Практическое занятие № 15

Практическое занятие № 15.
Задание к занятию № 15.
Тема: ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН.
Актуальность темы.
Биологическое окисление – совокупность протекающих в каждой клетке ферментативных процессов, в результате которых молекулы углеводов, жиров и аминокислот расщепляются, в конечном счете, до углекислоты и воды, а освобождающаяся энергия запасается клеткой в виде аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) и затем используется в жизнедеятельности организма (биосинтез молекул, процесс деления клеток, сокращение мышц, активный транспорт, продукция тепла и др.). Врач
должен знать о существовании гипоэнергетических состояний, при которых снижается синтез АТФ. При этом страдают все
процессы жизнедеятельности, которые протекают с использованием энергии, запасенной в виде макроэргических связей
АТФ. Наиболее распространенная причина гипоэнергетических состояний – гипоксия тканей, связанная со снижением концентрации кислорода в воздухе, нарушением работы сердечно-сосудистой и дыхательной систем, анемиями различного происхождения. Кроме того, причиной гипоэнергетических состояний могут быть гиповитаминозы, связанные с нарушением
структурного и функционального состояния ферментных систем, участвующих в процессе биологического окисления, а также
голодание, которое приводит к отсутствию субстратов тканевого дыхания. Кроме того, в процессе биологического окисления
образуются активные формы кислорода, запускающие процессы перекисного окисления липидов биологических мембран.
Необходимо знать механизмы защиты организма от данных форм (ферменты, лекарственные препараты, оказывающие мембраностабилизирующее действие – антиоксиданты).
Учебные и воспитательные цели:
- Общая цель занятия: привить знания о протекании биологического окисления, в результате которого образуется до 70-8% энергии в виде АТФ, а также об образовании активных форм кислорода и их повреждающего действия на организм.
- Частные цели: уметь определять пероксидазу в хрене, картофеле; активность сукцинатдегидрогеназы мышц.
1.
Входной контроль знаний:
1.1. Тесты.
1.2. Устный опрос.
2.
Основные вопросы темы:
2.1. Понятие об обмене веществ. Анаболические и катаболические процессы и их взаимосвязь.
2.2. Макроэргические соединения. АТФ – универсальный аккумулятор и источник энергии в организме. Цикл АТФАДФ. Энергетический заряд клетки.
2.3. Этапы обмена веществ. Биологическое окисление (тканевое дыхание). Особенности биологического окисления.
2.4. Первичные акцепторы протонов водорода и электронов.
2.5. Организация дыхательной цепи. Переносчики в дыхательной цепи (ЦПЭ).
2.6. Окислительное фосфорилирование АДФ. Механизм сопряжения окисления и фосфорилирования. Коэффициент
окислительного фосфорилирования (Р/О).
2.7. Дыхательный контроль. Разобщение дыхания (окисления) и фосфорилирования (свободное окисление).
2.8. Образование токсичных форм кислорода в ЦПЭ и обезвреживание перекиси водорода ферментом пероксидазой.
3.
Лабораторно-практические работы.
3.1. Методика определения пероксидазы в хрене.
3.2. Методика определения пероксидазы в картофеле.
3.3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц и конкурентное торможение её активности.
4.
Выходной контроль.
4.1. Тесты.
4.2. Ситуационные задачи.
5.
Литература:
5.1. Материалы лекций.
5.2. Николаев А.Я. Биологическая химия.-М.: Высшая школа, 1989., С 199-212, 223-228.
5.3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1990.С.224-225.
5.4. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к практическим занятиям по биохимии.- М.: Медицина, 1983, раб.
38.
2. Основные вопросы темы.
2.1. Понятие об обмене веществ. Анаболические и катаболические процессы и их взаимосвязь.
Живые организмы находятся в постоянной и неразрывной связи с окружающей средой.
Эта связь осуществляется в процессе обмена веществ.
Обмен веществ (метаболизм) – совокупность всех реакций в организме.
Промежуточный обмен (внутриклеточный метаболизм) – включает 2 типа реакций: катаболизм и анаболизм.
Катаболизм – процесс расщепления органических веществ до конечных продуктов (СО 2 , Н2О и мочевины). В этот
процесс включаются метаболиты, образующиеся как при пищеварении, так и при распаде структурно-функциональных
компонентов клеток.
Процессы катаболизма в клетках организма сопровождаются потреблением кислорода, который необходим для реакций окисления. В результате реакций катаболизма происходит выделение энергии (экзергонические реакции), которая
необходима организму для его жизнедеятельности.
Анаболизм – синтез сложных веществ из простых. В анаболических процессах используется энергия, освобождающаяся при катаболизме (эндергонические реакции).
Источниками энергии для организма являются белки, жиры и углеводы. Энергия, заключенная в химических связях этих соединений, в процессе фотосинтеза трансформировалась из солнечной энергии.
2.2. Макроэргические соединения. АТФ – универсальный аккумулятор и источник энергии в организме. Цикл
АТФ-АДФ. Энергетический заряд клетки.
АТФ – является макроэргическим соединением, содержащим макроэргические связи; при гидролизе концевой
фосфатной связи выделяется около 20 кдж/моль энергии.
