Дулина Тамара Рамазановна - Московский государственный

На правах рукописи
УДК: 616.248-073
Дулина Тамара Рамазановна
БИОМАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ У БОЛЬНЫХ
БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ В ИНДУЦИРОВАННОЙ
МОКРОТЕ И ВЫДЫХАЕМОМ ВОЗДУХЕ
14.00.05 – Внутренние болезни
14.00.43 – Пульмонология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва-2009
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медикостоматологический университет Росздрава»
Научные руководители:
Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Соколов Евгений
Иванович
Кандидат медицинских наук Зыков Кирилл Алексеевич
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Григорьев Юрий Геннадиевич
Доктор медицинских наук, профессор Федорова Татьяна Алексеевна
Ведущая организация:
ФГУ « Российский научный центр восстановительной медицины и
курортологии» Минздравсоцразвития России
Защита состоится ________________2009 года в ____ часов
на заседании диссертационного совета Д208.041.01 при ГОУ ВПО
«Московский государственный медико-стоматологический университет
Росздрава» (127437, г. Москва, ул. Делегатская, д.20/1.).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского
государственного медико-стоматологического университета (127206,
Москва, ул. Вучетича, д. 10а).
Автореферат разослан «__» ________________2009 год.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор
2
Е.Н. Ющук
Общая характеристика работы
Введение
Актуальность
Бронхиальная астма (БА) является одним из самых частых заболеваний
респираторного тракта во всех возрастных группах (А.Г. Чучалин, 2007 г.).
БА – прежде всего хроническое воспалительное заболевание, поэтому
большая роль отводится методам изучения воспаления. В совместном
докладе Национального института сердца, легких, крови (США) и
Всемирной организации здравоохранения «Бронхиальная астма. Глобальная
стратегия», опубликованном в 1993 году, в рекомендациях для дальнейших
исследований неоднократно подчеркивается необходимость в развитии
надежных неинвазивных тестов, которые могли бы отражать степень
воспаления. Установлено, что к регуляции клеточных функций, в том числе к
патогенезу бронхиальной астмы (БА) имеет отношение оксид азота (NO).
Содержание оксида азота в выдыхаемом воздухе может быть измерено с
помощью хемилюминесцентного метода. Повышение концентрации оксида
азота в выдыхаемом воздухе отражает степень аллергического воспаления в
бронхах и в настоящее время признано одним из маркеров БА (А.Г. Чучалин,
2000). Вместе с тем, указанный неинвазивный метод пока еще дорог и
малодоступен.
В
последнее
время
большое
внимание
уделяется
методам
неинвазивной оценки наличия и выраженности воспаления в бронхиальном
дереве, к которым относится метод индуцированной мокроты (ИМ). К
достоинствам метода ИМ относятся: неинвазивность, доступность и
дешевизна, отсутствие противопоказаний и сколько-нибудь выраженных
побочных эффектов, возможность оценить участвующие в воспалении
клеточные элементы, провоспалительные цитокины и другие растворимые
компоненты, а также метаболиты оксида азота. Изучение цитологического
состава
и
содержания
растворимых
компонентов
ИМ
может
дать
возможность не менее оперативно и достоверно судить об активности
3
патологических процессов в дыхательных путях, чем эндоскопическое
исследование бронхов со взятием биопсии и бронхоальвеолярного лаважа
(БАЛ). Вместе с тем, работы, посвященные сравнительному анализу
неинвазивных методов исследования при бронхиальной астме относительно
малочисленны, а их результаты часто противоречивы, что послужило
основанием для данного исследования.
Цель исследования
Изучить биомаркеры воспаления в индуцированной мокроте и
выдыхаемом воздухе у взрослых и детей с бронхиальной астмой и оценить
их информативность для диагностики заболевания и оценки эффективности
проводимой терапии.
Задачи исследования
1. Оценить безопасность и информативность метода индуцированной
мокроты для оценки интенсивности воспаления дыхательных путей у
больных БА различной степени тяжести.
2. Провести сравнительное изучение цитологических и биохимических
показателей ИМ и БАЛ.
3. Дать
патогистологическое
описание
бронхобиоптатов
и
провести
морфометрический анализ стенки бронха в норме и при бронхиальной
астме.
4. Изучить содержание NO в выдыхаемом воздухе, концентрацию нитратов в
ИМ и плазме крови.
5. Провести корреляционный анализ цитологических, морфометрических
показателей, концентрации эйкозаноидов, а также показателей NO и
нитратов при бронхиальной астме у детей и взрослых.
Научная новизна
Доказано, что характеристика клеточного состава ИМ одинаково
информативна у больных БА взрослого и детского возраста. Выявлена
корреляционная зависимость цитологических показателей ИМ от степени
тяжести БА и проводимой терапии. При сравнительном изучении у больных
4
БА цитологических и биохимических показателей индуцированной мокроты
и бронхоальвеолярного лаважа установлено, что они дополняют друг друга,
так как дают адекватную оценку воспалительных изменений в различных
отделах респираторного тракта.
