам добавляют тиамин (10 мг/дм3), а также 0,5% карбоната
кальция (для снижения кислотности среды) и 100 мкг/дм циклогексимида
(для подавления роста других видов дрожжей).
Br. custersii обладает высокой спиртообразующей способностью:
полностью сбраживают 18 % Сахаров в сусле с образованием 11-12% об.
спирта; спиртовыносливость ослаблена, и в вине, содержащем более 12 об.
спирта,
рост
культуры
прекращается.
Является
сильным
кислотообразователем, количество образуемого уксуснокислого эфира может
быть очень большим, легко ощущаемым, обогащает вино летучими и нелетучими кислотами с резким неприятным запахом уксусного амида
(мышиный
тон),
что
делает
вино
совершенно
непригодным
для
употребления.
В противоположность другим видам и родам дрожжей Brettanomyces
устойчив к сорбиновой кислоте, чувствителен к SO, (погибает при 100
мг/дм3), относится к разряду термофильных - с оптимальной температурой
31-32°С. Вызывают помутнения столовых вин ( часто сопровождающиеся
появлением мышиного тона), могут вызвать остановку брожения «покрасному».
Очень хорошо размножается в вине с 2% сахара, поэтому могут
задержать и нарушить нормальный ход шампанизации вин, а также
проведение ремюажа и дегоржажа.
Продукты, образуемые дрожжами этого рода, тормозят рост и
бродильные свойства шампанских дрожжей, являясь причиной недоброда
тиражной смеси. Наличие мелких клеток бреттаномицетов в дрожжевом
осадке затрудняет переведение его на пробку и полное удаление из бутылки
при дегоржаже, что приводит к увеличению брака шампанского.
Род Candida.
Дрожжевые организмы рода
неспорообразующим
дрожжам.
Candida относятся к пленчатым
Клетки
овальной
и
удлиненно-
цилиндрической формы, содержат по 1-2 жировых капельки.
Штих-культура сероватая до кремовой, тусклая или полутусклая,
мягкая, гладкая или полностью гранулированная. Сахара не сбраживает,
ассимилирует глюкозу, этанол, маннит, часть штаммов усваивают глицерин и
молочную кислоту.
Не используют нитраты в качестве источника азота и требуют для
роста из витаминов только биотин.
Род Pichia.
Клетки округлые, овальные, сильно вытянутые. Размеры (4-10) х (2-5)
мкм. Размножаются многосторонним почкованием; многие виды образуют
псевдомицелий с бластоспорами, иногда-истинный мицелий. Аскоспоры
округлые, шляповидные, обычно гладкие, редко шероховатые. В аске от 1 до
4 (иногда больше) спор, при созревании легко освобождаются. Брожение не у
всех видов; нитраты не ассимилируют; в витаминах не нуждаются.
В сахаросодержащих средах развиваются с образованием морщинистой пленки. На плотной среде культура дрожжей матовая, очень
скудная, тонкоморщинистая. Обладают способностью усваивать сахара
только путем окисления. Могут развиваться за счет окисления спиртов,
органических кислот, поэтому хорошо растут на поверхности уже
сброженных субстратов - вина, пива и других, содержание спирта в которых
не превышает 12-13% об. Устойчивы к диоксиду серы. Часто даже введение
500 мг/дм3 сернистой кислоты не задерживает их развитие.
Род Saccharomycodes.
Клетки крупные, до 20 мкм и более в длину, лимоновидные ил и
удлиненно-овальные. Вегетативное размножение - биполярное почкующееся
деление. Сумки со спорами возникают без предварительной конъюгации из
диплоидных вегетативных клеток; содержат по 2 или 4 крупные аскоспоры с
гладкой оболочкой, расположены попарно и в месте соединения имеют
иногда узкий ободок. Споры при созревании не освобождаются, а
копулируют попарно и прорастая, разрывают стенку аска. У некоторых
споры прорастают без конъюгации. Колонии белые бластообразные; на
жидких средах образуют осадок и кольцо. Сахара сбраживают. Нитраты не
усваивают. Колонии белые пастообразные. Известен один вид- 5"codes
ludwigii Hansen. Дрожжи, описанные В.И. Кудрявцевым как Saenkia bispora в
определителе Лоддер рассматриваются как синоним Scodes ludwigii.
Saccharomycodes ludwigii часто встречаются в сульфитированных винах и
соках с массовой концентрацией до 800 мг/дм3 общего и от 80 до 120 мг/дм3
свободного
диоксида
серы.
Образуют
10-12%
об.
этанола,
много
уксусноэтилового эфира, придающего неприятный (прокисший) запах
продукту. Дрожжи-сахаромикоды являются довольно частым сорняком в
шампанском производстве, могут тормозить вторичное брожение. Вызывают
помутнения разлитых в бутылки виноградных и плодово-ягодных вин.
Род Wingea.
Клетки округлые или овальные, редко немного удлиненные.
Размножаются многосторонним почкованием. Псевдомицелия нет или
имеется
рудиментарный.
Спор
не
образует.
Колонии
бесцветные.
Полисахаридов крахмалистого типа не производят. В жидкой среде образуют
осадок, на поверхности - кольцо, редко - пленку. Сахара многие виды
сбраживают активно. В природе распространены широко. Выделяют их из
виноградного сусла в основном из белых сортов винограда и винограда с
«благородной гнилью». Род очень гетерогенный.
Вид Torulopsis stellata сбраживает глюкозу, сахарозу и раффинозу на
1/3; быстрее сбраживает фруктозу, чем глюкозу, обладает осмофильными
свойствами; дрожжи этого вида способны развиваться в присутствии
высоких концентраций сахара (до 60%). Хорошо размножаются при
повышенной температуре (30-35°С), будучи чувствительными к холоду.
Сульфитоустойчивы как и дрожжи S. vim.
Эти дрожжи совместно с Hans, apiculata вызывают забраживание
сусла; способны накапливать спирт в среднем до 10,8% об. и могут
развиваться в присутствии 12,5% об. спирта. Среды, сброженные Т. stellata,
не имеют каких-либо особых органолептических или аналитических
характеристик.
Род Zygosaccharotnyces.
Клетки круглые и овальные. Размеры от (2-8) х (2,5) мкм до (5-13) х
(4,5-7)
мкм.
Размножаются
многосторонним
почкованием.
Образуют
аскоспоры (от 1 до 4 в сумке). Асками становятся зиготы, образующиеся
после изо- и гетерогамной конъюгации отдельных клеток.
Нитраты не ассимилируют. Общая биологическая особенность способность развиваться в субстратах с высокими массовыми концентрациями сахара (до 80%) - в вакуум-сусле, бекмесе и вызывать их
забраживание. Самые осмофильные из всех родов. Сбраживают глюкозу и
фруктозу. Могут развиваться и вызывать забраживание вина с массовой
концентрацией сахара от 20 до 50 г/дм3.
Ill РАЗДЕЛ. РАЗМНОЖЕНИЕ.
Жизнь дрожжевых клеток, как одноклеточных эукариот. сопровождается сменами вегетативного и полового размножения и, в связи с этим,
сменами гапло- и диплофаз. Особенностью дрожжей является то, что у части
видов вегетативное размножение клеток происходи в гаплофазе, а у других
видов - в диплофазе.
3.1.
Вегетативное размножение (митоз).
Способ
клеточного
деления,
характерный
для
большинства
дрожжевых организмов, получил название почкование. Только у дрожжей из
рода Schizosaccharomyces и дрожжевых организмов Endomyces клетки
делятся путем построения межклеточной перегородки.
В самом начале процесса образования почки происходит небольшое
местное растяжение клеточной оболочки, выпячивание ци-топлазматической
мембраны и эндоплазматического ретикулума. В начале процесса почкования
значительно
уменьшается
объем
родительской
клетки.
Клеточные
перегородки материнской клетки и почки строятся одновременно и
самостоятельно, при этом полное формирование перегородки почки
заканчивается быстрее. Почечные шрамы всегда остаются на материнской
клетке после отделения почек. Обычно они выглядят в виде кратерообразных
структур на поверхности клеточных оболочек. Почечные шрамы на
поверхности дрожжевых клеток легко выявляются не только на электронномикроскопических
препаратах,
но
также
и
при
флуоресцентном
микроскопировании.
При многополярном характере почкования новая почка не образуется
на месте старого почечного шрама.
При
биполярном
почковании
(виды
Saccharomycodes)
почки
образуются поочередно на двух полюсах клетки. При этом образуются
множественные почечные шрамы в виде колец вокруг полюсов клетки.
Образование новой почки начинается внутри воротничково-го кольца от
предыдущей почки. У дрожжей Saccharomycodes ludwigii, Hanseniaspora
valbyensia первая почка возникает на полюсе, противоположном родильному
шраму, а затем образуется поочередно на обоих полюсах клетки, поскольку
количество рубцов на обоих полюсах при многократном почковании,
оказывается примерно одинаковым. У дрожжей из рода
Nadsonia,
отличающихся апикулятным, но многополярным почкованием, вторая почка
может развиваться в центре или у края предыдущего почечного шрама.