К макроэргическим соединениям относятся ГТФ, ЦТФ, УТФ, креатинфосфат, карбамоилфосфат и др. Они используются в организме для синтеза АТФ. Например, ГТФ + АДФ  ГДФ + АТФ
Этот процесс называется субстратное фосфорилирование – экзоргонические реакции. В свою очередь все эти макроэргические соединения образуются при использовании свободной энергии концевой фосфатной группы АТФ. Наконец,
энергия АТФ используется для совершения различных видов работ в организме:
- механической (мышечное сокращение);
- электрической (проведение нервного импульса);
- химической (синтез веществ);
-осмотической (активный транспорт веществ через мембрану) – эндергонические реакции.
Таким образом, АТФ- главный, непосредственно используемый донор энергии в организме. АТФ занимает центральное место между эндергоническими и экзергоническими реакциями.
В организме человека образуется количество АТФ, равное массе тела и за каждые 24 часа вся эта энергия разрушается. 1 молекула АТФ «живет» в клетке около минуты.
Использование АТФ как источника энергии возможно только при условии непрерывного синтеза АТФ из АДФ за
счет энергии окисления органических соединений. Цикл АТФ-АДФ – основной механизм обмена энергии в биологических системах, а АТФ – универсальная «энергетическая валюта».
Каждая клетка обладает электрическим зарядом, который равен
[АТФ] + ½[АДФ]
[АТФ] + [АДФ] + [АМФ]
Если заряд клетки равен 0,8-0,9, то в клетке весь адениловый фонд представлен в виде АТФ (клетка насыщена
энергией и процесс синтеза АТФ не происходит).
По мере использования энергии, АТФ превращается в АДФ, заряд клетки становится равным 0, автоматически
начинается синтез АТФ.
2.3. Этапы обмена веществ. Биологическое окисление (тканевое дыхание). Особенности биологического окисления.
Обмен веществ состоит из 4 этапов.
I этап – расщепление в желудочно-кишечном тракте белков, жиров и углеводов до мономеров
Освобождается
(аминокислот, высших жирных кислот и глицерина, моносахаридов). В процессе пищеварения теря1% энергии
ется видовая специфичность питательных веществ.
Освобождается
20-30% энергии
70-80%
энергии
II этап – внутриклеточный катаболизм- глюкоза, высшие жирные кислоты, аминокислоты
подвергаются специфическим превращениям до образования ацетил-КоА (гликолиз, β-окисление
высших жирных кислот, трансаминирование аминокислот и др.)- процессы протекают в цитоплазме.
III этап – общий путь катаболизма – цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса).
IV этап – терминальная фаза окисления- тканевое дыхание, ЦПЭ- цепь переноса электронов
(дыхательная цепь).
Окисление органических веществ в клетках, сопровождающееся потреблением кислорода и синтезом воды, называют тканевым дыханием, а цепь переноса электронов (ЦПЭ) – дыхательной цепью.
Особенности биологического окисления:
1. Протекает при температуре тела;
2. В присутствии Н2О;
3. Протекает постепенно через многочисленные стадии с участием ферментов-переносчиков, которые снижают
энергию активации, происходит уменьшение свободной энергии, в результате чего энергия выделяется порциями. Поэтому окисление не сопровождается повышением температуры и не приводит к взрыву.
Электроны, поступающие в ЦПЭ, по мере их продвижения от одного переносчика к другому теряют свободную
энергию. Значительная часть этой энергии запасается в АТФ, а часть рассеивается в виде тепла.
Перенос электронов от окисляемых субстратов к кислороду происходит в несколько этапов. В нем участвует
большое количество промежуточных переносчиков, каждый из которых способен присоединять электроны от предыду-
щего переносчика и передавать следующему. Так возникает цепь окислительно-восстановительных реакций, в результате
чего происходят восстановление О2 и синтез Н2О.
2.4. Первичные акцепторы протонов водорода и электронов.
Никотинзависимые дегидрогеназы, содержащие в качестве коферментов НАД+ или НАДФ+ . НАД+ и НАДФ+ - производные витамина РР. Субстраты, от которых происходит отщепление (дегидрирование) протонов Н + и ē на НАД- и
НАДФ- зависимые дегидрогеназы находятся в цитоплазме и в матриксе митохондрий. Рабочей частью НАД и НАДФ
служит никотинамид (вит. РР). В окисленной форме никотинамидные коферменты обозначают как НАД + или НАДФ+ , так
как они несут положительный заряд на атоме азоте пиридинового кольца. В реакциях дегидрирования из двух атомов
водорода, отщепляемых от окисляемого субстрата, никотинамидное кольцо присоединяет ион водорода и два электрона,
второй ион водорода переходит в среду.
O
H O
H
H3
NH2
OH
+
COOH
O
N
COOH
+
+ Н+CH3
NH2
..
N
HC OH
R
НАД
CH3
O
-2Н+; -2ē
N
OOH
+
+2Н
; 3+2ē
CH
R НАДН + Н+
R
НАД+, присоединяя протоны и электроны от различных субстратов, служит главным коллектором энергии окисляемых веществ и главным источником электронов, обладающих высоким энергетическим потенциалом, для ЦПЭ.
Субстратами, отдающими протоны Н+ и электроны на НАД-зависимые дегидрогеназы, являются: изоцитрат, αкетоглутарат, малат, ПВК, глутаминовая кислота (глутамат) и др.
НАДФН не является непосредственным донором ЦПЭ, а используется исключительно в восстановительных биосинтезах.
Переносчики в дыхательной цепи
Флавиновые дегидрогеназы содержат в качестве простетических групп ФАД или ФМН. Рабочей частью ФАД и
ФМН является витамин В2, к которому присоединяются от окисляемого субстрата два протона Н + и два электрона.