Найдена положительная взаимосвязь между клеточным составом ИМ
и содержанием оксида азота в выдыхаемом воздухе, что свидетельствует об
их взаимном участии в воспалении дыхательных путей. Наличие в ИМ
клеточных элементов острого воспаления, повышенное содержание NO в
выдыхаемом
воздухе,
выявленные
патоморфологические
признаки
воспаления в биоптатах стенки бронха и увеличение синтеза эйкозаноидов у
больных БА в стадии ремиссии заболевания указывают на персистенцию
аллергического воспаления дыхательных путей. Показана возможность
определения
концентрации
эозинофильного
катионного
протеина
в
индуцированной мокроте и выявлена положительная корреляционная
взаимосвязь этого показателя с содержанием оксида азота в выдыхаемом
воздухе. Установлено, что процесс усиленного эндогенного синтеза NO
повышает уровень нитратов в ИМ, не повышая их концентрацию в плазме
крови.
Обнаружена
прямая
корреляционная
зависимость
между
концентрацией оксида азота в выдыхаемом воздухе и содержанием нитратов
в ИМ, что позволяет рекомендовать использование метода изучения
содержания
нитратов
в
индуцированной
мокроте
при
отсутствии
возможности определения концентрации оксида азота в выдыхаемом
воздухе.
Практическая значимость
Внедрение
безопасного
и
в
широкую
клиническую
информативного
метода
практику
изучения
неинвазивного,
показателей
индуцированной мокроты совместно с определением концентрации оксида
азота в выдыхаемом воздухе дает возможность объективно оценить
активность воспалительного процесса у больных БА как в период обострения
заболевания, так и во время ремиссии. На этой основе может быть
5
оптимизирован подбор противовоспалительной терапии и дальнейшая
оценка ее эффективности. Использование изученных неинвазивных методов
особенно оправдано при обследовании детей, страдающих бронхиальной
астмой, так как исследование показателей внешнего дыхания во время
ремиссии
заболевания
недостаточно
информативно,
а
многократное
использование инвазивных методов диагностики невозможно.
Основные положения, выносимые на защиту
1.
При
сравнительном
изучении
цитологических
и
биохимических
показателей индуцированной мокроты и бронхоальвеолярного лаважа у
больных БА установлено, что они дополняют друг друга, так как дают
адекватную оценку воспалительных изменений в различных отделах
респираторного тракта.
2. Повышенное содержание оксида азота в выдыхаемом воздухе и
увеличение в 11 раз доли эозинофилов в индуцированной мокроте у детей,
страдающих БА по сравнению со здоровыми, подтверждают персистенцию
аллергического
воспаления
дыхательных
путей
в
стадии
ремиссии
заболевания.
3. Процесс усиленного эндогенного синтеза оксида азота повышает уровень
нитратов в ИМ у больных БА по сравнению со здоровыми добровольцами,
что отражает выраженность воспаления, в отличие от концентрации нитратов
в плазме крови, которая практически не отличается от группы сравнения и не
зависит от тяжести БА.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в практику пульмонологического
отделения Главного клинического госпиталя МВД России и педагогическую
практику кафедры госпитальной терапии № 2 МГМСУ.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на совместном заседании
кафедр факультетской терапии и профболезней МГМСУ, лаборатории
6
пульмонологии НИМСИ МГМСУ и кафедры общей гигиены МГМСУ 26
ноября 2008 г.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3
из них опубликованная в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки
РФ.
Личное участие
Самостоятельно отбирала пациентов для исследования, освоила
проведение
компьютерной
спирометрии,
получение
индуцированной
мокроты, ее дальнейшую обработку, выделение супернатанта, приготовление
мазков индуцированной мокроты и бронхоальвеолярного лаважа, также
проводила подсчет клеточных элементов в мазках, определение нитратов в
супернатанте индуцированной мокроты. В ходе данного исследования
самостоятельно проводила статистическую обработку данных и анализ
полученных результатов.
Объем и структура диссертации
Диссертация представлена на 107 страницах, состоит из введения, 4
глав: обзор литературы, материалы и методы собственных исследований и
обсуждения
результатов
исследования,
выводов,
практических
рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 8 рисунками и 9 таблицами.
Библиографический указатель содержит 39 отечественных и 98 зарубежных
источника.
Содержание работы
Материалы и методы В исследование было включено 100 пациентов
– это взрослые и дети, страдающие атопической БА. Группу сравнения
составили 21 практически здоровый доброволец.
Взрослые.
персистирующей,
персистирующей
В
исследование
включались
среднетяжелой
атопической
пациенты
персистирующей
бронхиальной
астмой.
устанавливалась на основании рекомендаций GINA, 2002 г.
7
и
с
легкой
тяжелой
Тяжесть
БА
В
первую
группу
вошли
пациенты
с
легкой
персистирующей
бронхиальной астмой. Группу исследуемых больных составили 18 мужчин и
7 женщин. Средний возраст больных в этой группе составил 49,3 ± 4,5 лет,
средняя продолжительность заболевания – 8,2 ± 1,3 года. Во время
исследования терапия включала в себя прием ингаляционных β2-агонистов
длительного действия или их комбинации с ипратропиум бромидом, а также
ингаляционных глюкокортикостероидов. Объем форсированного выдоха за 1
секунду в % от должного в этой группе пациентов составил 96,6 ± 10,3.
Вторая группа состояла из пациентов, страдающих среднетяжелой
персистирующей бронхиальной астмой. В нее вошли 35 человек, из которых
21 мужчина и 14 женщин. Средний возраст пациентов в этой группе составил
51,3 ± 3,8 лет, при этом средняя продолжительность болезни – 14,1 ± 3,3 лет.
