ИКТ

Оглавление
Оглавление ............................................................................................................... 1
1. Биолюминесценция ............................................................................................. 2
1.1 Биохимия биолюминесценции ..................................................................... 3
1.1.1. Структура бактериальной люциферазы ............................................... 5
Список использованных источников .................................................................... 9
1
1. Биолюминесценция
Биолюминесценция – это свечение организмов, видимое простым
глазом.
Способностью
к
биолюминесценции
обладают
организмы,
принадлежащие к самым разным систематическим группам: бактериям,
грибам, моллюскам, насекомым. Механизм реакций, сопровождающийся
свечением, различен у разных видов, однако обычно включает в себя
окисление
некоторого
вещества
определенного
низкомолекулярного
субстрата – люциферина, кислородом воздуха, катализируемое специальным
ферментом люциферазой (названия образованы от латинского luciferos –
«несущий свет») [1].
В основе биолюминесценции – свечения живых организмов – лежит
катализируемая специфическим ферментом хемилюминесцентная реакция.
Все светящиеся бактерии содержат фермент биолюминесценции –
люциферазу. Идентификация структуры люциферазной молекулы во многом
зависит от качества препарата, получаемого в результате очистки [2].
2
1.1 Биохимия биолюминесценции
Установлено, что химическим
ферментативное
окисление
свечением
восстановленного
бактерий
является
флавинмононуклеотида
(FMN)H2, до флавинмононуклеотида (FMN) и длинноцепочечного альдегида
до миристиновой кислоты кислородом воздуха [3].
Суммарное уравнение процесса может быть записано так:
FMNH2 + RCHO + O2
FMN + RCOOH + H2O + hν (2)
Эта реакция протекает, по-видимому, через стадию образования
пероксида флавинмононуклеотида:
+RCHO
ФМН-Н2+Е+О2
Е-ФМН-Н2-ООН
RCOOH+E-ФМН-НОН*
Здесь
E-люцифераза,
RCOH-E-ФМН-Н2-OOH
RCOOH+E+ФМН+H2O+фотон (490 нм).
ООН-гидроперекисная
группа,
RCOH-
алифатический альдегид, RCOOH-жирная кислота, образующаяся при
окислении альдегида [1].
Альдегидный
неферментативному
субстрат
–
окислению,
RCHO
и
–
скорость
подвержен
медленному
окисления
зависит
от
температуры и начальной концентрации. При комнатной температуре
раствор альдегида, используемый для измерения биолюминесценции,
стабилен в течение 8 ч. Неферментативное окисление альдегида в отличие от
FМNН2 не оказывает влияния на ход люминесцентной реакции, поскольку
его скорость значительно меньше скорости ферментативного окисления.
Существует
предположение,
что
сродство
альдегида
к
люциферазе
обусловлено гидрофобными взаимодействиями между каждым участком
алифатической цепи альдегида и гидрофобными группами фермента.
Благодаря этому с увеличением длины углеродной цепи альдегид прочнее
связывается с люциферазой. Это обеспечивает бóльшую эффективность
превращения химической энергии в световую. Однако эту гипотезу нельзя
3
считать всеобъемлющей, поскольку не для всех люцифераз соблюдается
монотонная связь параметров биолюминесцентной реакции с длиной цепи
альдегида. Специфичность люцифераз к альдегидам проявляется в том, что
другие алифатические длинноцепочечные соединения (кетоны, кислоты,
спирты) не обнаруживают с люциферазой биолюминесцентной активности,
хотя не исключено, что они реагируют с ней без излучения.
Природным
тетрадеканаль,
субстратом
поскольку
в
бактериальной
бактериях
люциферазы
считается
ферментативная
система,
восстанавливающая для нужд биолюминесценции карбоновую кислоту,
имеет специфичность именно к миристиновой кислоте.
Ни один из исходных реагентов обсуждаемой реакции не может
существовать в бактериальной клетке в свободном виде (FMNН2– по причине
быстрого автоокисления, длинноцепочечный альдегид – потому что является
ядом
и
не
производится
организмами).
Поэтому
бактерии
имеют
специальные ферментативные системы, способствующие восстановлению
FMN и карбоновой кислоты исключительно для нужд биолюминесценции.
Считается, что восстановление FMN в бактериях происходит в реакции,
катализируемой другим ферментом – NAD(Р)H: FMN- оксидоредуктазой [3].
4
1.1.1. Структура бактериальной люциферазы
Бактериальная люцифераза представляет
собой
гетеродимер
с
молекулярной массой ~ 80 кДа. Сродство субъединиц друг к другу
чрезвычайно высоко.
Люцифераза не индивидуальный белок, а сложный комплекс,
состоящий из трех структурных единиц, каждая из которых необходима для
эффективной трансформации химической энергии в световую. Согласно
схеме Гастингса, флавин, альдегид и кислород связываются в одном месте на
α-субъединице фермента.
Бактериальная люцифераза - это αβ-гетеродимер, состоящий из двух
неидентичных α- и β- субъединиц с молекулярной массой 43 кДа и 33 кДа,
соответственно.
Индивидуальные
субъединицы
неактивны.
Получена
трехмерная структура люциферазы Vibrio harveyi (V. harveyi) с разрешением
1,5Å [4]. Эти люциферазы относятся к большому семейству белков - «(α/β)8–
бочоноков». Аминокислотные последовательности α- и β- субъединиц
люцифераз
имеют
32%
гомологию,
α-
субъединица
имеет
31
аминокислотный остаток, которые не представлены в β- субъединице.
