Беляева Екатерина Андреевна Микробиота кишечника

Государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
Тверская государственная медицинская академия
Министерства здравоохранения
Российской Федерации
На правах рукописи
Беляева Екатерина Андреевна
Микробиота кишечника коренного жителя Центрального
федерального округа РФ как основа для создания региональных
пробиотических препаратов
03.02.03 – микробиология
Диссертация
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель:
доктор медицинских наук,
доцент Ю.В. Червинец
Тверь, 2014
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
стр.
ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………………4
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………..30
1.1. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта здоровых людей…………….30
1.2. Дисбиоз………………………………………………………………………….35
1.3. Пути коррекции дисбиоза. Пробиотики………………………………………38
1.4. Лактобациллы как пробиотики………….........................................................42
1.5. Бифидобактерии как пробиотики……………………………………………...50
1.6. Изучение антагонистической активности лактобацилл, бифидобактерий….54
1.7. Адгезивные свойства лактобацилл и бифидобактерий……………………….56
1.8. Современные подходы в поиске новых пробиотиков………………...............59
ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………………...61
2.1. Выделение и идентификация представителей микробиоценоза
кишечника здоровых людей………………………………………………………...61
2.2. Отбор антагонистически активных штаммов
лактобацилл и бифидобактерий………………………………...…..………....69
2.3. Биохимическая идентификация антагонистически активных
штаммов лактобацилл и бифидобактерий…………………….………...........70
2.4. Генетическая идентификация антагонистически активных
штаммов лактобацилл и бифидобактерий………………………………….....72
2.5. Характеристика пробиотического потенциала лактобацилл и
бифидобактерий……………………………………………………………………..75
2.6. Адгезивная активность лактобацилл и бифидобактерий………….………...81
2.7. Симбиоз лактобацилл и бифидобактерий ………….…..…………….…........83
3
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………….…………………………………………….............86
Выводы……………………………………………………………………………….96
Практические рекомендации………………………………………………………..98
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...................................................................................99
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………...100
ПРИЛОЖЕНИЕ…………………………………………………………………….125
4
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Микробиота кишечника человека представлена более 1014 микроорганизмов,
активно участвующих в жизнедеятельности человека (пищеварительном процессе, обмене веществ, поддержании иммунного статуса). Последние научные данные указывают на специфичность в составе кишечной микрофлоры, как у каждого
индивидуума, так и у национальных и региональных групп населения (наличие
различных энтеротипов). Огромное число микроорганизмов, составляющих микробиоту кишечника, пока не позволяет провести ее полный анализ; существуют
различные подходы, позволяющие охарактеризовать отдельные элементы микробиоты. Предлагаемый в данной работе анализ видового и штаммового разнообразия микроорганизмов рода Lactobacillus и Bifidobacterium из кишечной микробиоты здоровых жителей одного конкретного региона России (Центрального федерального округа) позволит разработать новые подходы и оценить региональную
специфичность состава этого компонента микробиоты. Эти данные могут быть в
дальнейшем использованы для разработки научной основы создания пробиотических препаратов, базирующихся на принципах персонализированной медицины.
Симбиотическая микрофлора людей, проживающих в регионах, различающихся климатическими условиями, бытовыми традициями населения, рационами
питания, не является абсолютно одинаковой, поскольку биоценозы имеют выраженный индивидуальный характер и заметно отличаются даже у индивидуумов
одного региона. Еще более значительные различия отмечаются в микробной экологии окружающей среды, особенности которой в значительной степени отражаются на составе транзиторного компонента эндогенных микробных систем населения. Поэтому следует принимать во внимание тесную взаимосвязь между индигенной микрофлорой человека и экзогенным микробным миром, поскольку собственная микробиота человека является частицей биосферного микробного звена, а
одной из очень важных функций эндогенной микроэкологической системы явля-
5
ется поддержание гармоничных, мирных взаимоотношений человека с микробным сообществом окружающей среды. Между аутофлорой людей и экзогенным
микробным миром региона, в котором они проживают, эволюционно сформировались определенные компромиссные отношения, которые в нормофизиологических условиях позволяют предупредить агрессивное воздействие на организм человека экзогенных потенциальных патогенов [65].
Адаптация организма человека к экзогенному микробному миру региона
прослеживается в онтогенезе. Уже в период новорожденности начинает активно
развиваться эффективный иммунный ответ организма человека относительно экзогенной микрофлоры, специфической для конкретного региона. Поэтому наиболее высокую эффективность обычно проявляют пробиотики, основу которых составляют «местные» штаммы микроорганизмов.
Повышенное внимание к пробиотическим препаратам в настоящее время
вызвано ростом контингента лиц, имеющих микроэкологические нарушения и
требующих коррекции собственной микрофлоры [3]. Наиболее эффективными и
физиологичными средствами коррекционного воздействия на микрофлору при
дисбактериозах являются микробные биопрепараты с живыми культурами лактобацилл и бифидобактерий. Создание и широкое внедрение в медицину высококачественных пробиотиков на основе региональных биовариантов физиологической
микрофлоры является в настоящее время актуальной и важной задачей [68].
Степень разработанности темы исследования
Глобальные национальные и международные проекты сегодня активно занимаются изучением нормального микробиоценоза и его изменений при различных заболеваниях. Микробиота человека изучается в рамках программы Human
Microbiome Project (http://nihroadmap.nih.gov/hmp/), где определена полная нуклеотидная последовательность и аннотированы геномы 20 штаммов 14 видов лактобацилл. По проекту «Русский метагеном» осуществлено глубокое секвенирование свыше 150 образцов ДНК, выделенных из кала здоровых людей, проживаю-
6
щих на территории Российской Федерации. В географию выборки входили города
из различных федеральных округов – Центрального (Москва, Ростов), СевероЗападного (Санкт-Петербург), Приволжского (Казань, Самара, Саратов), Западной
Сибири (Омск, Новосибирск). В рамках проекта были выявлены территориальные
различия микробиоты у людей, проживающих в Российской Федерации, но был
показан общий схожий метаболизм.
В 2003 году региональная оценка микробиоты кишечника проводилась у
населения Западной Сибири. Было установлено, что характер дисбиотических нарушений зависит от уровня загрязненности атмосферного воздуха. Распространенность дисбактериоза у жителей Западной Сибири составила 762±0,05 случаев
на 1000 населения [35].
История создания пробиотических препаратов в России связана с именем
Г.И. Гончаровой, которая в 1966 году впервые разработала технологию изготовления «Бифидумбактерина сухого». Среди бифидофлоры у детей и взрослых был
отобран целый ряд штаммов, перспективных как по технологическим, так
и медико-биологическим характеристикам.
В настоящее время современные пробиотики получены в Германии, Бельгии, Дании. В России широкое применение находят отечественные пробиотики IV
поколения, представляя собой живые B.bifidum1 (Бифидумбактерин форте, Пробифор) либо B.bifidum1+L.plantarum8RA-3 (Флорин форте), сорбированные (иммобилизованные на частицах измельченного активированного угля). В связи с
тем, что эффективность пробиотических препаратов определяется совокупностью
биологических свойств штаммов, входящих в их состав, большое внимание уделяется созданию поликомпонентных пробиотиков [3, 4].
Ни один из имеющихся отечественных или импортных лекарственных пробиотических препаратов не создан на основе микроорганизмов, отвечающих этнорегиональным
критериям, а наиболее эффективным стало бы использование
штаммов, которые могут адаптироваться к конкретному организму. Поэтому создание пробиотических препаратов, основанных на принципах персонализирован-
7
ной медицины и ориентированных на конкретные региональные группы населения страны, является инновационным направлением по улучшению здоровья населения.
Цель и задачи исследования
Цель исследования:
Охарактеризовать микробиоту кишечника коренных жителей Центрального
федерального округа Российской Федерации и селекционировать новые штаммы
лактобацилл и бифидобактерий для создания региональных пробиотических препаратов.
Задачи исследования:
1. Выделить и идентифицировать микрофлору кишечника от здоровых людей в
возрасте от 18 до 21 года, проживающих на территории Центрального федерального округа Российской Федерации.
2. Селекционировать лактобациллы и бифидобактерии, обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условнопатогенным микроорганизмам людей, проживающих на территории Центрального федерального округа Российской Федерации, для создания новых
пробиотиков.
3. Провести генетическую идентификацию антагонистически активных штаммов
лактобацилл и бифидобактерий.
4. Определить адаптационный и пробиотический потенциал антагонистически
активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий.
5. Определить симбиотические взаимоотношения антагонистически активных
штаммов лактобацилл и бифидобактерий.
Научная новизна исследования
Впервые охарактеризована микробиота кишечника клинически здоровых
людей в возрасте от 18 до 21 года, коренных жителей Центрального федерального
8
округа РФ, проживающих в Тверской, Ярославской, Московской, Костромской и
др.
областях
ЦФО
в
третьем
поколении;
были
выявлены
нарушения
микроэкологии кишечника у 75% здоровых людей.
Впервые определена ведущая роль представителей рода Bacillus в
дисбиотических нарушениях кишечника у клинически здоровых людей, данный
микроорганизм преобладал среди условно-патогенной микрофлоры.
Из кишечника здоровых людей с нормобиоценозом, коренных жителей
ЦФО
РФ,
были
селекционированы
новые
штаммы
лактобацилл
и
бифидобактерий, обладающие высокой степенью антагонизма по отношению к
патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, чувствительностью к
антимикробным препаратам, широким спектром пробиотического и адаптационного потенциала.
Характеристика микроорганизмов родов Lactobacillus и Bifidobacterium как
потенциальных пробиотических штаммов из кишечной микробиоты здоровых
жителей конкретного округа России позволит разработать новые подходы и установить региональную специфичность микробиоты для создания адаптированных
к этно-географической группе пробиотиков.
Практическая значимость исследования
Выделено и охарактеризовано 6 штаммов лактобацилл и 5 штаммов бифидобактерий, которые проявили наиболее выраженные антагонистические свойства по отношению к условно-патогенной и патогенной бактериальной и грибковой
микрофлоре ЖКТ. Селекционированные штаммы являются перспективными для
создания новых пробиотических препаратов.
Данные исследования могут быть в дальнейшем использованы для разработки научной основы создания региональных пробиотических препаратов, базирующихся на принципах персонализированной медицины и ориентированных на
конкретные региональные группы населения страны.
9
Методология и методы исследования
Материалом для исследования служили фекалии 156 здоровых студентовдобровольцев медицинской академии в возрасте от 18 до 21 года (120 девушек и
36 юношей), коренных жителей, проживающих в третьем поколении в Тверской,
Ярославской, Московской, Костромской, Брянской, Тульской, Воронежской, Калужской, Тамбовской, Смоленской и Владимирской областях ЦФО. У всех студентов материал брали в зимний период. На момент обследования никаких жалоб
на нарушение функций пищеварительного тракта добровольцы не предъявляли.
Исследования проводились с разрешения этического комитета Тверской
государственной медицинской академии. У всех лиц получено информированное
согласие на сбор материала. Проводилось анкетирование (Приложение),
включающее в себя данные об отсутствии хронических заболеваний ЖКТ, острых
кишечных инфекций за полгода до взятия материала, наличии аппендикса (с
удаленным аппендиксом труднее восстанавливать микрофлору кишечника после
инфекционного заболевания), смешанном питании, переносимости лактозы (т.к.
непереносимость лактозы характеризуется избыточным ростом и усилением
жизнедеятельности микрофлоры кишечника, усваивающей лактозу). В течение
семи дней студенты не должны были принимать антимикробные препараты.
Таким образом, критериями включения студентов в исследование являлись
отсутствие хронических заболеваний ЖКТ, острых кишечных инфекций за полгода до взятия материала, наличие аппендикса, смешанное питание, переносимость
лактозы и проживание каждого в третьем поколении в одной из областей ЦФО.
Выделение микроорганизмов
Подготовка фекалий для исследования проводилась следующим образом:
1 г фекалий вносили в 9 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия
(0,9% р-ра NaCl) и тщательно суспендировали путем встряхивания в шуттельаппарате в течение 20-30 мин. Затем отстаивали и через 1 час из надосадочной
жидкости делали разведения с изотоническим раствором хлорида натрия с 10 2 до
10
1011.
Из разведений делали посев на питательные среды с последующей
инкубацией.
Для комплексного изучения аэробной и анаэробной микрофлоры посевы
производили на отечественные и импортные питательные среды, включающие:
желточно-солевой агар (г. Оболенск), МакКонки агар (BBL®), Колумбиа агар
(BBL®, ―Himedia‖), Эритрит агар (ФГУП НПО «Микроген», Москва), Sabouraud
Dextrose Agar (BBL®), MRS Agar (BBL®), Schaedler Agar (BBL®) с кровью, Muller-Hinton
II
агар
(BBL®).
Посевы
культивировали
в
аэробных,
микроаэрофильных и анаэробных условиях с использованием микроанаэростатов
(BBL) и газогенераторных пакетов Gas Pack Plus (BBL) в течение 24-72 часов при
температуре 37о С.
Из изолированных колоний, выросших на соответствующих питательных
средах, готовили мазки и окрашивали по методу Грама. Морфологические и
тинкториальные свойства микроорганизмов изучали, пользуясь программноаппаратным комплексом Диаморф Цито (увеличение 1:1000 с использованием
бинокулярного микроскопа «Биолам»). Количество бактерий определяли путѐм
подсчѐта колониеобразующих единиц на 1 г фекалий (lg КОЕ/г).
Биохимическая активность определялась с помощью тест систем api® (bio
Mérieux) и программного обеспечения API WEB на базе бактериологической
лаборатории кафедры микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии
ГБОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России.