Проводилась терапия ингаляционными β2-агонистами длительного действия,
ингаляционными
антихоленергическими
препаратами,
ингаляционными
глюкокортикостероидами (22 пациента). 13 человек получали пероральные
глюкокортикостероиды, из которых 8 мужчин и 5 женщин. Объем
форсированного выдоха за 1 секунду в % от должного в этой группе
пациентов составил 78,7 ± 5,9.
В третью группу вошли пациенты с тяжелой персистирующей БА, из
которых 15 мужчин и 5 женщин. Средний возраст больных в этой группе
составил 59,4 ± 5,4 года, при этом средняя продолжительность заболевания –
23,2
±
2,2
года.
Противовоспалительная
терапия
проводилась
ингаляционными β2-агонистами длительного действия, ингаляционными
антихоленергическими
препаратами,
ингаляционными
глюкокортикостероидами. Объем форсированного выдоха за 1 секунду в %
от должного в этой группе пациентов составил 74,6 ± 4,8.
Дети.
В исследование были включены дети, страдающие
среднетяжелой персистирующей БА в стадии ремиссии. Степень тяжести
бронхиальной
астмы
устанавливалась
на
основании
рекомендаций
Национальной программы «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения,
8
профилактика», 1997 г. В данную группу вошли 11 мальчиков и 9 девочек.
Средний возраст детей составил – 11,4 ± 1,6 лет. Длительность заболевания в
этой группе – 7,5 ± 2,9 лет. Объем форсированного выдоха за первую
секунду в % от должного у исследуемых детей составил 83,8 ± 10,6.
Критериями
исключения
пациентов
из
исследования
являлись
следующие показатели:
- наличие острого или хронического неаллергического воспаления в
бронхах;
- наличие острой или хронической патологии сердечно-сосудистой
системы в анамнезе;
- курение (в последние 12 месяцев).
В группу сравнения включались практически здоровые некурящие
добровольцы без патологии легких и сердца. Всего в данной группе
обследован 21 человек,
из которых 11 добровольцев – взрослые (все
мужчины) и 10 – дети (8 мальчиков и 2 девочки). Средний возраст взрослых
пациентов в данной группе составил 19,5 ± 2,4 года, в группе детей – 9,1 ±
1,6 лет. Объем форсированного выдоха за 1 секунду в % от должного в этой
группе пациентов составил 105, 7 ± 5,4.
Кроме специальных исследований у всех участников группы контроля
были проведены сбор анамнеза, перкуссия, аускультация легких, исследован
общий анализ крови, общий IgE сыворотки крови, а также проведена
компьютерная
спирометрия
с
определением
основных
объемных
и
скоростных показателей.
Для оценки степени выраженности воспалительных изменений в
бронхиальном дереве у 49 пациентов в межприступный период было
проведено бронхологическое обследование со взятием БАЛ и биоптатов
слизистой оболочки стенок бронхов. Среди обследованных больных БА у 5
человек имелось легкое персистирующее течение заболевания, у 28 –
среднетяжелое персистирующее (среди них 20 детей) и у 16 – тяжелое
9
персистирующее течение БА. 10 человек (6 взрослых и 4 ребенка с
врожденной патологией бронхов) составили группу сравнения.
Все участники исследования, а в случае обследования детей - их
родители или законные представители, были ознакомлены с протоколом
исследования, который был составлен в соответствии с требованиями Global
Сlinical Practices и законами РФ, и подписывали установленную форму
информированного согласия, одобренную локальным этическим комитетом.
Методы Получение мокроты, индуцированной 3-5 % гипертоническим
раствором NaCI, распыляемым ультразвуковым ингалятором «Омрон»
(Япония) по методу Pin et al. (1992 г.);
Компьютерная спирометрия с определением объемных и скоростных
показателей проводилась по стандартной методике (Erich Jaeger, Германия);
Хемилюминесцентное определение оксида азота в выдыхаемом
воздухе анализатором Logan Research 2149 (Великобритания);
Бронхологическое
исследование
фибробронхоскопом
BF
40
с
получением бронхоальвеолярного лаважа и бронхиальных биоптатов стенок
бронхов по стандартной методике;
Цитологическое исследование мазков индуцированной мокроты и БАЛ
на микроскопе Laborlux S (Германия);
Измерение толщины базальной мембраны в биоптатах бронхов в 10
участках на каждом срезе при увеличении х400 на препаратах толщиной 5-7
мкм, окрашенным гематоксилином и эозином. Кроме того, оценивалось
соотношение
реснитчатых
и
бокаловидных
клеток
на
стандартном
протяжении эпителиальной выстилки на микроскопе Laborlux S (Германия);
Определение
нитратов:
исследование
на
микропланшетном
спектрофотометре “Dynatech MRGOO” (Швейцария) супернатанта ИМ и
плазмы крови методом Грисса;
Определение
эозинофильного
катионного
протеина
супернатанте ИМ проводилось радиоиммунным методом;
10
(ЭКП)
в
Изучение синтеза эйкозаноидов – метаболитов арахидоновой кислоты
(простациклина, простагландинов F2α, и E2 , тромбоксана В2 и лейкотриена В4)
в БАЛ радиоизотопным методом с использованием экзогенной
14
С-
арахидоновой кислоты;
Данные описательной статистики представлены в виде среднего
значения ± стандартная ошибка, в случае непараметрического распределения
- в виде медианы (25-75%). Достоверность различий между исследуемыми
группами в случае параметрического распределения признаков оценивалась
при помощи непарного t-критерия Стьюдента. В случае непараметрических
данных сравнение проводилось методом Манна-Уитни. Корреляционные
связи определяли методом линейной корреляции при параметрических
данных и методом ранговой корреляции Спирмена при непараметрическом
распределении. Различия считались статистически достоверными при р <
0,05. Статистическая обработка результатов исследования проводилась при
помощи пакета прикладных программ «Statistica for Windows StatSoft Inc.
