На правах рукописи ЦВЯЩЕНКО Татьяна Юрьевна
реклама
На правах рукописи ЦВЯЩЕНКО Татьяна Юрьевна КАЛЬЦИЙЗАВИСИМЫЕ И ЭНДОТЕЛИЙЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ ГУМОРАЛЬНЫХ КОНСТРИКТОРНЫХ РЕАКЦИЙ ВЕНОЗНЫХ СОСУДОВ СКЕЛЕТНОЙ МУСКУЛАТУРЫ 03.03.01 – Физиология Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2010 Работа выполнена в Отделе физиологии висцеральных систем Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, Санкт-Петербург Научный руководитель: доктор медицинских наук Кудряшов Юрий Анатольевич Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук профессор Лосев Николай Андреевич доктор медицинских наук профессор Власов Тимур Дмитриевич Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии РАН им. И.М. Сеченова, Санкт-Петербург Защита состоится «28» декабря 2010 в 1300 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.03 при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН по адресу :197376, Санкт-Петербург, Каменоостровский пр.,69/71 С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Научно-исследовательского института экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу:197376, Санкт-Петербург, ул акад. Павлова,12 Автореферат разослан «______» ноября 2010г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Л.В. Пучкова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Физиология венозного отдела сердечнососудистой системы имеет относительно небольшую историю. Согласно современным представлениям (Б.И. Ткаченко,1979; Б.И. Ткаченко, Ю.А. Кудряшов, А.В. Самойленко,2000), венозные сосуды предназначены для осуществления двух функций – емкостной и резистивной, первая из которых служит для обеспечения адекватного венозного возврата крови от органов к сердцу, а вторая – для поддержания гидростатического капиллярного давления, одного из показателей обменной функции микрососудов. Малоразработанным направлением исследований в физиологии органного кровообращения является изучение роли кальцийзависимых механизмов в регуляции активных реакций вен на гуморальные раздражители, в реализации резистивной и емкостной функций венозных сосудов. Ведущая роль ионов кальция в реализации как электро-, так и фармакомеханического сопряжения процессов возбуждения и сокращения в гладких мышцах сосудов была показана еще в 1968 г. В работе Somlyo ( Somlyo A.V., Somlyo A.P., 1968г). Вместе с тем большинство исследований, касающихся механизмов регуляции кальциевого обмена в сосудистых миоцитах, выполнено на артериальных сосудах ( Р.С. Орлов и др.,1971; Bayer –Symposium IX «Cardiovascular Effects of Dihydropyridine-Type Calcium Antagonists and Agonists», 1985; Kim A. Dora et al, 2008). Сведения о венозных сосудах в указанных работах практически не представлены, хотя известно (Kudryashov et al, 1989; Torok et al, 1997), что сократительные реакции сегментов брыжеечных вен кролика в большей степени зависят от входа в миоциты ионов кальция, чем реакции сегментов артерий. Многочисленные исследования механизмов транслокации клетках проводятся на сегментах ионов кальция в гладкомышечных крупных артериальных сосудов с использованием веществ, обладающих свойствами блокаторов кальциевых 3 каналов, т.е. ограничивающих вход кальция в клетки и уменьшающих его внутриклеточную концентрацию (Fleckenstein, 1985). Другим направлением интенсивно развиваемых исследований регуляции венозных сосудов, их реактивности к действию гуморальных стимулов является изучение роли венозного эндотелия. Это направление получило свое развитие начиная с 1980 года после публикации работы R. F. Furchgott и J. V. Zawadzki. Следует отметить, что исследование роли эндотелия в изменениях реактивности кровеносных сосудов к гуморальным воздействиям проводится, как правило, на сегментах крупных артериальных сосудов и аорте(Ando Н et al,2006; Mandala et.al, 2007). А исследования на венозных сосудах единичны (Ma J et.al, 2006). В указанном плане проведение исследований на органных венозных сосудах является актуальным. В настоящее время является актуальным изучение взаимодействия кальциевых и эндотелиальных механизмов, участвующих в изменении реактивности органных венозных сосудов. По данному вопросу имеются лишь единичные работы (Jimenez et.al, 2001) в которых, однако, отсутствует единое мнение по поводу этого взаимодействия. Отмечается заметное преобладание исследований в пользу наличия такого взаимодействия, вместе с тем и противоположная точка зрения остается значимой. Очевидно, что исследования в указанном плане должны быть направлены на выяснение условий и степени взаимодействия кальциевых и эндотелиальных факторов, зависимости этого взаимодействия и функциональной принадлежности сосудов, включая возможные различия в регуляции тонуса органных венозных сосудов. Большинство исследований, проведены на сегментах и полосках крупных артериальных сосудов и аорты, т.е. в жёстких биохимических условиях, позволяющих производить малорепрезентативны по точный анализ сравнению с полученных исследованиями данных, в но условиях, приближающихся к физиологическим, т.е. при перфузии венозных сосудов 4 аутокровью животного с применением методов динамической регистрации изменений сопротивления кровотоку в венозных сосудах. Цель исследования. Определение кальцийзависимых и эндотелийзависимых механизмов и их взаимодействия в гуморальной регуляции венозных сосудов скелетной мускулатуры в условиях перфузии аутокровью животных. Задачи исследования. 