Методы идентификации выделенных микроорганизмов
Биохимическая идентификация микроорганизмов
А) Идентификация микроорганизмов рода Lactobacillus, Bacillus
Грамположительные палочки, располагающиеся одиночно, или небольшими
скоплениями, выросшие на MRS среде и кровяном МПА в микроаэрофильных и
аэробных условиях, определяли, используя тест-систему api® 50 CH (bioMérieux
Vitek, Inc.). Исследовали ферментацию микроорганизмами глицерина, эритрита,
D-арабинозы, L-арабинозы, D-рибозы, D-ксилозы, L-ксилозы, D-адонитола,
11
метил-D-ксилопиранозида, D- галактозы, D-глюкозы, D-фруктозы, D-маннозы, Lсорбозы, L-рамнозы, D-маннитола, D-сорбитола, метил-D-маннопиранозида,
метил-D-гликопиранозида, N-ацетилглюкозамина, амигдалина, арбутина, Dцелобиозы, D-мальтозы, D-лактозы, D-мелибиозы, D-сахарозы, D-трегалозы,
инулина,
D-мелезитозы,
D-раффинозы,
амидона,
гликогена,
ксилитола,
гентиобиозы, D-туранозы, D-ликсозы, D-тагатозы, D-фукозы, L-фукозы, Dарабитола,
L-арабитола,
глюконата
калия,
2-кетоглюконата
калия,
5-
кетоглюконата калия; продукцию дульцита, инозита, а также гидролиз эскулина
салицина. Из исследуемой микробной культуры готовили взвесь в среде api ® 50
CH Medium плотностью не менее 3 единиц по стандарту McFarland. Полученную
взвесь вносили по 150 мкл в ячейки тест-системы. Тест-систему api® 50 CH
помещали во влажную камеру и инкубировали при 37С 24 часа в анаэробных
условиях.
Б) Идентификация микроорганизмов рода Clostridium, Bifidobacterium,
Actinomyces, Bacteroides, Peptostreptococcus, Leptotrichia
Грамположительные
грамположительные
палочки,
нитевидные,
споро-
и
ветвящиеся
неспорообразующие,
микроорганизмы,
грамположительные кокки, грамотрицательные палочки и кокки, выросшие на
средах Schaedler-agar в анаэробных условиях, определяли, используя тест-систему
api® 20 A (bioMérieux Vitek, Inc.). Исследовали ферментацию микроорганизмами
глюкозы, маннита, лактозы, сахарозы, мальтозы, салицина, ксилозы, арабинозы,
глицерола, целлобиозы, маннозы, мелецитозы, раффинозы, сорбита, рамнозы,
трегалозы; продукцию индола (IND), уреазы, а также гидролиз желатина (GEL) и
эскулина (ESC). Из исследуемой микробной культуры готовили взвесь в среде
api® 20 A Medium плотностью не менее 3 единиц по стандарту McFarland.
Полученную взвесь вносили следующим образом: 250 мкл – в ячейку GEL, по 150
мкл в остальные ячейки тест-системы, кроме того в ячейку IND наслаивали
стерильное вазелиновое масло. Тест-систему api® 20 A помещали во влажную
камеру и инкубировали при 37С 24 часа в анаэробных условиях. Затем для
12
определения продукции индола в ячейку IND вносили одну каплю ксилола,
перемешивали
и
добавляли
одну
каплю
реактива
Эрлиха
(р-
диметиламидобензальдегид 8,75 г, этанол 825 мл, 37% хлористоводородная
кислота 175 мл). В положительном случае через 5 минут наблюдали изменение
цвета содержимого ячейки с желтого на красный. Для учета результатов
ферментации углеводов в ячейки вносили по одной капле 0,02 % водного
раствора бромкрезолпурпура, в положительных случаях индикатор изменял цвет
на желтый или желто-зеленый. Наличие -гликозидазы (гидролиз эскулина)
дополнительно изучали по отсутствию флюоресценции ячейки ESC при ее
ультрафиолетовом облучении с длиной волны 365 нм.
В) Идентификация микроорганизмов рода Candida, а также семейства Enterobacteriaceae
Грам- и оксидазоотрицательные палочки (энтеробактерии) изучали с
помощью тест-системы BBLEnterotube II (Becton Dickinson GmbH) на предмет
ферментации глюкозы, лизина, орнитина, адонитола, лактозы, арабинозы,
сорбитола, дульцитола, мочевины, цитрата, а также продукции сероводорода,
индола, ацетоина (реакция Фогес-Проскауэра) и дезаминирования фенилаланина.
Грамположительные крупные овальные, округлые микроорганизмы, образующие
псевдомицелий (кандиды, криптококки), идентифицировали с применением тестсистемы
BBLMycotube
(Becton
Dickinson
GmbH)
для
определения
ферментации декстрозы, ксилозы, сахарозы, раффинозы, лактозы, трегалозы,
цитрата и мочевины.
Инкубацию тест-систем проводили при 37С: BBLEnterotube II 24 часа,
BBLMycotube - 48-72 часа. Для изучения продукции индола в отверстие в
пленке, покрывающей ячейку H2S/Indol (BBLEnterotube II), вносили три –
четыре
капли
реактива Ковача, через несколько секунд при положительной
реакции наблюдали покраснение реактива. Для проведения реакции ФогесПроскауэра в ячейку Voges-Proskauer вносили три капли 6%-го спиртового
раствора -нафтола и две капли 40%-ого водного раствора гидроокиси калия,
13
спустя 10 минут в положительных случаях отмечали изменение цвета реагентов
на красный.
Г) Идентификация микроорганизмов рода Enterococcus
Грамположительные
каталазоотрицательные
кокки,
расположенные
преимущественно цепочками или парами исследовали по биохимическим
свойствам, используя тест-систему api 20 STREP (bioMérieux Vitek, Inc.), по
ферментации рибозы (RIB), L-арабинозы (ARA), маннита (MAN), сорбита (SOR),
лактозы (LAC), трегалозы (TRE), инулина (INU), раффинозы (RAF), крахмала
(AMD), гликогена (GLYG), гиппурата (HYP); по наличию -гликозидазы (ESC),
пирролидонилариламидазы (PYRA), - и -галактозидаз (-, -GAL), глюкуронидазы (-GUR), щелочной фосфатазы (PAL), лейцинариламидазы (LAP),
аргининдигидролазы (ADH); по продукции ацетоина (VP).
Чистую исследуемую культуру микроорганизмов субкультивировали на
агаре Колумбия, содержащем 5 % взвеси бараньих эритроцитов при 37С в
течение 24 часов в анаэробных условиях. Определяли реакцию на каталазу.
В случае отрицательной каталазной активности из полученной биомассы
готовили взвесь микробных клеток плотностью не менее 4 единиц по
оптическому стандарту мутности McFarland в 2 мл стерильной дистиллированной
воды. В первые десять ячеек тест-системы вносили по 150 мкл микробной взвеси.
Оставшиеся 0,5 мл взвеси бактерий смешивали с содержимым ампулы GP Medium. Получившуюся взвесь по 150 мкл вносили в следующие десять ячеек тестсистемы и наслаивали в них стерильное вазелиновое масло. Тест-систему api 20
STREP помещали в инкубационную камеру, в которую для создания влажной
камеры наливали 5 мл дистиллированной
воды. Культивирование проводили
четыре часа при 37С.
Затем в ячейку VP вносили по одной капле 6%-го спиртового раствора нафтола и 40%-ого водного раствора гидроокиси калия, в ячейку HYP – две
капли 7% раствора нингидрина в 2-метоксиэтаноле, в ячейки PYRA, -, -GAL, GUR, PAL, LAP - по одной капле препаратов ZYM1 (трис-гидроксиметил-
14
аминометан 25г, 37% хлористоводородная кислота 11 мл, лаурилсульфат 10 г,
дистиллированная вода до 100 мл) и ZYM2 (0,35% раствор Fast blue BB в 2метоксиэтаноле). Результаты указанных реакций учитывали через 10 минут.
Инкубацию тест-системы api 20 STREP продолжали еще 20 часов, после чего
согласно интерпретационной таблице учитывали результаты ферментации RIB,
ARA, MAN, SOR, LAC, TRE, INU, RAF, AMD,GLYG, ADH
и ESC. Кроме
указанных тестов определяли гемолитическую активность бактерий.
Д) Идентификация микроорганизмов рода Staphylococcus
Грамположительные кокки, расположенные гроздьями, выросшие на ЖСА в
аэробных условиях определяли, используя тест-систему api® Staph (bioMérieux Vitek, Inc.). Исследовали ферментацию микроорганизмами глюкозы, фруктозы,
маннозы, мальтозы, лактозы, трегалозы, маннитола, ксилитола, мелибиозы,
нитрата калия, нафтил фосфата, пирувата натрия, раффинозы, ксилозы, сахарозы,
метил-гликопиранозида, ацетилглюкозамина, аргинина; а также продукцию
уреазы. Из исследуемой микробной культуры готовили взвесь в среде api ® Staph
Medium плотностью не менее 3 единиц по стандарту McFarland. Полученную
взвесь вносили следующим образом: по 150 мкл в ячейки тест-системы, кроме
того в ячейку с аргинином и уреазой наслаивали стерильное вазелиновое масло.
Тест-систему api® 20 A помещали во влажную камеру и инкубировали при 37С
24 часа в аэробных условиях. Затем в ячейку с нитратом калия, нафтилом
фосфата, пируватом натрия вносили соответствующие реактивы и ждали 10 мин.
Результаты всех реакций обозначали цифровыми кодами согласно
инструкции. Микроорганизмы идентифицировали соответственно цифровому
профилю, используя программу Api WEB для ПК.
Схема выделения и идентификации бактерий
А) Схема выделения и идентификации аэробных бактерий
Сбор транспортировка и подготовка материала

Рассев материала на питательные среды
15
Среда
Эндо
ЖелточноСреда
Кровяной
Лактоагар,
солевой агар Cабуро агар
MRS агар, (BBL)
O
Инкубация 48 часов при 37 C

Учет
Макроскопическое и микроскопическое изучение
колоний, отсев для получения чистой культуры бактерий
Инкубация в условиях аэробиоза

Идентификация
Enterotube II, Mycotube (BBL), API 20 Staph; API 20 Strept, API
50CH (bio Mérieux)
Б) Схема выделения и идентификации анаэробных бактерий
Сбор, транспортировка и подготовка материала

Рассев материала на питательные среды
Schaedler Agar с кровью (BBL)
Инкубация в условиях анаэробиоза с использованием Gas Pak Plus (BBL)
(в микроанаэростате в атмосфере CO2+H2)
72 часа, при 37OC

Учет
Макроскопическое и
Отсев с целью
микроскопическое
подтверждения
изучение колоний, отсев
принадлежности
для получения чистой
бактерий к группе
культуры бактерий
строгих анаэробов
(Schaedler Agar +кровь) (Schaedler Agar +кровь)
Инкубация в условиях анаэробиоза с использованием Gas Pak Plus (BBL)
(в микроанаэростате в атмосфере CO2+H2), 48 часов, при 37OC. Инкубация в
условиях аэробиоза


16
Идентификация
API 20A (bio Mérieux)
Генетическая идентификация чистой культуры лактобацилл и
бифидобактерий
А) Генетическую идентификацию лактобацилл определяли по стандартному
методу с использованием нуклеотидной последовательности гена 16S РНК на базе
Института общей генетики им. Н.И. Вавилова (г. Москва).
ПЦР, реакционная смесь:
Объем одной пробы составлял
25 мкл
100 мкл
Проба включает в себя
на 25мкл
на 100 мкл
1.10-кратный буфер
2,5 мкл
10 мкл
2.Смесь дезоксинуклеотид-
2,5 мкл
10 мкл
1,25 мкл
5 мкл
трифосфатов
3. Диметилсульфоксид
добавляется при работе
с хромосомной ДНК
4.MgCl2 из р-ра 50 mM
1,5 мкл
6 мкл
5.Taq-полимераза
0,2 мкл
0,8 мкл
5 ед/мкл
6. ДНК
Хромосомная
Плазмидная
ПЦР-фрагмент
7.H2O бидист.стер.
0,1 мкг
0,3 мкг
0,02 мкг
0,05 мкг
0,01 мкг
до 25 мкл
0,02 мкг
до 100 мкл
8. Праймеры –
прямой (F) и обратный(R)
5 пкмоль каждого
20 пкмоль
8 мкл из 25 мкл смешивается с краской и наносится на форез.
Для подбора нужной концентрации MgCl2 делали реакционную смесь в
объеме 100 мкл, разливали на 4 пробирки по 25 мкл и добавляли в них 0,5мкл -1,0
17
мкл - 1,5 мкл – 2 мкл MgCl2 из р-ра 50 mM. По результатам фореза выбрали
нужную концентрацию MgCl2, при которой образуется минимальное число и
максимальное количество продуктов полимеразноцепной реакции (ПЦР).
Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР были синтезированы фирмой
«Синтол». Реакцию ПЦР ставили в стандартных условиях (94°С– 5 мин.; 40
циклов 94°С 30сек., 54°С 40 сек., 72°С 1 мин.; 72°С - 5 мин). В качестве матрицы
для ПЦР использовали 0,5 мкл биомассы штаммов (отцентрифугированной и
промытой буфером Т10Е0,1, состоящего из 10мM Трис-HCl и 0.1мM ЭДТА, pH
8.0). Амплификацию проводили в термоциклерах ―Терцик‖ фирмы ―ДНКТехнология‖.
Разделение продуктов ПЦР проводили в 1% геле агарозы,
использовали трис-боратный буфер.
Электрофорез в агарозном геле в горизонтальной камере:
Камеру для фореза установливали горизонтально с помощью уровня, в
камере расположили съемные бортики
и гребенку. Зубцы гребенки были на
несколько миллиметров выше дна камеры. Был сделан 1% раствор агарозы в 0,5кратном форезном буфере, раствор нагрели в кипящей водяной бане до полного
растворения агарозы, добавили этидиум бромид до концентрации 0,5 мкг/мл (5
мкл водного раствора этидиум бромида (10 мг/мл) на 100 мл раствора агарозы).
Чуть остывший раствор агарозы с этидиум бромидом (5-10 мин остывает) выливали в форезную камеру, толщина слоя агарозы была 5-6 мм. Через 30 мин
раствор агарозы перешел в гель.
Гребенку и бортики вынули из камеры, налили в форезную камеру
форезный буфер так, чтобы он на несколько миллиметров был выше агарозного
геля. Подсоединили электроды (ДНК движется от – к +), включили напряжение.
Далее выключили напряжение, нанесли пробы (водные растворы ДНК с буфером
для нанесения на гель, объем проб 10-25 мкл). Снова включили напряжение. Для
маленькой камеры использовали напряжение 80 V, для большой 120 V.
Длительность разгонки ДНК определялась величиной фрагментов ДНК, обычно
0,5 – 1,5 час.
18
Гель сфотографировали на хемископе в ультрафиолетовом свете через
оранжевый светофильтр.
5-кратный Трис-боратный форезный буфер, на 0,5 л
Трис основной
(м.м. 121)
26,95 г
ЭДТА, 2-Na соль (м.м. 372,3)
2,33 г
Борная кислота (м.м. 61,81)
13,75 г
Трис-боратный форезный буфер хранили при комнатной температуре. Рабочий
раствор 0,5-кратного буфера держали в холодильнике.