У
делящихся
дрожжей
Schizosaccharomyces
pombe
клеточная
перегородка закладывается сначала в виде кольца внутри цилиндрической
поверхности исходной клетки и растет, как и у всех дрожжей, в направлении
к центру. При разделении перегородки образуются две более короткие
цилиндрические клетки, на каждой из которых сохраняется утолщенный
поясок по месту разлома, который и представляет собой шрам деления.
Образование ложного и истинного мицелия. При почковании
зрелые почки могут не отделяться от материнской клетки и образуют
цепочки клеток приблизительно одинакового размера или грозди. Это
приводит к образованию ложных гиф (псевдомицелия).
В ложном мицелии клетки дифференцированы: вокруг удлиненных
клеток (в местах их соединения) кучками, мутовками или поодиночке
располагаются мелкие, крупные или овальные клетки - бластоспоры. По
характеру
расположения
бластоспор
различают
несколько
типов
псевдомицелия (часто при изучении видов рода Candida).
Истинный мицелий имеется только у дрожжей, способных размножаться делением. При этом ветви различного размера разрастаются в
результате непрерывного роста верхушки гифы, поперечная перегородка
между клетками образуется без сужения. Мицелий может распадаться на
части, в результате формируется одноклеточные артроспоры — оидии.
Образование мицелия с пряжками характерно для базидиомицетовых
дрожжей.
Образование эндоспор. Эндоспоры - вегетативные клетки, которые
разграничиваются внутри клетки или гифы. Их можно наблюдать в старых
культурах на солодово-дрожжевом агаре, сусло-агаре, картофельном или
кукурузно-молочном агаре при комнатной температуре. Обычно образуются
они у дрожжей Candida, Cryptococcus.
Образование хламидоспор. У некоторых видов дрожжей (Candida
albicuns, С. tropicalis и др.) на средах, благоприятствующих липогенезу,
формируются хламидоспоры Это толстостенные неполового происхождения
споры,
образующиеся
интеркалярно
или
терминально
в
результате
округления клеток. Они содержат много жира и поэтому хорошо сохраняют
жизнеспособность в период покоя.
Образование баллистоспор. Это один из способов бесполого
размножения, присущий родам Sporobolomyces, Bullera и Sporidiobolits. Эти бесполые споры формируются на заостренных выростах
вегетативных клеток стеригмах
в
и
при
созревании
отбрасываются
воздух капельновыделительным механизмом.
3.2. Половое размножение (мейоз и спорообразование у дрожжей).
Половой или мейотический цикл размножения обнаруживается у
большинства видов дрожжей в результате предшествующего слияния ядер
двух клеток. Мейоз протекает у них во время споруляции диплоидных клеток
или диплоидных зигот (в случае вегетативного размножения в гаплофазе) и
заканчивается образованием асков с гаплоидными спорами (аскоспорами).
У многих видов, в том числе и у дрожжей из рода Saccharomyces в
асках образуется 4 споры. У некоторых видов, в частности у Schizosaccharomycesoctosporus и у дрожжей из родов Nematospora, нормально
образуется восемь аскоспор. Исключительным является множественное
образование спор (50-100) дрожжами Kluyveromyces polysporus. Есть виды
дрожжей, у которых образуется по две споры в аске у некоторых - по одной
споре. Таким образом, спорообразование у дрожжей является результатом
полового процесса и этим принципиально отличается от процесса
спорообразования у бактерий. Аскоспоры дают начало дрожжам, которые
размножаются почкованием.
Форма спор у дрожжей разных видов может быть различной
(округлой, овальной, шляпообразной и т.д.), однако она является характерной
для вида и служит, таким образом, систематическим признаком.
Аскоспоры представляют собой в какой-то степени покоящиеся
клетки
с
толстыми
оболочками,
устойчивые
к
неблагоприятным
климатическим условиям, действию высокой температуры, высушиванию и
другим неблагоприятным внешним воздействиям. Однако аскоспоры не так
термостабильны, как бактериальные споры и быстро погибают при 60 °С,
тогда как споры бактерий переносят температуру кипящей воды и даже более
высокие температуры в течение нескольких часов.
По способу полового размножения дрожжи подразделяют на
перфектные или телеоморфные, у которых половая стадия может быть
представлена аском или базидией, и имперфектные или анаморфные, у
которых половая стадия отсутствует.
Жизненный цикл перфектных дрожжей связан с чередованием
вегетативного размножения и спорообразования с разной стадией гаплоидной
и диплоидной стадий. Так, у дрожжей рода Schizosaccharomyces вегетативное
размножение клеток проходит в гаплоидной фазе (клетки имеют одинарный
набор хромосом); у дрожжей ода Saccharomyces одни виды вегетативно
растут в гаплоидной фазе, другие - в диплоидной, а у некоторых видов нет
четкого разграничения чередования гаплоидной и диплоидной фаз.
Дрожжи со сменой дипло- и гаплофаз делятся на две группы гомоталличные и гетероталличные. У гомоталличных штаммов быстро
протекает диплоидизация гаплоидных спор или их потомства и тогда
диплоидная фаза является устойчивой, при этом сливаться (конъюгировать)
могут только потомки одной споры или гаплоидные клетки, образовавшиеся
из одной споры. У гетероталличных дрожжей сливаться могут лишь клетки,
образовавшиеся из разных спор (клеток), между которыми есть половые
различия. Потомство одной споры гетероталличных дрожжей всегда
гаплоидно т.е. имеет один из двух типов спаривания. Вегетативное
размножение гетероталличных дрожжей может протекать либо в гаплоидной
либо в диплоидной фазе. Диплоиды могут формироваться в результате
слияния гаплоидных вегетативных клеток или аскоспор противоположных
типов спаривания.
Аскоспорообразование - это важный период жизненного цикла
клеток, включающий много последовательных различных состояний клеток
дрожжей.
РАЗДЕЛ 1V.ОСНОВЫ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ.
4.1.
Предмет генетики.
Генетика — наука, изучающая закономерности и материальные
основы наследственности и изменчивости организмов, а также механизмы
эволюции
живого.
Наследственностью
поколения
передавать
другому
называется
признаки
строения,
свойство
одного
физиологические
свойства и специфический характер индивидуального развития. Свойства
наследственности реализуются в процессе индивидуального развития.
Наряду со сходством с родительскими формами в каждом поколении
возникают те или иные различия у потомков, как результат проявления
изменчивости.
Изменчивостью
называется
свойство,
противоположное
наследственности, заключающееся в изменении наследственных задатков —
генов и в изменении их проявления под влиянием внешней среды. Отличия
потомков от родителей возникают также вследствие возникновения
различных комбинаций генов в процессе мейоза и при объединении
отцовских и материнских хромосом в одной зиготе. Эти и, другие формы
изменчивости подробнее изложены. Здесь надо отметить, что выяснение
многих вопросов генетики, особенно открытие материальных носителей
наследственности и механизма изменчивости организмов, стало достоянием
науки последних десятилетий, выдвинувших генетику на передовые позиции
современной биологии. Основные закономерности передачи наследственных
признаков были установлены на растительных и животных организмах, они
оказались приложимы и к человеку. В своем развитии генетика прошла ряд
этапов.
Первый этап ознаменовался открытием Г. Менделем (1865)
дискретности
(делимости)
наследственных
факторов
и
разработкой
гибридологического метода изучения наследственности, т. е. правил
скрещивания организмов и учета признаков у их потомства. Дискретность
наследственности состоит в том, что отдельные свойства и признаки
организма развиваются под контролем наследственных факторов (генов),
которые при слиянии гамет и образовании зиготы не смешиваются, не
растворяются, а при формировании новых гамет наследуются независимо
друг от друга.
Значение открытий Г. Менделя оценили после того, как его законы
были вновь переоткрыты в 1900 г. тремя биологами независимо друг от
друга: де Фризом в Голландии, К. Корренсом в Германии и Э. Чермаком в
Австрии. Результаты гибридизации, полученные в первое десятилетие XX в.
на различных растениях и животных, полностью подтвердили менделевские
законы наследования признаков и показали их универсальный характер по
отношению ко всем организмам, размножающимся половым путем.
Закономерности наследования признаков в этот период изучались на уровне
целостного организма (горох, кукуруза, мак, фасоль, кролик, мышь и др.).
Менделевские законы наследственности заложили основу теории гена —
величайшего открытия естествознания XX в., а генетика превратилась в
быстро развивающуюся отрасль биологии. В 1901 — 1903 гг. де Фриз
выдвинул мутационную теорию изменчивости, которая сыграла большую
роль в дальнейшем развитии генетики. Важное значение имели работы
датского ботаника В. Иоганнсена, который изучал закономерности наследования на чистых линиях фасоли. Он сформулировал также понятие
«популяция»
(группа
организмов
одного
вида,
обитающих
и
размножающихся на ограниченной территории), предложил называть
менделевские «наследств венные факторы» словом ген, дал определения
понятий «генотип» и «фенотип».
Второй этап характеризуется переходом к изучению явлений
наследственности на клеточном уровне (цитогеЯ нетика). Т. Бовери (1902—
1907), У. Сэттон и Э. Вильсон. (1902—1907) установили взаимосвязь между
менделевскими законами наследования и распределением хромосом в
процессе клеточного деления (митоз) и созревания половых клеток (мейоз).