Версия 6.0».
Результаты исследования и их обсуждение
Исследование клеточного состава ИМ и БАЛ. Морфометрический
анализ состояния стенки бронхов
Сравнительный цитологический состав ИМ и БАЛ был исследован у 20
детей со среднетяжелой персистирующей БА в стадии ремиссии (табл. 1).
Таблица 1.
Цитологический состав ИМ и БАЛ больных БА и здоровых детей
(% клеток)
Группа
Субстрат Макрофаги Нейтрофилы Эозинофилы Лимфоциты
Больные
ИМ
48,6±2,8
2,0±0,3
42,3±3,8
7,1±0,4
БА, n=20
БАЛ
83,6±5,4
12,7±1,3
1,8±0,3
1,9±0,2
Здоровые
ИМ
71,5±3,6
27,6±1,1
0,6±0,2
0,4±0,1
,n=10
БАЛ
93,75,6
0,70,1
0,20,1
5,40,3
- p< 0,05 по сравнению со здоровыми лицами
11
У пациентов не наблюдалось признаков обострения заболевания как
минимум в течение 1 месяца. Больные не получали ни ингаляционных, ни
системных кортикостероидов. Соотношение клеточных элементов в ИМ и
БАЛ оказалось статистически достоверно различным. Так, альвеолярных
макрофагов в ИМ обнаружено почти в 2 раза меньше, чем в БАЛ.
Нейтрофилов, напротив, в 3,5 раза, а эозинофилов почти в 4 раза было
больше в ИМ (табл. 1).
Указанные различия обусловлены особенностями методов получения
материала. Техника забора бронхоальвеолярного лаважа преследует цель
охарактеризовать состав клеточных элементов в дистальных отделах
бронхиального дерева. В ИМ цитологический состав в большей мере
отражает
степень выраженности
воспалительного
процесса
в
более
проксимальных отделах респираторного тракта.
При сравнении клеточного состава ИМ и БАЛ у здоровых лиц обращает
на себя внимание то, что их различия связаны с содержанием нейтрофилов. В
отношении других клеточных элементов различия между составом ИМ и
БАЛ не достоверны.
При сравнении клеточного состава ИМ и БАЛ при бронхиальной астме
тяжелого персистирующего течения обращает на себя внимание тенденция к
повышению уровня нейтрофилов и снижению уровня макрофагов (табл. 2).
Таблица 2.
Цитологический состав ИМ и БАЛ у больных БА тяжелой степени
тяжести (% клеток)
Субстрат
Эозинофилы
Нейтрофилы
Макрофаги
Лимфоциты
ИМ
10,3 ± 1,5
55,7 ± 2,2
33,6 ± 4,2
0,4 ± 0,1
БАЛ
4,6 ± 0,1
23,3 ± 1,3
71,2 ± 5,1
1,3 ± 0,1
р< 0,01 – в сравнении между группами
12
Выраженная тенденция к повышению уровня нейтрофилов в ИМ и
БАЛ при тяжелой персистирующей БА указывает на их значимую
патогенетическую роль в реализации воспаления и клинических проявлений
заболевания.
В таблице 3 представлены результаты цитологического исследования
ИМ у больных легкой персистирующей БА, среднетяжелой персистирующей,
принимающих ингаляционные кортикостероиды, детей со среднетяжелой
персистирующей БА в стадии ремиссии заболевания и здоровых лиц.
Как известно, ведущая роль в развитии воспаления у больных БА
принадлежит эозинофилам, тучным клеткам и лимфоцитам (О.М. Гробова и
А.Л. Черняев, 1998; S.T. Holgate et al., 1990; P.J. Barnes, 1996).
Таблица 3.
Цитологический состав ИМ у больных БА и здоровых лиц (% клеток)
Степень
Эозинофилы Нейтрофилы
Макрофаги
Лимфоциты
тяжести БА
Легкая персист.
n=25
Средняя
персист. n=22
1,0  0,1
34,3  1,3
60,3  1,1
1,6  0,3
11,12,5
32,3  2,6
53,7  3,7
0,5  0,1
7,1  0,4
42,3  2,8
48,6  2,8
0,4  0,1
0,6  0,1
11,3  3,2
86,7  4,6
1,5  0,2
Средняя
персист. (дети)
n=20
Здоровые n=21
-р< 0,05 по сравнению со здоровыми лицами
- р<0,01 по сравнению со здоровыми лицами
Как видно из табл. 3 доля эозинофилов в ИМ больных со
среднетяжелой персистирующей БА в 11 раз больше, чем у больных легкой
персистирующей БА и в 18 раз выше, чем в группе сравнения. Доля
эозинофилов в ИМ у детей, оказалось в 11 раз больше, чем у здоровых лиц,
13
несмотря на то, что исследование проводилось в период стойкой ремиссии.
Таким образом, процентное содержание эозинофилов в ИМ у больных БА
отражает степень выраженности аллергического воспаления.
Под
нашим
наблюдением
находились
взрослые
больные
со
среднетяжелой персистирующей БА, принимавшие ингаляционные (22
пациента) и пероральные глюкокортикостероиды (13 пациентов). Вид
проводимой терапии оказал выраженное влияние на клеточный состав ИМ.