Флавиновые ферменты- сложные ферменты, в
простетической группе ФМН или ФАД, в состав которых
R
входит витамин В2
R
O
N
H3C
H
+
H
C
N
O
+2Н ; +2ē 3
H3C
-2Н+; -2ē
N
ФАД+
окисленная
форма
O NH
2ē
2 Н+
H3C
N
H
ФАДН2
NH
O
восстановленная
форма
Большинство ФАД-зависимых дегидрогеназ – растворимые белки, локализованные в матриксе митохондрий. Они
являются акцепторами протонов Н+ и электронов от субстратов: ацил-КоА, глицерол-3-фосфат и др.
Исключение составляет сукцинат-фумарат дегидрогеназа, находящаяся во внутренней мембране митохондрий. Это
II комплекс в ЦПЭ. Она является акцептором протонов Н+ и электронов от субстрата – янтарная кислота (сукцинат).
2.5. Организация дыхательной цепи. Переносчики в дыхательной цепи (ЦПЭ).
Основные переносчики электронов встроены во внутреннюю мембрану митохондрий и организованы в 4 комплекса. Компоненты комплексов расположены в строго определенной последовательности, в порядке возрастания их окислительно-восстановительных потенциалов (редокс-потенциалов). Величина редокс-потенциала связана с изменением свободной энергии. Её выражают в вольтах; чем она меньше (отрицательнее), тем меньше сродство вещества к электронам.
13
Чем больше сродство, тем больше восстановительный потенциал.
I комплекс – НАДН-дегидрогеназа – состоит из нескольких полипептидных цепей.
COO
В I комплекс входят две простетические группы: ФМН и FeS (железо-серные белки). Атомы железа в этих белках
(негемовое железо) собраны в несколько групп, так называемых железо-серных центров. Известны 3 типа FeS-центров
(FeS, Fe2S2, Fe4S4), в котором атом железа связан с атомом серы остатками цистеина или неорганической серы.
На I комплекс протоны и электроны от субстратов (изоцитрат, малат и др.) транспортирует главный первичный акцептор водорода – НАД-зависимая дегидрогеназа (восстановленная форма НАДН+Н+). НАДН+Н+ - два электрона и один
протон переносятся на ФМН простетическую группу I комплекса с образованием ФМНН2. Второй протон поглощается из
матрикса. С ФМНН2 электроны и протоны транспортируются на FeS. От железо-серных центров электроны и протоны
переносятся на кофермент Q (убихинон).
II комплекс – сукцинат-фумарат-дегидрогеназа. Состоит из 2 простетических групп: ФАД и FeS. На ФАД электроны и протоны отщепляются от субстрата – сукцинат, при этом ФАД восстанавливается в ФАДН2. Затем протоны и
электроны передаются на FeS, с FeS они транспортируется на убихинон.
Убихинон - (вездесущий хинон) или кофермент Q. Это небелковый переносчик. Он является жирорастворимым соединением. Структура КоQ сходна с витаминами К, Е.
Молекулы убихинона различаются длиной углеводородной цепи, которая у млекопитающих содержит 10 изопреноидных звеньев и обозначается как Q10.
Убихинон выполняет коллекторную функцию, присоединяя ē и протоны от НАДН-дегидрогеназы (I комплекс),
сукцинат-фумаратдегидрогеназы (II комплекс) и ФАД- зависимых дегидрогеназ, он обратимо восстанавливается в гидрохинон (QН2).
Содержание убихинона значительно превосходит количество других компонентов ЦПЭ. Например, на 1 молекулу
НАД+ приходится 50молекул КоQ.
От убихинона происходит транспорт только электронов на цитохромы.
Цитохромы.
Обнаружены в 1886г. Мак-Мунном, исследованы в 1925г. Девидом Кейлином.
Цитохромы – это сложные белки-гемопротеины, которые в качестве простетической группы содержат гем.
Известно около 30 различных цитохромов.
Их многообразие обусловлено:
- различием боковых цепей в структуре гема;
- различием в структуре полипептидных цепей;
- различием в способе связи полипептидных цепей с гемом.
В зависимости от способности поглощать свет в различной части спектра все цитохромы делятся на группы а, в, с.
Внутри каждой группы отдельные виды с уникальными спектральными свойствами обозначают цифровыми индексами
(в, в1, в2 и т.д.)
Цитохромы имеют ряд особенностей:
1. Цитохромы в ЦПЭ располагаются в порядке возрастания окислительно-восстановительного потенциала (редокспотенциала);
2. Железо в цитохромах способно изменять свою степень окисления, поэтому цитохромы в ЦПЭ транспортируют
только электроны.
В транспорте двух электронов принимают участие две молекулы каждого вида цитохромов, так как одна молекула
цитохрома может переносить только один электрон.
В ЦПЭ участвуют 5 типов цитохромов- а, а3, в, с, с1. За исключением цитохрома с, все цитохромы находятся во
внутренней мембране митохондрий в виде сложных белковых комплексов.
III комплекс – QН2-дегидрогеназа состоит из 2 типов цитохромов (в1 и в2), цитохрома с1 и FeS. Внутри комплекса
электроны передаются от цитохромов в на FeS-центры, затем на цитохром с1. С цитохрома с1 электроны транспортируются на цитохром С. Это периферический водорастворимый мембранный белок с молекулярной массой 12500Д, имеющий
одну полипептидную цепь из 100 аминокислотных остатков и молекулу гема, ковалентно связанную с полипептидом. От
цитохрома С электроны переносятся на IV комплекс.
