введение - Институт фундаментальной биологии и биотехнологии

Федеральное государственное
образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Институт биологии и биотехнологии
Кафедра биофизики
ОТЧЕТ О ВЫПОЛНЕНИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ
ПРАКТИКИ
Срок практики с 1 сентября по 10 октября 2010 года
Место практики Институт биофизики СО РАН
(г. Красноярск)
Магистрант 1 курса
Н.В. Бигашева
Оценка «_______»
Руководитель
Н.С.Кудряшева
Оценка защиты «________»
Итоговая оценка «________»
Красноярск 2010
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 3
Глава 1 Литературная часть ....................................................................................... 5
1.1 Биолюминесценция и ее применение в биосенсорах ........................................ 5
1.2 Биолюминесцентная реакция морских бактерий ............................................... 6
2. Влияние гуминовых веществ на ПАУ .................................................................. 8
Список литературы ................................................................................................... 10
2
ВВЕДЕНИЕ
По предложению Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), для
оценки экологического риска используются 16 приоритетных веществ, которые
формируют основной фон загрязнения полиароматическими углеводородами
ПАУ. К ним относятся нафталин, аценафталин, аценафтен, антрацен, флуорен,
фенантрен, флуорантен, пирен, хризен, тетрафен, 3,4-бензфлуорантен, 11,12бензфлуорантен, 3,4-бензпирен, 1,12-бензперилен, 2,3-о-фениленпирен, 1,2,5,6ди-бензантрацен.
Канцерогенность
доказана
лишь
для
отдельных
представителей ПАУ, но известно, что все они накапливаются в организмах и
характеризуются высокой токсичностью.
Проблемы загрязнения окружающей среды ПАУ (независимо от источников
поступления) связаны с их канцерогенными свойствами, способностью
накапливаться в органах и тканях организмов. Отдельные представители ПАУ
вызывают заболевания эндокринной системы, нарушения репродуктивных
функций, осложнения беременности, спонтанные аборты, младенческую
смертность, патологии новорожденных (уродства и генетические изменения),
умственную отсталость и аномалии в развитии детей. У подростков, постоянно
испытывающих воздействие ПАУ, формируются болезни органов чувств,
костно-мышечной системы, нарушения иммунного и гормонального статуса, а
также другие функциональные расстройства.
В настоящее время ПАУ загрязняют все компоненты биосферы (атмосферу,
водные экосистемы и почвы). В атмосферу они поступают с промышленными
выбросами, выхлопными газами двигателей
внутреннего сгорания, от
предприятий электроэнергетики, во время лесных пожаров, в водные
экосистемы – с атмосферными осадками, поверхностным стоком и сточными
водами нефтеперерабатывающих предприятий. В результате атмосферного
переноса
ПАУ
загрязняются
почвы,
3
растительность,
подземные
иповерхностные воды. Весной, в период таяния снега и льда на реках, с
поверхностнымстоком
происходит
залповое
поступление
ПАУ,
аккумулированных за зимний период.[1]
Известно, что биолюминесцентные реакции чувствительны к токсичным
соединениям и используются в качестве биосенсоров на токсичность и
являются основой современных нанобиотехнологий. Вероятно, эти реакции
могут являться удобными маркерами для изучения влияния модельных
углеводородов на биохимические процессы.[2] Для изучения связывания
модельных углеводородов с ферментами в качестве моделей удобно
использовать флуоресцентные органические соединения (пирен, антрацен,
нафталин.). По изменению флуоресцентных характеристик этих соединений
можно судить об эффективности их связывания с ферментами.
4
Глава 1 Литературная часть
1.1 Биолюминесценция и ее применение в биосенсорах
Известно, что в основе биолюминесценции (свечении живых организмов)
лежит
хемилюминесцентная
реакция
катализируемая
специфическим
ферментом. По определению, хемилюминесценция — это явление, при котором
энергия, выделяющаяся в ходе химической реакции, трансформируется в
электронно-возбужденное состояние одного из продуктов этой реакции. [3]
В большинстве случаев квантовый выход хемилюминесценции не
превышает
десятых
или
тысячных
долей
процента.
Особенностью
биолюминесцентных систем является высокий квантовый выход (от 1 до 100%)
и обязательное участие в реакции белковых компонент — специфических
белков, которые выступают в роли биокатализатора, без которого образование
электронно-возбужденного продукта реакции оказывается невозможным. Белок
является матрицей, связанной ковалентно или нековалентно с небелковым
излучающим хромофором. Высокие квантовые выходы в биолюминесценции
связаны с образованием Последние часто оказываются защищенными от
различного рода процессов переноса и превращения энергии, снижающих
квантовые выходы [4].
Ферменты,
катализирующие
биолюминесценцию,
называются
люциферазами.
Общей особенностью всех светоизлучающих биологических систем является
то, что всем им требуется молекулярный кислород для осуществления
свечения.
Ферменты биолюминесцентных реакций являются составляющей частью
биосенсоров.