Буфер для нанесения проб на 5мл
Сахароза
40%
2 гр
Бромфеноловый синий 0,25%; добавлять в раствор сахарозы 0,5 мл 2,5% р-ра
Определение
нуклеотидной
последовательности
фрагментов
ДНК
проводили в НИИ ФХМ ФМБА РФ на приборе 3730xl DNA Analyzer
(AppliedBiosystems,USA)
с
набором
реактивов
BigDye®
Terminator
v3.1
CycleSequencingKit (AppliedBiosystems, USA). Для определения вида по гену 16S
РНК использовали стандартные праймеры 27f (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и
1492r (GGTTACCTTGTTACGACTT); ожидаемый размер ПЦР-фрагментов – 1465
пн [45, 116].
Анализ нуклеотидной последовательности проводили с помощью алгоритма
BLASTn и базы данных GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Б) Родовое и видовое генетическое типирование бифидобактерий проверялось
методом ПЦР на базе Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (г.
Москва) с использованием следующих праймеров:
Родовые
праймеры для Bifidobacterium
представлены в таблице 1.
(16S RNA gene-targeted primers)
19
Таблица 1
Родовые праймеры для Bifidobacterium
Название
Структура
олигонуклеотида
олигонуклеотида
Bif164-f
GGGTGGTAATGCCGGATG
Bif662-r
CCACCGTTACACCGGGAA
g-Bifid-F
CTCCTGGAAACGGGTGG
g-Bifid-R
GGTGTTCTTCCCGATATCTACA
bif-sec
CATGCCCCTACGTCCAG
23S-bif
CAAGGCATCCACCATACGC
Ожидаемый
размер ПЦР-фрагмента
500
549–563
1440
Видовые праймеры для рода Bifidobacterium представлены в таблице 2.
Таблица 2
Видовые праймеры для рода Bifidobacterium
Название вида Название
Структура олигонуклеотида
олигонуклеотида
Ожидаемы
й
размер
ПЦРфрагмента
B. adolescentis BiADOg-1a
CTCCAGTTGGATGCATGTC
group
BiADOg-1b
TCCAGTTGACCGCATGGT
BiADO-2
CGAAGGCTTGCTCCCAGT
BiANG-1
CAGTCCATCGCATGGTGGT
BiANG-2
GAAGGCTTGCTCCCCAAC
BiBIF-1
CCACATGATCGCATGTGATTG 278
BiBIF-2
CCGAAGGCTTGCTCCCAAA
BiBRE-1
CCGGATGCTCCATCACAC
BiBRE-2
ACAAAGTGCCTTGCTCCCT
B. angulatum
B. bifidum
B. breve
B. catenulatum BiCATg-1
CGGATGCTCCGACTCCT
279
275
288
285
20
group
BiCATg-2
CGAAGGCTTGCTCCCGAT
B. longum
BiLON-1
TTCCAGTTGATCGCATGGTC
BiLON-2
GGGAAGCCGTATCTCTACGA
BiINF-1
TTCCAGTTGATCGCATGGTC
BiINF-2
GGAAACCCCATCTCTGGGAT
BiDEN-1
ATCCCGGGGGTTCGCCT
BiDEN-2
GAAGGGCTTGCTCCCGA
BiGAL-1
TAATACCGGATGTTCCGCTC
BiGAL-2
ACATCCCCGAAAGGACGC
B. infantis
B. dentium
B. gallicum
B.
animalis Blact-F
subsp. lactis
Методика
828
387
CCCTTTCCACGGGTCCC
Blact-R
831
170–189
194
AAGGGAAACCGTGTCTCCAC
бактериологического
исследования
кала
на
дисбактериоз
кишечника
Сбор материала. Кал для исследования отбирали в стерильную посуду,
стеклянную или пластиковую, разрешенную к использованию в специальных
микробиологических исследованиях. В стерильную емкость кал отбирался в
количестве около 1 г и доставлялся в лабораторию в пределах 2 ч.
Обработка
материала.
В
стерильный,
предварительно
взвешенный
стеклянный сосуд вносили порцию кала и, после повторного взвешивания,
определяли массу биоматериала; затем добавляли такое количество стерильного
0,9%-го изотонического раствора хлорида натрия, чтобы получилось исходное
разведение 1:10. В процессе приготовления суспензии кал тщательно растирали о
стенки лабораторного сосуда для получения равномерной взвеси и встряхивали в
штуцеле до образования гомогенной массы.
После отстаивания 1 мл суспензии переносился в следующую пробирку с 9
мл буфера с последующим получением в ней разведения 10-2. Из полученного
разведения материала готовили еще шесть разведений, перенося мерной пипеткой
по 1 мл разведения в 9 мл изотонического раствора хлорида натрия. Для большей
21
точности анализа в каждой пробирке оставалась пипетка и в дальнейшем с
данным разведением соприкасалась только она.
На следующем этапе производился посев на плотные питательные среды по
секторам. Из соответствующих разведений на сектор наносился 0,1 мл суспензии.
Для идентификации и подсчета колоний микроорганизмов использовались среды
Эндо, кровяной агар, ЖСА, Сабуро, лактоагар.
Второй день исследования. Вынимали из термостата засеянные накануне
чашки (кроме лактоагара и анаэростата), подсчитывали количество колоний
микроорганизмов, готовили мазки с окраской по Граму и определяли
морфологические и тинкториальные свойства. Дальнейшая идентификация
проводилась по приведенной выше схеме.
Оценка
результатов.
При
оценке
результатов
бактериологического
исследования фекалий исходили из показателей относительной нормы. Для
определения степени дисбактериоза имело значение количество анаэробных
микроорганизмов. Из этой группы микроорганизмов обязательно исследовали
количество
бифидобактерии
и
лактобактерий,
учитывают
количество
лактозоположительных эшерихий и др.
Степень дисбактериоза определяли, пользуясь ОСТ [47].
Методы изучения пробиотического потенциала лактобацилл и бифидобактерий
Определение
антагонистической
способности
лактобацилл
и
бифидобактерий проводили методом прямого и отсроченного антагонизма.
Первичное исследование антагонизма проводили согласно методике
прямого антагонизма, описанной у Л.П.Блинковой [11]. Поверхность плотной
питательной среды (лактоагар (MRS) для лактобацилл и Шедлер агар для
бифидобактерий) петлей засевали суточную культуру лактобацилл (концентрация
1∙109 по ОСО мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича) и бифидобактерий в виде
прямой полосы от края до края через центр чашки. Для определения
антагонистической активности лактобацилл и бифидобактерий в отношении
22
тестовых культур грамотрицательных, грамположительных микроорганизмов и
дрожжевых грибов рода Candida. Свежевыделенные тестовые культуры подсевали
штрихами перпендикулярно к исследуемой. Посев тест-штаммов проводили
петлей диаметром 1мм в направлении от зоны роста штамма лактобацилл и
бифидобактерий, не касаясь ее, и перпендикулярно ей. В качестве тестовых
культур был использованы штаммы Staphylococcus aureus 25923, Candida albicans
АТСС 885-653, Escherichia coli АТСС 25922.
Результаты учитывали через 24 - 48 часов инкубирования при
37ºC в
термостате по величине зоны отсутствия роста тест-культуры. Контролем служил
их параллельный посев на чашки с той же средой без испытуемой культуры.
Степень антагонизма определяли по следующим критериям: 10 мм и менее –
низкая, 10-20 мм – средняя, 21 мм и более – высокая.
После биохимической и генетической идентификации антагонистическую
способность микроорганизмов выявляли методом агаровых слоев или методом
отсроченного
антагонизма
[11].
На
поверхность
соответствующего
для
используемого штамма плотного питательного агара наносили бляшками
исследуемые штаммы бифидобактерий или лактобактерий и культивировали в
термостате 24 часа при температуре 37°С, затем убивали их парами хлороформа и
наносили слой питательной полужидкой среды с равномерно распределенной в
ней тестовой культурой бактерий и вновь культивировали в термостате 24 часа
при 37°С. Положительный результат учитывали по появлению вокруг бляшки
зоны отсутствия роста.
В качестве тестовых культур были использованы следующие штаммы: Staphylococcus aureus 25923, Candida albicans АТСС 885-653, Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027, Salmonella typhimurium 415, Shigella sonnei I фазы 941, Bacillus subtilis 534, Escherichia coli АТСС 25922.
Степень антагонизма определяли по следующим критериям:
зона
отсутствия роста 10 мм и менее – низкая, 10-20 мм – средняя, 21 мм и более –
высокая.
23
Определение ферментов агрессии лактобацилл и бифидобактерий
У лактобацилл и бифидобактерий определяли наличие лецитиназной,
казеинолитической,
уреазной,
желатиназной,
нуклеазной,
каталазной
и
гемолитической активности.
Для выявления лецитиназной активности исследуемые культуры засевали
на желточный агар. Через 18-24 часа инкубации при 37С вокруг продуцирующих
лецитиназу колоний наблюдали зоны опалесценции [42].
Продукцию казеиназы изучали модифицированным экспресс-методом,
предложенным Е.М. Горской с соавторами.
Метод заключался в изучении казеинолитической активности суточной
бульонной культуры лактобацилл и 48-часовой культуры бифидобактерий, которую вносили в лунки с казеиновым агаром по 20 мкл. После 24-48-часовой
инкубации в микроаэрофильных и анаэробных условиях зоны протеолиза
проявляли
добавлением
5%
трихлоруксусной
или
соляной
кислоты.
Казеинолитическая активность определялась по следующим критериям: низкая –
диаметр зон до 10 мм, средняя – 11-15 мм, высокая – выше 16 мм.
Определение продукции микроорганизмами уреазы проводили, используя
стандартный Urease Test Broth (BBL, USA), который вносили по 150 мкл в лунки
микропланшет для иммуноферментного анализа (ИФА). В них добавляли по 50
мкл суспензии суточных микробных культур и инкубировали при 37С в течение
18-24 часов. Реакцию считали положительной при изменении цвета среды с
желтого на красный.
Желатиназную активность исследуемых культур определяли ускоренным
методом [42]. Принцип метода заключается в том, что при взаимодействии
бактериальной желатиназы в питательной среде с желатином, находящимся в
виде тонкого слоя черной эмульсии на полимерной фото- или рентгеновской
пленке, происходит гидролиз желатины. Это выражается в удалении слоя
желатина и просветлении пленки. Исследуемые культуры сеяли бляшками на
оптимальные питательные среды, инкубировали сутки при
37С. Затем на
24
бактериальные бляшки с помощью стерильного пинцета помещали квадратики
пленки. Инкубация при 37С в течение 18-24 часов. Положительной реакцией на
желатиназу считали просветление квадратика пленки над бляшкой.
Дезоксирибонуклеазную
и
рибонуклеазную активности исследуемых
культур определяли стандартными методами [42]. Принцип методов основан на
том, что бактериальные ДНК-азы и РНК-азы деполимеризуют соответствующие
нуклеиновые кислоты. Проявление реакции происходит путем добавления
хлористоводородной кислоты (осадителя нуклеиновых кислот). Агаровая среда,
содержащая соответствующие нуклеиновые кислоты, становится мутной, тогда
как вокруг микробных бляшек, в случае продукции нуклеаз, образуются
прозрачные зоны.
Для определения ДНК-аз 1 % ДНК-азный агар стандартный (Sigma)
разливали в стерильную чашку Петри. Сразу же вносили 0,1 мл 10 % раствора
хлорида кальция, поскольку большинство нуклеаз являются металлозависимыми
ферментами. После образования геля чашки подсушивали 30 минут. Исследуемые
суточные культуры засевали бляшками на чашку. Посевы инкубировали при
37С в течение 24-48 часов. Для проявления результатов опыта на поверхность
среды
наносили
5
мл
1
N
хлористоводородной
кислоты.
Результаты
регистрировали визуально в проходящем свете или на черном фоне. При
положительной
ДНК-азной
активности
микробной
культуры
вокруг
соответствующей бляшки отмечали наличие зоны просветления радиусом 2 мм и
более на мутном фоне среды.
РНК-азную активность культур определяли аналогичным методом, но в
качестве субстрата использовали 5 % водный раствор дрожжевой РНК (Sigma),
который добавляли в МПА.
Для определения каталазной активности микроорганизмов использовали
метод раздавленной капли на предметном стекле [42]. На обезжиренное
предметное стекло наносили одну каплю взвеси суточной агаровой культуры в 0,9
% растворе натрия хлорида, в которую вносили каплю 3 % раствора перекиси
25
водорода,
затем
капли
накрывали
покровным
стеклом.
Результаты
регистрировали визуально по феномену образования пузырьков газа под
покровным стеклом.
Гемолитическую активность определяли по наличию вокруг колоний зоны
гемолиза
после
суточной
инкубации
посевов
исследуемых
культур
микроорганизмов на 5% кровяном питательном агаре при 37°С в течение 18-24
часов. В опыте использовалась кровь человека О (I) группы Rh+.
Определение чувствительности лактобацилл и бифидобактерий к желчи
Для культивирования микроорганизмов применяли следующие питательные
среды: лактобульон – для лактобацилл, бифидобульон – для бифидобактерий. В
опытные пробирки с соответствующей средой добавляли желчь для получения
следующих концентраций: 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1,25%, 0,625%.
Суточную
бульонную
культуру
исследуемого
штамма
лактобацилл
добавляли по 0,5 мл в каждую из опытных пробирок и контрольную пробирку и
культивировали при температуре 37ºC. Через 24 часа измеряли оптическую
плотность при длине волны 600 нм по отношению к исходному бульону.
В пробирки с различными концентрациями желчи вносили 48-часовую
бульонную культуру бифидобактерий и проводили инкубацию в анаэростате при
37°С в течение 24 часов. Из каждой пробирки делали пересев исследуемой смеси
в объеме 0,3 мм на чашку Петри с плотной питательной средой бифидум агар с
последующей инкубацией в анаэробных условиях в течение двух суток.
Чув-
ствительность бифидобактерий к различной концентрации желчи определяли путем подсчета количества колоний, выросших на плотной питательной среде по
сравнению с контролем бульонной культуры без желчи.
Определение чувствительности лактобацилл и бифидобактерий к
антимикробным препаратам
Определение
чувствительности
микроорганизмов
к
антимикробным
препаратам проводили методом диффузии в агар на среде Muller-Hinton в
26
соответствие с методиками, рекомендованными NCCLS с помощью стандартных
дисков фирмы BBL. Агар разливали в чашки Петри (толщина 4 мм).