Развитие учения о клетке привело к уточнению строения, формы и
количества хромосом и помогло установить, что гены, контролирующие те
или иные признаки, не что иное, как участки хромосом. Это послужило
важной предпосылкой утверждения хромосомной теории наследственности.
Решающее значение в ее обосновании имели исследования, проведенные на
мушках дрозофилах американским генетиком Т. Г. Морганом и его
сотрудниками (1910—1911). Ими установлено, что гены расположены в
хромосомах в линейном порядке, образуя группы сцепления. Число групп
сцепления генов соответствует числу пар гомологичных хромосом,
и
гены
одной группы сцепления могут перекомбинироваться в процессе мейоза
благодаря явлению кроссинговера, что лежит в основе одной из форм
наследственной комбинативной изменчивости организмов. Морган установил также закономерности наследования признаков, сцепленных с полом.
Третий этап в развитии генетики отражает достижения молекулярной
биологии и связан с использованием методов и принципов точных наук —
физики, химии, математики, биофизики и др. - в изучении явлений жизни на
уровне молекул. Объектами генетических исследований стали грибы,
бактерии, вирусы. На этом этапе были изучены взаимоотношения между
генами и ферментами и сформулирована теория «один ген — один фермент»
(Дж. Билл и Э. Татум, 1940): каждый ген контролирует синтез одного
фермента; фермент в свою очередь контролирует одну реакцию из целого
ряда биохимических превращений, лежащих в основе проявления внешнего
или внутреннего признака организма. Эта теория сыграла важную роль в
выяснении
физической
природы
гена
как
элемента
наследственной
информации.
В 1953 г. Ф. Крик и Дж. Уотсон, опираясь на результаты опытов
генетиков и биохимиков и на данные рентгеноструктурного анализа, создали
структурную модель ДНК в форме двойной спирали. Предложенная ими модель ДНК хорошо согласуется с биологической функцией этого соединения:
способностью к самоудвоению генетического материала и устойчивому
сохранению его в поколениях — от клетки к клетке. Эти свойства молекул
ДНК объяснили и молекулярный механизм изменчивости: любые отклонения
от исходной структуры гена, ошибки самоудвоения генетического материала
ДНК, однажды возникнув, в дальнейшем точно и устойчиво воспроизводятся
в дочерних нитях ДНК. В последующее десятилетие эти положения были
экспериментально
подтверждены:
уточнилось
понятие
гена,
был
расшифрован генетический код и механизм его действия в процессе синтеза
белка в клетке. Кроме того, были найдены методы искусственного получения
мутаций и с их помощью созданы ценные сорта растений и штаммы
микроорганизмов — продуцентов антибиотиков, аминокислот.
Возникло новое направление в молекулярной генетике генная
инженерия — система приемов, позволяющих биологу конструировать
искусственные генетические системы. Генная инженерия основывается на
универсальности
генетического
кода:
триплеты
нуклеотидов
ДНК
программируют включение аминокислот в белковые молекулы всех
организмов — человека, животных, растений, бактерий, вирусов. Благодаря
этому можно синтезировать новый ген или выделить его из одной бактерии и
ввести его в генетический аппарат другой бактерии, лишенной такого гена.
Подобные пересадки генов пока удаются на микроорганизмах или в культуре
клеток, но не на целостном многоклеточном организме. Однако в будущем на
этом пути можно ожидать больших результатов в отношении управления
свойствами наследственности.
Таким образом, третий, современный этап развития генетики открыл
огромные
перспективы
направленного
вмешательства
в
явления
наследственности и селекции растительных и животных организмов, выявил
важную роль генетики в медицине, в частности, в изучении закономерностей
наследственных болезней и физических аномалий человека.
4.2.
Закономерности исследования признаков.
Основные закономерности передачи наследственных признаков от
родителей к потомкам были установлены Г. Менделем во второй половине
XIX в. Он скрещивал растения гороха, различающиеся по отдельным признакам, и на основе полученных результатов обосновал идею о существовании
наследственных задатков, ответственных за проявление признаков. В своих
работах Мендель применил метод гибридологического анализа, ставшего
универсальным в изучении закономерностей наследования признаков у
растений, животных и человека.
В отличие от своих предшественников, пытавшихся проследить
наследование многих признаков организма в совокупности, Мендель
исследовал это сложное явление аналитически. Он наблюдал наследование
всего
лишь
одной
пары
или
небольшого
числа
альтернативных
(взаимоисключающих) пар признаков у сортов садового гороха, а именно:
белые и красные цветки; низкий и высокий рост; желтые и зеленые, гладкие
и морщинистые семена гороха и т. п. Такие контрастные признаки называются аллелями, а термин «аллель» и «ген» употребляют как синонимы.
Для скрещиваний Мендель использовал чистые линии, т. е. потомство
одного самоопыляющегося растения, в котором сохраняется сходная
совокупность генов. Каждая из этих линий не давала расщепления признаков.
Существенным в методике гибридологического анализа было и то, что
Мендель впервые точно подсчитал число потомков — гибридов с разными
признаками, т. е. математически обработал полученные результаты и ввел
для записи различных вариантов скрещивания принятую в математике
символику: А, В, С, D и т. д. Этими буквами он обозначал соответствующие
наследственные факторы.
В современной генетике приняты следующие условные обозначения
при скрещивании: родительские формы — Р; полученные от скрещивания
гибриды первого поколения — F1; гибриды второго поколения — F2,
третьего — F3, и т. д. Само скрещивание двух особей обозначают знаком х
(например: АА х аа).
Из множества разнообразных признаков скрещиваемых растений
гороха в первом опыте Мендель учитывал наследование лишь одной пары:
желтые и зеленые семена, красные и белые цветки и т. д. Такое скрещивание
называется моногибридным. Если прослеживают наследование двух пар
признаков, например желтые гладкие семена гороха одного сорта и зеленые
морщинистые - другого, то скрещивание называют дигибридным. Если же
учитывают три и большее число пар признаков, скрещивание именуют
полигибридным.
Аллели обозначают буквами латинского алфавита, при этом одни
признаки Мендель назвал доминирующими (преобладающими) и обозначил
их заглавными буквами — А, В, Сит. д., другие — рецессивными
(уступающими, подавляемыми), которые обозначил строчными буквами — а,
в, с и т. д. Поскольку каждая хромосома (носитель аллелей или генов)
содержит лишь одну из двух аллелей, а гомологичные хромосомы всегда
парные (одна отцовская, другая материнская), в диплоидных клетках всегда
есть пара аллелей: АА, аа, Аа, ВВ, bb, Bb и т. д. Особи и их клетки, имеющие
в своих гомологичных хромосомах пару одинаковых аллелей (АА или аа),
называются гомозиготными. Они могут образовывать только один тип
половых клеток: либо гаметы с аллелью А, либо гаметы с аллелью а. Особи, у
которых в гомологичных хромосомах их клеток имеются и доминантный, и
рецессивный гены Аа, называются гетерозиготными; при созревании
половых клеток они образуют гаметы двух типов: гаметы с аллелем А и
гаметы с аллелем а. У гетерозиготных организмов доминантная аллель А,
проявляющаяся фенотипически, находится в одной хромосоме, а рецессивная
аллель а, подавляемая доминантом, — в соответствующем участке (локусе)
другой гомологичной хромосомы. В случае гомозиготности каждая из пары
аллелей отражает либо доминантное (АА), либо рецессивное (аа) состояние
генов, которые в обоих случаях проявят свое действие. Понятие о
доминантных
и
рецессивных
наследственных
факторах,
впервые
примененное Менделем, прочно утвердилось в современной генетике. Позже
были введены понятия генотип и фенотип. Генотип — совокупность всех
генов, которые имеются у данного организма. Фенотип — совокупность всех
признаков
и
свойств
индивидуального
организма,
развития
в
которые
данных
выявляются
условиях.
в
процессе
Понятие
фенотип
распространяется на любые признаки организма, начиная от первичных
продуктов действия генов — молекул РНК и полипептидов и кончая
особенностями внешнего строения, физиологических процессов, поведения и
т. д. Фенотипическое проявление признаков всегда реализуется на основе
взаимодействия генотипа с комплексом факторов внутренней и внешней
среды.
4.3.
Законы Менделя.
Закономерности наследования признаков Г. Мендель сформулировал
на основе анализа результатов моногибридного скрещивания и назвал их
правилами (позже они стали называться законами). Как оказалось, при
скрещивании растений двух чистых линий гороха с желтыми и зелеными
семенами в первом поколении (F1) все гибридные семена имели желтый цвет.