1. Изучить реакции изолированной большой подкожной вены задней конечности кошки на норадреналин и/или ангиотензин II при сочетанном влиянии блокатора кальциевых каналов верапамила и деэндотелизации этанолом или гемоглобином. 2. Исследовать изменения реактивности к норадреналину изолированной большой подкожной вены задней конечности в условиях блокады кальциевых каналов нифедипином и при деэндотелизации этанолом или гемоглобином. 3. Охарактеризовать констрикторные (норадреналин, ангиотензин II) реакции большой подкожной вены задней конечности in vivo при действии антагониста кальция нифедипина до и после угнетения эндотелиальных факторов гемоглобином. 4. Определить величину констрикторных (норадреналин, ангиотензин II) реакций глубоких вен задней конечности кошки при действии антагониста кальция нифедипина до и после угнетения эндотелиальных факторов этанолом. Научная новизна. Впервые показано, что блокада выделения эндотелиальных факторов вызывает увеличение констрикторных реакций на норадреналин и ангиотензин глубоких и поверхностных вен задней конечности кошки. Получены новые экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что блокаторы кальциевых каналов верапамил и нифедипин приводят к понижению констрикторных реакций поверхностных и глубоких 5 венозных сосудов задней конечности кошки независимо от функциональной полноценности венозных эндотелиоцитов. В исследованиях обнаружено, что феномен возвращения констрикторных реакций к исходному уровню (имевшему место до действия блокаторов кальциевых каналов) имеет органную специфичность, то есть имеет место на поверхностных венах задней конечности и не проявляется на глубоких. Научно – практическое значение работы. Полученные в процессе работы ранее неизвестные материалы о взаимоотношениях кальциевых и эндотелиальных механизмов в регуляции венозных сосудов скелетной мускулатуры относятся к фундаментальным физиологическим разработкам. Обнаруженные в работе экспериментальные факты, касающиеся кальциевых и эндотелиальных механизмов изменения реактивности венозных сосудов скелетной мускулатуры могут открыть новые пути поиска превентивных мероприятий и разработку лекарственных средств для коррекции нарушений реактивности периферических вен в результате повреждений венозных миоцитов и эндотелиоцитов. Установленные в работе закономерности и механизмы регуляции венозного тонуса с участием кальциевых и эндотелиальных факторов при действии гуморальных стимулов и фармакологических средств на вены органов и тканей могут быть использованы в лекционных курсах в ВУЗах медико – биологического профиля, а также в соответствующих пособиях и руководствах. Основные положения, выносимые на защиту 1. Блокаторы кальциевых каналов верапамил и нифедипин приводят к понижению констрикторных реакций поверхностных и глубоких сосудов задней конечности кошки независимо от венозных функциональной полноценности венозных эндотелиоцитов. 2. Блокада выделения расслабляющих эндотелиальных факторов экзогенным гемоглобином и/или деэндотелизация этанолом увеличивает 6 констрикторные реакции подкожной и глубоких вен задней конечности кошек на норадреналин и ангиотензин II. 3. Сочетанное влияние повреждающих факторов на венозные эндотелиоциты, то есть химической или физико-химической деэндотелизации на фоне действия антагонистов кальция приводит к возвращению констрикторных реакций подкожной вены задней конечности к исходному уровню, имевшему место до применения блокаторов кальциевых каналов. Этот феномен не проявляется на глубоких венах. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на заседании Отдела физиологии висцеральных систем НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН; на научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (16-17 мая 2007 года г. СанктПетербург); на IV всероссийской с международным участием школеконференции по физиологии кровообращения (17-19 ноября 2008 г. Москва); на III Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт- Петербургские научные чтения – 2009» (2-4 декабря 2009 года г. СанктПетербург). Публикации По теме диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК РФ и тезисы 5 докладов. Личный вклад автора в проведении исследования Соискателем были проведены: анализ литературы по теме исследования, спланированы и проведены эксперименты, статистически обработаны полученные данные, написание статей и подготовка докладов на конференциях. Морфологические исследования были проведены совместно со с.н.с., к.б.н. Отдела общей и частной морфологии НИИЭМ СЗО РАМН Л.А. Федосихиной. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 7 168 источников. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследования проведены на венозных сосудах задней конечности кошек, наркотизированных уретаном (1,1 г/кг, в/в) и/или этаминалом натрия (30-40 мг/кг, в/м), с применением гепарина (1500 Ед/кг, в/в). Все эксперименты проведены с соблюдением основных биотических правил обращения с животными . В Отделе физиологии висцеральных систем разработаны методы перфузии аутокровью животного выделенной большой подкожной вены задней конечности, и глубоких венозных сосудов икроножной мышцы кошек (in situ). Также был использован метод (Webb-Peploe, Shepherd,1969) перфузии большой подкожной вены задней конечности ( in vivo). Метод регистрации динамических изменений сопротивления кровотоку выделенной большой подкожной вены задней конечности у кошек. Большую подкожную вену задней конечности (кошек) изолировали от окружающих тканей на протяжении от голеностопного сустава до места впадения в бедренную вену. Вену перфузировали гепаринизированной (1500 ед) артериальной аутокровью животного в режиме постоянного пульсирующего кровотока (частота пульсаций составляла 134 имп/мин, пульсовое давление 15-20 мм рт.ст.). Перфузионное давление поддерживали на уровне 20-25 мм рт. ст., что с учетом падения давления в катетере на 10-15 мм рт.ст. не превышало физиологически допустимых величин венозного давления для данного региона. О сдвигах сопротивления кровотоку при воздействиях судили по изменениям перфузионного давления, регистрируемого электроманометром на механотронных преобразователях. В экспериментах подобного рода, то есть при перфузии подкожной вены в условиях стабилизированного кровотока, сдвиги перфузионного давления отражают изменение сопротивления исследуемого сосуда. Об изменениях кровенаполнения вены судили с помощью метода аккумулографии (Б.И. Ткаченко,1979), позволяющего регистрировать в динамике кровенаполнение органных венозных сосудов, а в данном случае большой подкожной вены задней конечности кошек. Метод регистрации динамических изменений сопротивления кровотоку большой подкожной вены (in vivo). Изменение сопротивления постоянному кровотоку большой подкожной вены задней конечности кошек определяли in vivo по методу, предложенному Вебб-Пеплое и Шефердом (Webb-Peploe, Shepherd,1969). Выделяли участок этой вены в области голеностопного сустава и вводили в просвет вены катетер, через который осуществляли перфузию этого сосуда в режиме стабилизированного кровотока артериальной кровью, забираемой из бедренной артерии контралатеральной конечности того же животного. Перфузионное давление поддерживали на уровне 20-25 мм рт.ст., что с учетом падения давления на катетере на 10-15 мм рт.ст. не превышало физиологически допустимых значений венозного давления для данного региона. О сдвигах сопротивления судили по изменению перфузионного давления, регистрируемого электроманометром. Метод был применен в проведенных исследованиях вследствие минимальной травматичности, корректности измерений сдвигов венозного сопротивления кровотоку большой подкожной вены. Метод регистрации изменений сопротивления глубоких вен задней конечности кошки. Принцип метода регистрации динамических изменений посткапиллярного сопротивления кровотоку в икроножной мышце кошек основан на морфологических особенностях строения глубокой и поверхностной (подкожной) венозных систем задних конечностей млекопитающих, связанных через посредство коммуникантных венозных 8 стволов (v.v. communicants). Однонаправленность этой связи определяется наличием клапанного аппарата в коммуникантных венах, препятствующего поступлению крови из системы глубоких (внутримышечных) вен конечностей млекопитающих в систему поверхностных (v.saphena magna et parva) при физиологически допустимых уровнях венозного давления. Наличие второй системы венозного оттока крови от мышц конечностей позволило осуществить добавочную к основной перфузии вен препарата голени кошки. Описанный метод параллельной перфузии внутримышечных венозных сосудов голени кровью по естественному пути – артериальные сосуды и капилляры, - а также раствором декстрана через посредство поверхностных вен, впадающих в глубокие вены мышечного препарата, позволил учитывать динамические изменения посткапиллярного сопротивления в ответ на действие вазоактивных веществ, введенных в артериальное русло голени. В силу того, что внутримышечные вены перфузировали параллельно кровью и раствором декстрана в режиме постоянного потока, - изменения венозного перфузионного давления отражали изменения посткапиллярного сопротивления в икроножной мышце. В экспериментах использовали следующие препараты: 1. С целью получения констрикторных реакций венозных сосудов скелетной мускулатуры, болюсно вводили норадреналин (норадреналина гидрохлорид) в дозе 5 мкг и ангиотензина II (ангиотензинамид) 5 мкг в 0,1 мл 6% раствора декстрана. 2. В качестве блокаторов медленных кальциевых каналов использовали верапамил и/или нифедипин, которые растворяли в 6% растворе декстрана. Указанные вещества инфузировали с помощью микроиъектора. Верапамил использовали в дозах 6,25; 12,25; 25 и 50 мкг, содержащихся в 0,1 мл декстрана, а нифедипин в дозе 1 мкг в 1 мл растворе декстрана. Инфузию производили со скоростью 0,1 мл в мин (верапамил) и 1 мл в мин (нифедипин). 3. Химическую деэндотелизацию подкожной вены осуществляли путем инфузии 1% раствора лошадиного гемоглобина. Физико-химическое повреждение эндотелия вены исследуемого органа производили путем инфузии в нее (предварительно «промытую» физиологическим раствором) 12 % раствора этанола в объеме 5 мл. После этого вену промывали физиологическим раствором и возобновляли перфузию кровью животного. Температуру поступающей в вену крови поддерживали на постоянном уровне (37 оС) при помощи ультратермостата (U -15 Germany). Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием t – критерия при помощи пакета программ STATISTICA 8.0. Разность средних значений в несвязанных выборках считали достоверной при р<0,05. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Изменения сопротивления кровотоку и емкости изолированной большой подкожной вены в ответ на действие норадреналина и/или ангиотензина II при сочетанном влиянии верапамила и деэндотелизации (этанолом, гемоглобином). Исследования показали, что в проведенных опытах норадреналин и ангиотензин вызывали сокращение гладких мышц большой подкожной вены задней конечности кошки, что проявлялось повышением перфузионного давления на 17±1,9 мм рт.ст. для норадреналина и 11,25±1,1 мм рт.ст. для ангиотензина. Уменьшение кровенаполнения при этом составляло 0,143±0,012 9 мл для норадреналина и 0,06±0,008 мл для ангиотензина. После окончания реакции производили деэндотелизацию Электронномикроскопические подкожной исследования вены (исследования этанолом. проведены в Отделе общей и частной морфологии НИИЭМ СЗО РАМН) показали, что в результате действия на подкожную вену 12 % раствора этанола происходит повреждение сосудистого эндотелия, являющееся по данным литературы (Караганов Я.Л. и др, 1989; Куприянов В.В., 1986), стресс – реакцией эндотелиоцитов на действие химического агента. При этом структура гладкомышечных элементов вены по данным электронной микроскопии не изменялась. После нарушения функциональной целостности эндотелия венозной стенки этанолом величины сократительных реакций на норадреналин и ангиотензин II возросли, что проявлялось в повышении перфузионного давления на 31±5,8 мм рт.ст. на норадреналин и 16±2,25 мм рт.ст. на ангиотензин. Также при этом имело место понижении кровенаполнения подкожной вены на 0,178±0,025 мл и 0,16±0,02 мл на норадреналин и ангиотензин соответственно. Это увеличение сократительных реакций может быть объяснено снятием действия расслабляющих факторов, выделяемых эндотелиоцитами (Медведева Н.А., Шендеров С.М.,1989). На фоне деэндотелизации производили инфузию верапамила в различных дозировках (6,25; 12,5; 25; 50 мкг/мин). В проведенных экспериментах имело место дозозависимое уменьшение перфузионного давления при действии норадреналина и ангиотензина. Понижение кровенаполнения вены в ответ на действие норадреналина и ангиотензина также имело дозозависимое ослабление. На основании этих данных сделано заключение о том, что действие блокатора кальциевых каналов верапамила в отношении реакций большой подкожной вены на норадреналин и ангиотензин (повышение перфузионного давления и снижение кровенаполнения) 10 проявляется в условиях деэндотелизации, и следовательно, не зависит от функционального состояния венозных эндотелиоцитов. Затем была изменена последовательность предъявляемых повреждающих факторов, то есть сначала проводилась инфузия блокатора кальциевых каналов верапамила, с последующей деэндотелизацией этанолом. Фоновые значение сократительных реакций большой подкожной вены на норадреналин и ангиотензин составляли в отношении повышения сопротивления соответственно 17,7±5,1 мм рт.ст. и 17,5±6,3 мм рт.ст,а в отношении снижения кровенаполнения 0,09±0,01 мл и 0,07±0,01мл. После инфузии верапамила имело место дозозависимое уменьшение сократительных реакций на норадреналин и ангиотензин. На фоне инфузии блокатора кальциевых каналов производили физико-химическую деэндотелизацию вены этанолом, после чего сократительные реакции на норадреналин и ангиотензин значительно возросли по величине и составляли 16,5±3 мм рт.ст. и 20±8,2 мм.рт.ст. соответственно по сопротивлению; а по кровенаполнению на норадреналин и ангиотензин были соответственно равны 0,09±0,01мл и 0,12±0,04 мл. Таким образом, был выявлен феномен возрастания, сниженных действием блокатора кальциевых каналов, сократительных реакций большой подкожной вены на норадреналин и ангиотензин на фоне продолжающегося действия блокатора кальциевых каналов, но после деэндотелизации этанолом. Опираясь на данные литературы ( Gogfraind T., Engleme C., Wibo M.,1985; Kim A Dora et al, 1997), можно предполагать, что открываются новые каналы, независимые от данного блокатора кальциевых каналов, использованного в экспериментах. Также были проведены эксперименты с использованием лошадиного гемоглобина в качестве химического (Toda N., Okamura T., 1998) деэндотелизатора. Этот способ нарушения функциональной целостности эндотелия сосудов описан в литературе и является классическим (Toda N., Okamura T., 1998). Деэндотелизацию производили путем инфузии 1 % раствора лошадиного гемоглобина в вену. 11 Фоновые значения увеличения сопротивления кровотоку при действии норадреналина в данной серии составляли 31±6,5 мм рт.ст., а изменения кровенаполнения было равно 0,3±0,04 мл. После инфузии блокатора кальциевых каналов верапамила сократительные реакции вены уменьшились, что отразилось на меньшем повышении перфузионного давления в реакциях на норадреналин они были равны 6,5±1,5мм рт.ст.; при этом изменения кровенаполнения составляло всего лишь 0,025±0,006 мл. При инфузии экзогенного гемоглобина средние величины сократительных реакций вены на норадреналин значительно возросли и составили 34±8,75 мм рт.