Суспензия исследуемой культуры готовится на 0,9% растворе натрия
хлорида до мутности 0,5 по стандарту McFarland из 18-24-часовой культуры
лактобактерий и бифидобактерий, выращенных на оптимальных питательных
средах. Для инокуляции используются стерильные ватные тампоны. Тампон
погружается в пробирку с суспензией, отжимается избыток инокулюма о стенки
пробирки и наносится на поверхность агара, т.е. посев газоном. На газон
наносятся стандартные диски с антибиотиками. Чашки инкубируют в течение 1824 часов при температуре 37°С. Учет результатов осуществляют по величине
зоны задержки роста.
Определение способности микроорганизмов створаживать молоко
Суточную бульонную культуру лактобацилл и 48-часовую культуру бифидобактерий в объеме 0,3 мл вносили в пробирки с 10 мл стерильного обезжиренного молока. Пробирки помещали в термостат при температуре 37°С и учитывали
результаты каждые 2 часа по образованию творожистого осадка.
Методы
изучения
адаптационного
потенциала
лактобацилл
и
бифидобактерий. Определение адгезивной способности
Степень
адгезии
микроорганизмов
определяли,
пользуясь
средним
показателем адгезии (СПА) по методу Брилис В.И. [39] на эритроцитах человека
О (I) группы Rh+.
При постановке опыта на предметное стекло наносили одну каплю
буферного раствора (0,1М раствор фосфата натрия на изотоническом растворе
хлорида натрия, pH 7,2 – 7,3) в котором суспендировали по одной петле взвесь
эритроцитов, предварительно дважды отмытых буферным раствором путем
центрифугирования (300 – 1000 об/мин), концентрацией 100 млн/мл и одну петлю
густой суточной суспензии культуры микроорганизмов (№ 6 по Mc Farland),
выращенных в оптимальной жидкой питательной среде. На одно стекло наносили
3 капли суспензии разных микроорганизмов. Предметное стекло с эритроцитами
27
и суспензией бактерий помещали во влажную камеру на 30 минут при
температуре 37oC. Затем препарат высушивали при той же температуре,
фиксировали в пламени спиртовки и окрашивали по методу Грама. При
микроскопии определяли среднее количество микроорганизмов, прикрепившихся
к одному эритроциту. Подсчитывали не менее 25 эритроцитов, учитывая не более
5 эритроцитов в одном поле зрения, это СПА.
Адгезивность считалась нулевой при СПА от 0 до 1,0; низкой при СПА от
1,01 до 2,0; средней при СПА от 2,01 до 4,0; высокой при СПА свыше 4,0.
Вариации результатов при данном методе 15%.
Совместное культивирование на поверхности плотной питательной среды
Биосовместимость исследуемых лактобацилл и бифидобактерий между
собой изучалась методом совместного культивирования на плотной питательной
среде по Н.А. Глушановой [23].
Суточную первую бульонную культуру наносили на поверхность плотной
питательной среды в чашках Петри бактериологической петлей диаметром 2-3 мм
и оставляли при комнатной температуре до полного впитывания капли. После
этого, отступив 1-2 мм от края первого пятна, наносили каплю суточной второй
бульонной культуры. Растекаясь, вторая капля затекала на пятно первой
культуры, примерно на половину диаметра. В наложенной части культуры
размножались
при
взаимном
наложении
(совместное
культивирование),
конкурируя друг с другом. Свободные части пятен каждой культуры служили
контролем жизнеспособности каждой из культур и «всхожести» бактерий на
питательной среде. После подсыхания капли второй культуры чашки с посевами
инкубировали при температуре 37ºC. Предварительный учет результатов
проводили через 18-20 часов инкубации, окончательный учет результатов через
48 часов. Результат учитывали по наличию признаков подавления или даже зоны
задержки роста чувствительной культуры.
Статистическая обработка материала
28
Данные экспериментов обрабатывались с помощью прикладной программы
―STATISTICA‖ (Stat Soft Russia) и «Excel». Вычисляли средние значения, доверительный интервал среднего -95,000%, доверительный интервал среднего
+95,000%, медиану, минимум, максимум, нижнюю квартиль, верхнюю квартиль,
стандартное отклонение, стандартную ошибку, асимметрию, эксцесс [12].
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Клинически здоровые люди в возрасте от 18 до 21 года, проживающие в
Центральном федеральном округе России, обладают разной степенью нарушений микробиоценоза кишечника.
2. Селекционированные штаммы лактобацилл и бифидобактерий могут быть
использованы для создания региональных пробиотиков у людей Центрального федерального округа РФ.
Степень достоверности и апробация результатов
Достаточный объем выборки и статистическая обработка материала свидетельствуют о достоверности полученных результатов.
Диссертация апробирована на заседании кафедры микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии ГБОУ ВПО Тверской государственной медицинской
академии Минздрава Российской Федерации (протокол №4 от 16.01.2014).
Результаты исследования были доложены
на V Всероссийском с
международным участием медико-биологическом конгрессе молодых ученых
«Симбиоз-Россия 2012». Доклад «Лактобациллы и бифидобактерии кишечной
микрофлоры здоровых людей, перспективные для создания пробиотиков для
населения Центрального федерального округа» занял первое место на секции
«Микробиология».
29
Публикации
Основное содержание работы отражено в 15 научных публикациях: в статьях, в том числе, в рекомендованных ВАК РФ – 3, рецензируемых РАЕ – 1, в зарубежном журнале – 1, в других изданиях – 10.
Объем и структура диссертации
Работа состоит из введения, основного текста (обзор литературы и главы
собственных исследований), заключения, списка сокращений, списка литературы, приложения. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками, 23 таблицами. Библиографический указатель включает 224 наименования, из них 68 отечественных и 156 зарубежных источников
литературы.
30
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта здоровых людей
Пищеварительный тракт представляет собой одну из наиболее сложных экосистем, которая представлена ассоциацией резидентной микробиоты и клетками
различных фенотипических линий эпителиальной стенки. Термин микробиота,
предложенный D.C. Savage [206], представляет собой коллективное сообщество
бактерий на слизистых оболочках каждого индивидума. Взаимно дополняя друг
друга, макроорганизм и микробиота человека образуют единую симбиотическую
систему. При этом макроорганизм представляет не только среду обитания, находясь в состоянии динамического равновесия с собственной микрофлорой, но и является частью этой системы [6, 18, 34, 35, 41, 49].
На суммарной площади слизистой оболочки, составляющей около 400 м2,
обитают свыше 500 видов микроорганизмов. Бактерии составляют от 35 до 50%
содержимого ободочной кишки человека, а их совокупная биомасса составляет
примерно 2-3 кг [21].
Состав нормальной микрофлоры каждого биотопа (полость рта, пищевод,
желудок, двенадцатиперстная, тонкая и толстая кишки) различен и специфичен.
Кроме того, микробная флора желудочно–кишечного тракта (ЖКТ) находится в
постоянном динамическом равновесии с разнообразными факторами внешней
среды, собственного организма и естественной резистентности. Это равновесие
обусловлено очень тонко сбалансированным взаимодействием между клетками
пищеварительной системы, микробной флорой и иммунной системой [37, 38].
Всех представителей микробной флоры, с которыми взаимодействует
макроорганизм, подразделяют на четыре группы: облигатная флора (основная
микрофлора кишечника); факультативная (условно-патогенные и сапрофитные
микроорганизмы); транзиторная (случайные микроорганизмы, неспособные к
31
длительному
пребыванию
в
макроорганизме);
патогенная
(возбудители
инфекционных заболеваний) [59].
Облигатная микрофлора кишечника - бифидобактерии, лактобактерии, кишечные палочки, пропионобактерии, пептострептококки, энтерококки, бактероиды. Видовой состав этих микроорганизмов и содержание их в кишечнике относительно постоянно. Бифидобактерии относятся к наиболее распространенным и
значимым представителям облигатной флоры кишечника. У детей, находящихся
на грудном вскармливании, преобладают Bifidobacterium bifidum, большая часть
из которых располагается в толстой кишке, составляя основную пристеночную и
просветную микрофлору. Бифидобактерии присутствуют в кишечнике на протяжении всей жизни человека, у детей они составляют от 90 до 98% всех микроорганизмов кишечника в зависимости от возраста [90].
Лактобактерии заселяют организм новорожденных в раннем постнатальном
периоде. При рождении у человека в кишечнике отсутствуют Lactobacillus
acidophilus, однако в дальнейшем происходит колонизация и быстрый рост этих
микроорганизмов. Недавние исследования показали, что в популяции лактобацилл в экологически благополучном районе доминируют виды L.acidophilus,
L.fermentum и L.casei, тогда как у жителей неблагополучных топодемов, наряду с
L.acidophilus, преобладали L.rhamnosus и L.plantarum [51].
Эшерихии колонизируют кишечник в первые дни после рождения, где обнаруживаются в количестве 107 КОЕ/г фекалий и сохраняются на протяжении
всей жизни на этом же уровне.
Заселение кишечника бактероидами происходит постепенно. Они обычно не
регистрируются в бактерийных картах фекалий у детей первого полугодия жизни;
у детей в возрасте от 7 месяцев до 1-2 лет содержание бактероидов не превышает
108 КОЕ/г. У взрослого человека количество бактероидов достигает
1010 -
1011КОЕ/г [13,16].
Факультативная (условно-патогенная) микрофлора - стафилококки, стрептококки, пептококки, условно-патогенные энтеробактерии, дрожжевые грибы,
32
вейлонеллы, фузобактерии, бациллы. Состав факультативной микрофлоры кишечника меняется в зависимости от действия тех или иных факторов внешней
среды: климата, времени года, состояния окружающей среды [31].
К транзиторной микрофлоре относятся неферментирующие грамотрицательные
палочки
преимущественно
родов
Acinetobacter,
Flavobacterium,
Pseudomonas, легко попадающие в кишечник из окружающей среды. Многие из
них являются сапрофитами, некоторые относятся к возбудителям оппортунистических инфекций (флавобактерии, отдельные виды псевдомонад). Транзиторная
микрофлора составляет менее 0,6% у здоровых детей дошкольного возраста, от 1
до 4 % - у взрослых людей [58].
Патогенная микрофлора обусловливает развитие инфекционных заболеваний (бактериальная дизентерия, сальмонеллез, эшерихиозы и др.) [29, 62].
Функции нормофлоры представлены в таблице 3.
Таблица 3
Функции микробиоты (нормальной микрофлоры)
Функция
Механизм реализации
Колонизационная резистентность
Межмикробный антагонизм (продукция органических кислот, перекиси водорода, мурамидазы, бактерицинов, микроцинов и других антагонистически активных веществ).
Активация иммунной системы (индукция синтеза
иммуноглобулинов, лизоцима, интерферона, цитокинов).
Детоксикационная,
Гидролиз продуктов метаболизма белков, липидов,
антимутагенная и анти- углеводов, деконъюгация желчных и гидроксилироканцерогенная
вание жирных кислот, инактивация гистамина, ксенобиотиков и проканцерогенных веществ.
Синтетическая
Образование аминокислот, витаминов, гормонов,
биоактивных аминов и других биологически активных веществ.
Пищеварительная
Усиление активности ферментов, пищеварительной и
моторной функции желудочно-кишечного тракта.
Микрофлора различных микробиотопов различается между собой по количественному и качественному составу. В полости рта находятся следующие мик-
33
роорганизмы: микрококки, диплококки, стрептококки, стафилококки, коринебактерии, аэробные бациллы, спириллы, спирохеты, вибрионы, лактобактерии, актиномицеты, анаэробные кокки, бактероиды, бифидобактерии и др. Общее количество микроорганизмов составляет 107 -108 КОЕ/мл слюны. Концентрация анаэробных бактерий 107-108, аэробных - 106-107 КОЕ/мл [60, 201].
По имеющимся немногочисленным сведениям, микрофлора пищевода
скудная. В проксимальной его части обнаруживаются бактерии типичные для
микрофлоры полости рта и глотки, в дистальном отделе выявляются стафилококки, дифтероиды, лактобактерии, сарцины, бациллы, кандиды [14]. Единичными
остаются сведения о присутствии H.pylori в микробиоценозе пищевода у здоровых лиц [8]. Отсутствуют сведения о количестве микроорганизмов, их ферментативной активности и проявлениях признаков патогенности.
В качестве резидентной флоры в слизистой оболочке желудка и желудочном соке встречаются молочнокислые бактерии, дифтероиды, дрожжевые грибы
рода кандида, стрептококки, стафилококки, микрококки, нейссерии [20]. Количество микроорганизмов в желудке не превышает 103 КОЕ/г. Основная масса бактерий обитает в пилорической части. Доминирующее место среди этой микрофлоры занимают стафилококки и стрептококки, грамотрицательные бактерии [38].
Микрофлора двенадцатиперстной кишки у здоровых людей достаточно
скудна. У здорового человека в 1 мл дуоденального содержимого находится 103–
105 различных бактерий. В дуоденальном содержимом чаще обнаруживались
стрептококки, лактобактерии, дифтероиды, кишечные палочки. Были выявлены
аэробные и анаэробные кокки, лактобациллы, бифидобактерии, энтеробактерии,
бактериоды, вейлонеллы [7, 36]. Считается, что часть из них поступает из желудка
вместе с пищей, а другая часть – из слизистой оболочки 12-перстной кишки.
Обсемененность кишки возрастает после приема пищи, а затем в процессе
пищеварения возвращается к исходному уровню [50].
В кишечнике взрослого человека количество микроорганизмов составляет
1013 КОЕ/г. Облигатная микрофлора является превалирующей (95–98 %) и пред-
34
ставлена анаэробами: бактероидами (105–12 мк/г), лактобациллами (105–7 мк/г) и
бифидобактериями (108–10 мк/г). Среди аэробной микрофлоры преобладают кишечная палочка (106–9 мк/г) и энтерококк (103–9 мк/г) [64]. Индигенные бактерии
создают зону закисления (бифидобактерии – до рН 5,0; лактобактерии – до рН
4,0), конкурируют с другими бактериями за сайты адгезии на энтероцитах, образуя защитную микропленку на поверхности слизистой оболочки кишечника. Добавочная и транзиторная микрофлора составляет лишь 1–4 % от общего количества биомассы микробов кишечника. Различные условно-патогенные микроорганизмы могут быть представлены в количестве до 105 мк/г [15, 31, 62].
Качественный
и
количественный
состав
просветной
микрофлоры
кишечника учитывается при исследовании фекалий на дисбактериоз согласно
ОСТ 91500.11.0004-2003[46] (таблица 4).