Следовательно, признак желтой окраски семян был доминирующим. В
буквенном выражении это записывается так: Р АА х аа; все гаметы одного
родителя А, А, другого — а, а, возможное сочетание этих гамет в зиготах равно четырем: или Аа, Аа, Аа, Аа, т. е. у всех гибридов F1 наблюдается полное
преобладание одного признака над другим — все семена при этом желтого
цвета. Аналогичные результаты получены Менделем и при анализе наследования других шести пар изученных признаков. Исходя из этого, Мендель
сформулировал
правило
доминирования,
моногибридном
скрещивании
все
или
потомство
первый
в
первом
закон:
при
поколении
характеризуется единообразием по фенотипу и генотипу — цвет семян
желтый, сочетание аллелей у всех гибридов Аа. Эта закономерность
подтверждается и для тех случаев, когда нет полного доной красавицы,
имеющего красные цветки (АА), с растением, имеющим белые цветки (аа), у
всех гибридов F1 (Аа) цветки оказываются не красными, а розовыми — их
окраска
имеет
промежуточный
цвет,
но
единообразие
полностью
сохраняется. После работ Менделя промежуточный характер наследования у
гибридов F1 был выявлен не только у растений, но и у животных, поэтому закон доминирования — первый закон Менделя — принято называть также
законом единообразия гибридов первого поколения.
Из семян, полученных от гибридов F1, Мендель выращивал растения,
которые либо скрещивал между собой, либо давал им: возможность
самоопыляться. Среди потомков F2 выявилось расщепление: во втором
поколении оказались как желтые, так и зеленые семена. Всего Мендель
получил в своих опытах 6022 желтых и 2001 зеленых семян, их численное
соотношение примерно 3:1. Такие же численные соотношения были
получены и по другим шести парам изученных Менделем признаков
растений гороха. В итоге второй закон Менделя формулируется так: при
скрещивании гибридов первого поколения их потомство дает расщепление в
соотношении 3:1 при полном доминировании и в соотношении 1:2:1 при
промежуточном наследовании (неполное доминирование). Схема этого опыта
в буквенном выражении выглядит так: Р Аа х Аа, их гаметы А и а, возможное
сочетание гамет равно четырем: или АА, 2Аа, аа, т. е. 75% всех семян в F2,
имея один или два доминантных аллеля, обладали желтой окраской и 25 % —
зеленой. Факт появления в F2 рецессивных признаков (оба аллеля у них
рецессивны — аа) свидетельствует о том, что эти признаки, так же как
контролирующие их гены, не исчезают, не смешиваются с доминантными
признаками в гибридном организме, их активность подавлена действием
доминантных генов. Если же в организме присутствуют оба рецессивных по
данному признаку гена, то их действие не подавляется и они проявляют себя
в фенотипе. Генотип гибридов в F2 имеет соотношение 1:2:1.
При последующих скрещиваниях потомство F2 ведет себя по-разному:
1) из 75% растений с доминантными признаками (с генотипами А А и Аа)
50% гетерозиготны (Ad) и поэтому в F они дадут расщепление 3:1, 2) 25%
растений гомозиготны по доминантному признаку (АА) и при самоопылении
в F не дают расщепления; 3) 25% семян гомозиготны по рецессивному
признаку (аа), имеют зеленую окраску и при самоопылении в не дают
расщепления признаков.
Для объяснения существа явлений единообразия гибридов первого
поколения и расщепления признаков у гибридов второго поколения Мендель
выдвинул гипотезу чистоты гамет: всякий гетерозиготный гибрид (Аа, Вв и т.
д.) формирует «чистые» гаметы, несущие только одну аллель: либо А, либо а
что
впоследствии
полностью
подтвердилось
и
в
цитологических
исследованиях. Как известно, при созревании половых клеток у гетерозигот
гомологичные хромосомы окажутся в разных гаметах и, следовательно, в
гаметах будет по одному гену из каждой пары.
Анализирующее
скрещивание
используется
для
выяснения
гетерозиготности гибрида по той или иной паре признаков. При этом гибрид
первого
поколения
скрещивается
с
родителем,
гомозиготным
по
рецессивному гену (аа). Такое скрещивание необходимо потому, что в большинстве случаев гомозиготные особи (АА) фенотипически не отличаются от
гетерозиготных (Аа) (семена гороха от АА и Аа имеют желтый цвет). Между
тем в практике выведения новых пород животных и сортов растений
гетерозиготные особи в качестве исходных не годятся, так как при
скрещивании
их
потомство
даст
расщепление.
Необходимы
только
гомозиготные особи. Схему анализирующего скрещивания в буквенном
выражении можно показать двумя вариантами: 1) гибридная особь
гетерозиготная
(Аа),
фенотипически
неотличимая
от
гомозиготной,
скрещивается с гомозиготной рецессивной особью (аа): Р Аа х аа; их гаметы
— Аа Аа, аа, распределение в F1: или Аа, Аа, аа, аа, т. е. в потомстве
наблюдается расщепление 2 : 2 или 1:1, подтверждающее гетерозиготность
испытуемой особи; 2) гибридная особь гомозиготна по доминантным
признакам {А А): Р А А х аа; их гаметы А, А и а, а; в потомстве F
1
расщепления не происходит:
Цель дигибридного скрещивания — проследить наследование двух
пар признаков одновременно. При этом скрещивании Мендель установил
еще одну важную закономерность: независимое расхождение аллелей и
свободное, или независимое, их комбинирование, впоследствии названное
третьим законом Менделя. Исходным материалом были сорта гороха с
желтыми гладкими семенами (ААВВ) и зелеными морщинистыми (аавв);
первые доминантные, вторые рецессивные. Гибридные растения из F,
сохраняли
единообразие:
имели
желтые
гладкие
семена,
были
гетерозиготными, их генотип — АаВв, Каждое из этих растений в мейозе
образует гаметы четырех типов: АВ, Ав, аВ, ав. Для определения сочетаний
этих типов гамет и учета результатов расщепления теперь пользуются
решеткой Пеннета. При этом генотипы гамет одного родителя располагают
над решеткой по горизонтали, а генотипы гамет другого родителя — у левого
края решетки по вертикали.
Например, в семье, где отец здоров, а мать скрытая носительница
болезни (у нее одна ЛГ-хромосома несет дефектный ген, а другая — нормальна), половина сыновей будут наследовать гемофилию, а половина
дочерей станут носительницами. От браков больных мужчин со здоровыми
женщинами всегда родятся здоровые сыновья (свою единственную Х-хромосому они получают от здоровой матери), но все дочери будут
носительницами, так как у каждой из них присутствует одна из А-хромосом,
полученная от больного отца. Аналогично идет наследование и других признаков, сцепленных с Х-хромосомой (дальтонизм и некоторые другие).
Иногда некоторые аномалии сцеплены с У-хромосомой, которые от отца
передаются всем сыновьям (чешуйчатость кожи, перепончатые пальцы, сильное оволосение на ушах и др.).
4.4.
Формы изменчивости.
Модификационная изменчивость не вызывает изменений генотипа,
она связана с реакцией данного, одного и того же генотипа на изменение
внешней
среды:
в
оптимальных
условиях
выявляется
максимум
возможностей, присущих данному генотипу. Так, продуктивность беспородных животных в условиях улучшенного содержания и ухода повышается
(надои молока, нагул мяса). В этом случае все особи с одинаковым
генотипом отвечают на внешние условия одинаково (Ч. Дарвин этот тип
изменчивости назвал определенной изменчивостью). Однако другой признак
—
жирность молока — слабо подвержен изменениям условий среды, а
масть животного — еще более устойчивый признак. Модификационная
изменчивость обычно колеблется в определенных пределах. Степень
варьирования признака у организма, т. е. пределы модификационной
изменчивости, называется нормой реакции.
Широкая норма реакции свойственна таким признакам, как удои
молока, размеры листьев, окраска у некоторых бабочек; узкая норма реакции
— жирности молока, яйценоскости у кур, интенсивности окраски венчикову
цветков и др.
Фенотип формируется в результате взаимодействия генотипа и
факторов среды. Фенотипические признаки не передаются от родителей
потомкам, наследуется лишь норма реакции, т. е. характер реагирования на
изменение окружающих условий. У гетерозиготных организмов при
изменении условий среды можно вызвать различные проявления данного
признака.
Генотипическая изменчивость подразделяется на мутационную и
комбинативную. Мутациями называются скачкообразные и устойчивые
изменения единиц наследственности — генов, влекущие за собой изменения
наследственных признаков. Термин «мутация» был впервые введен де
Фризом. Мутации обязательно вызывают изменения генотипа, которые
наследуются потомством и не связаны со скрещиванием и рекомбинацией
генов.
Существуют хромосомные и генные мутации. Хромосомные мутации
связаны с изменением структуры хромосом. К мутациям относится также
изменение числа хромосом. Полиплоидия — увеличение числа хромосом,
кратное гаплоидному набору. В соответствии с этим у растений различают
триплоиды (3n), тетраплоиды (4n) и т. д. В растениеводстве известно более
500 полиплоидов (сахарная свекла, виноград, гречиха, мята, редис, лук и др.).
Все они выделяются большой вегетативной массой и имеют большую
хозяйственную ценность.
Большое многообразие полиплоидов наблюдается в цветоводстве:
если одна исходная форма в гаплоидном наборе имела 9 хромосом, то
культивируемые растения этого вида могут иметь 18, 36, 54 и до 198
хромосом. Полиплоиды получают в результате воздействия на растения
температуры, ионизирующей радиации, химических веществ (колхицин),
которые разрушают веретено деления клетки. У таких растений гаметы
диплоидны, а при слиянии с гаплоидными половыми клетками партнера в
зиготе возникает триплоидный набор хромосом (2п + 1л = 3п). Такие
триплоиды не образуют семян, они бесплодны, но высокоурожайны. Четные
полиплоиды : образуют семена.