IV комплекс – цитохромоксидаза входят два цитохрома типа аа3, каждый из которых имеет центр связывания с
кислородом. Цитохромы а и а3 имеют в своей структуре гем А, отличающийся от гема цитохромов с и с 1. Он содержит
формильную группу вместо одной из метильных групп и углеводородную цепь вместо одной из винильных групп.
Другая особенность комплекса аа3 – наличие в нем ионов меди, связанных с белковой частью в так называемых
CuA- центрах. Перенос электронов комплексом а-а3 включает реакции:
Cu+
Cu2+ + ē
Fe2+
Fe3+ + ē
Комплекс цитохромов а-а3 транспортирует электроны непосредственно на молекулярный кислород, активируя его:
2ē
аа3
½ О2
О=
У активированного кислорода появляются две свободные валентности, к которым присоединяются 2 протона Н + от
первичных акцепторов водорода: НАД-зависимых дегидрогеназ, ФАД-зависимых дегидрогеназ; сукцинат-фумаратдегидрогеназы (II комплекс) через убихинон (QН2).
Организация дыхательной цепи
Доноры протонов Н+ и электронов:
-сукцинат
(субстраты -S)
субстраты
-изоцитрат;
-α-кетоглутарат; ЦТК
2ē,
-малат;
2Н+
-ПВК; - глутамат
H
АДФ+Н3РО4
S
H
АТФ-аза
НАДН-дегидрогеназа
ФМН ФМНН2;FeS
-0,30
2ē 1/2O
1/2O=
2
+0,82
2ē,2Н+
НАД-зависимая
дегидрогеназа
НАД
2ē,2Н+
НАДН+Н+
-0,32
H2O
АТФ АДФ+Н3РО4
II компл.
мембрана III комплекс
сукцинат-фумарат
QH2-дегидрогеназа
дегидрогеназа
ц.b
FeS
ц.c1
3+
ФАД
ФАДН2 FeS
Fe3+
Fe
2ē
2ē,2Н+
2ē,2Н+
АТФ-аза
внутренняя
I комплекс
-0,42
АДФ+Н3РО4
АТФ
2ē,
2Н
+
+0,03
2Н+
Q
2ē,2Н+
2ē
2ē 2ē
Fe2+
+0,07
убихинон
QH2
+0,04
Первичные акцепторы
протонов и электронов
IV комплекс
Цитохром
оксидаза
а а3
ц. С Cu2+
Cu+
2ē
Fe 2+
Fe3+ Fe3+
Fe2+
2+
+0,29
+0,55
+0,23 Fe 2ē
+0,25
2ē,2Н+
ФАД-зависимые
дегидрогеназы
ФАД
ФАДН2
-0,05
Доноры протонов и электронов: 2ē,2Н+
-ацил КоА; -глицерол-3-фосфат
АТФ-аза
АТФ
внутренняя
мембрана
матрикс
митохондрий
2.6. Окислительное фосфорилирование АДФ. Механизм сопряжения окисления и фосфорилирования. Коэффициент окислительного фосфорилирования (Р/О).
Так как электроны всегда стремятся переходить от электроотрицательных систем к электроположительным, их
транспорт по ЦПЭ к кислороду сопровождается относительно большим снижением свободной энергии.
В ЦПЭ можно выделить 3 участка, в которых перенос электронов сопровождается относительно большим снижением свободной энергии. Это количество свободной энергии необходимо для синтеза АТФ из АДФ и фосфата (фосфорилирование).
Процесс переноса электронов по ЦПЭ и синтез АТФ энергетически сопряжены.
Синтез АТФ из АДФ и Н3РО4 за счет энергии переноса электронов по ЦПЭ называют окислительным фосфорилированием.
Механизм сопряжения окончательно не выяснен, наиболее обоснованной является хемиосмотическая теория Митчелла, предложенная в 1961г.
Перенос электронов по ЦПЭ от НАДН к кислороду сопровождается выкачиванием протонов из матрикса митохондрий через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство.
Протоны, перенесенные из матрикса в межмембранное пространство, не могут вернуться обратно в матрикс, так
как внутренняя мембрана не проницаема для протонов.
Таким образом, создается протонный градиент, при котором концентрация протонов в межмембранном пространстве больше, а рН меньше, чем в матриксе. Кроме того, каждый протон несет положительный заряд, и вследствие этого
появляется разность потенциалов по обе стороны мембраны: отрицательный заряд – на внутренней стороне, положительный заряд – на внешней. В совокупности электрический и концентрационный градиенты составляют электрохимический
потенциал ΔμН+ - источник энергии для синтеза АТФ.
Энергия электрохимического потенциала (ΔμН+) используется для синтеза АТФ, если протоны возвращаются в
матрикс через ионные каналы АТФ-синтазы (V комплекс).
Наиболее активный транспорт протонов в межмембранное пространство, необходимый для образования ΔμН+ происходит на участках ЦПЭ, соответствующих расположению комплексов I, III, IV. Эти участки называют пунктами сопряжения дыхания и фосфорилирования, где и происходит синтез АТФ.
V комплекс – АТФ-синтаза.
Это интегральный белок внутренней мембраны митохондрий. Он расположен в непосредственной близости к дыхательной цепи. АТФ-синтаза состоит из двух белковых комплексов.