ст., а изменения кровенаполнения составляло 0,355±0,065 мл. На основании данных этой серии экспериментов сделано заключение о том, что на фоне действия блокатора кальциевых каналов верапамила химическая деэндотелизация экзогенным гемоглобином, так же как и в опытах в которых в качестве деэндотелизатора применяли этанол, имело место повышение сократительных реакций подкожной вены выше фоновых значений. Представленные результаты свидетельствуют о том, что возвращения феномен констрикторных реакций большой подкожной вены на норадреналин и ангиотензин II после химической и физико-химической деэндотелизации гемоглобином и/или этанолом, к исходному уровню, который был отмечен до его понижения блокатором кальциевых каналов верапамилом, проявляется при деэндотелизации как этанолом, так и гемоглобином. Изменения сопротивления кровотоку и емкости изолированной вены на норадреналин при инфузии нифедипина или при деэндотелизации этанолом и гемоглобином. Проведенные исследования показали, что в условиях относительной физиологической нормы норадреналин вызывал сокращение гладких мышц подкожной вены задней конечности кошки, что проявлялось повышением перфузионного давления на 11,3±1,8 мм рт.ст.( р<0,05) Уменьшение венозного кровенаполнения при этом составляло 0,18±0,01(р<0,05) мл. После окончания 12 реакции производили деэндотелизацию подкожной вены этанолом. Для этого применяли метод повреждения эндотелия венозных сосудов этанолом (12%). После нарушения функциональной полноценности эндотелия венозной стенки этанолом величины сократительных реакций на норадреналин возросли, что проявлялось в повышении сопротивления кровотоку на 23,8±2,8 мм рт.ст. (р<0,05) и при этом имело место понижение кровенаполнения подкожной вены на 0,26±0,02 мл (р<0,05). Это увеличение сократительных реакций может быть объяснено снятием действия расслабляющих факторов, выделяемых эндотелиоцитами (Медведева Н.А., Шендеров С.М.,1989). На фоне деэндотелизации производили инфузию нифедипина (1мкг/мин). После действия блокатора кальциевых каналов (Torok J.,Tkachenko B.I., Kudryashov Y.A.,Torokova R,1997) имело место резкое понижение величин реакций вены на норадреналин. Так, увеличение сопротивления кровотоку составило лишь 4.4±1,25 мм рт.ст., а уменьшение кровенаполнения вены – 0,12±0,02 мл.( р<0,05). На основании этих исследований сделано заключение о том, что действие блокатора кальциевых каналов не зависит от состояния сосудистых эндотелиоцитов. В следующей серии опытов фоновые значения сократительных реакций вены на норадреналин составили по сопротивлению 20±2,2 мм рт.ст.( р<0,05), а по кровенаполнению 0,18±0,012 мл (р<0,05). После инфузии нифедипина сократительные реакции на норадреналин резко уменьшались и составляли в отношении сопротивления кровотоку 12,5±0,9 мм рт.ст.( р<0,05), а уменьшение кровенаполнения составляло 0,08±0,01 мл (р<0,05). После деэндотелизации вены этанолом, произведенной на фоне действия блокатора кальциевых каналов нифедипина, сократительные реакции на норадреналин значительно возрастали по величине и приближались к фоновым значениям. Это особенно проявлялось в отношении повышения сопротивления кровотоку, поскольку оно составляло 19±1,9 мм рт.ст.; при этом реакции по изменению ёмкости также возрастали и были равны 0,15±0,02 мл. Таким образом, был подтвержден 13 феномен, выявленный в исследованиях, с применением в качестве блокатора кальциевых каналов верапамила, который характеризовался возрастанием сократительных реакций на норадреналин после деэндотелизации этанолом на фоне продолжающегося действия нифедипина. Опираясь на данные литературы (Kim A. Dora et al, 1997), можно предполагать, что открываются новые кальциевые каналы, независимые от блокатора кальциевых каналов, использованного в экспериментах. Следующим этапом исследований явилось применение лошадиного гемоглобина для деэндотелизации вены. Химическую деэндотелизацию производили путем инфузии 1% раствора лошадиного гемоглобина в вену. В условиях инфузии гемоглобина средние величины сократительных реакций вены на норадреналин значительно возрастали и составляли 26, 6 ±3,7 мм рт.ст.(р<0,05), а изменение кровенаполнения составляло 0,25±0,02 мл( р<0,05). Следовательно, так же, как и в экспериментах с применением для деэндотелизации 12% раствора этанола, в этой серии опытов увеличение сократительных реакций на норадреналин происходило, по-видимому, в результате устранения расслабляющих факторов, выделяемых эндотелиоцитами. Инфузия блокатора кальциевых каналов нифедипина приводила к выраженному уменьшению сократительных реакций на норадреналин и составляла 13 ±3,8 мм рт.ст.(р<0,05), а изменении ёмкости 0,11±0,02 мл.(р<0,05). Эти исследования подтверждают, что действие блокатора кальциевых каналов не зависит от целостности эндотелия сосудов. В следующей серии экспериментов очередность предъявления повреждающих факторов была изменена. Начальная инфузия блокатора кальциевых каналов нифедипина приводила к уменьшению сократительных реакций на норадреналин, а последующая химическая деэндотелизации гемоглобином возвращала реакции к уровню близкому к тому, который был до действия повреждающих факторов. 