Гетероплоидия
—
изменение
числа
хромосом,
не
кратное
гаплоидному набору. При этом набор хромосом в клетке может быть
увеличен на одну, две, три хромосомы (2п + 1; 2п + 2; 2п + 3) или уменьшен
на одну хромосому (2п-1). Например, у человека с синдромом Дауна
оказывается одна лишняя хромосома по 21-й паре, и кариотип такого
человека составляет 47 хромосом у людей с синдромом Шерешевского —
Тернера (2п-1) отсутствует одна Z-хромосома и в кариотипе остается 45
хромосом. Эти и другие подобные отклонения числовых отношений в
кариотипе человека сопровождаются расстройством здоровья, нарушением
психики и телосложения, снижением жизнеспособности и др.
Существуют
следующие
виды
перестроек
хромосом:
отрыв
различных участков хромосомы, удвоение отдельных фрагментов, поворот
участка хромосомы на 180° или присоединение отдельного участка
хромосомы к другой хромосоме. Подобное изменение влечет за собой
нарушение функции генов в хромосоме и наследственных свойств организма,
а иногда и его гибель.
Генные мутации затрагивают структуру самого гена и влекут за собой
изменение свойств организма (гемофилия, дальтонизм, альбинизм, окраска
венчиков цветков и т. д.). Генные мутации возникают как в соматических, так
и в половых клетках. Они могут быть доминантными и рецессивными.
Первые проявляются как у гомозигот, так и у гетерозигот, вторые — только у
гомозигот.
У
растений
возникшие
соматические
генные
мутации
сохраняются при вегетативном размножении. Мутации в половых клетках
наследуются при семенном размножении растений и при половом
размножении
животных.
Одни
мутации
оказывают
на
организм
положительное действие, другие безразличны, а третьи вредны, вызывая либо гибель организма, либо ослабление его жизнеспособности (например,
серповидноклеточная анемия, гемофилия у человека).
При выведении новых сортов растений и штаммов микроорганизмов
используют индуцированные мутации, искусственно вызываемые теми или
иными мутагенными факторами (рентгеновские или ультрафиолетовые лучи,
химические вещества). Затем проводят отбор полученных мутантов, сохраняя
наиболее продуктивные. В нашей стране этими методами получено много
хозяйственно перспективных сортов растений: неполегающие пшеницы с
крупным колосом, устойчивые к заболеваниям; высокоурожайные томаты;
хлопчатник с крупными коробочками и др.
Комбинативная наследственная изменчивость возникает в результате
обмена гомологичными участками гомологичных хромосом в процессе
мейоза, а также как следствие независимого расхождения хромосом при
IV РАЗДЕЛ. ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ.
Лабораторная работа № 1.
Микроскопические методы исследования.
План:
1. Знакомство
с
рабочим
местом
и
режимом
работы
в
микробиологической лаборатории.
2. Микроскопия готового окрашенного препарата – мазка дрожжей с
применением сухой и иммерсионной систем.
1. На рабочем столе должны быть: микроскоп, иммерсионное масло,
бактериологическая петля, спиртовка, набор красок, промывалка и
ванна для промывки препаратов, предметные стекла и салфетка для их
протирания,
штатив
для
пробирок
с
культурами,
пинцет,
фильтровальная бумага, вата. Из личных вещей – только рабочая
тетрадь для записи результатов. Нельзя входить в лабораторию в
пальто, вносить посторонние вещи. Работать только в белом халате. Во
время работы избегать лишнего хождения, сквозняков, двигаться
аккуратно, ничего не бросать на пол. В лаборатории запрещается
курить, принимать пищу, пить, не допускать лишние разговоры. По
окончании работы в микробиологической лаборатории необходимо
вымыть руки с мылом.
2. Порядок, работы при микроскопии с иммерсией. Поднять конденсор,
открыть его диафрагму, поставить плоское зеркало. Установить
объектив х8 на расстояние меньше рабочего и, глядя в окуляр,
установить освещение. На исследуемый препарат нанести каплю
иммерсионного масла и положить каплю его на предметный столик.
3. Поставив иммерсионный объектив (х90, А=1,25), необходимо, глядя
сбоку, опустить объектив на расстояние меньше рабочего (т.е.
погрузить объектив в масло), а затем, глядя в окуляр, макровинтом
поднимать тубус до появления мелькания препарата. После этого
нужно точно отфокусировать микровинтом, не делая более ½ оборота в
одну или другую сторону.
Рабочее расстояние до объектива с увеличением х8 – 8,5 мм, для
объектива с увеличением х 40 – 0,4 мм, для объектива с увеличением х 90 –
0,1 мм.
Пользуясь данными указаниями, промикроскопировать препарат –
мазок дрожжей при различных увеличениях и зарисовать.
х8
х40
х90
дрожжевые клетки
Микроскоп и техника микроскопирования
Изучение невидимых невооруженным глазом клеток микроорганизмов,
размеры которых не превышают десятки и сотни микрометров (1мкм=0,001
мм), возможно только при помощи микроскопов (от греч. micros -малый,
scopeo - смотрю).
При помощи микроскопа изучают морфологию микроорганизмов, их
рост и развитие, проводят первичную идентификацию (от лат. identifikare отождествление) исследуемых организмов, ведут наблюдения за характером
развития микробных ценозов (сообществ) в субстратах.
Светопольная микроскопия. Устройство микроскопа
Все световые биологические микроскопы отечественного производства
условно можно разделить на три группы: микроскопы биологические
упрощенные,
микроскопы
биологические
рабочие,
микроскопы
биологические исследовательские.
Среди существующих моделей современных микроскопов наиболее
распространены МБР (-1, -2, -3) и т.д. Микроскопы системы МБР последних
выпусков носят название «Биолам» - Биолам Р (-1, -2, -3) и т.д.
Они предназначены для исследования препаратов в проходящем свете в
светлом поле (световые микроскопы), увеличивая в сотни раз.
Принципиальной и наиболее распространенной моделью этой группы
является микроскоп МБР-1 (рис. 8).
Устройство микроскопа.
Микроскоп состоит из механической и оптической части. Механическая
часть микроскопа МБР-1 включает штатив, предметный столик тубус
(труба). Штатив состоит из основания и тубусодержателя. Тубусодержатель с
увеличительной оптикой приводят в движение вращением
макрометрического и микрометрического винтов. Макрометрический винт
(кремальера, зубчатка, макровинт) служит для предварительной,
ориентировочной установки изображения рассматриваемого объекта.
Рис.8. Устройство и оптическая схема микроскопа МБР-1:
1 — основание микроскопа; 2 — кронштейн конденсора; 3 — тубусодержатель (ручка
микроскопа); 4 — коробка с микромеханизмом (штатив); 5 — окуляр; 6 — тубус; 7 — призма; 8 —
головка тубусодержателя; 9 — винт для фиксации револьвера; 10 — револьвер на салазках; 11 —
объектив; 12 — предметный столик; 13—конденсор; 14 — рукоятка ирис-диафрагмы; 15 —
апертурная диафрагма; 16 — зеркало; 17 — микрометрический винт; 18 — макрометрический
винт.
Микрометрический винт (микровинт) используют для получения
последующего
более
четкого
изображения.
При
полном
повороте
микрометрического винта тубус передвигается на 0,1мм (100 мкм). При
вращении винтов по часовой стрелке тубус опускается по направлению к
препарату, при вращении против нее идет от препарата, однако полных
оборотов микровинтом делать не следует, вначале необходима грубая
настройка.
На предметный столик помещают препарат с объектом исследования.
Предметный
столик
вращается
и
перемещается
при
помощи
двух
находящихся справа и слева винтов. В центре столика находится отверстие
для освещения препарата снизу лучами света, направляемыми зеркалом
микроскопа. В центре столика вмонтированы два зажима (клеммы) пружинящие металлические пластинки, предназначенные для закрепления
препарата.
Если необходимо исследовать поверхность препарата, не допуская
наблюдение какого-либо определенного участка препарата, у многих
микроскопов на предметный столик помещают препаратоводитель. На этом
приспособлении имеется система линеек - нониусов, при помощи которых
можно зафиксировать любую точку исследуемого объекта. Для этого при
установке препаратоводителя совмещают центр вращения столика и
оптическую
ось
препаратоводителя
системы
по
микроскопа
кресту
(отсюда
центрировочной
предметный
пластинкой
столик
с
препаратоводителем называют иногда крестообразным).
Тубус - это оправа, в которую заключены элементы оптической системы
микроскопа.
К
нижней
его
части
прикрепляют
револьвер
(объективодержатель) гнездами для объективов. Современные модели
микроскопов имеют наклонный тубус с дугообразным тубу содержателем,
что
обеспечивает
горизонтальное
положение
предметного
столика.
Наклонный тубус можно повернуть вокруг вертикальной оси в любое
удобное положение и закрепить винтом. Внутри наклонного тубуса, в
нижней его части, помещена призма. В верхний конец тубуса вставляется
окуляр. Модели микроскопов Биолам Р-(3, 4) и т.д. имеют бинокулярный
тубус.
Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного аппарата
(зеркало, светофильтры, ирисовая диафрагма, конденсор) и увеличительной
оптики (объективы и окуляры).
Во многих современных микроскопах зеркало и конденсор заменены
вмонтированным в прибор регулируемым источником света.
Осветительный аппарат находится под предметным столиком. Зеркало
отражает падающий на него свет в конденсор. Одна сторона зеркала плоская,
другая - вогнутая. При работе с конденсором необходимо пользоваться
только плоским зеркалом. При работе с рассеянным источником света
применяют вогнутое зеркало.
Вогнутое зеркало также применяют при работе без конденсора с
объективами малых увеличений.
Конденсор (от лат. condensо - уплотняю, сгущаю) состоит из двух-трех
короткофокусных линз. Он собирает лучи, идущие от зеркала, и направляет
их на объект. Конденсор необходим, прежде всего, при работе с
иммерсионной системой. Линзы конденсора вмонтированы в металлическую
оправу, соединенную с зубчатым механизмом, позволяющим перемещать
конденсор вверх и вниз специальным винтом.
Для регулирования интенсивности освещения в конденсор вмонтирована
ирисовая диафрагма, состоящая из стальных серповидных пластинок. Чтобы
получить более четкое изображение исследуемого объекта, регулируют
степень раскрытия диафрагмы. Окрашенные препараты лучше рассматривать
при
почти
полностью
открытой
диафрагме,
неокрашенные
-
при
уменьшенном отверстии диафрагмы.
Под конденсором располагается откидная оправа для светофильтров
(обычно к микроскопу прилагаются синее и белое матовые стекла). При
работе
с
искусственным
источником
света
светофильтры
создают
впечатление дневного освещения, что делает микроскопирование менее
утомительным для глаз.
Объектив (от греч. objectum - предмет исследования) - наиболее важная
часть микроскопа. Он дает действительное, увеличенное и обратное
изображение изучаемого объекта. Объектив состоит из системы линз,
заключенных в металлическую оправу. Наружная линза, обращенная плоской
стороной к препарату, самая главная, - называется фронтальной, она
обеспечивает увеличение. Остальные линзы в системе объектива выполняют
преимущественно
функции
коррекции
оптических
недостатков,
возникающих при исследовании объектов. Один из таких недостатков следствие явления сферической аберрации. Это явление связано со
свойством линз неравномерно преломлять периферические и центральные
лучи. Первые обычно преломляются в большей степени, чем вторые, поэтому
пересекаются на более близком расстоянии к линзе. В результате
изображение точки приобретает вид расплывчатого пятна.
Лабораторная работа № 2.
Обработка лабораторной посуды.
Основные питательные среды и их приготовление.
Посуда, используемая в микробиологическом практикуме должна
быть абсолютно чистой, а в ряде случаев стерильной. Загрязненную посуду
обрабатывают хромовой смесью, промывают проточной водой, сушат в
сушильном шкафу. Сухую посуду заворачивают в бумагу и стерилизуют в
сушильном шкафу в течение часа при 1700С или двух часов при 1600С. При
стерилизации колбы должны быть закрыты ватными пробками. Посуду
хранят завернутой или закрытой в месте, защищенном от попадания пыли.
Питательные среды используют для накопления, выделения,
культивирования и сохранения микроорганизмов. При составлении сред
учитывают как потребности микроорганизмов в веществах, необходимых для
жизни, так физико-химические условия, в которых микроорганизмы могут
осуществлять обмен между клеткой и средой.
Чтобы расти и размножаться клетка должна получать в необходимых
количествах все содержащиеся в ней элементы и быть обеспечена
источником энергии.
По составу питательные среды подразделяют на две группы:
натуральные среды неопределенного состава и синтетические.
Натуральными обычно называют среды, которые состоят из
продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный
неопределенный химический состав.
Синтетические – это среды, в состав которых входят только
определенные
химически
чистые
соединения,
взятые
в
указанных
концентрациях. Синтетические среды следует готовить в точно указанных
пропорциях на дистиллированной воде.
По
назначению
диагностические
различают
среды,
позволяют
элективные
быстро
и
дифференциально-
отличать
одни
виды
микроорганизмов от других.
По физическому состоянию среды разделяются на жидкие, плотные и
сыпучие.
Для
выявленияфизиолого-биохимических
особенностей
микроорганизмов, а также для накопления их биомассы применяют для
выделения чистых культур, в диагностических целях, для хранения культур и
т.д.
Посуда, предназначенная для приготовления сред и культивирования
микроорганизмов, не должна содержать посторонних веществ. Готовые
среды хранят в прохладном, защищенном от света помещении, в закрытой
стерильной посуде.
Жидкую
или
плотную
питательную
среду
готовят
согласно
рецептуре, разливают в чистую посуду (обычно колбы), закрывают ватными
пробками и стерилизуют под высоким давлением в автоклаве.
Лабораторная работа № 3.
Приготовление препаратов микроорганизмов.
Для наблюдения микроорганизмов под микроскопом необходимо
соответствующим образом приготовить препарат. Препараты готовят, как
правило, на предметных стеклах, которые должны иметь толщину, не
превышающую 1,2 – 1,3 мм. Поверхность стекла должна быть тщательно
очищена и обезжирена, чтобы капля жидкости равномерно растекалась по
стеклу, а не собиралась в выпуклые капли. Наиболее надежный способ
обезжиривания
-
обработка
хромовой
смесью
с
последующим
ополаскиванием водой и спиртом.
Покровные стекла, применяемые для приготовления препаратов
живых бактерий, должны быть тщательно вымыты и высушены. Толщина
покровных стекол не должна превышать 0,15 – 0,17 мм. Более толстые стекла
ухудшают качество изображения.
Наблюдать микроорганизмов в живом
состоянии сложно на
препаратах: «раздавленная капля», «висячая капля», «отпечаток».
Препарат «раздавленная капля» - на предметное стекло наносят
каплю воды или красителя и перенося в нее небольшое количество культуры
изучаемых микроорганизмов,
размешивают и покрывают покровным
стеклом. Если микроорганизмы выращены на плотной среде, то микробную
массу переносят с помощью бактериологической петли. Если же культуру
выращена на жидкой среде, то на предметное стекло суспензию клеток
наносят с помощью стерильной пипетки. Каплю прижимают покровным
стеклом так, чтобы под ним не образовывалось пузырьков воздуха.
Приготовленный таким образом препарат помещают на предметный столик,
микроскопа и рассматривают с сухой системой.
Препарат
«висячая
капля»,
используют
для
выявления
подвижности у микроорганизмов, а также наблюдения за размножением
микроорганизмов.
Для
приготовления
препарата
небольшую
каплю
суспензии микроорганизмов наносят на покровное стекло, переворачивают
его каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с
углублением в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна
лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается
герметически заключенной во влажной камере, что допускает многодневное
наблюдение за объектом.
Препарат «отпечаток». Из агаризованной среды в чашке Петри, на
которой растут изучаемые микроорганизмы, срезают скальпелем небольшой
кубик (блок) и переносят его на предметное стекло так, чтобы поверхность с
микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или колонии
прикладывают покровное стекло и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть
в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз на каплю воды
на предметом стекле и рассматривают с сухой системой.
Для выявления некоторых морфологических особенностей и учета
количество микроорганизмов, проверки чистоты культуры и ряда других
целей готовят фиксированные окрашенные препараты, которые могут
храниться долгое время.
Приготовление
препаратов
фиксированных
клеток
включает
следующие стадии:
-
приготовление мазка – на обезжиренное стекло наносят
каплю воды и переносят в
нее небольшое количество
исследуемого
Полученную
материала.
суспензию
равномерно размазывают петлей или краем предметного
стекла по площади 1-2 см возможно более тонким слоем;
-
высушивание препарата следует проводить над пламенем
горелки, но не нагревая самого мазка. Лучше всего сушить
препарат при комнатной температуре на воздухе.
-
фиксация препарата преследует несколько целей: убить
микроорганизмы, обеспечить лучшее прилипание клеток к
стеклу, сделать мазок более восприимчивым к окраске.
Самым распространенным способом фиксации является
термическая обработка. Препарат трижды проводят над
пламенем горелки мазком вверх;
-
окраска клеток чаще всего проводится
анилиновыми
красителями, фуксином, генуианвиолетом, метиленовым
синим и т.д. Фиксированный препарат помещают на
параллельные стеклянные рейки, лежащие на стенках
кюветы, и обливают раствором выбранного красителя. По
окончанию окраски препарат промывают водой. Затем
препарат высушивают на воздухе или, осторожно промокают
его фильтровальной бумагой и рассматривают с иммерсией.
Лабораторная работа № 4
Получение элективных накопительных культур
сенной и картофельной палочек
Сено из разнотравья мелко нарезают ножницами и помещают в
конические колбы, заливают водой, добавляют щепотку мела и кипятят в
течение 15 мин. Колбу закрывают ватной пробкой и помещают в термостат
при температуре 250С на 2-3 суток. На поверхности сенного отвара
образуется сероватая пленка, состоящая из особой грамотрицательной
сенной палочки. В сене всегда присутствуют споры Bac. Subtilis, так как они
не гибнут при кипячении и дают рост вегетативным формам бактерий.