Прием пероральных кортикостероидов уменьшил среднее содержание
эозинофилов в 18 раз, в то время как количество нейтрофилов увеличилось
почти вдвое. Это указывает на то, что в первую очередь оказался
подавленным аллергический компонент воспаления (табл. 4).
Таблица 4.
Зависимость клеточного состава ИМ от проводимой терапии (% клеток)
Проводимая
Эозинофилы Нейтрофилы Макрофаги
Лимфоциты
терапия
Ингаляционные
18,3 ± 2,5
23,5 ± 5,6
56,7 ± 3,7
0,5 ± 0,1
1,2 ± 0,2
47,3 ± 2,1
51,2 ± 2,3
0,3 ± 0,1
кортикостероиды
Пероральные
кортикостероиды
р< 0,05 – в сравнении между группами
Необходимо отметить, что ни у одного обследованного (здоровые
добровольцы, больные БА, взрослые и дети) при получении ИМ ни в одном
наблюдении не выявлено появления признаков затрудненного дыхания и
других осложнений; лишь у 11 обследованных после процедуры появлялся
соленый привкус во рту.
При патологоанатомическом исследовании определялась степень
выраженности эндобронхита (по классификации Г.И. Лукомского, 1973 г.) и
морфологическая форма хронического бронхита (по классификации Г.И.
14
Непомнящих, 1979). Полученные данные сопоставлялись со степенью
тяжести БА.
При легкой персистирующей степени тяжести у всех 5 пациентов
эндоскопически
выявлен
катаральный
эндобронхит
1
степени,
морфологически у 1 больного - хронический катаральный бронхит (КБ), что
соответствовало степени эндобронхита и клиническому течению. У двух
больных – морфологически
катарально-склеротический (КСБ), у двух
пациентов – картина склеротического бронхита (СБ), то есть степень
выраженности патологии бронха у 4 и 5 пациентов более выражена, чем
клиническое течение БА.
При среднетяжелой персистирующей БА у 19 пациентов из 28,
обследованных в этой группе, эндоскопически был выявлен катаральный
эндобронхит 1 степени, у 8 пациентов – катаральный бронхит 2 степени, у 1
исследуемого патологии не выявлено. Морфологически при эндобронхите 1
степени у 5 пациентов наблюдалась картина КСБ, у 14 больных – картина
КБ. При эндобронхите 2 степени морфологически выявлена картина СБ.
Таким образом, в этой группе пациентов в большинстве наблюдений степень
выраженности
морфологических
изменений
была
ниже
клинических
проявлений, а в 8 случаях значительно выше – склеротический бронхит.
Наибольшее несоответствие степени тяжести и морфологической
картины наблюдалось у больных тяжелой персистирующей БА. У 13 из 16
наблюдений эндоскопически фиксировался катаральный эндобронхит 1
степени. При этом у 10 пациентов морфологически обнаружен катаральный
бронхит, у двух из 13 пациентов выявлен КСБ, у одного – СБ с атрофией
слизистой оболочки и массивной лимфогистиоцитарной инфильтрацией
собственной пластинки слизистой и подслизистого слоя. У трех из 16
больных эндоскопически выявлен эндобронхит 2-3 степени, морфологически
у них наблюдались КСБ и СБ.
15
Обнаружить корреляцию между степенью морфологических изменений
и длительностью заболевания не удалось.
Следует отметить, что в нашей работе характер и выраженность
морфологических изменений в бронхах у детей с БА не отличались от
таковых
у взрослых пациентов. Сходные гистологические изменения в
бронхах при БА у взрослых и детей наблюдали и другие исследователи.
В группе сравнения эндоскопически в хрящевых бронхах изменений не
выявлено, однако в одном наблюдении морфологически был обнаружен
катаральный бронхит и в одной – катарально-склеротический бронхит.
Наиболее характерными морфологическими изменениями при БА
являются утолщение стенки дыхательных путей и нарушение соотношения
бокаловидных
и
реснитчатых
клеток.
Часто
это
сопровождается
повреждением эпителия и утолщением базальной мембраны.
Гистологические признаки воспаления стенки бронхов были выявлены
у всех больных БА. Было обнаружено, что при легкой персистирующей БА
толщина базальной мембраны увеличивалась в 2,7 раза по сравнению со
здоровыми добровольцами (5,1± 0,9 и 1,9± 0,6 мкм при р<0,001
соответственно). При среднетяжелой и тяжелой персистирующей БА эти
показатели увеличивались в 3,8 и 4,1 раза соответственно (7,2±0,4 и 7,7±0,8
мкм при р<0,001). Обнаружено также нарушение соотношения бокаловидных
и реснитчатых клеток в эпителии слизистой бронхов. Оно составило при
легкой персистирующей БА 1/3,9, у детей, страдающих среднетяжелой
персистирующей БА в стадии ремиссии 1/2,6 и у больных БА тяжелого
персистирующего течения 1/2,5 при норме – 1/4. Утолщение базальной
мембраны и изменение соотношения реснитчатых и бокаловидных клеток в
пользу последних у больных БА различной степени тяжести указывает на
наличие воспалительного процесса в стенке бронхов, даже в период
ремиссии заболевания.
16
Обнаружить корреляцию между степенью морфологических изменений
и длительностью заболевания не удалось. Вместе с тем учитывая
мозаичность изменений слизистой оболочки бронхов, нельзя с высокой
точностью судить о выраженности воспаления бронхов.