Таблица 4
Качественный и количественный состав основной микрофлоры толстого
кишечника у здоровых людей (КОЕ/г фекалий)
Виды микроорганизмов
Возраст, годы
<1
1- 60
>60
Бифидобактерии
1010-1011
109- 1010
10 8 -10 9
Лактобактерии
10 6 - 107
10 7 -10 8
1 10 6 -10 7
Бактероиды
10 7 - 108
10 9 -10 10
10 10 - 10 11
Энтерококки
10 5 -10 7
105 - 108
10 6 -10 7
Фузобактерии
<10 6
10 8 -10 9
10 8 -10 9
10 6 -10 7
10 9 -10 10
10 9 -10 10
Пептострептококки
<10 5
10 9 -10 10
1010
Клостридии
<103
< 10 5
<10 6
107 - 108
107 - 108
107 - 108
<10 5
<10 5
<10 5
0
0
0
<10 4
<10 4
<10 4
0
0
0
Эубактерии
E.coli типичные
E.coli лактозонегативные
E.coli гемолитические
Другие условно-патогенные энтеробактерии *
Стафилококк золотистый
35
<10 4
<10 4
<10 4
Дрожжевые грибы рода Candida
<10 3
<10 4
<10 4
Неферментирующие бактерии**
< 103
<10 4
<10 4
Стафилококки (сапрофитный, эпидермальный)
Примечание * - представители родов Klebsiella, Enterobacter, Hafhia, Serratia, Proteus,
Morganella, Citrobacter и др. ** - Pseudomonas, Acinetobacter и др.
1.2. Дисбиоз
Нарушение микробного равновесия приводит к дисбиозу (дисбактериозу)
кишечника. Дисбактериоз кишечника – это качественное и количественное изменение нормальной кишечной микрофлоры в сторону увеличения числа микробовсимбионтов, в норме отсутствующих или встречающихся в незначительных количествах [25].
В современном представлении понятие ―дисбактериоз‖ – чисто бактериологическое. Оно характеризуется снижением содержания резидентной (главной)
кишечной флоры (бифидобактерий, кишечных палочек, молочнокислых бактерий), нередко сочетающимся с увеличением числа условно-патогенных бактерий
(амфибионтов), в норме встречающихся в незначительных количествах [48]. В условиях нарушенного микробного равновесия ослабляются антигенные свойства
нормальной микрофлоры, а условно-патогенная флора приобретает новую качественную характеристику [9, 132].
Дисбиотические нарушения значительно усложняют течение, диагностику и лечение гастроэнтерологических заболеваний. В этой связи для обеспечения полного клинического выздоровления обязательным компонентом комплексной терапии больных любыми желудочно-кишечными болезнями должна
быть коррекция микроэкологических нарушений [28].
Факторами, провоцирующими развитие дисбиоза кишечника, являются
применение антибиотических препаратов, гормональная терапия, применение
слабительных и угнетающих иммунитет препаратов; неправильный режим пита-
36
ния и стрессы; неблагоприятная экологическая обстановка. Заболеваниями, вызывающими развитие дисбиоза кишечника, могут являться болезни ЖКТ и поджелудочной железы, почек и печени, анемия на основании дефицита фолиевой кислоты, расстройства перистальтики и прочие патологии [28].
Существует большое количество классификаций дисбиоза, в основу которых положены различные критерии. Универсальной классификации дисбактериоза не существует.
По причине возникновения выделяют следующие виды дисбактериоза [25]:
первичный (у практически здоровых лиц, если причину определить не удалось);
возрастной дисбиоз (развивается в связи с закономерными возрастными изменениями в основных органах и системах организма); сезонный дисбиоз (вызван сезонными изменениями характера питания и свойств организма); пищевой дисбактериоз (вызван резким изменением характера питания, например, при диарее путешественников); профессиональный (в результате воздействия профессиональных вредностей); дисбактериоз у болеющих (вторичный — его причиной часто
является другое заболевание); дисбактериоз вследствие воздействия радиоактивных веществ; смешанный дисбактериоз (комплекс разных причин).
В 1972 году Г.Г. Кузнецовой была предложена классификация, включающая
4 стадии и 4 степени тяжести дисбактериоза кишечника, характеризующиеся увеличением и снижением титра тех или иных микроорганизмов. Другая классификация, созданная в 1987 году Б.Ф. Пенегиным, выделяет 4 фазы дисбактериоза:
первая — характеризуется увеличением симбионтов; вторая — отмечается исчезновение некоторых симбионтов и увеличение количества микроорганизмов, которые в норме не выявляются или выявляются в небольших титрах; третья — бактерии могут расширять границы своей локализации, появляясь в тех биотопах, где в
норме отсутствуют; четвертая — происходит увеличение удельного веса условнопатогенных штаммов и их ассоциаций [34].
И.Б.Куваева и К.С.Ладодо [33] предложили унифицированную рабочую
классификацию дисбактериозов с целью учета широкого спектра микробных ас-
37
социаций, исследуемых в фекалиях, их количества и изменения биологических
свойств, особенно при появлении признаков, характеризующих агрессивность условно-патогенных микроорганизмов и тяжести развившихся дисбиотических нарушений при различных заболеваниях. В данной классификации выделяется четыре фазы дисбиоза: латентная, пусковая, агрессии аэробной флоры, ассоциативного дисбиоза.
В настоящее время по данным В.М.Бондаренко с микробиологических
позиций выделяют три степени дисбактериозов [13]:
I степень - снижение количественного содержания бифидобактерий и/или
лактобактерий, снижение или повышение эшерихий на 1-2 порядка логарифма;
II степень – повышение содержания гемолитических эшерихий или других
условно-патогенных микробов до концентрации 105 -107 КОЕ/г или обнаружение
ассоциаций УПМ в концентрации 104-105 КОЕ/г;
III степень – обильный рост ассоциаций микробов в концентрации -106-107
КОЕ/г и выше.
Микроэкологические изменения кишечника обычно характеризуются
разнообразными
признаками,
сопровождающими
основное
заболевание.
Различают фазы и стадии синдрома ―дисбактериоз кишечника‖ (таблица 5).
Таблица 5
Фазы и стадии дисбактериоза кишечника
Фаза
Стадии
Латентная (субклиническая)
Компенсированная
Клиническая
Субкомпенсированная
Декомпенсированная
При субкомпенсированной и, особенно, при декомпенсированной стадии
дисбактериоза кишечника наиболее часто происходит снижение колонизационной
резистентности,
возникновением
угнетение
функций
дисметаболических
иммунологических реакций [13].
иммунной
системы
состояний
и
организма
с
извращенных
38
Многообразие проявлений и форм дисбиозов, факторов влияющих на нормофлору, а также индивидуальные особеннности каждого человека создают трудности в создании единой классификации.
1.3. Пути коррекции дисбиоза. Пробиотики
Обязательным и важнейшим мероприятием при микроэкологических нарушениях в ЖКТ является устранение причин их возникновения и эффективная терапия основного заболевания. Основными современными приемами сохранения и
коррекции микробной экологии является назначение пробиотиков, пребиотиков,
синбиотиков, аутопробиотиков, а также микроэкологическая инженерия.
Пребиотики – это препараты немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект на организм хозяина через селективную стимуляцию
роста или усиления метаболической активности нормальной микрофлоры кишечника [15, 16, 17, 27]. В эту группу входят препараты, относящиеся к различным
фармакотерапевтическим группам, но обладающие общим свойством – стимулирововать рост и развитие нормальной микрофлоры кишечника.
Синбиотики - это препараты, полученные в результате рациональной комбинации пробиотиков и пребиотиков. Часто это биологически активные добавки,
входящие в состав функционального питания, обогащенные одним или несколькими штаммами представителей родов Lactobacillus и/или Bifidobacterium [32, 63].
Пробиотики – это живые микроорганизмы, которые при назначении в адекватных количествах, нормализуя микробиоту, вызывают положительный эффект
на организм человека. Пробиотические препараты широко применяются для профилактики и лечения различных заболеваний ЖКТ, включая дисбиотические состояния, ожирение, сахарный диабет I типа, опухолевые процессы и др. [1, 2, 42,
53, 67, 92, 187, 220].
Выделяют следующие категории пробиотиков [63]:
39
 Монопробиотики – субстанции, содержащие представителей только одного
вида бактерий;
 Ассоциированные пробиотики – субстанции, представляющие собой ассоциацию штаммов нескольких видов микроорганизмов (от 2 до 30).
В зависимости от назначения пробиотиков их также разделяют на:
 Гетеропробиотики – назначаются вне зависимости от видовой принадлежности хозяина, от которого первоначально были выделены штаммы пробиотических бактерий;
 Гомопробиотики – назначаются только представителям того вида животных
или человеку, из биоматериала которых были выделены соответствующие
штаммы;
 Аутопробиотики – штаммы нормальной микрофлоры, изолированные от
конкретного индивидуума и предназначенные для коррекции его микроэкологии
Изучение кишечной микробиоты – это проблема, которой уделяется пристальное внимание. Потребление пробиотиков как пищевых добавок для поддержания здоровья и облегчения болезни завоевывает популярность и все чаще защищается специалистами здравоохранения, поскольку знания о кишечной микробиоте и потреблении соответствующих пробиотиков значительно возросли в последние годы [189, 197].
Микроорганизмы обычно получают из кишечника человека или животных.
Убитые бактерии, вещества, выделенные из них, а также конечные продукты бактериального роста могут оказать определенное действие, но эти дериваты не являются пробиотиками, так как при их назначении они уже были неживыми. Микроорганизмы не могут считаться пробиотиками, пока они не будут изолированы,
очищены, а их положительный эффект доказан [15, 16, 17, 30].
Концепция применения пробиотиков утверждает, что грамотное использование живых микроорганизмов приводит к положительному воздействию на экосистему человека [19, 57]. В одних случаях эти эффекты могут быть достигнуты в
40
результате изменения популяции или активности колонизации микроорганизмов,
в других случаях это связано с прямым действием пробиотиков на клетки хозяина.
Пробиотики являются препаратами микробного происхождения, оказывающими при естественном способе введения позитивные эффекты на физиологические, биохимические и иммунные реакции организма хозяина через оптимизацию его микробной экологической системы [16, 32, 47, 62, 154] .
Наиболее хорошо изученными пробиотическими штаммами являются бифидобактерии и лактобациллы. Однако в качестве пробиотиков могут быть использованы и другие микроорганизмы: эшерихии, энтерококки, бактероиды и др.
Возможно использование комбинации различных пробиотических культур.
К пробиотическим производственным штаммам предъявляются следующие
требования [46, 56]:
1. Предлагаемый штамм должен быть идентифицирован до вида по фено- и
генотипическим признакам. При устойчивости штамма к антибиотикам она должна быть обусловлена хромосомной природой.
2. Штамм должен обладать однородными морфологическими, тинкториальными, культуральными свойствами без признаков диссоциации.
3. Штамм должен быть однороден по физиолого-биохимическим свойствам,
охарактеризованным с помощью регламентированных методов или с использованием зарегистрированных тест-систем.
4. Штамм не должен продуцировать ферменты, относящиеся к факторам патогенности.
5. Штамм должен обладать антагонистической активностью по отношению
к патогенным и условно-патогенным бактериям. Зона угнетения роста тесткультур должна быть более 10 мм.
6. Штамм не должен обладать высокими адгезивными свойствами.
7. Штамм не должен быть чувствительным к воздействию желудочного сока, щелочи, желчи.
41
Современный арсенал пробиотиков, зарегистрированный в РФ, включает
в себя монокомпонентные, поликомпонентные и сорбированные пробиотики, содержащие бифидобактерии, лактобациллы, эшерихии, энтерококки и апатогенные
представители родов Bacillus, Aerococcus и Saccharomyces. Для каждой из этих
групп препаратов существуют рекомендации в применении, связанные в основном со степенью тяжести дисбиотических нарушений конкретного пациента.
В РФ зарегестрированы следующие препараты-пробиотики на основе бифидобактерий
[17]:
классические
монокомпонентные
—
Бифидумбактерин
(B. bifidum с добавлением бифидогенного фактора — лактозы, различные лекарственные формы); поликомпонентные - Бификол (B. bifidum и E. coli М-17), Бифиформ® (B. longum и Enterococcus faecium), комбинированные и сорбированные —
Бифилиз (B. bifidum и лизоцим), Бифидумбактерин форте (B. bifidum адсорбированные на активированном угле), Пробифор — лиофильно высушенная микробная масса живых бактерий антагонистически активного штамма B. bifidum № 1
в дозе 108 КОЕ, иммобилизированных на частицах косточкового активированного
измельченного угля с добавлением лактозы. Лечебные свойства сорбированных
пробиотиков обусловлены заселением кишечника бифидобактериями, которые
в иммобилизованном состоянии обеспечивают плотную локальную колонизацию
слизистой оболочки и, тем самым, быстрее восстанавливают нормофлору
и репаративный процесс в слизистой оболочке кишечника. Существенно, что эта
группа пробиотиков может использоваться в комплексе с антибиотиками, гормонами, нестероидными противовоспалительными препаратами [30].
Широкое применение имеют следующие лактосодержащие пробиотики:
монокомпонентные -
Лактобактерин
(L. plantarum
8 RA-3),
Биобактон
(L. acidophilus 126), Гастрофарм (L. bulgaricus 51); поликомпонентные — Ацилакт
(L. acidophilus разных штаммов 100АШ, NК1, К3Ш24), Линекс® (L. acidophilus,
B. infantis,
Е. faecium);
комбинированные
и сорбированные —
(L. acidophilus и полисахарид кефирных грибков) [55].
Аципол
42
1.4. Лактобациллы как пробиотики
1.4.1. Влияние лактобацилл на организм человека
Лактобациллы, которые входят в состав желудочно-кишечной микробиоты,
обладают антимикробной активностью и участвуют в защитных механизмах всего
пищеварительного тракта.
Показана
эффективность
применения
некоторых
лактобацилл
(L.
acidophilus, L. rhamnosus) в лечении и профилактике заболеваний ЖКТ, например, острой инфекционной диареи и антибиотикоассоциированной диареи [114,
135]. G. Deshpande установил, что некоторые штаммы лактобацилл могут сократить частоту рецидива диареи, вызванной Clostridium difficile, и предотвратить
появление некротического энтероколита у недоношенных новорожденных [106].