Другие микроорганизмы при этом вырастают редко и в небольших
количествах.
Получение культуры картофельной палочки.
Промывают клубень картофеля и, не снимая кожуры нарезают
ломтиками. Их поверхность натирают мелом и кладут в чашку Петри.
Выдерживают чашку с ломтиками картофеля 10 мин. В сушильном шкафу
при 100 0С. После этого чашки помещают в термостат при 27-30 0С на 2-3
суток. Оптимальная температура для развития Bac. Mesentericus несколько
выше, чем для Bac. Subtilis, поэтому культуры ставят в разные термостаты.
На поверхности ломтика картофеля образуется плотная морщинистая
пленка, состоящая из особой картофельной палочки. Она движется при
помощи жгутиков, размеры клеток 4-5 мкм, грамположительная.
Лабораторная работа № 5
Определение количества мертвых клеток и клеток, содержащих
гликоген в культуре дрожжей
Метод подсчета количества мертвых клеток основан на способности
мертвых дрожжевых клеток окрашиваться метиленовой синью, тогда как
живые клетки устойчивы к воздействию этого красителя.
На предметное стекло наносят каплю, раствора метиленового синего,
в который с помощью микробиологической петли вносят, небольшое
количество суспензии дрожжей и готовят препарат «раздавленная петля».
Готовый препарат рассматривают под микроскопом. Постепенно передвигая
препарат, считают количество мертвых и живых клеток культуры. Затем
вычисляют среднее содержание тех и других в десяти полях зрения
микроскопа, окончательный расчет проводят по формуле:
В100
А = -----------------В+С
где
В – среднее содержание мертвых клеток;
С – среднее содержание живых клеток;
А – содержание мертвых клеток (%).
По этому показателю судят о качестве семенных дрожжей – в
хороших семенных дрожжах содержание мертвых клеток не должно
превышать 10 %.
Содержание в дрожжевых клетках запасного питательного вещества
гликоген характеризует способность их к брожению. В нормально упитанных
дрожжах 70-75 % клеток содержат гликоген.
Содержание гликогена определяют в живом препарате, смешивая
каплю дрожжевой смеси с каплей раствора Люголя. Препарат рассматривают
через 5-6 мин. При этом клетки, содержащие гликоген приобретают
коричневую или красно-бурую окраску, а клетки без гликогена –
желтоватую. Количество клеток с гликогеном определяют путем подсчета
числа окрашенных клеток в десяти полях зрения и выражают в %.
Лабораторная работа № 6
Морфология бактерий
Бактерии составляют наиболее обширную и весьма разнообразную
группу микроорганизмов. Морфологически бактерии различают по форме,
величине, взаимному расположению клеток и спорообразованию.
По форме бактерии делят на 3 группы: шаровидные, палочковидные и
извитые. Шаровидные бактерии – кокки. Диаметр кокков 0,5 – 1,2 мкм.
Моно- или микрококки. Их клетки делятся в одной плоскости и сразу
после деления обособляются, распологаясь одиночно.
Диплококки и истрептококки, образуются при делении клеток в
одной плоскости; у диплококков клетки располагаются попарно, у
стрептококков клетки соединены в цепочки.
Тетракокки возникают при делении клеток в 2-х взаимно
перпендикулярных плоскостях, клетки образуют группы по 4 особи.
Сарцины формируются при делении клеток в 3-х взаимно
перпендикулярных плоскостях, при этом образуются пакеты из 8-16 и более
клеток.
Стафилококки представлены скоплениями клеток, напоминающими
виноградные гроздья. Деление клеток идет в нескольких плоскостях.
Палочковидные
бактерии.
Это
самая
многочисленная
и
разнообразная группа бактерий. Палочковидные бактерии различают по
величине клеток, их расположению, очертанию концов клетки, по наличию
или
отсутствию
жгутиков.
Длина
клетки
палочковидных
бактерий
колеблется от десятых долей микрона до 10-15 мкм и более, диаметр клетки –
от 0,5 до 1 мкм. Размер клеток зависит от условий выращивания культуры.
Большинство
способствующих,
палочковидных
они
обозначают Bact.
получили
микроорганизмов
название
бактерий
–
формы
(род
не
Bacteuium
или В.). Палочковидные бактерии, способные при
неблагоприятных
условиях
формировать
споры,
принято
называть
бациллами (род Bacillus обозначают Bac.).
Бактерии
и
бациллы
располагаются
одиночно,
попарно
или
соединяются в цепочки, в последнем случае их называют соответственно
стрептобактерии
и
стрептобациллы.
Среди
палочковидных
бактерий
встречаются как сапрофиты, так и патогенные формы.
Извитые бактерии делят на три типа клеток.
Вибрионы представлены короткими изогнутыми палочками в форме
запятой. Клетки вибрионов изогнуты на 1/3 – ¼ оборота. Длина клетки
составляет 1-3 мкм.
Спириллы. Клетки их изогнуты на 2-3 оборота и имеют форму
латинской буквы S. Размеры клеток 15-20 мкм.
Спирохеты представлены очень тонкими длинными клетками
итопорообразной формы с большим числом мелких витков.
Для проведения исследования необходимы следующие материалы и
оборудование: предметные покровные стекла, микробиологическая петля,
спиртовка, пинцет, капельница с водой, водные растворы красителей –
фуксина, метиленового синего генецианвиолета, промывалка с водой,
кристализатор
со
стеклянным
мостиком
для
препаратов,
полоски
фильтровальной бумаги, микроскоп, чистые культуры микроорганизмов,
настои различных естественных материалов (мясо, рыба, мука, овощи, навоз,
фрукты).
В
процессе
исследования
небольшое
количество
материала
измельчают, помещают в склянку, на кончике скальпеля добавляют немного
мела, и заливают водопроводной водой на 2/3 объема склянки. Склянку с
настоем выдерживают в термостате при 25-280С или в теплом помещении в
темноте 3-5 дней. За это время в среде накапливается масса разнообразных
бактерий.
Проведя
микроскопирование,
обращают
внимание
на
форму,
взаимное расположение клеток.
Лабораторная работа № 7
Окраска по Граму
Отношение бактерий к окраске по Граму используется как один из
диагностических признаков при определении вида бактерий. Метод основан
на способности некоторых форм бактерий образовывать в клетке прочное
соединение двух красителей – генцианвиолета и кристаллвиолета с йодом.
Эти микроорганизмы относят к грамположительным. Клетки других
микроорганизмов после обработки генцианвиолетом и йодом легко
обесцвечиваются спиртом и приобретают красный цвет при последующей
окраске фуксином. Их считают грамположительным.
Окраску по Граму проводят следующим образом. На одном
обезжиренном предметном стекле готовят три мазка из разных культур. В
центре наносят мазок исследуемого микроорганизма, слева и справа – мазки
контрольных микроорганизмов. Клетки одного из них окрашиваются по
Граму положительно, а другого отрицательно. Мазок высушивают над
пламенем горелки. На фиксированный мазок наливают мазок карболового
генцианвиолета. Краситель сливают и не промывая препарат водой,
обрабатывают его раствором Люголя в течение 1-2 мин. До полного
почернения. Раствор Люголя сливают и обрабатывают препарат в течение
0,5-1 мин. Этиловым спиртом (96 %) для обесцвечивания. С этой целью
погружают предметное стекло в стакан со спиртом или наливают спирт на
мазок. Чтобы исключить излишнее обесцвечивание клеток, к спирту следует
добавить йод (2 мл 10% раствора йода на 100 мл этанола). Препарат
промывают водой и дополнительно окрашивают водным фуксином 1-2 мин.
Краситель сливают, препарат вновь промывают водой, высушивают и
микроскопируют с иммерсионной системой. При правильном окрашивании
грамположительные
бактерии
имеют
сине-фиолетовый
цвет,
а
грамотрицательные красный.
Лабораторная работа № 8
Подсчет клеток микроорганизмов под микроскопом
Это метод рекомендуется использовать для подсчета крупных
объектов – дрожжей, одноклеточных водорослей. Обычно используют
камеру Горячева-Тома. При работе с камерой необходимо соблюдать
определенный порядок ее заполнения. В начале углубления с сеткой
покрывают
специальным
шлифованным
покровным
стеклом,
слегка
прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до
появления колец Ньютона. После этого камеру заполняют исследуемой
суспензией микроорганизмов. Суспензию вносят пипеткой. Число клеток
подсчитывают при увеличении 10х40. Обычно подсчитывают клетки
микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки,
перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в
квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верхнюю и правую стороны
квадрата.
Для получения достоверного результата общее число подсчитанных
клеток микроорганизмов должно быть не менее 600. Количество клеток в 1
мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле:
а103
М = ---------------  n
h S
где М – число клеток в 1 мл суспензии;
а – среднее число клеток в квадрате сетки;
h – высота камеры, мм;
S – площадь квадрата сетки, мм2;
103 – коэффициент перевода см3 в мм3 (103 = 1/400)
n – разведение исследуемой суспензии.
Схема приготовления разведенной суспензии и рассева суспензии
микроорганизмов.