14 В результате проведенных исследований на изолированной большой подкожной вене задней конечности кошки с применением в качестве деэндотелизаторов раствора этанола и гемоглобина получены данные, свидетельствующие, с одной стороны об автономности, а с другой стороны об определенной зависимости кальциевых и эндотелиальных механизмов констрикторных реакций большой подкожной вены на норадреналин. В данном исследовании был использован препарат большой подкожной вены, который позволил в аналитических условиях регистрировать показатели обеих функций венозных сосудов, то есть резистивной (изменение сопротивлении кровотоку) и ёмкостной (изменение кровенаполнения венозного сосуда). Можно заключить, что взаимодействие кальций и эндотелийзависимых механизмов возможно, но лишь в определённых условиях. Одним из таких условий является очередность предъявления повреждающих факторов. На фоне нарушения функциональной полноценности эндотелия блокатор кальциевых каналов понижает величины констрикторных реакций подкожной вены. В то же время на фоне нарушения входа внеклеточного кальция в гладкомышечные клетки последующая химическая деэндотелизация возвращает величины к прежним значениям, имевшим место в условиях относительной физиологической нормы. В последнем случае возврат величин реакций к прежнему уровню можно объяснить облегчением входа внеклеточного кальция в гладкомышечные клетки по предполагаемым новым каналам. Констрикторные (норадреналин, ангиотензин II) реакции поверхностной вены задней конечности in vivo при действии антагониста кальция нифедипина до и после торможения выделения эндотелиальных факторов гемоглобином. Проведенные исследования показали, что в условиях относительной физиологической нормы, норадреналин и ангиотензин II вызывали сокращение гладких мышц большой подкожной вены задней конечности кошки, что проявлялось в повышении перфузионного 15 давления, при действии норадреналина на 414 мм рт.ст. , а ангиотензина - на 165 мм рт.ст. После нарушения функциональной полноценности эндотелия венозной стенки в результате инфузии 1% раствора гемоглобина величины реакций возрастали в большей степени при действии норадреналина, чем ангиотензина II. Так норадреналин вызывал повышение перфузионного давления на 598 мм рт.ст., а ангиотензин на 277 мм рт.ст. от исходного уровня. Это увеличение также может быть объяснено снятием действия расслабляющих факторов, выделяемых эндотелиоцитами (Ando et al, 2006; Buluc, Demirel-Yilmaz, 2006). В условиях блокады входа внеклеточного кальция, то есть на фоне действия нифедипина, констрикторные реакции подкожной вены при действии норадреналина и ангиотензина резко уменьшались по величине и составляли для норадреналина 29 3мм рт.ст., а для ангиотензина 83 мм рт. ст. Величины этих реакций были статистически достоверно меньше (при р<0,05) величин реакций полученных в экспериментах в условиях нарушения полноценности эндотелия вследствие инфузии 1% раствора гемоглобина. На основании полученных данных сделано заключение о том, что блокатор кальциевых каналов нифедипин, так же как и верапамил вызывает понижение величин констрикторных реакций большой подкожной вены независимо от нарушения функциональной полноценности венозных эндотелиоцитов. Следующим этапом исследований было изменение очередности предъявления повреждающих факторов, то есть нарушение полноценности эндотелия производили на фоне действия блокатора входа внеклеточного кальция нифедипина. В этой серии опытов в норме норадреналин и ангиотензин вызывали сокращение гладких мышц подкожной вены так же, как и в предыдущей серии опытов. При действии норадреналина повышение перфузионного давления составляло 485 мм рт.ст., а при действии ангиотензина 163 мм рт.ст. После инфузии блокатора кальция нифедипина (1 мкг/мин) величины реакций статистически достоверно (р<0,05) понижались, 16 при действии норадреналин составляли 243 мм рт.ст., а при действии ангиотензина 83 мм рт. ст. Как оказалось, деэндотелизации приводила к резкому увеличению величины констрикторных реакций, особенно это проявлялось в отношении норадреналина. В результате реакции составляли для норадреналина 517мм рт.ст., а для ангиотензина 255 мм рт.ст. Величины реакций на норадреналин статистически достоверно (р<0,05) были больше реакций полученных в условиях блокады кальциевых каналов . На основании результатов экспериментов, сделано заключение о том, что несмотря на действие на гладкие мышцы обоих повреждающих факторов блокатора кальциевых каналов и химической деэндотелизации происходило увеличение амплитуды сократительных реакций большой подкожной вены на норадреналин и ангиотензин, причем для норадреналина это увеличение было статистически достоверным (р<0,05). В целом следует отметить, что величины сократительных реакций вены в ответ на действие констрикторных стимулов, примененных в эксперименте, на фоне действия двух повреждающих факторов, вернулись к исходному уровню, имевшему место в условиях относительной физиологической нормы. Таким образом, в результате химической деэндотелизации гемоглобином блокада кальциевых каналов нифедипином оказалось незначимой, поскольку величины констрикторные реакций вены значительно возросли. На основании полученных данных этот феномен можно объяснить открытием новых, независимых от