Гидрофобный комплекс F◦ погружен в мембрану. Он служит основанием, которое фиксирует АТФ-синтазу в мембране.
Комплекс F0 состоит из нескольких субъединиц, образующих канал, по которому протоны переносятся в матрикс.
Комплекс F1 выступает в матрикс. Он состоит из 9 субъединиц. Между α- и β- субъединицами располагаются три
активных центра, в которых происходит синтез АТФ.
Повышение концентрации протонов в межмембранном пространстве активирует АТФ-синтазу. Электрохимический потенциал ΔμН+ заставляет протоны двигаться по каналу АТФ-синтазы в матрикс. Параллельно под действием ΔμН+
происходят конформационные изменения в парах α- и β- субъединиц белка F1 , в результате чего из АДФ и Н3РО4 образу-
ется АТФ. Электрохимический потенциал, генерируемый в 3 пунктах сопряжения в ЦПЭ, используется для синтеза одной
молекулы в каждом пункте.
Сопряжение дыхания и фосфорилирования
(окислительное фосфорилирование).
Наружная мембрана митохондрии
Межмембранное пространство
nH+
Внутренняя
мембрана
митохондрий
NADH
+
+
+
+
2ē
Q
2ē
+
I компл.
nH+
nH+
цит. С
aa3
FMH
2ē
II компл.
FAD
NAD
bc1
2ē
АТФсинтаза
2ē
Cu2+
фумарат
Малат
Н2О
1/2О2
сукцинат
Оксалаацетат
IV компл.
III компл.
H+
АДФ+Н3РО4
МАТРИКС
АТФ
V компл
Отношение количества Н3РО4, использованной на фосфорилирование АДФ, к атому поглощенного кислорода,
называют коэффициентом окислительного фосфорилирования и обозначают Р/О.
Для субстратов, которые отдают протоны и электроны на НАД-зависимые дегидрогеназы, коэффициент фосфорилирования равен 3/1=3АТФ, так как протоны и электроны транспортируются через 3 пункта сопряжения (I, III, IV комплексы).
Например, изоцитрат, малат, ПВК и др.
Для субстратов, которые отдают протоны и электроны на ФАД-зависимые дегидрогеназы и сукцинат-фумаратдегидрогеназу (II комплекс), коэффициент фосфорилирования равен 2/1=2АТФ, так как электроны поступают на III комплекс, минуя первый пункт сопряжения (I комплекс). Например, сукцинат, глицерол-3-фосфат и др.
2.7. Дыхательный контроль. Разобщение дыхания (окисления) и фосфорилирования (свободное окисление).
Окисление субстратов и фосфорилирование АДФ в митохондриях прочно сопряжены. Скорость использования
АТФ регулирует скорость потока электронов в ЦПЭ. Если АТФ не используется и его концентрация в клетках возрастает,
то прекращается и поток электронов к кислороду. С другой стороны, расход АТФ и превращение его в АДФ увеличивает
окисление субстратов и поглощение кислорода.
Зависимость интенсивности дыхания митохондрий от концентрации АДФ называют дыхательным контролем.
Некоторые химические вещества (протонофоры) могут переносить протоны и другие ионы (ионофоры) из мембранного пространста через мембрану в матрикс, минуя протонные каналы АТФ-синтазы. В результате этого исчезает
электрохимический потенциал и прекращается синтез АТФ. Это называют разобщением дыхания и фосфорилирования. В
результате разобщения количество АТФ снижается, а АДФ увеличивается, что приводит к возрастанию скорости окисления НАДН и ФАДН2, возрастает и количество поглощенного кислорода, но энергия выделяется в виде тепла, и коэффициент Р/О резко снижается (свободное окисление).
Разобщители – липофильные вещества, легко проходящие через липидный слой мембраны:
- 2,4-динитрофенол,
- дикумарол (антивитамин вит. К);
- билирубин (продукт распада гема);
- тироксин (гормон щитовидной железы).
Все эти вещества проявляют разобщающее действие только при их высокой концентрации.
2.8. Образование токсичных форм кислорода в ЦПЭ и обезвреживание перекиси водорода ферментом пероксидазой.
В большинстве реакций с участием молекулярного кислорода его восстановление происходит поэтапно с переносом одного электрона на каждом этапе. При одноэлектронном переносе происходит образование промежуточных высокореактивных форм кислорода.
В невозбужденном состоянии кислород нетоксичен. Образование токсических форм кислорода связано с особенностями его молекулярной структуры. О2 содержит 2 неспаренных электрона с параллельными спинами, которые не могут образовывать термодинамическую стабильную пару и располагаются на разных орбиталях. Каждая из этих орбиталей
может принять ещё один электрон.
Полное восстановление О2 происходит в результате 4 одноэлектронных переходов:
ē
О2
О2-
О2ˉ - супероксид
+ē , Н+
Н2О2 - пероксид
+ē , Н+
Н2О2
+ē , Н+
Н2О + ОНгидроксильный радикал
2Н2О
Супероксид, пероксид и гидроксильный радикал- активные окислители, представляют серьезную опасность для
многих структурных компонентов клетки.
Активные формы кислорода могут отщеплять электроны от многих соединений, превращая их в новые свободные
радикалы, инициируя цепные окислительные реакции. Активные формы О2 вызывают окисление липидов, белков мембраны клеток, ДНК, РНК. Все это приводит к разрушению клеток.