Положительные результаты были получены при использовании Lactobacillus
rhamnosus GG в профилактике колоректального рака [107] и лечении синдрома
раздраженного кишечника [98]. Есть работы, доказывающие эффективность использования селективных штаммов лактобацилл в профилактике и лечении бактериальной и вирусной диареи [151, 181], гастроэнтеритов, вызванных H. pylori
[111, 186, 204, 205].
Пробиотические штаммы лактобацилл вызывают положительные эффекты в
профилактике и лечении заболеваний мочеполовой системы и бактериальных вагинозов у женщин [121, 162, 199], атопических заболеваний, пищевой аллергии
[96] и кариеса зубов [171]. Однако, в редких случаях, публикуются данные о развитии инфекционного заболевания, вероятно вызванные пробиотическими штаммами лактобацилл у пациентов с ослабленным иммунитетом или тяжелыми хроническими заболеваниями [165, 185].
В основе способности лактобацилл воздействовать на макроорганизм лежат
три механизма действия: подавление патогенных штаммов с последующим восстановлением микробного гомеостаза за счет межмикробных взаимодействий,
улучшение функций эпителиального барьера и активация иммунного ответа [52,
43
94, 123, 168]. Способность лактобацилл подавлять жизнедеятельность патогенных
микроорганизмов известна с тех времен, когда их начали использовать в пищевой
промышленности для предотвращения размножения микробов, вызывающих
гниение продуктов. Постепенно интерес к лактобациллам увеличился благодаря
их иммунорегулирующим и иммуностимулирующим свойствам. Также заслуживает большого внимания способность лактобацилл усиливать барьерную функцию эпителиального покрова кишечника по отношению к патогенным микроорганизмам. Несмотря на всю сложность выполняемых функций, нельзя забывать,
что различные штаммы лактобацилл вызывают различную ответную реакцию в
макроорганизме. Результаты изучения одного вида лактобацилл нельзя распространить на весь род Lactobacillus. Особенно важно уделить внимание изучению
генетической ультраструктуры лактобацилл, проявляющих штаммоспецифические свойства.
Существуют две основные категории факторов, которые способствуют оптимальному функционированию пробиотических штаммов лактобацилл: факторы,
позволяющие оптимально адаптироваться к новой нише, которую они временно
заняли в макроорганизме (адаптационные факторы), и факторы, напрямую способствующие проявлению положительных эффектов лактобацилл (пробиотические факторы). Эти две категории полностью включены в определение пробиотичесих штаммов, включающих прежде всего живые и активные микроорганизмы,
оказывающие положительный эффект на здоровье макроорганизма [122].
Пробиотические факторы включают три основных механизма действия
пробиотиков: поддержание микробного баланса, защита эпителиального барьера
и регулирование иммунитета. Адаптационные факторы содействуют проявлению
пробиотических эффектов, включают в себя устойчивость к стрессовым воздействиям, активный метаболизм, адаптированный к макроорганизму и способность к
адгезии к слизистой оболочке кишечника. Для пробиотиков взаимодействие с
макроорганизмом можно оценивать как мутуалистическое. Адаптационные и
44
пробиотические факторы лактобацилл, также как и факторы патогенности УПМ
содействуют выживанию микробиоты в занимаемой нише [170].
1.4.2. Продукция кислот лактобациллами
Главным антимикробным компонентом, продуцируемым лактобациллами,
является молочная кислота [10, 44, 209]. S. C. J. De Keersmaecker определил, что
высокая антимикробная активность L. rhamnosus GG по отношению к S. enterica
serovar typhimurium связана с действием молочной кислоты [215]. Молочная кислота воздействует на рост и экспрессию вирулентных факторов сальмонелл
[109]. Кроме снижения pH молочная кислота способна повышать проницаемость
клеточной стенки грамотрицательных бактерий [158]. В дополнение к этому, органические кислоты, такие как молочная кислота, могут захватывать элементы,
необходимые для роста, например железо, благодаря комплексообразующим
свойствам [91].
S. Menard при исследовании противоинфекционной и иммуностимулирующей активности L.plantarum показал, что представители этого вида лактобацилл
обладают выраженной способностью в анаэробных условиях образовывать уксусную и молочную кислоты, а также катаболизировать аргинин и генерировать
окись азота, которая образуется в ЖКТ за счет конститутивных ферментов лактобацилл, участвует в таких функциях кишечника, как бактериостаз, секреция мукуса, перистальтика, обеспечение местного иммунитета [157].
D. Zhang с соавторами предложил pH-зависимый механизм действия лактобацилл на патогенные штаммы без изменения жизнеспособности патогенов [161].
После нейтрализации культуры L.casei rhamnosus GG до значения pH=7, сразу нарушался механизм, в основе которого лактобациллы препятствовали инвазии S.
enterica серовара typhimurium в культуру клеток Caco-2. Вырабатывая метаболиты, такие как уксусная и молочная кислоты, и понижая тем самым pH, большое
количество лактобацилл подавляет рост бактериальных патогенов [143]. L. lactis,
L. casei shirota и L. acidophilus YIT 0070 подавляли рост E.coli O157:H7 посредством молочной кислоты и pH-зависимого механизма [148]. L.acidophilus casei strain
45
Shirota благодаря молочной кислоте подавляли рост клинических изолятов H.
pylori in vitro и in vivo [142]. L.acidophilus, L.casei subsp. rhamnosus и L. bulgaricus
подавляли рост H. pylori in vitro выделяемой уксусной, молочной и хлористоводородной кислотами [75]. Штаммы лактобацилл, изолированные из кишечника цыпленка, вследствие действия органических кислот ингибировали рост S.enteritidis,
S. pullorum и S. typhimurium [145].
A. Delgado изучал штамм L. plantarum VTT-E-78076, который секретировал
антибактериальные компоненты, подавляющие рост грамотрицательных тестовых
культур: Pantoea agglomerance VTT-E-90396 и Fusarium avenaceum VTT-D-80147.
Активная фракция этих компонентов включала бензойную кислоту, 5-метил-2,4
имидазолидинедион,
тетрогидро-4-гидрокси-4метил-2H-пиран-2-один
и
3-
(метилпропил)-2,5 пиперазинедион [179].
1.4.3. Продукция бактериоцинов лактобациллами
Многие лактобациллы секретируют антимикробные пептиды, которые называются бактериоцинами. Семейство бактериоцинов включает в себя широкое
разнообразие пептидов и протеинов, различающихся размерами, микробной мишенью, механизмом действия и воздействием на иммунитет [11]. Бактериоцины
лактобацилл обычно проявляют свою активность по отношению к близкородственным бактериям, занимающим одинаковую с ними экологическую нишу [13].
T.R.Klaenhammer (1993) [155] обнаружил три класса бактериоцинов, выделяемых
лактобациллами. І класс бактериоцинов, известный как лантибиотики, включает в
себя небольшие пептиды (Mr<5kDa), содержащие необычные аминокислоты, лантионин и β-метиллантионин, и небольшое число дегидратированных аминокислот.
ІІ класс бактериоцинов представляет собой небольшие термостабильные
лантиониннесодержащие пептиды (Mr<5kDa), подразделенные на 3 подкласса:
Listeria- активные пептиды; пептиды, нуждающиеся в двух составных частях для
проявления активности; частично секретирующиеся пептиды. ІІІ класс бактериоцинов включает в себя большие термолабильные протеины (Mr>30kDa). Совре-
46
менные исследования установили генетику, биохимию и механизм действия І
класса [169] и ІІ класса бактериоцинов [102, 174, 202].
Большиство бактериоцинов лактобацилл представляют собой небольшие,
устойчивые к температуре, протеины с высокой изоэлектрической точкой (II
класс бактериоцинов). Они действуют путем увеличения проницаемости мембраны чувствительных бактерий, в которых формируются прерывистые поры благодаря рассеиванию сил, приводящих в движение протоны, в результате чего теряется энергия и наступает гибель клетки [196]. Другие бактериоцины не формируют мембранные поры, а причиняют вред чувствительным бактериям с помощью
основной ферментной активности. Продукция бактериоцинов контролируется
многими штаммами в зависимости от плотности популяции с помощью секретируемого пептидного феромона для quorum sensing. Чувство собственного роста,
сравнимое с таковым у родственных штаммов, предполагает возможность микроорганизмов запускать продукцию бактериоцинов в то время, когда конкуренция
за питательные вещества становится наиболее сильной [196].
Несмотря на тот факт, что бактериоцины, выделенные от лактобацил, неактивны по отношению к грамотрицательным микробам, T.S. Kim показал, что лактацины A164 и BH5 проявляют активность в отношении грамотрицательных бактерий H. pylori [77]. J. Lee и G.Kaletunç определили, что низин воздействует на
грамнегативные бактерии путем разрушения наружной мембраны [144]. Более того, L.acidophylus IBB801 продуцирует небольшой бактериоцин под названием
ацидофилин 801 с установленной молекулярной массой (Mr<6,5kDa), который
обладает узким бактерицидным спектром действия по отношению к грамотрицательным патогенным бактериям E. coli Row и S.panama 1467 [193]. Бактериоцины
могут быть использованы в качестве пищевых консервантов [87]. Однако использование бактериоцинов при желудочно-кишечных расстройствах, вызванных
грамположительной микрофлорой, достаточно ограничено, потому что она нечувствительна к бактериоцинам в отличие от грамотрицательных бактерий.
47
Другие антибактериальные компоненты, продуцируемые лактобациллами,
отличаются от бактериоцинов тем, что ингибирующий компонент, секретируемый
L. casei spp., оказался нечувствительным к воздействию протеолитических ферментов и высокой температуры [167].
Ингибирующими молекулами могут быть и не бактериоцины, которые прежде всего ассоциированы с представителями семейства Enterobacteriaceae. L.casei
subsp. rhamnosus GR-1 и L. acidophilus 76 проявляют ингибирующую активность
по отношению к пиелонефритному штамму E.coli, продуцируя бактерицидную
субстанцию, которая не является ни молочной кислотой, ни перекисью водорода,
молекулярная масса которой более 12-14 kDa, является термолабильной субстанцией, не преципитирующейся в присутствии 80% сульфата аммония, экстрагируется в хлороформе и остается активной в буферном растворе [159].
L.delbrueckii VI1007 продуцирует по крайней мере три ингибирующих фактора, отличающихся от молочной кислоты, один из которых идентифицирован
как бактериоциноподобная термолабильная протеиназо-чувствительная молекула
или комплекс с молекулярной массой >50 kDa [133]. Ингибирующие молекулы,
активные по отношению к E.coli O157:H7, секретируемые в истощающую среду
штаммами L.rhamnosus ВК20 и L. acidophilus HN017, частично инактивировались
благодаря совместному действию лактат дегидрогиназы, трипсина и протеиназы
K [141].
G.L. Lorea с соавторами обнаружил in vitro, что антихеликобактерная активность L. acidophilus CRL 639 вызвана аутолитической активностью белковоподобного компонента, высвобождающегося после лизиса клетки [166]. Используя
клетки HT29-MTX, экспрессирующие муцин, играющий роль рецептора для
H.pylori, выявлена антихеликобактерная активность штамма L. acidophilus LB, который секретирует антибактериальную субстанцию, не зависящую от значений
pH и концентрации молочной кислоты [83]. Аналогичным образом супернатант
L.johnsonii La1 препятствует росту, проявлению уреазной активности и адгезии к
эпителиальным клеткам H.pylori [120]. Другой возможный механизм ингибирова-
48
ния адгезии H.pylori был предложен T. Mukai с соавторами [147], который выявил, что L.reuteri прикрепляются к центральному гликолипидному рецептору
H.pylori. Должно быть отмечено, что молочная кислота, проявляя антимикробный
эффект благодаря низкому значению pH, может усиливать проницаемость наружной мембраны грамотрицательных бактерий, и также потенцировать эффекты
других антимикробных субстанций [158]. R. Callewaert, W. Messens, P. Neysens и
F. Leroy продемонстрировали, что продукция бактериоцинов зависит от энергообеспеченности, температуры, уровня pH, источника азота, от окружающих условий [97, 164, 172, 176]. Она контролируется различными регуляторными системами, включающими в себя процесс, зависящий от концентрации клеток, которые
вовлекают секретируемые пептидные феромоны для ―quorum-sensing‖ [125, 198].
До сих пор нет информации о механизмах регуляции продукции небактериоцинных антимикробных молекул лактобациллами.
Инновационная терапевтическая стратегия, развиваемая в течение последних 10 лет, включает в себя использование антимикробных пептидов, выделенных
из эпителия, функционирующих как первая линия химической защиты в пищеварительном тракте. Они рассматриваются в качестве источника антибиотикоподобных молекул [88, 95,
104, 126, 138]. Проводятся широкие структурно-
функциональные работы по моделированию пептидов как прототипов инновационных лекарственных средств, которые могут в будущем использоваться как антимикробные [85, 134, 156, 212, 223]. К данному моменту некоторые из этих пептидов прошли успешные клинические исследования [88, 132, 212]. Тысячи различных антимикробных пептидов с различной молекулярной массой и последовательностью аминокислот проявляют свою активность в низкой концентрации.
Механизм уничтожения бактерий пептидами может быть более эффективным,
чем специфические активные структуры. Показано, что повреждение клеточной
стенки летально для бактерии [177], другие исследования указывают на множественный механизм, заключающийся в прикреплении пептидов к различным мишеням цитоплазматической области бактерий [210]. Некоторые антибактериальные
49
молекулы, продуцируемые отобранными штаммами лактобацилл, повторяют механизм действия антимикробных пептидов макроорганизма [136]. Небактериоциногенные антибиотикоподобные молекулы, продуцируемые отобранными штаммами лактобацилл, представляют интерес для инновационной антимикробной терапии [79, 90, 150, 203].
1.4.4. Продукция перекиси водорода лактобациллами
Продукция перекиси водорода (H2O2) штаммами лактобацилл является защитным антимикробным механизмом особенно в вагинальной экосистеме [199,
209]. R. D. Pridmore с соавторами [140] описал in vitro роль перекиси водорода,
выделяемой L.johnsonii NCC533 в отношении сальмонелл. Этот штамм выделяет
H2O2 в миллимолярных количествах после инкубации в присутствии O2. Генетическая основа продукции перекиси водорода пока не ясна.