Биосенсорная технология сочетает в себе достижения биологии и
современной микроэлектроники. Биосенсор обычно состоит из биологического
компонента (клетки, фермента или антитела), соединенного с крошечным
преобразователем – прибором, приводимым в действие одной системой и
5
передающим энергию (обычно в другой форме) другой системе. Бисенсоры
являются детекторами, действие которых основано на специфичности клеток и
молекул и используется для идентификации и измерения количества малейших
концентраций различных веществ.
При связывании искомого вещества с биологическим компонентом
биосенсора преобразователь генерирует электрический или оптический сигнал,
мощность которого пропорциональна концентрации вещества. Биосенсоры
могут быть использованы для:
– измерения пищевой ценности, свежести и безопасности продуктов
питания;
– экспресс-анализа крови непосредственно у кровати больного;
– обнаружения и измерения степени загрязнения окружающей среды;
– детекции и определения количества взрывчатых веществ, токсинов и
возможного биологического оружия [5].
1.2 Биолюминесцентная реакция морских бактерий
Бактериальная люцифераза состоит из двух неидентичных субъединиц  и 
(42000
г/моль
и
37000
г/моль
соответственно.
Молекулярный
вес
бактериальной люциферазы – 79000 г/моль. Субъединицы люцифераз разных
видов бактерий различаются по аминокислотному составу и молекулярному
весу. Роль субъединиц также различна. Опыты показывают, что активный
центр локализован, главным образом, на -субъединице. На каждый димер
имеется только один центр связывания ФМН — на -субъединице, которая
важна как для связывания флавина, так и для катализа. Роль -субъединицы до
конца не ясна, хотя и очень существенна для проявления биолюминесцентной
активности:
показано,
что
-субъединица
обеспечивает
стабилизацию
каталитически активного димера [6,7].
Пространственная структура бактериальной люциферазы показана на
рисунке 1.
6
Рисунок 1 – Пространственная структура бактериальной люциферазы
К настоящему времени установлено, что химической основой свечения
морских бактерий является ферментативное окисление восстановленного
флавинмононуклеотида (ФМНН2) и длинноцепочечного альдегида кислородом
воздуха.
Схема
химического
преобразования,
соответствующая
биолюминесцентной реакции бактериальной люциферазы, приведена на
рисунке 2.
люцифераза
ФМН  Н 2 + RCOH + O 2  ФМН + RCOOH + H 2O + h
Рисунок 2 - Реакция, лежащая в основе свечения бактерий
Здесь ФМН — флавинмононуклеотид; ФМНН2 — восстановленная
форма флавинмононуклеотида; RCOH — длинноцепочечный алифатический
альдегид
(должен
иметь
от
6
до18
атомов
углерода);
RCOOH
—
соответствующая жирная кислота; О2— молекулярный кислород; Н2О — вода.
В
ходе
реакции
образуется
электронно-возбужденный
продукт,
испускающий голубовато-зеленый свет с максимумом при длине волны 490 нм,
при этом альдегид окисляется до соответствующей кислоты. Реакция протекает
через ряд промежуточных процессов со временем жизни порядка 10-20 с, то
есть это одна из наиболее медленных ферментативных реакций [8].
7
2. Влияние гуминовых веществ на ПАУ
Гумусовые кислоты представляют собой наиболее обширный класс
природных соединений, входящих в состав органического вещества почв,
природных вод и твердых горючих ископаемых. Наличие в молекулах
гумусовых кислот ароматического каркаса, замещенного карбоксильными,
гидроксильными и карбонильными группами, обеспечивает их высокое
сродство к полиядерным ароматическим углеводородам (ПАУ). В связи с
этим
взаимодействие
с
гумусовыми
фактором, контролирующим
кислотами
является
важнейшим
концентрацию свободной формы
ПАУ
в
водных экосистемах. Учитывая, что именно свободная форма обладает
максимальной токсичностью, гумусовые кислоты можно рассматривать как
детоксиканты по отношению к ПАУ. Необходимость создания адекватных
моделей биогеохимических циклов и прогноза развития токсикологической
ситуации в загрязненных экосистемах определяет важность и актуальность
изучения связывающей способности гумусовых кислот по отношению к ПАУ и
установления
количественных
соотношений
между
строением,
связывающей способностью и детоксицирующими свойствами гумусовых
кислот.
Гумусовые
представляют
кислоты
собой
(от
наиболее
латинского
“humus”
–
реакционноспособную
земля,
часть
почва)
обширного
класса природных соединений, объединяемых под названием гуминовые
вещества
(ГВ).
органического
Образование
Гуминовые
вещества
ГВ
в
вещества
составляют
водных
природных
средах
и
от
60
почвенных
происходит
в
до
80%
сред.
результате
химического и биологического разложения растительных и животных
остатков.
В
основе
данного
процесса
лежит
отбор
биодеградации структур. В отличие от синтеза биополимеров,
устойчивых
к
протекающего
по заданному генетическому коду, образование гуминовых веществ - чисто
стохастический процесс. По этой причине ГВ представляют собой смесь
макромолекул переменного состава и нерегулярного строения.