Большая часть активных форм О2 образуется при переносе электронов в ЦПЭ, прежде всего, при функционировании QН2– дегидрогеназного комплекса. Это происходит в результате неферментативного переноса («утечки») электронов
с QН2 на кислород.
Супероксид может образовываться:
1. При спонтанном окислении гемоглобина. В норме гемоглобин обратимо связывает кислород в оксигемоглобин,
однако оксигемоглобин превращается в метгемоглобин (Fе 3+) и супероксид О2ˉ.
2. Вирус гриппа взаимодействует с нейтрофилами легочной ткани и образует О 2ˉ, который поддерживает воспаление, деструктивные процессы.
3. Нейтрофилы, в избытке накапливающиеся в воспаленных суставах, также образуют О 2ˉ, которые участвуют в
развитии артритов.
В организме существуют защитные механизмы:
- гемсодержащие ферменты: пероксидаза, которая расщепляет Н2О2:
пероксидаза
Н2О2
Н2О + О
3.
Лабораторно-практические работы.
3.1. Методика определения пероксидазы в хрене.
В пробирку вносят 3 капли 1% раствора гидрохинона, добавляют 3 капли вытяжки из хрена и 3 капли 3% перекиси водорода. Оставляют стоять 2-3 минуты. Наблюдают появление красно- коричневого окрашивания.
3.2. Методика определения пероксидазы в картофеле.
На срез картофеля капнуть 1-2 капли гидрохинона и 1-2 капли перекиси водорода. Оставить на 2-3 минуты. Наблюдается красно-коричневое окрашивание среза картофеля.
Практическое занятие № 16.
Задание к занятию № 16.
Тема: ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН.
Учебные и воспитательные цели:
- Общая цель занятия: привить знания о терморегуляторной функции ЦПЭ, общем пути катаболизма (ЦТК), причинах
гипоэнергетических состояний, о функциях микросомального окисления, а также об обезвреживании активных
форм кислорода и использовать эти знания в практической деятельности.
- Частная цель: уметь определять каталазную активность в интактных эритроцитах по методу Крайнева.
1. Входной контроль знаний:
1.1. Тесты.
1.2. Устный опрос.
2. Основные вопросы темы:
2.1. Терморегуляторная функция ЦПЭ.
2.2. Короткие пути окисления.
2.3. Общий путь катаболизма – цикл трикарбоновых кислот (ЦТК).
2.4. Функции ЦТК
2.5. Энергетический баланс ЦТК.
2.6. Гипоэнергетические состояния, причины.
2.7. Микросомальное окисление, биологическая роль.
2.8. Обезвреживание перекиси водорода ферментом каталазой.
3. Лабораторно-практические работы.
3.1. Определение каталазной активности в интактных эритроцитах по методу Крайнева.
3.2. Качественная реакция на каталазу.
4. Выходной контроль.
4.1. Тесты.
4.2. Ситуационные задачи.
5. Литература:
5.1. Материалы лекций.
5.2. Николаев А.Я. Биологическая химия.-М.: Высшая школа, 1989. С. 212-223, 228-231.
5.3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1990.С. 213-224.
5.4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 2004. С. 305-316.
5.5. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к практическим занятиям по биохимии.- М.: Медицина, 1983, раб.
36.
2.
Основные вопросы темы.
2.1. Терморегуляторная функция ЦПЭ.
На синтез молекулы АТФ расходуется примерно 40-45% всей энергии электронов, переносимых по ЦПЭ, 25% тратится на работу по переносу веществ через мембрану. Остальная часть энергии рассеивается в виде теплоты и используется на поддержание температуры тела. Дополнительное образование теплоты происходит при разобщении дыхания и
фосфорилирования, которое может быть биологически полезным. Оно позволяет генерировать тепло для поддержания
температуры у новорожденных, у зимнеспящих животных и у всех млекопитающих в процессе адаптации к холоду. У
них существует бурый жир – особая ткань, специализирующаяся на теплопродукции посредством разобщения дыхания и
фосфорилирования. Бурый жир содержит много митохондрий. Около 10% всех белков приходится на так называемый
разобщающий белок (РБ-1) – термогенин.
2.2. Короткие пути окисления.
К коротким путям окисления относятся пути окисления субстратов, в результате которых синтезируется менее 3
молекул АТФ:
- окисления субстратов, коэффициент окислительного фосфорилирования Р/О=2 АТФ (сукцинат, ацил-КоА, глицерол-3-фосфат и др.);
Цианрезистентное дыхание.
При данном пути окисления электроны и протоны от субстратов передаются на ФАД-зависимые дегидрогеназы,
ФАД восстанавливается до ФАДН2, а с ФАДН2 протоны и электроны транспортируются на 1/2О2. Это приводит к образованию Н2О2. Например, по такому пути окисляется ксантин – промежуточный продукт распада пуриновых нуклеотидов в
мочевую кислоту.
2.3. Общий путь катаболизма – цикл трикарбоновых кислот (ЦТК).
Цикл Кребса открыт Гансом Кребсом в 1937г. (цикл трикарбоновых кислот), за открытие этого цикла Кребс в
1953г. получил Нобелевскую премию.