Во влагалище здоровых женщин обнаружены штаммы лактобацилл, продуцирующие H2O2, тогда как у пациенток с бактериальным вагинозом наблюдалось
увеличение числа анаэробных лактобацилл, которые, в свою очередь, не вырабатывали перекись водорода. L. crispatus и L. jensenii, наиболее часто встречающиеся лактобациллы женской половой системы, подавляли гонококки под действием
перекиси водорода [213]. Исследуя антимикробную активность 22 штаммов лактобацилл вагинального происхождения, A. Aroutcheva с соавторами [105] обнаружила, что приблизительно 80% этих штаммов продуцируют перекись водорода,
молочную кислоту, органические кислоты, бактериоцины и проявляют активность по отношению к штаммам Gardnerella vaginalis. L.breves CD2, L.salivarius
FV2 и L.gasseri MV335, прикрепляясь к эпителиальным клеткам, вытесняли вагинальные патогены, а также продуцировали большое количество H2O2, связывались с патогенами и подавляли рост G. vaginalis.
F. Shanaham установил, что L. crispatus F117 и L. paracasei штаммы F2 и
F28, вырабатывающие большую концентрацию H2O2, подавляли рост S.aureus в
питательной среде [194, 195, 211]. L.delbrueckii VI1007 продуцирует по крайней
50
мере три субстанции, подавляющие рост патогенов, одна из которых идентифицирована как H2O2 [222].
С.В. Черкасов изучил продукцию перекиси водорода у 45 штаммов лактобацилл в реакции разложения перекиси водорода ферментом пероксидазой с
окислением тетраметилбензидина в качестве субстрата. В результате исследований было установлено, что 67% изученных штаммов лактобацилл продуцируют
перекись
водорода.
Количество
продуцируемой
перекиси
достигало
1,5
мкмоль/мл. Все перекись-продуцирующие штаммы L.acidophilus в разной степени обладали способностью ингибировать бактериальную каталазу, что было установлено после контакта тест - штамма Staphylococcus aureus ATCC 6538P с культуральной жидкостью лактобацилл [61].
1.5. Бифидобактерии как пробиотики
1.5.1. Экология и роль бифидобактерий. Взаимоотношение с
макроорганизмом
Представители рода Bifidobacterium являются грамположительными бактериями с высоким содержанием G+C, принадлежащие к актинобактериям, представляют собой облигатных обитателей ЖКТ млекопитающих, птиц и некоторых
холоднокровных животных. Между организмом хозяина и бифидобактериями могут развиваться различные взаимосвязи, начиная от оппортунистических патогенных взаимоотношений (например, Bifidobacterium dentium) до комменсальных или
даже мутуалистических отношений (например, виды Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium breve). Среди известных пробиотических микроорганизмов бифидобактерии являются одними из самых доминирующих групп, и некоторые виды
бифидобактерий часто используются в качестве пробиотического ингредиента во
многих функциональных продуктах питания. Взаимоотношения микробиоты с
макроорганизмом представляют собой решающий фактор в развитии и поддержании физиологии и иммунной системы человека.
51
Пробиотики, в частности бифидобактерии, используются в составе ферментированных продуктов питания и считаются безопасными в применении. Известно, что применяемые per os пробиотики могут привести к развитию взаимовыгодного симбиоза с микрофлорой ЖКТ и активации иммунной системы путем выработки провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (ФНО),
интерлейкин (IL) -12, или IL-6, а также противовоспалительных цитокинов, таких
как трансформирующий фактор роста β (TGF) и IL-10 [152, 160, 183].
Биологически активные пептиды, выделяемые B. infantis, сохраняют свою
биологическую активность in vivo и являются эффективными в нормализации
проницаемости кишечника, что способствует восстановлению его функции на модели мышей с колитом [208]. Эффект воздействия пептидов опосредуется путем
уменьшения уровня провоспалительных цитокинов и улучшения экспрессии
плотных белков-переходников. Биологически активные субстанции, выделенные
из бифидобактерий, можно применять в клинической практике для увеличения
сопротивления и поддержания кишечного барьера.
A. Imaoka с соавторами обнаружил противовоспалительный эффект бифидобактерий у людей с неспецифическим язвенным колитом [84]. При совместном
культивировании периферических мононуклеарных клеток крови от людей с эрозивным колитом и двумя штаммами бифидобактерий Bifidobacterium breve и Bifidobacterium bifidum выявлено, что пробиотические бактерии увеличивают продукцию IL-10 и подавляют секрецию IL-8. Bifidobacterium bifidum BGN4 способен
контролировать развитие синдрома раздраженного кишечника путем подавления
продукции цитокинов, таких как гамма-интерферона и моноцитарного хемоатрактантного протеина T-клетками [180].
В подавлении роста опухоли мочевого пузыря (ОМП) Wei Tang с соавторами успешно использовал генетический метод лечения с помощью новых
Bifidobacterium infantis (BI). Противоопухолевой активностью обладает система
BI-ОМП, вызывающая апоптоз опухолевых клеток. Апоптоз, запрограммированная смерть клетки, относится к определенным физиологическим или патологиче-
52
ским состояниям, в которых завершение клеточной жизнеспособности регулируется путем активации множества факторов апоптоза. В нормальных клетках два
процесса, апоптоз и пролиферация, сосуществуют и поддерживают динамическое
равновесие. Когда ген уничтожения системы BI-ОМП был доставлен в опухоль
крыс, обнаружено, что система может существенно тормозить рост опухоли мочевого пузыря крыс, индуцируя апоптоз в опухолевых клетках [69].
Чтобы преодолеть трудности, которые препятствуют широкому применению специальной системы доставки в генной терапии рака и подавлению роста
рака печени, использован штамм Bifidobacterium longum в качестве системы для
транспортировки гена, контролирующего эндостатин, который может подавлять
рост опухолей. Штамм B. longum с геном эндостатина (B. bacterium longum -En)
вводился орально мышам с опухолью. Результаты показали, что B. bacterium longum -En может сильно тормозить рост опухоли печени у мышей и продлить их
срок жизни. Кроме того, рост опухоли подавляется более эффективно, если лечение включало комбинацию B. longum -En и селена. Обогащение B. longum -En селеном улучшает деятельность NK клеток и Т-клеток и стимулирует активность
ИЛ-2 и ФНО-α у мышей. Таким образом, B. longum -En может быть очень эффективным вектором для транспортировки противоопухолевых генов в генной терапии рака [89].
1.5.2. Противовирусная активность бифидобактерий
Несмотря на указанное в литературе позитивное влияние бифидобактерий,
остается не изученным их противовирусный эффект в отношении клеток рака
шейки матки. Большинство случаев рака шейки матки связаны с инфекционным
процессом в аногенитальной области, вызванным вирусом папилломы человека
(ВПЧ). Min-Kyeong Cha [86] показала, что Bifidobacterium adolescentis SPM1005-A
проявил противовирусную активность путем подавления экспрессии онкогенов
Е6 и Е7. Процесс канцерогенеза рака шейки матки связан с избыточной экспрессией вирусных онкогенных белков Е6 и Е7, которые инактивируют действие супрессоров опухолевого роста, p53 и pRb, блокируют апоптоз, сокращают теломе-
53
ры и снижают иммунное распознавание [173]. Предпринимались попытки подавить эти два гена, характерных для вируса папилломы человека высокого риска 16
и 18 типа. G. L. Li c соавторами показал, что онкогенный механизм регуляции, активирующий факторы опухолевых супрессоров и индуцирующий апоптоз, может
быть использован в раковых клетках шейки матки [139].
M. Ivec с соавторами выявил способность бифидобактерий уменьшать инфекционный процесс, вызванный вирусом везикулярного стоматита путем продукции провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-6 и гаммаинтерферон [149]. Эти эффекты коррелируют с митохондриальной активностью
инфекционных макрофагов, таким образом, измерение активности митохондриальных дегидрогеназ может являться первым показателем потенциального ингибирующего эффекта бифидобактерий на репликацию вируса.
Выявлена
способность
штамма
Bifidobacterium longum subsp. infantis,
выделенного из испражнений детей, ингибировать репликацию in vitro
ротавируса, а также защищать клетки, МА-104 и HT-29, от проникновения в них
вируса [178]. Кроме того, данное свойство бифидобактерий подтверждено in vivo
на модели мышей. Этот новый штамм обладал свойствами, характерными для
пробиотических бактерий, такими как резистентность к желчным солям, NaCl,
низкому
pH,
а
также
адгезией
к
слизистой
оболочке
кишечника
и
чувствительность к антибиотикам [112].
1.5.3. Биосинтетические возможности бифидобактерий
В производстве молочных продуктов нередко используют бифидобактерии.
Так, Li Haiping с соавторами в соевое молоко добавлял культуру из шести пробиотических штаммов, в том числе B. animalis ssp.lactis V9 и B. animalis Bb12, и оценивал их характеристики брожения [124]. Показано, что шесть пробиотических
штаммов могут хорошо расти в этой среде и увеличивать содержание биологически активных веществ в соевом молоке, в том числе γ-аминомасляной кислоты,
витамина B6, и общих изофлавоидных агликонов, и могут быть использованы в
качестве потенциальных стартеров для соевого молока. Некоторые виды Bifido-
54
bacterium предотвращают развитие инфекционного процесса, вызванного патогенными бактериями, такими как Escherichia coli, Salmonella и H. рylori [110, 113].
Abdelmajid Zouhir с соавторами установил, что штаммы Bifidobacterium spp.
RBL 68 и RBL 85, выделенные из испражнений новорожденных, продуцируют две
бактериоциноподобные субстанции, подавляющие грамположительные и грамотрицательные бактерии [182]. Эти белковоподобные субстации проявили свою активность по отношению к возбудителям, вызывающим порчу продуктов, таких
как Listeria monocytogenes. Это делает бифидобактерии потенциально полезными
в пищевой промышленности. Методом диффузии в агар показано ингибирующее
воздействие бифидобактерий, B. thermophilum, B. bifidum, B. longum и B. infantis,
за счет их антимикробных субстанций по отношению к патогенным бактериям,
особенно штаммам Listeria monocytogenes. Ингибирующие эффекты оставались
стабильными после термообработки при 100 °С в течение 5 мин, но снижались
после использования ферментов проназы-E и протеиназы-K. Некоторые из изученных бифидобактерий оказались толерантными к действию перекиси водорода
(100-200 мкг/мл), желчных солей (0,3%), лизоцима (0,5 мг/мл), способными переносить низкие значения рН и выживать при ее критических значениях (рН=2)
[224]. Продуцирующие бактериоцины штаммы микроорганизмов, в частности молочнокислые бактерии, или сами бактериоцины могут быть использованы как
природные консерванты пищевых продуктов.
1.6. Изучение антагонистической активности лактобацилл,
бифидобактерий
Важнейшим критерием отбора пробиотических штаммов является изучение
их антагонистической активности по отношению к патогенным и условнопатогенным микроорганизмам, которая обеспечивает колонизационную резистентность ЖКТ.
55
Антагонистическая активность лактобацилл связана с продуцированием в
больших количествах органических кислот (главным образом, молочной), антибиотикоподобных субстанций различного химического состава, спектра и механизма действия (лактоцина), перекиси водорода.
P. Hütt показал, что подавление роста Shigella sonnei является результатом
действия внеклеточных и диффундирующих субстанций L.casei rhamnosus GG,
таких как молочная и уксусная кислоты [81].
Супернатант бесклеточной культуры L.casei rhamnosus Lcr35 подавлял рост
9 патогенных бактерий: энтеротоксигенный штамм E.coli (ETEC), энтеропатогенный штамм E.coli (EPEC), K.pneumoniae, S. flexneri, S. typhimurium, E. cloacae, P.
aeruginosa, E. faecalis и Clostridium difficile [184]. Штаммы лактобацилл, выделенные из пищеварительного тракта, ингибировали рост четырех анаэробных возбудителей гастроэнтеральных инфекций: H. pylori, Campilobacter jejuni, E. coli и C.
difficile [80]. L. plantarum VTT-E-78076 секретировал антибактериальные компоненты, подавляющие рост грамотрицательных тестовых культур: Pantoea agglomerance VTT-E-90396 и Fusarium avenaceum VTT-D-80147. Активная фракция этих
компонентов включала бензойную кислоту, 5-метил-2,4 имидазолидинедион, тетрогидро-4-гидрокси-4метил-2H-пиран-2-один и 3-(метилпропил)-2,5 пиперазинедион [179].
J. Lee определил, что L. casei rhamnosus GG вырабатывает низкомолекулярную термостабильную подавляющую субстанцию, отличающаяся от молочной и
уксусной кислот, и проявляет активность по отношению к Clostridium spp., Bacteroides spp., Bifidobacterium spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp. и Streptococcus spp. [119].
Супернатант штаммов L. acidophilus LB и La1 содержал антибактериальные
компоненты, активные к широкому спектру грамотрицательных и грамположительных патогенов, таких как S.aureus, L. monocytogenes, S.typhimurium, S.flexneri,
K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. cloacae, но не проявлял активность по отношению к лактобациллам [73, 83].
56
Антагонистическая активность бифидобактерий связана с продукцией органических кислот (ацетата и лактата) и бактериоцинов с широким спектром антимикробного действия (ингибирование роста кишечных палочек, клостридий,
сальмонелл, шигелл, листерий, кампилобактеров, вибрионов и др.), а так же с
блокированием рецепторов на слизистой кишечника, предотвращим фиксацию на
них потенциально патогенных микроорганизмов [63].
S. M. Kouamé-Sina показала, что бифидобактерии животного происхождения
Bifidobacterium minimum, Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum, Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium thermacidophilum subsp. suis и Bifidobacterium magnum, выделенные из коровьего молока проявляют антибактериальную
активность по отношению к Listeria monocytogenes, Salmonella hadar, Salmonella
typhimurium, E. coli O27, E. coli O157H7 и S. aureus за счет выработки органических кислот [108].
Штаммы, выделенные из организма человека, B. adolescentis, B. longum, B.
breve, B. bifidum, B. infantis, проявляют антагонистическую бактериоцинпродуцирующую активность в отношении E. coli, Klebsiella ozaenae, S. aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa и G. vaginalis [137, 194, 217].
Применение одновременно нескольких методов определения антагонистической активности лактобацилл и бифидобактерий (прямого и обратного антагонизма, гомо- и изоантагонизма) имеет важное значение при отборе перспективных производственных штаммов [40].
1.7. Адгезивные свойства лактобацилл и бифидобактерий
Способность
к
адгезии
кишечных
лактобацилл
и
бифидобактерий
изучается, используя клетки линий Caco-2 и HT29-MTX. G.J. Chauviere с
соавторами [72] обнаружил, что не все штаммы лактобацилл прикреплялись к
энтероцитоподобным клеткам Caco-2, указывая на штаммоспецифичную адгезию.