8
По
своей
химической
высокомолекулярные
природе
ароматические
ГФК
представляют
оксикарбоновые
кислоты.
собой
В
силу
нерегулярности строения ГФК не имеют единой структурной формулы,
поэтому можно говорить только о «гипотетических средних» структурах.
Гипотетический структурный фрагмент ГФК почвы приведен на Рис. 3 [9].
9
Список литературы
1. Безопасность России. Экологическая диагностика/под ред. чл.-корр.
РАН В.В. Клюева. М.: Знание, Машиностроение, 2000. 496 с.
2. Майстренко В.Н., Хамитов Р.З., Будников Г.К. Эколого-аналитический
мониторинг суперэкотоксикантов. М.: Химия, 1996. 319 с. 11
3. Kudryasheva, N.S. Bioluminescence and exogenous compounds. Physicochemical basis for bioluminescent assay / N.S. Kudryasheva // Photochem.
Photobiol. – 2006. – Vol. 83. – Р. 77-86.
4. Кудряшева, Н.С. Физико-химические основы биолюминесцентного
анализа / Н.С. Кудряшева, В.А. Кратасюк, Е.Н. Есембекова. –
Красноярск: КГУ, 2000. – 154с.
5. Kratasyuk, V.A. The use of bioluminescent biotests for study of natural and
laboratory aquatic ecosystems / V.A. Kratasyuk, E.N. Esimbekova, M.I.
Gladyshev, E.B. Khromichek, A.M. Kuznetsov, E.A. Ivanova // Chemosphere.
– 2001. – №42. – Р. 909 – 915.
6. Манжуль, М.М. Исследование свойств НАД(Р)Н:ФМН-оксидоредуктазы
из морских люминесцентных бактерий Vibrio fischeri / М.М. Манжуль,
В.С.Данилов // Журн. биохимии. – 1994. – Т.59, №10. – С. 1608 – 1614.
7. Немцева,
Е.В.
Механизм
электронного
возбуждения
в
биолюминесцентной реакции бактерий / Е.В. Немцева, Н.С. Кудряшева //
Успехи химии. – 2007. – Т.76, №1. – С. 102-104.
8. Zachary T., Crystal Structure of the Bacterial Luciferase/Flavin Complex
Provides Insight into the Function of the β Subunit / Zachary T. Campbell,
Andrzej Weichsel, William R. Montfort, Thomas O. Baldwin // Biochemistry.
- 2009. – Vol.48. P. 6085–6094 .
9. Гречищева, Н.Ю. Взаимодействие гумусовых кислот с полиядерными
ароматическими углеводородами: химические и
токсикологические
аспекты: Диссертация на соискание ученой степени кандидата
химических наук: 11.00.11 / Н.Ю. Гречищева. – Москва-2000. – 157 с.
Elibrary Since Direct EBSCO
10
Безопасность России. Экологическая диагностика/под ред. чл.-корр.
1.
РАН В.В. Клюева. М.: Знание, Машиностроение, 2000. 496 с.
Майстренко В.Н., Хамитов Р.З., Будников Г.К. Эколого-аналитический
2.
мониторинг суперэкотоксикантов. М.: Химия, 1996. 319 с. 11
3.
Kudryasheva, N.S. Bioluminescence and exogenous compounds. Physico-
chemical basis for bioluminescent assay / N.S. Kudryasheva // Photochem. Photobiol.
– 2006. – Vol. 83. – Р. 77-86.
4.
Кудряшева, Н.С. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа
/ Н.С. Кудряшева, В.А. Кратасюк, Е.Н. Есембекова. – Красноярск: КГУ, 2000. –
154с.
5.
Kratasyuk, V.A. The use of bioluminescent biotests for study of natural and
laboratory aquatic ecosystems / V.A. Kratasyuk, E.N. Esimbekova, M.I. Gladyshev,
E.B. Khromichek, A.M. Kuznetsov, E.A. Ivanova // Chemosphere. – 2001. – №42. –
Р. 909 – 915.
6.
Манжуль, М.М. Исследование свойств НАД(Р)Н:ФМН-оксидоредуктазы из
морских люминесцентных бактерий
Vibrio fischeri / М.М. Манжуль,
В.С.Данилов // Журн. биохимии. – 1994. – Т.59, №10. – С. 1608 – 1614.
7. Немцева, Е.В. Механизм электронного возбуждения в биолюминесцентной
реакции бактерий / Е.В. Немцева, Н.С. Кудряшева // Успехи химии. – 2007. –
Т.76, №1. – С. 102-104.
8. Zachary T., Crystal Structure of the Bacterial Luciferase/Flavin Complex Provides
Insight into the Function of the β Subunit / Zachary T. Campbell, Andrzej Weichsel,
William R. Montfort, Thomas O. Baldwin // Biochemistry. - 2009. – Vol.48. P.
6085–6094 .
9. Гречищева, Н.Ю. Взаимодействие гумусовых кислот с полиядерными
ароматическими углеводородами: химические и
токсикологические
аспекты: Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических
наук: 11.00.11 / Н.Ю. Гречищева. – Москва-2000. – 157 с.
11