В ЦТК включается ацетил-КоА, который образуется в результате окисления жирных кислот, отдельных аминокислот и др. Некоторые метаболиты (глюкоза, глицерин и др.) превращаются в ПВК, из которой образуется ацетил-КоА в
процессе окислительного декарбоксилирования:
пируватдегидрогеназный
комплекс
ПВК
ацетил-КоА
НАД (РР), ФАД (В2), ТДФ (В1),
HS- КоА (В3), липоевая кислота
ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
CH3
COOH
+
С O
SKoA
ацетил-КоА
С O
CH2
CH2
HO
+ H2O
-HSKoA
COOH
оксалаацетат
(ЩУК)
COOH
COOH
цитратсинтетаза
аконитаза
COOH
CH2
H
HO
CH2
изоцитратдегидрогеназа
COOH НАД
(РР)
H
НАДН·Н+
ЦПЭ
3АТФ
COOH
COOH
цитрат (лимонная к-та) изоцитрат
COOH
COOH
COOH
COOH
-СО2
синтетаза
α-кетоглутаратгидратаза
CH
CH
цитратCH22
-СО2 CH2 дегидрогеназный CH2 -HSKoA
комплекс
(фумараза)
дегидрогеназа
CH
CH2 ФАД,ТДФ,HSKoA, CH2 ГДФ+Ф
CH22 ФАД ФАДН2 CH
+ Н2О
Н
ГТФ
ЦПЭ
COOH
CH
С O липоевая к-та
С O
2
АДФ + ГТФ= COOH
НАД НАДН·Н+
2АТФ
=АТФ + ГТФCOOH
фумарат
COOH
ЦПЭ
SKoA
SKoA
сукцинат
COOH
α-кетоглутарат
3АТФ
COOH
HO CH
CH2
L-малат
(яблочная к-та) COOH
сукцинилКоА
малатдегидрогеназа
НАД
НАДН·Н+
ЦПЭ
3АТФ
(янтарная к-та)
(фумаровая к-та)
COOH
O
С
CH2 оксалаацетат (ЩУК)
COOH
2.4. Функции ЦТК.
•
Интегративная функция (объединяющая обмен белков, жиров и углеводов через образование ацетилКоА).
•
Водородгенерирующая функция – образуется 4 пары протонов Н+.
•
Энергетическая функция – образуется 1 молекула АТФ между сукцинил-КоА и сукцинат (субстратное
фосфорилирование).
•
Анаболическая (пластическая) – метаболиты ЦТК используются для синтеза других веществ:
- ацетил-КоА – в синтезе холестерина и его производных (желчных кислот, стероидных гормонов, провитамина Д3), высших жирных кислот, кетоновых тел, ацетилхолина и др;
- α-кетоглутаровая кислота – глутаминовая, глутамин, ГАМК, пролин, аргинин;
- сукцинил-КоА – гем;
- СО2 – глюкоза, высшие жирные кислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды;
- фумаровая кислота – в синтезе мочевины;
- ЩУК – аспарагиновая кислота, аспарагин, глюкоза, метионин, треонин.
2.5. Энергетический баланс ЦТК.
Субстраты ЦТК: изоцитрат, α-кетоглутарат и малат отдают протоны и электроны на НАД-зависимые дегидрогеназы, которые транспортируют протоны и электроны в ЦПЭ на I комплекс, следовательно протоны и электроны проходят
все три пункта сопряжения (I, III, IV комплексы). Коэффициент окислительного фосфорилирования для:
- изоцитрат – 3/1=3АТФ;
- α-кетоглутарат – 3/1=3АТФ;
9АТФ в ЦПЭ
- малат – 3/1=3АТФ
Субстрат ЦТК: сукцинат отдает протоны и электроны на сукцинат-фумарат-дегидрогеназу (II комплекс), которая
переносит протоны и электроны на убихинон, минуя I комплекс ЦПЭ, следовательно, электроны проходят два пункта
сопряжения (III, IV комплексы).
Коэффициент окислительного фосфорилирования для сукцинат – 2/1=2АТФ.
Между сукцинил-КоА и сукцинат образуется 1 молекула АТФ (субстратное фосфорилирование).
Энергетический баланс ЦТК= 9АТФ (ЦПЭ) + 2АТФ (ЦПЭ) + 1АТФ (субстратное фосфорилирование) = 12
молекул АТФ.
2.6. Гипоэнергетические состояния, причины.
Для постоянного синтеза АТФ клетками необходим приток метаболитов как субстратов дыхания и кислорода как
конечного акцептора электронов в реакциях окисления, сопряженных с синтезом АТФ.
Нарушения какого-либо этапа метаболизма, приводящие к прекращению синтеза АТФ, гибельны для клетки.
Состояния, при которых синтез АТФ снижен, объединяют термином «гипоэнергетические».
Причины «гипоэнергетических состояний»:
•
Голодание (недостаток субстратов дыхания);
•
Гиповитаминозы В1, В2, В3, РР – эти витамины входят в состав ферментов, участвующих в транспорте электронов на кислород.
•
Гипоксия может возникнуть: при недостатке кислорода во вдыхаемом воздухе; при заболеваниях легких и
нарушении легочной вентиляции; при нарушениях кровообращения, вызванных заболеваниями сердца, спазмом и тромбозом сосудов, кровопотерей; при наследственных и приобретенных нарушениях структуры гемоглобина (анемии) и др.
2.7. Микросомальное окисление, биологическая роль.
•
Протекает в микросомах эндоплазматического ретикулума.
•
10% молекулярного кислорода не является акцептором протонов Н + , а непосредственно включается в молекулу субстрата;
•
В процессе микросомального окисления АТФ не синтезируется.
Функции.