Рисунок 1 Структуры ферментов бактериальной биолюминесцентной системы: а люцифераза из Vibrio harveyi с разрешением 1.5A [4].
.
5
Аминокислотный состав люциферазы приведен в таблице 1 [5].
Таблица 1 – Аминокислотный состав люциферазы [5].
Как следует из таблицы 1, в состав люциферазы входит большое число
неполярных аминокислот. Средняя гидрофобность составляет 1240 кал на
один аминокислотный остаток. Это делает люциферазу одной из самых
гидрофобных среди известных белков. Высокое содержание неполярных
аминокислот, по-видимому, требует того, чтобы некоторые из них
находились на внешней поверхности белковой глобулы.
Недавно определенная трехмерная структура люцифераз предполагает,
что активный центр находится внутри большой внутренней полости на αсубъединице. Эта полость достаточно большая, чтобы разместить FMNH2,
O2, и длинноцепочечный альдегид.
Роль β- субъединицы до конца не известна, но предполагается, что она
существенна для получения высокого квантового выхода реакции [6].
6
β-субъединица нужна для люминесцентной реакции и ответственна за
термостабильность фермента и за его взаимодействие с восстановленным
флавином.
Люцифераза относится к сульфгидрильным белкам, к ферментам, в
активный центр которых входят SH-группы. Такие ферменты весьма
чувствительны к следам тяжелых металлов.
Субстратами бактериальной люциферазы являются восстановленный
ФМН(ФМНН2)
и
длинноцепочечный
алифатический
альдегид.
Все
бактериальные люциферазы проявляют биолюминесцентную активность с
альдегидами, длина цепи которых от 8 до 16 углеродов.
Бактериальная люцифераза состоит из двух гомологичных субъединиц,
α и β. Обе субъединицы складываются в однодоменный (α./β) 8-бочонок.
Каталитический сайта находится исключительно на α субъединицы. Уже есть
достаточно
вызывающие
доказательств
изменение
для
межсубъединичных
кинетики
фермента
связей.
были
Мутации,
найдены
на
α
субъединицы. Хотя точное местоположение на ферменте для связывания
субстрата не было продемонстрировано. Было предложено три модели для
связывания флавина. Первая модель основана на высоком разрешении
кристаллической структуры. Во второй модели флавина была использована
структура с низким разрешением для размещения FMN на основе
структурного сходства с метилентетрадигрометаноптерин редуктазы (MER).
Молекула FMN была смоделирована в приблизительном расположение
кофактора MER F420. В третьей модели, структура β2 была использована для
размещения фосфатные группы флавина в растворителе. Сообщены
экспериментально-определенные структуры люциферазы / FMN комплекса и
обнаружены, что две из моделируемых структур правильные, а третья нет [7].
Кристаллическая
структура люциферазы
Vibrio
harveyi
была
определена с разрешением в 2,4 и 1,5 Ǻ в отсутствие связанного субстрата
или ингибитора. Таким образом, точное местоположение и атомная
структура активного центра люциферазы не определны. α и β цепи
7
отображать 32% идентичной последовательности. Тем не менее, есть только
один сайт связывания для каждого из FMNH2 и алифатических альдегидов.
Люцифераза V. harveyi имеет место, где ингибитор альдегида не зависит от
субстрата альдегида, но пересекается с сайтом FMNH 2. В отличие от
быстрого равновесия связывания альдегида и субстрата FMNH 2 , связывание
и высвобождение альдегида этого ингибитора проявляются гораздо
медленнее. Таким образом, ингибирование наблюдается только при высоком
уровне альдегида [8].
8
Список использованных источников
1
Владимиров
биолюминесценция
Ю.А.
как
Активированная
инструмент
хемилюминесценция
в
и
медико-биологических
исследованиях // Соровский образовательный журнал, том 7, №1, 2001
2 Гительзон, И.И. Светящиеся бактерии / И.И. Гительзон, Э.К. Риодичева,
С.Е. Медведева и др. -Новосибирск: Наука, СО, 1984
3 Немцева Е.В., Кудряшева Н.С. Механизм электронного возбуждения в
биолюминесцентной реакции бактерий // Успехи химии 76 (1), 2007.
4 A.J. Fisher, T.B. Thompson, J.B. Thoden, T.O. Baldw in, and I. Rayment, // J.
Biol. Ch em., 271, 21956-21968, 1996
5 Березин И.В., Бровко Л.Ю., Угарова Н.Н. Люцифераза светляков //
Биоорганическая химия, том 3, № 12, 1977
6 Суковатая И.Е., Тюлькова Н.А., Кайкова Е.В. Вляиние растворителей на
спектры флуоресцентции бактериальной люциферазы // Материалы 9-ой
Международной молодежной научной
школы
по оптике,
лазерной
физике и биофизике, Саратов, 2005.
7 Zachary T. Campbell, Andrzej Weichsel, William R. Montfort, Thomas O.
Baldwin Crystal Structure of the Bacterial Luciferase/Flavin Complex Provides
Insight into the Function of the β Subunit // Biochemistry, 2009, 48 (26), pp
6085–6094
8 Chi-Hui Li, Shiao-Chun Tu Active Site Hydrophobicity Is Critical to the
Bioluminescence Activity of Vibrio harveyi Luciferase // Biochemistry, 2005,
44 (39), pp 12970–12977
9