нифедипина также как и от верапамила, кальциевых каналов. Эту точку зрения разделяют авторы (Kim A Dora et al, 1997; Jimenez et al, 2001) в исследованиях которых в опытах на сегментах аорты (Jimenez et al, 2001) и сегментах артериальных сосудов (Kim A Dora et al, 1997) имел место подобный феномен возврата величин констрикторных реакций к прежнему уровню после действия блокатора кальциевых каналов и последующей деэндотелизации. В представленном исследовании феномен был показан в опытах на большой 17 подкожной вене задней конечности кошки, то есть в максимально приближенных условиях к экспериментам in vivo. Констрикторные (на норадреналин, ангиотензин II) реакции глубоких вен задней конечности кошки при действии антагониста кальция нифедипина до и после торможения выделения эндотелиальных факторов этанолом . Исследования показали, что ангиотензин при введении в глубокие вены, минуя артериальные капилляры, вызывал, в отличие, от норадреналина, двухфазные констрикторные реакции венозных сосудов. Известно (Regoli, 1979), что точкой приложения специфические действия ангиотензиновые ангиотензина рецепторы, в среди сосудах являются которых выделяют несколько подтипов, физиологическое значение которых еще полностью не установлено (Tabrizchi, Pang, 1987). Также показано (Pals, Fulton, 1968), что ангиотензин II оказывает возбуждающее влияние и на α-адренорецепторы. Можно полагать, что в нашем исследовании вторая фаза реакции глубоких вен икроножной мышцы, вызванных ангиотензинном, была обусловлена его возбуждающим действием на α-адренорецепторы. В проведенных констрикторной исследованиях реакции глубоких учитывали вен, лишь которая первую является фазу собственно ангиотензиновой. Средние величины этой реакции в серии экспериментов, в которых производили деэндотелизацию с последующей инфузией блокатора кальциевых каналов нифедипина, составляли 23,5±3,1 мм рт.ст. После физикохимической деэндотелизации этанолом имела место тенденция к увеличению реакций (24,9±5,1 мм рт.ст.). Блокатор кальциевых каналов нифедипин на фоне деэндотелизации также приводил лишь к небольшому снижению констрикторных реакций на ангиотензин (перфузионное давление понижалось до 22,3±5,1 мм рт.ст.). Наряду с этим норадреналин в норме вызывал меньшие, по сравнению с ангиотензинном, по величине констрикторные реакции глубоких вен, которые составляли 14,4±5,8 мм рт.ст. Деэндотелизация этанолом приводила к увеличению констрикторных реакций венозных сосудов, которые 18 составляли по увеличению перфузионного давления 22,3±5,0 мм рт.ст. Аналогичные данные были получены и в исследованиях на большой подкожной вене. Обнаруженное увеличение реакций объясняется снятием релаксирующих факторов (Медведева Н.А., Шендеров С.М.,1989) венозных эндотелиоцитов на гладкие мышцы, что и приводило к увеличению констрикторных реакций на норадреналин. Антагонист кальция нифедипин вызывал резкое достоверное (р<0,05) понижение величин констрикторных реакций на норадреналин, которые составляли 7,7±3,2 мм рт.ст. Сделано заключение, что нифедипин блокировал поступление внеклеточного кальция к гладкомышечным элементам глубоких вен, что и приводило к выраженному уменьшению констрикторных реакций на норадреналин этих сосудов. В следующей серии экспериментов на глубоких венах икроножной мышцы изменили порядок предъявления повреждающих факторов, то есть на фоне действия блокатора кальциевых каналов нифедипина производили физикохимическую деэндотелизацию этанолом. В этих исследованиях в норме ангиотензин II вызывал увеличение перфузионного давления на 37,2±8,5 мм рт.ст. В условиях сохраненной функциональной полноценности венозного эндотелия в сосудах икроножной мышцы нифедипин приводил к снижению величины повышения перфузионного давления. Это понижение составляло 21,9±5,4 мм рт.ст. Последующая деэндотелизация в этой серии экспериментов приводила к еще большему понижению величин констрикторных реакций, прирост перфузионного давления составлял лишь 11,5±2,3 мм рт.ст. эта величина реакций достоверно (р<0,05) отличалась от исходного уровня бывшего до действия повреждающих факторов. На основании этих экспериментов сделано заключение о том, что два повреждающих фактора в очередности нифедипин-этанол, вызывает резкое понижение величин констрикторных реакций глубоких венозных сосудов икроножной мышцы. Аналогичные факты были получены и в исследованиях с норадреналином. В норме констрикторные реакции вен на норадреналин составляли 17,4±1,7 мм 19 рт.ст., после блокады кальциевых каналов - 12,5±2,8, а после деэндотелизации прирост перфузионного давления, вызванный норадреналином, составлял всего лишь 9,6±2,6 мм рт.