•
Детоксикационная (обезвреживающая) функция. В реакциях микросомального окисления субстраты гидроксилируются, повышается их растворимость, что способствует их выведению или снижению их токсичности
(вывод лекарственных веществ из организма, избытка холестерина и т.д.);
•
Пластическая функция – синтез различных соединений:
- из холестерина образуются желчные кислоты, стероидные гормоны (гормоны коры надпочечников, половые гормоны);
- из пролина
оксипролин;
- из лизина
оксилизин;
- из фенилаланина
тирозин и др.
В реакциях микросомального окисления участвуют ферменты- гидроксилазы (оксигеназы), которые делятся на монооксигеназы, катализирующие включение одного атома кислорода в молекулу субстрата и диоксигеназы- включение
двух атомов кислорода в молекулу субстрата.
2.8. Обезвреживание перекиси водорода ферментом каталазой.
В организме существуют защитные механизмы:
- гемсодержащие ферменты: каталаза, которая расщепляет Н2О2:
каталаза
2Н2О2
2Н2О + 2О2
- супероксиддисмутаза (СД), глутатионпероксидаза, обезвреживающие О2ˉ:
СД
2О2- + 2Н+
2Н2О2 + О2
каталаза
2Н2О2
2Н2О + 2О2
- антиоксиданты, обезвреживающие свободные радикалы – витамины Е, А, С; глутатион, цистеин, биофлавоноиды,
Q10 , мочевая кислота, янтарная кислота, селенит натрия и др.
3. Лабораторно-практические работы.
3.1. Определение каталазной активности в интактных эритроцитах по методу Крайнева.
Об активности каталазы можно судить либо по количеству перекиси водорода, разложившейся под влиянием этого
фермента, либо по количеству выделившегося при этом кислорода. По методу Крайнева активность каталазы выражают в
микромолях перекиси водорода, разложенной 1 мл крови в течение минуты. Каталаза крови содержится почти исключительно в эритроцитах. Активность этого фермента снижается при некоторых заболеваниях, например анемии, туберкулезе, раке и
др.
Ход работы:
1. Приготовить суспензию эритроцитов: отмерить в пробирку 5 мл 0,85% раствора хлористого натрия и добавляют туда
0,1 мл крови, тщательно перемешивая.
2. Отмерить в две пробирки по 5 мл 10% раствора серной кислоты.
3. Отмерить в два тигля по 2 мл 0,5 М раствора перекиси водорода.
4. Отмерить в два стакана по 6 мл 0,85% раствора хлористого натрия и по 2 мл суспензии эритроцитов.
5. С помощью пинцета поместить на дно каждого стакана тигель с перекисью водорода.
6. В первый стакан (контроль) влить из пробирки 5 мл 10% раствора серной кислоты и перемешать содержимое (инактивация каталазы).
7. Второй стакан с тиглем (опыт) вращают до перемешивания содержимого, каталаза эритроцитов начинает разлагать
перекись водорода. Перемешивание продолжают в течение 30 секунд, после чего вливают в него 5 мл 10% раствора серной
кислоты из пробирки. Реакция приостанавливается. Избыток перекиси водорода в обоих стаканах (опыт и контроль) титруют
0,1N раствором перманганата калия до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.
Вычисление производят по формуле:
(А - В)  1,7  2
0,04  34
1 мл 0,1N раствора KMnO4 эквивалентен 1,7 мг перекиси водорода
0,04 – количество крови в стакане
А – количество миллилитров 0,1N раствора KMnO4 , пошедшего на титрование контрольного стакана,
В – количество миллилитров 0,1N раствора KMnO4 , пошедшего на титрование опытного стакана,
В норме активность каталазы равна 12-20 ммоль/мл/мин.
Практическое занятие № 17 (контрольное).
Задание к занятию № 17.
Тема: ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН.
Цель: контроль приобретенных знаний.
Основные вопросы темы.
1. Понятие об обмене веществ. Анаболические и катаболические процессы и их взаимосвязь. Экзерганические, эндерганические реакции.
2. Макроэргические соединения. АТФ – универсальный аккумулятор и источник энергии в организме. Цикл АТФ-АДФ.
Энергетический заряд клетки.
3. Этапы обмена веществ. Биологическое окисление (тканевое дыхание). Особенности биологического окисления.
4. Первичные акцепторы протонов водорода и электронов.
5. Организация дыхательной цепи. Переносчики в дыхательной цепи (ЦПЭ).
6. Окислительное фосфорилирование АДФ. Механизм сопряжения окисления и фосфорилирования. Коэффициент окислительного фосфорилирования (Р/О).
7. Дыхательный контроль. Разобщение дыхания (окисления) и фосфорилирования (свободное окисление).
8. Образование токсичных форм кислорода в ЦПЭ и их обезвреживание.
9. Терморегуляторная функция ЦПЭ.
10. Короткие пути окисления.
11. Общий путь катаболизма – цикл трикарбоновых кислот (ЦТК), химизм процесса.
12. Функции ЦТК
13. Энергетический баланс ЦТК.
14. Гипоэнергетические состояния, причины.
15. Микросомальное окисление, биологическая роль.
Лабораторно-практические работы.
1.
2.
Определение пероксидазы в хрене
Определение пероксидазы в картофеле.
Литература:
1.
2.
3.
4.
Материалы лекций.
Николаев А.Я. Биологическая химия.-М.: Высшая школа, 1989.
Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1990.
Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 2004.