Лабораторная работа № 9
Способность к спообразованию
Метод «гипсовых блоков»
Смешивают две части прокаленного гипса и одну часть воды. Из
полученной массы формуют круглые блоки диаметром 2-3 см. и высотой 11,5 см. Поверхность блока зачищают шкуркой. Блоки помещают в чашки
Петри или Коха и стерилизуют сухим жаром 2-3 часа при температуре 160
0
С. Дно чашки и поверхность блока увлажняют стерильной водой. Осадок
двухсуточной культуры наносят на повехность блока и тщательно
размазывают. Оставляют блоки в термостате на 1-2 суток при температуре
25-30 0С. Соскабливают с блока часть дрожжевой культуры и готовят
фиксированный препарат при помощи дист. Н2О.
Фиксированный препарат заливают фуксином Циля, нагревают над
пламенем горелки до появления пара, не
Доводя до кипения. По мере испарения краску подливают на
препарат, не давая ей подсыхать. Через несколько минут остатки краски
сливают и препарат промывают водой. Для обесцвечивания применяют 1-5 %
растворы НCl, H2SO4 и уксусной кислот, раствор этилового спирта. Затем
препарат промывают водой и дополнительно подкрашивают метиленовым
синим.
В результате клетка микроорганизмов будет окрашены в Синий, а
споры в красный цвет.
Лабораторная работа № 10
Определение бродильной активности дрожжей объемным методом
Прибор
для
определения
состоит
из
бродильного
сосуда,
соединенного бюреткой.
Одним из основных явлений, которые наблюдаются при спиртовом
брожении, является снижение концентрации бродящего сусла. Их сахара
образуется спирт и СО2, который выделяется из жидкости. Бродильная
активность зависит из жидкости. Бродильная активность зависит от
содержания в них белкового азота.
Бюретки
заполняют
25
%
раствором
NaCl,
подкисленного
ортофосфорной кислотой до pH=1.
В колбу помещают 0,7 г. спресованных дрожжей и 30 мл 10 %
раствора сахарозы, содержащего 0,2 % КН2РО4. Устанавливают уровень
жидкости в бюретки на нуль. Брожение ведут в течение 3 ч. при температуре
20 0С, отмечая каждый час уровень жидкости в бюретки. Хорошие дрожжи за
3 ч. выделяют 25-30 мл СО2.
Лабораторная работа № 11
Способность пивоваренных дрожжей сбраживать различные углеводы
Для выявления способности дрожжей: сбраживать различные виды
углеводов их засеивают в среды, содержащие различные сахара с
индикаторной краской, называемые цветным или пестрым рядом Гисса
(среда Гисса).
Для приготовления среды Гисса к 1 л дистиллированной воды
добавляют 102 пептона, 5г хлорида Натрия, 4-5 г. агар-агар и устанавливают
рН = 7,2 – 7,4. Добавляют 1 мл бромтимолового синего (1,6% р-р).
Стерилизуют при 12020С (1 атм) в течении 20 мин.
В расплавленную среду вносят 5 г. сахара, разливают в стерильные
пробирки и столбиком высотой 3 см, стерилизуют при 112 0С (0,5 атм.) в
течении 12 мин. и, после того как среда остынет, производят посев. Посев и
полужидкие среды Гисса проводят уколом до дна пробирки и выращивают
его в течении 1-2 суток при температуре 25-30
0
С. Образование СО2
обнаруживают по изменению окраски среды и появлению в среде пузырьков
и разрывов.
Лабораторная работа № 12
Маслянокислое брожение
Маслянокислое брожение – сложный процесс превращения углеводов
в масляную кислоту и другие продукты, совершаемый группой анаэробных
спороносных бактерий. Химизм маслянокислого брожения сложен и до
настоящего времени недостаточно выяснен. Схематически процесс может
быть изображен в виде следующего уровня:
С6Н12О6
СН3 – СН2 – СН2 – СООН + 2СО2 + 2Н2 + 495 к Дж
Процессу маслянокислого брожения подвергаются не только сахара,
но и другие, более сложные углеводы. Маслянокислые бактерии имеют
различные активные ферменты, способные производить расщепление
сложные
углеводов.
Образующаяся
масляная
кислота
в
невысоких
концентрациях является веществом, стимулирующим рост высших растений.
Материалы и оборудование.
Большие пробирки, резиновые робки к ним, клубни картофеля,
пинцеты, скальпели, мел в порошке, водяная баня, раствор Люголя, 5 %-ный
раствор хлорного железа.
Ход работы:
Неочищенный картофель нарезают ломтиками, которые могут легко
войти в пробирку. Заполняют ими пробирку на 1/3 объема, добавляют
щепотку мела и заполняют водой почти до верха. Пробирку помещают в
водяную баню при температуре 800С на 10-15 мин. Затем пробирки
закрывают пробками и ставят в теплостат с температурой 350С.
В этих условиях уже через 2-3 дня в жидкости обнаруживают
бактерии масленнокислого брожения.
Культура маслянокислых бактерий при этом является элективной.
Для
их
преимущественного
развития
созданы
анаэробные
условия,
бесспоровые формы убиты предварительным нагреванием, добавка масла
нейтрализует образующиеся кислоты и способствует развитию бактерий.
На следующем занятии производят микроскопированием жидкости в
которой обнаруживают главным образом Clostridium pasteurianum –
подвижные палочки с закругленными концами, одиночные и парные.
В старых культурах у одного из концов клетки обнаруживают спору.
При микроскопировании можно рекомендовать добавление к капле
культурной
жидкости
капли
раствора
Люголя.
Микроскопируют
раздавленную каплю с сухим объективом или с масляной иммерсией.
Маслянокислые бактерии содержат в своих клетках гранулезу, которая
окрашивается раствором Люголя в синий цвет.
С культуральной жидкостью проводят качественную реакцию на
масляную кислоту. Для этого к 5 мл жидкости добавляют 2 мл 5 %-ного
хлорного железа. При нагревании образуется маслянокислое железо
коричневого цвета.
Лабораторная работа № 13
Уксусное брожение
Процесс уксуснокислого брожения называют брожением скорее по
традиции, чем по смыслу, т.к. от брожения он отличается аэробным
характером. Вызывается процесс группой бактерий, которые являются
облигатными аэробами. Любая среда, содержащая небольшое количество
спирта, не изолированная от атмосферы, является благоприятным субстратом
для развития уксуснокислых бактерий, попадающих туда из воздуха.
Уксуснокислые бактерии широко распространены в природе, они
встречаются в пыли, на поверхности растений и, в частности, на их плодах.
Морфологически они неоднородны.
Вид бактерий
Acetobacter aceti
Форма бактерии
Короткая, неподвижная
палочка, не образующая
спор
Acetobacter pasteurianum Морфологически близка
к 1-й
Acetobacter xylinum
Имеет грубую
морщинистую пленку
Acetobacter kutzigianum Образует пленку
всползающую на стенки
колбы
Реакция на йод
Желтая окраска
Синяя окраска
Синяя окраска
Синяя окраска
Ход работы:
В конические колбы наливают тонкий слой пива (0,5-1 см). Толщина
слоя пива имеет большое значение для исхода опыта, т.к. для ускорения
бактерий должны быть созданы аэробные условия. К пиву добавляют
немного С2Н5ОН (0,5 мл). Колбы закрывают ватными пробками и ставят в
термостат при температуре 30-35 0С на несколько суток.
На следующем занятии просматривают колбы, описывают характер
образовавшихся пленок, микроскопируют окрашенные мазки, делают
качественную реакцию на уксусную кислоту. Для этого жидкость
нейтрализуют 10 %-ным раствором соды и добавляют немного раствора
хлорида железа (произвольной концентрации). Смесь нагревают. При
наличии уксусной кислоты появляется красное окрашивание вследствии
образования ацетата железа.
Рекомендуемая литература
1.С.В. Борисова, О.А. Решетник, З.Ш. Мингалеева Использование дрожжей в
промышленности. Санкт-Петербург ГИОРД 2008г.
2.А.Т. Перетрухина, И.В.Перетрухина. микробиология сырья и продуктов
водного происхождения. Санкт-Петербург ГИОРД 2005г. 318с.
3.Практикум по микробиологии. Москва ACADEMA2005г.
4.Г.Г. Жарикова. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и
гигиена. Москва ACADEMA2005г.
5.Контроль качества продукции физико-химическими методами. Вино и
виноматериалы/ Под ред. В.в. Ашапкина. – М.: ДеЛи принт, 2005.-128.
Рецензия
На учебно-методическое пособие по дисциплине «Биотехнология
дрожжей и генетика микроорганизмов» для студентов направления 260100.62
Учебно-методическое пособие по дисциплине «Биотехнология
дрожжей и генетика микроорганизмов» разработанное Чкареули Л.В.,
составлено в соответствии с учебно-методическим комплексом по данной
дисциплине для организации процесса самообразования с целью повышения
эффективности изучения и закрепления теоретических практических знаний
по дисциплине.
В учебном пособии представлены сведения по основным разделам
зимологии - науки о дрожжевых грибах.
Обсуждается значение дрожжей в качестве модели для изучения многих
вопросов клеточной биологии. Рассматриваются особенности строения
дрожжевой клетки, химический состав и функции основных клеточных
структур, особенности морфологии дрожжевых грибов, типы их размножжения.
.