ст. На основании полученных результатов исследований на глубоких венах, в отличие от констрикторных реакций поверхностных вен задней конечности кошки феномен увеличение констрикторных реакций глубоких вен икроножной мышцы кошек в ответ на действие норадреналина не был обнаружен. Можно заключить, что глубокие вены икроножной мышцы значительно отличаются от поверхностных вен, по крайней мере, в отношении взаимодействия кальциевых и эндотелиальных механизмов в проявлении констрикторных реакций на норадреналин и ангиотензин. Об этом также свидетельствуют результаты исследований, в которых ангиотензин в дозе 5 мкг вызывал двухфазную реакцию в отличие от поверхностных вен. Так в исследованиях (Tayo, Bevan, 1987) in vitro на сегментах аорты кролика, верхней мезентериальной и почечной артерий изучали зависимость сокращения и эндотелиального расслабление от наличия кальция в физиологическом растворе, омывающем сегменты сосудов. На основании проведенных исследований авторы пришли к заключению о том, что выявленное взаимоотношение между кальциевыми и эндотелиальными механизмами зависит от органной принадлежности кровеносных сосудов. В наших исследованиях эти различие были обнаружены в пределах одного органа, однако, следует отметить, что поверхностные и глубокие вены задней конечности кошек функционально отличаются, поскольку глубокие вены окружены каркасом скелетной мускулатуры, в отличие от поверхностной вены. Различия, обнаруженные в исследованиях, между кальциевыми и эндотелиальными факторами двух систем венозных сосудов скелетной мускулатуры ставят вопрос об определенной автономности проявления кальцийзависимых и эндотелийзависимых механизмов регуляции тонуса 20 венозных сосудов, которые зависят от органной специфичности и функциональной значимости венозных сосудов в организме млекопитающих. В процессе работы получены ранее неизвестные факты о взаимоотношениях кальциевых и эндотелиальных механизмов в гуморальной регуляции венозных сосудов скелетной мускулатуры. Обнаруженные в работе экспериментальные факты и феномены, касающиеся кальциевых и эндотелиальных механизмов изменения реактивности венозных сосудов скелетной мускулатуры могут открыть новые пути поиска превентивных мероприятий и разработки лекарственных средств для коррекции нарушений реактивности периферических вен в результате повреждений венозных миоцитов и эндотелиоцитов ВЫВОДЫ 1. Физико – химическая деэндотелизация этанолом и химическая экзогенным гемоглобином приводит к увеличению констрикторных реакций на норадреналин и ангиотензин глубоких и подкожной вен задней конечности кошки, в результате блокады выделения венозными эндотелиоцитами факторов расслабления. 2. Блокаторы кальциевых каналов верапамил и нифедипин приводят к понижению констрикторных реакций поверхностных и глубоких венозных сосудов задней конечности кошки независимо от функциональной полноценности венозных эндотелиоцитов. 3. Химическая деэндотелизация экзогенным гемоглобином и физикохимическая этанолом приводит к возвращению констрикторных реакций изолированной in situ большой подкожной вены задней конечности на норадреналин и ангиотензин II к исходному уровню, который был до их понижения блокатором кальциевых каналов верапамилом или нифедипином. 4. Констрикторные (норадреналин, ангиотензин II) реакции поверхностной вены задней конечности in vivo, также как и в исследованиях на изолированной большой подкожной вене, при действии антагониста кальция нифедипина понижаются, а при последующем торможении эндотелиальных факторов экзогенным гемоглобином возвращаются к исходному уровню и даже превышают его. 5. Реакции глубоких вен задней конечности кошки, вызванные норадреналином и ангиотензинном II, при действии антагониста кальция нифедипина понижаются, но после торможения выделения эндотелиальных факторов этанолом не возвращаются к исходному, до действия блокатора кальциевых каналов, уровню. 21 6. Феномен возвращения констрикторных реакций к исходному уровню (имевшему место до действия блокаторов кальциевых каналов) имеет органную специфичность, то есть проявляется в опытах на подкожной вене задней конечности и не проявляется на глубоких. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Цвященко Т.Ю., Кудряшов Ю.А. Кальцийзависимые и эндотелийзависимые механизмы констрикторных реакций подкожной вены // Бюлл. Экспер. Биол. и медицины. – 2009. - № 147(2). – С.127-129 2. Цвященко Т.Ю., Кудряшов Ю.А. Роль внеклеточного кальция и эндотелия в проявлении констрикторных реакций изолированной подкожной вены на норадреналин // Регионарное кровообр. и микроциркуляция. – 2009. - №4(32). – С.65-69 3. Цвященко Т.Ю., Кудряшов Ю.А. Резистивная и емкостная функция подкожной вены в условиях блокады кальциевых и эндотелиальных факторов // Тезисы XXI Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова, 2010,С.663 4. Цвященко Т.Ю. Особенности констрикторных реакций на норадреналин и ангиотензин глубоких и поверхностных вен икроножной мышцы // Санкт-Петербургские научные чтения – 2009: Материалы III Международного молодежного медицинского конгресса, 2-4 декабря 2009, С.326 5. Цвященко Т.Ю. Кальциевые и эндотелиальные механизмы гуморальной адренергической регуляции резистивной и ёмкостной функции изолированной подкожной вены // Санкт-Петербургские научные чтения – 2009: Материалы III Международного молодежного медицинского конгресса, 2-4 декабря 2009, С.317 6. Цвященко Т.Ю. Совместное влияние кальция и эндотелиальных факторов на проявление констрикторных реакций подкожной вены // Материалы IV всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения,18-19 ноября 2008, С.101 7. Цвященко Т.Ю. Соотношение кальциевых и эндотелиальных факторов в проявлении констрикторных реакций подкожной вены // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Материалы научно-практической конференции, 16-17 мая 2007 года, С.75-76 22