Известно, что высвобождение метаболитов арахидоновой кислоты
(АК) – простагландинов и
лейкотриенов
– является
центральным,
универсальным звеном в развитии воспалительных изменений при БА (T.M.
Kelso, N. Abou-Shala et al., 1996). Специфичность и тяжесть клинических
проявлений этого заболевания во многом определяются именно участием
указанных медиаторов (эйкозаноидов) в его патогенезе.
У всех пациентов имела место активация как липоксигеназного, так и
циклоксигеназного путей метаболизма АК, что сопровождалось увеличением
образования
всех
персистирующем
изучаемых
течении
эйкозаноидов.
заболевания
было
Даже
отмечено
при
легком
достоверное
увеличение уровня биосинтеза эйкозаноидов гранулоцитами жидкости БАЛ.
Синтез метаболитов АК у больных БА среднетяжелого персистирующего и
тяжелого персистирующего течения был повышенным и практически не
различался между этими группами (табл.5).
Таблица 5.
Значения экзогенного биосинтеза эйкозаноидов гранулоцитами
жидкости БАЛ
Степень
тяжести
БА
Легкая
персист.,
n= 5
ПгI2
6,7 ± 2,5
ПгF2α
ПгЕ2
ТхВ2
ЛтВ4
5,3 ± 2,4
3,5 ± 1,0
4,6 ± 1,4
4,5±0,8**
6,3 ± 0,7*** 11,2 ± 2,0*
10,2 ± 1,6
Средняя
персист.
n=28
7,9±1,92** 5,7 ± 0,9**
17
Тяжелая
персист.
n=16
7,4 ± 1,1** 6,2 ± 0,7*** 4,6±0,6***
Здоровые 3,1 ± 0,5
n=10
2,4 ± 0,3
1,8 ± 0,2
6,6 ± 1,1**
12,5± 2,4*
2,6 ± 0,3
5,7 ± 1,4
*- р< 0,05 – по сравнению со здоровыми
**- р< 0,01 – по сравнению со здоровыми
***- р< 0,001 – по сравнению со здоровыми
Толщина базальной мембраны эпителия бронхов у больных БА
среднетяжелого и тяжелого течения тесно коррелировала с биосинтезом ПгЕ2
гранулоцитами жидкости БАЛ (r=0,95, р<0,01), что свидетельствует о том,
что данный медиатор играет одну из определяющих ролей в утолщении
базальной мембраны.
Анализ корреляционной взаимосвязей между биохимическими и
цитологическими показателями аллергического воспаления показал, что
существует взаимосвязь между показателями индуцированной мокроты и
эйкозаноидами у больных БА тяжелой персистирующей степени тяжести. В
частности, обнаружена отрицательная корреляционная связь между долей
нейтрофилов ИМ и ТхВ2 (r= - 0,58, р<0,05), положительная корреляционная
зависимость между долей макрофагов ИМ и уровнем ТхВ2 (r= 0,53, р<0,05),
отрицательная – между содержанием лимфоцитов и концентрацией ЛтВ4 (r = 0,67, р<0,05). Выявленные корреляционные взаимосвязи между клеточными
элементами ИМ и концентрацией метаболитов АК, свидетельствуют о том,
что показатели индуцированной мокроты может использоваться для
объективной оценки выраженности воспаления у больных БА.
Определение взаимосвязи цитологических показателей ИМ
с содержанием NO в выдыхаемом воздухе и показателями ФВД
В период ремиссии БА изолированные показатели спирометрии, в том
числе значение ОФВ1, недостаточно информативны для определения степени
тяжести
патологического
процесса.
18
Например,
у
детей,
больных
среднетяжелой персистирующей БА, величина ОФВ1 составляет в среднем
83,8±10,6 % от должной величины, то есть превышает 80,0 %, принятые в
качестве порога, разделяющего легкую и среднетяжелую персистирующие
степени тяжести заболевания. У взрослых больных с легкой персистирующей
БА величина ОФВ1 составляет в среднем 96,6±10,3 %, что может быть
достаточно характерным и для здоровых лиц.
Сопоставление величины ОФВ1 с клеточным составом ИМ позволяет
более объективно оценить степень выраженности воспалительных изменений
при БА, так как повышенное содержание эффекторных клеток воспаления в
ИМ сохраняется и во время ремиссии заболевания. В группе детей выявлена
отрицательная коррелятивная зависимость между долей нейтрофилов и
величиной ОФВ1 (r= - 0,6, р< 0,05), что характеризует уровень воспаления и
определяет степень бронхиальной обструкции в период ремиссии.
Возможность получения объективной информации о выраженности
патологического процесса еще больше возрастает, если в комплексе с
цитограммой ИМ и величиной ОФВ1 определять содержание NO в
выдыхаемом воздухе (табл. 6).
Таблица 6.
Показатели ОФВ1 (% от должного) и содержание NO в выдыхаемом
воздухе (ppb - частиц на миллиард)
Исследуемый Легкая
персист.
показатель
БА
ОФВ1, %
96,6±10,3
NO, ppb
16,4±1,7
Средняя
персист.
БА
70,7±5,9
Средняя
персист.
БА, дети
83,8±10,6
18,6±2,2
19,1±1,3
Тяжелая
персист.
БА
74,6±4,8
26,1±2,6
Здоровые
105,7±5,4
5,5±0,1
- р0,05 по сравнению со здоровыми
- принимающие ингаляционные кортикостероиды
У всех больных БА уровень оксида азота значимо повышен по
сравнению со здоровыми лицами, даже при легкой персистирующей форме
заболевания. Повышение содержания оксида азота в выдыхаемом воздухе у
19
детей подтверждает персистенцию аллергического воспаления дыхательных
путей в стадии ремиссии.
Полученные показатели содержания NO в выдыхаемом воздухе тесно
коррелировали с количеством эозинофилов в ИМ у детей со среднетяжелой
БА в стадии ремиссии (r= 0,83, р<0,05), что еще раз подтверждает наличие
аллергического воспаления у больных БА в этот период и необходимость его
мониторинга. Также обнаружена прямая коррелятивная связь между уровнем
выдыхаемого NO и толщиной базальной мембраны у больных среднетяжелой
БА (r = 0,73, р = 0,02). Уровень выдыхаемого оксида азота не зависел от
длительности заболевания. Это указывает на то, что уровень выдыхаемого
NO может отражать выраженность воспалительных процессов в бронхах.
Кроме
перечисленных
показателей,
у
больных
с
легкой
персистирующей БА в ИМ была определена концентрация эозинофильного
катионного протеина (ЭКП). Концентрация его составила 18,3±1,1 мкг/мл (у
здоровых - 1, 043-1,056 мкг/мл). Обнаружена положительная корреляционная
связь между концентрацией ЭКП в индуцированной мокроте и уровнем
оксида азота в выдыхаемом воздухе (r = 0,67, р<0,05), что указывает на
возможность использования супернатанта ИМ для исследования ЭКП, как
биомаркера аллергического воспаления.
Сравнение концентрации оксида азота в выдыхаемом воздухе и
содержания нитратов в плазме крови и индуцированной мокроте.
Кроме изучения содержания оксида азота в выдыхаемом воздухе, в
ходе исследования был проведен анализ концентрации нитратов как в
супернатанте ИМ, так и в плазме крови.
Таблица 7.
Концентрации NO в выдыхаемом воздухе и содержание нитратов
в плазме крови и ИМ у больных БА и здоровых лиц
Определяемые
показатели
Легкая
перситир.
БА, n=25
Средняя
перситир.
БА, n=22
20
Средняя
персистир.
БА**, n=13
Здоровые
, n=21
NO, рpb
Нитраты в ИМ,
нмоль/мл
Нитраты в
плазме крови,
нмоль/мл
16,4 ± 1,7
18,6 ± 2,2
7,5 ± 1,1
5,5 ± 0,1
5,3 ± 0,7
6,4 ± 1,1
3,1 ± 0,6
0,8 ± 0,2
2,1 ± 0,2
2,5 ± 0,2
2,0 ± 0,1
1,8 ± 0,2
* - по сравнению со здоровыми p< 0,05
**- при оральном приеме кортикостероидов
Как видно из табл. 7 содержание NO в выдыхаемом воздухе у больных
БА разной тяжести достоверно выше, чем в группе сравнения. При этом
следует отметить, что прием пациентами пероральных кортикостероидов в
значительной степени снижает концентрацию NO в выдыхаемом воздухе, что
связано
с
ингибирующим
воздействием
глюкокортикостероидов
на
индуцибельную NOS (D.H. Yates, S.A. Kharitonov, R.F. Robbins et al., 1996).
Во всех трех группах больных БА обнаружено достоверное
увеличение концентрации нитратов в ИМ по сравнению со здоровыми
лицами. Содержание нитратов в плазме крови было значительно ниже, чем в
ИМ. Кроме того, концентрация нитратов в плазме крови практически не
зависела от тяжести течения БА. У пациентов, принимавших пероральные
глюкокортикостероиды, уровень нитратов в ИМ был значительно ниже, чем
в
других
группах
больных
БА.
Обнаружена
умеренная
прямая
корреляционная связь между уровнем NO в выдыхаемом воздухе и
концентрацией нитратов в ИМ, составившая при БА легкой персистирующей
формы r = 0,52 (р<0,05), у больных со среднетяжелой персистирующей БА
при ингаляционном приеме кортикостероидов r = 0,68 (р<0,05). Это
позволяет рекомендовать использование метода изучения нитратов в ИМ при
отсутствии возможности оценить концентрацию NO в выдыхаемом воздухе.
ВЫВОДЫ
1. Исследование биомаркеров воспаления у больных БА с помощью
неинвазивного
метода
индуцированной
мокроты
доказало
его
безопасность и высокую информативность, как при оценке состояния
21
больных различного возраста и степени тяжести, так и при
определении
эффективности
проводимой
противовоспалительной
терапии.
2. При сравнительном изучении у больных БА цитологических и
биохимических
показателей
индуцированной
мокроты
и
бронхоальвеолярного лаважа установлено, что они дополняют друг
друга, так как дают адекватную оценку воспалительных изменений в
различных отделах респираторного тракта.
3. Анализ морфометрических изменений в биоптатах стенки бронха
выявил утолщение базальной мембраны и 2-3-х кратное преобладание
числа бокаловидных клеток над реснитчатыми у больных БА в
сравнении со здоровыми лицами.
4. Повышенное содержание оксида азота в выдыхаемом воздухе и
увеличение в 11 раз доли эозинофилов в индуцированной мокроте у
детей, страдающих БА по сравнению со здоровыми, подтверждают
персистенцию аллергического воспаления дыхательных путей в стадии
ремиссии заболевания.
5. Процесс усиленного эндогенного синтеза оксида азота повышает
уровень нитратов в ИМ у больных БА по сравнению со здоровыми
добровольцами, что отражает выраженность воспаления, в отличие от
концентрации нитратов в плазме крови, которая практически не
отличается от группы сравнения и не зависит от тяжести БА.
6. Положительная корреляционная взаимосвязь между концентрацией
эозинофильного катионного протеина в супернатанте ИМ и уровнем
оксида азота в выдыхаемом воздухе указывает на возможность их
использования в качестве биомаркеров воспаления при БА.
Практические рекомендации
1. Неинвазивные методы исследования (изучение цитологических и
биохимических показателей индуцированной мокроты и определение
концентрации оксида азота в выдыхаемом воздухе) позволяют оценить
22
наличие и выраженность воспалительных изменений в бронхиальном
дереве у больных бронхиальной астмой независимо от возраста по
следующим критериям: число эозинофилов и нейтрофилов в ИМ,
концентрация эозинофильного катионного протеина и содержание
нитратов в супернатанте ИМ, уровень оксида азота в выдыхаемом
воздухе.
2. Используя указанные методы можно также оценить и эффективность
противовоспалительной
терапии
больных
БА:
снижение
числа
эозинофилов в ИМ, уменьшение концентрации эозинофильного
катионного протеина и содержания нитратов в супернатанте ИМ, а
также снижение концентрации выдыхаемого оксида азота.
3. При отсутствии в лечебном учреждении необходимого оборудования
для измерения содержания оксида азота в выдыхаемом воздухе, можно
воспользоваться определением концентрации нитратов в супернатанте
ИМ, при этом содержание нитратов в ИМ более 5,3 нмоль/л, указывает
на наличие аллергического процесса в дыхательных путях.
Список опубликованных работ по теме диссертации
1. Вознесенский Н.А., Соодаева С.К., Сугкоева Т.Р., Калманова Е.Н., Дулин
К.С., Ягмуров Б.Х., Чучалин А.Г. Выдыхаемый оксид азота (NO) и
бронхиальная гиперреактивность при лечении недокромилом натрия //
Материалы 9 Национального конгресса по заболеваниям органов дыхания,
Москва, 1999, с. 72.
2. Вознесенский Н.А., Соодаева С.К., Дулин К.С., Авдеева О.Е., Степанов
Е.В., Сугкоева Т.Р., Ягмуров Б.Х., Чучалин А.Г. Выдыхаемый оксид азота
(NO) и моноксид углерода (СО) при легочных заболеваниях //Материалы
9 Национального конгресса по заболеваниям органов дыхания, Москва,
1999, с. 329.
3. Вознесенский Н.А., Сугкоева Т.Р., Соодаева С.К. Эозинофильный
катионный протеин и выдыхаемый оксид азота при бронхиальной астме //
23
Материалы 10 Национального конгресса по заболеваниям органов
дыхания, Санкт-Петербург, 2000, с. 7.
4. Запруднова Е.А., Круглов С.В., Ларионов Н.П, Сугкоева Т.Р., Соодаева
С.К.
Изменения
концентрации
метаболитов
оксида
азота
при
бронхиальной астме // Материалы 11 Национального конгресса по
заболеваниям органов дыхания, Москва, 2001, с. 12.
5. Сугкоева Т.Р.,
Запруднова
Дмитрова Т.П., Вознесенский Н.А., Самсонова М.В.,
Е.А.,
Соодаева
С.К.
Исследование
биомаркеров
БА
неинвазивными методами // Материалы 11 Национального конгресса по
заболеваниям органов дыхания, Москва, 2001, с. 14.
6. Сугкоева Т.Р. Оценка воспаления у детей с бронхиальной астмой средней
степени тяжести в период ремиссии // Материалы межвузовской научнотеоретической
конференции,
посвященной
80-летию
образования
Московского государственного медико-стоматологического университета,
28 марта 2002 г., Москва, 2002, с. 38-39.
7. Сугкоева Т.Р.(Дулина Т.Р.). Определение концентрации нитратов в
индуцированной мокроте у больных бронхиальной астмой // Материалы
межвузовской научно-теоретической конференции, посвященной 80летию
образования
Московского
государственного
медико-
стоматологического университета, 28 марта 2002 г., Москва, 2002, с. 4041.
8. Дулина Т.Р., Самсонова М.В. Исследование индуцированной мокроты для
оценки воспаления у детей с бронхиальной астмой средней степени
тяжести // Вопросы современной педиатрии, 2005, Т.5, №1, с. 189-190.
9. Дулина Т.Р., Самсонова М.В. Цитологическая и морфометрическая
оценка воспаления у детей с бронхиальной астмой средней степени
тяжести // Вопросы современной педиатрии, 2007, Т.6, №2, с. 51-53.
10. Дулина Т.Р. Содержание оксида азота в выдыхаемом воздухе и
концентрация нитратов в индуцированной мокроте и плазме крови у
24
больных бронхиальной астмой // Медицинская помощь, 2008, №5, с.4041.
11. Н.А. Рослая, Т.В. Бушуева, Т.Р. Дулина // Цитокиновый профиль у
больных
профессиональными
производстве
тугоплавких
заболеваниями
металлов
//
промышленная экология, 2008, №9, с.47-48.
25
органов
дыхания
в
Медицина
труда
и