Некоторые штаммы лактобацилл, включающие L.acidophilus BG2FO4 и LB, L.
johnsonii La1, L. rhamnosus DR20, L.acidophilus HN017, L. casei subsp. rhamnosus
57
Ler35, L. casei rhamnosus GG, L. casei Shirota, L. rhamnosus LC-705,
прикрепляются к энтероцитоподобным клеткам Caco-2 [78, 141, 221]. Убитая
культура L.acidophilus LB, так же как и живая, эффективно прикреплялись к
недифференцированным и дифференцированным клеткам Caco-2 [146]. Как и
лактобациллы, штаммы бифидобактерий проявляют адгезивность. B.adolescentis,
B.angulatum, B.bifidum, B.breve, B.catenulatum, B.infantis, B.longum, B. Pseudocatenulatum, B.breve4, B.infantis1, B.lactis DR10 проявили адгезивную активность к
щеточной каемке клеток Caco-2 и к слизи, секретируемой клетками HT29-MTX
[71, 141, 218]. Механизм прикрепления штаммов B.longum к клеткам Caco-2
связан с аутоаггрегационными и гидрофобными свойствами бактерий [70]. Было
обнаружено, что бифидобактерии прикреплялись к слизи, выделенной от
пожилых людей, в меньшей степени, чем от других возрастных групп. Этот факт
является фактором, способствующим снижению колонизации бифидобактерий у
пожилых людей [181]. Также было выявлено, что при совместном присутствии
L.casei rhamnosus GG и L.bulgaricus, возрастала адгезия к слизи B.lactis Bb12, хотя
другие тестируемые штаммы лактобацилл никак не влияли на адгезивные
свойства штамма B.lactis. A.C. Ouwehand [181] считает, что только адгезии к
кишечным клеткам человека и изолированной слизи недостаточно для описания
взаимодействия между штаммами лактобацилл, бифидобактерий и слизистой
оболочкой. Этот автор полагает, что адгезивность лактобацилл и бифидобактерий
необходимо изучать, используя кусочки кишечной ткани. Среди штаммов,
проявляющих адгезивность к клеткам Caco-2, L.casei rhamnosus GG показали
хорошую способность к адгезии на кишечном эптелии, а L.johnsonii La1 и L.casei
Shirota прикреплялись в меньшей степени.
Процесс адгезии лактобацилл и бифидобактерий включает в себя пассивные
силы, электростатическое взаимодействие, гидрофобные пространственные силы,
а также липотейхоевые кислоты и специфические структуры, такие как покрытые
лектином внешние отростки (дериваты). Среди 25 штаммов исследуемых лактобацилл, G.J. Chauviere с соавторами [72] выявил, что 7 из них проявляют адгезив-
58
ные свойства, и только 3, включая L.acidophilus, имеют кальций-независимый механизм прикрепления. Подобным образом, L.johnsonii La1 проявляет высокую
кальций независимую адгезивность по отношению к энтероцитоподобной культуре клеток Caco-2 и слизи, секретируемой гомогенной культурой бокаловидных
клеток линии HT29-MTX [71]. Бактериальный компонент, включенный в процесс
адгезии L. acidophilus LB и BG2FO4, является протеазорезистентным и находится
на поверхности бактерии [72, 146]. Выделен протеин с молекулярной массой 29
kDa, находящийся на поверхности L.fermentum 104R, который может быть изолирован из супернатанта клеточной культуры бактерии и вызывать адгезию. Показано, что протеин участвует в процессе прикрепления этого штамма к слизистой
оболочке тонкого кишечника поросят и желудочному муцину [93, 181, 200]. Установлено, что липотейхоевая кислота является фактором, ответственным за адгезию L.johnsonii La1. Эта молекула, изолированная из бактериальной клеточной
стенки и супернатанта клеточной культуры, ответственна за процесс прикрепления L.johnsonii La1 к клеткам Caco-2. Этот механизм зависит от концентрации
протеина [99]. L.animalis и L.fermentum имеют лектиноподобные протеиновые
структуры на своей поверхности, а у штамма L. animalis обнаружили рибитол
тейхоевые кислоты в клеточной стенке [131]. Таким образом, лактобациллы и бифидобактерии содержат различные поверхностные структуры, взаимодействующие с эпителиальными клетками кишечника.
Адгезивные свойства и персистенция в кишечнике
L.casei rhamnosus GG и L. johnsonii La1, проявившие адгезивность in vitro, у
гнотобиологических мышей при их назначении per os были выявлены во всех
сегментах пищеварительного тракта. L. salivarius и L. plantarum 299v проявили
колонизационную способность у мышей гнотобионтов BALB/c и IL-10 соответственно. Есть данные указывающие на то, что некоторые штаммы бифидобактерий
колонизируют пищеварительный тракт in vivo [71].
У мышей - гнотобиотов
C3H/He/Oujco при энтеральном назначении штаммов B.infantis -1, проявляющих
адгезивность in vitro обнаружен высокий уровень этих бактерий в слизистой обо-
59
лочке различных отделов желудочно-кишечного тракта и в кишечном содержимом.
Жизнеспособные B. adolescentis выделялись из организма мышей даже
спустя 5 дней после окончания энтерального введения [216].
1.8. Современные подходы в поиске новых пробиотиков
Современные методики оценки кишечной микробиоты позволяют выявлять
ее нарушения и совершенствовать подходы для создания новых пробиотиков. В
ближайшем будущем появятся пробиотики третьего поколения и также новые
критерии отбора, определяющие лечебные цели этих пробиотиков [175].
Современные источники указывают на то, что применение пробиотических
препаратов стало бы более эффективным при большей персонификации, и их назначение должно зависеть от группы населения с определенными фенотипами.
Основа такой индивидуальности мукозной ткани может зависеть от генотипа, образа жизни, выбора питания и эндогенной микробиоты [115, 117].
Несмотря на обилие информации, на данный момент отсутствуют сведения
о генетической особенности лактобацилл и бифидобактерий, выделенных от различных этно-географических групп населения. В связи с этим актульным считается разработка методологии сравнительного исследования нормофлоры человека,
изучение их действия in vitro для выделения высокоантагонистических пробиотических штаммов с целью создания новых пробиотиков.
Альтернативой классической биохимической идентификации становится
метод генотипирования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Использование генетических платформ второго поколения позволяет проводить
метагеномные исследования не только на основании анализа генов 16S рРнк, но и
по полному секвенированию генов микроорганизмов, их плазмид и вирусов. Разработка новых и оптимизация известных молекулярно-генетических методик индикации и точной видовой идентификации бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium является актуальной, практически значимой и своевременной задачей,
60
которой уделяется большое внимание как отечественными, так и зарубежными
исследователями [22, 54, 103, 127, 128, 129, 130].
61
ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Выделение и идентификация представителей микробиоценоза
кишечника здоровых людей
В исследование были включены 156 здоровых студентов-добровольцев в
возрасте от 18 до 21 года (120 девушек и 36 юношей), проживающих в третьем
поколении на территории одной из 11 областей Центрального федерального
округа
Российской
Федерации
(таблица
6).
При
бактериологическом
исследовании кала было определено качественное и количественное разнообразие
представителей нормофлоры и УПМ кишечника здоровых людей и проведена
статистическая обработка полученных результатов.
Таблица 6
Распределение студентов-добровольцев из ЦФО по областям
№
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Область
Тверская
Московская
Брянская
Ярославская
Тульская
Воронежская
Калужская
Костромская
Смоленская
Тамбовская
Владимирская
Численность
Процентное
студентов
распределение
81
33
16
6
4
4
3
3
2
2
2
51,9%
21,2%
10,3%
3,8%
2,6%
2,6%
1,9%
1,9%
1,3%
1,3%
1,3%
При исследовании микрофлоры кишечника учитывали количество лактобацилл, бифидобактерий, бактероидов, кишечной палочки, энтерококков, пептострептококков, стафилококков, клостридиев, бацилл, актиномицет, дрожжевых грибов рода Candida. Достоверных различий между девушками и юношами не обнаружено. Общее количество выделенных микроорганизмов
составило 575
62
штаммов. Из кишечника выделено и идентифицировано до рода 448 штаммов
нормальной микрофлоры: 2 непатогенных штамма рода Staphylococcus (S.cohnii),
124 штамма - Lactobacillus, 87 - Bifidobacterium, 95 – Enterococcus (E.durans,
E.faecalis, E.faecium), 66 – Bacteroides (B.stercoris, B.ovatus), 40 – Peptostreptococcus (P.asaccharolyticus), 8 – Leptotrichia (L. buccalis), 9 – Clostridium
(C.clostridioforme, C.butyricum, C.beijerinckii) и 17 штаммов Escherichia coli (таблица 7).
Таблица 7
Состав нормальной микрофлоры, выделенной из кишечника здоровых людей
№
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Род микроорганизма
Staphylococcus
Lactobacillus
Bifidobacterium
Enterococcus
Bacteroides
Peptostreptococcus
Leptotrichia
Clostridium
Escherichia coli
Количество штаммов
2
124
87
95
66
40
8
9
17
Из кишечника выделено и идентифицировано до рода 127 штаммов
условно-патогенной и патогенной микрофлоры: 6 патогенных штаммов рода Staphylococcus (S.aureus), 40 – Actinomyces (A.israelii), 55 – Bacillus (B.subtilis,
B.cereus), 26 – Candida (C.albicans, C.tropicalis) (таблица 8).
Таблица 8
Состав условно-патогенной и патогенной микрофлоры,
выделенной из кишечника здоровых людей
№
1
2
3
4
Род микроорганизма
Staphylococcus aureus
Actinomyces
Bacillus
Candida
Количество штаммов
6
40
55
26
63
Выявлена частота встречаемости представителей нормофлоры: в 79%
случаев высевались лактобациллы, в 61% - энтерококки, в 55% - бифидобактерии,
в 42% - бактероиды, в 26% - пептострептококки, в 11% - эшерихии, в 5% лептотрихии и клостридии, в 1% - стафилококки (рисунок 1).
Рисунок 1. Спектр и частота встречаемости представителей нормофлоры
кишечника здоровых людей, % (n=156)
Представители патогенной и условно-патогенной микрофлоры высевались в
следующем процентном соотношении: в 35% случаев – бациллы, в 26% актиномицеты, в 17% - кандиды, в 4% - патогенные стафилококки (рисунок 2).
64
Рисунок 2. Спектр и частота встречаемости условно-патогенных и патогенных
микроорганизмов кишечника здоровых людей, % (n=156)
При определении количественного состава нормофлоры выявлено, что
количество лактобацилл составило – 7,25±0,08 lg КОЕ/г, энтерококков – 7,17±0,09
lg КОЕ/г, бифидобактерий – 7,72±0,07 lg КОЕ/г, бактероидов – 7,25±0,09 lg
КОЕ/г, пептострептококков – 7,15±0,13 lg КОЕ/г, эшерихий – 7,58±0,18 lg КОЕ/г,
стафилококков – 6,26±0,74 lg КОЕ/г, лептотрихий – 7,33±0,17 lg КОЕ/г,
клостридий – 7,04±0,28 lg КОЕ/г (рисунок 3).
Рисунок 3. Количество представителей нормофлоры, выделенной из кишечника
здоровых людей, lg KOE/г (n=156)
Среднее количество патогенных и условно-патогенных микроорганизмов
составило для бацилл – 7,86±0,14 lg КОЕ/г, актиномицет – 7,74±0,08 lg КОЕ/г,
кандид – 6,43±0,17 lg КОЕ/г, стафилококков – 6,48±0,3 lg КОЕ/г (рисунок 4).
65
Рисунок 4. Количество условно-патогенных и патогенных микроорганизмов,
выделенных из кишечника здоровых людей, lg KOE/г (n=156)
Для представителей нормофлоры, патогенных и условно-патогенных
микроорганизмов были рассчитаны параметры описательной статистики (таблицы
9, 10).
Таблица 9
Описательная статистика представителей нормальной микрофлоры
Bifido- Escheri Leptotr Lactoba Bacter Enterobacte- chia
ichia
cillus
oides coccus
rium
coli
spp
spp
spp
spp
spp
Среднее
7,723 7,579 7,327
7,252
7,251
7,174
Доверительный 7,592 7,194 6,934
7,102
7,072
6,995
интервал
среднего
95,000%
Доверительный 7,853 7,963 7,720
7,402
7,430
7,352
интервал
среднего
+95,000%
Медиана
7,824 7,761 7,310
7,391
7,452
7,222
Минимум
5,824 5,523 6,523
5,523
5,523
5,523
Максимум
8,778 8,426 8,000
8,820
8,606
9,000
Peptostreptococcus spp
7,155
6,890
Clostri Staphydium
lococcus
spp
spp
7,037
6,399
6,261
-
7,419
7,675
-
7,222
5,523
8,308
7,523
5,824
8,225
6,261
5,523
7,000
66
Нижняя
квартиль
Верхняя
квартиль
Стандартное
отклонение
Стандартная
ошибка
Асимметрия
Эксцесс
7,523
7,507
7,094
6,554
6,824
6,544
6,749
6,368
5,892
8,125
8,079
7,598
7,924
7,843
7,776
7,824
7,523
6,631
0,612
0,722
0,470
0,843
0,727
0,876
0,828
0,830
1,044
0,066
0,180
0,166
0,076
0,089
0,090
0,131
0,277
0,739
-1,264 -1,728 -0,234
1,806 3,514 -0,005
-0,462
-0,701
-0,702
-0,14
0,058
-0,472
-0,523 -0,152
-0,439 -1,587
-
Таблица 10
Описательная статистика патогенных и условно-патогенных микроорганизмов
Bacillus spp
Среднее
Доверительный
интервал среднего 95,000%
Доверительный
интервал
среднего
+95,000%
Медиана
Минимум
Максимум
Нижняя квартиль
Верхняя квартиль
Стандартное
отклонение
Стандартная
ошибка
Асимметрия
Эксцесс
Actinomyces spp Staphylococcus
aureus
Candida spp
7,856
7,568
7,740
7,569
6,485
5,725
6,426
6,071
8,144
7,911
7,244
6,781
8
3,501
9,000
7,392
8,477
1,019
7,824
6,125
8,426
7,523
8,125
0,534
6,651
5,523
7,136
5,923
7,113
0,724
6,363
5,523
8,426
5,523
7,078
0,880
0,140
0,084
0,295
0,173
-1,645
5,357
-1,418
2,144
-0,355
-2,359
0,783
-0,012
Объем выборки в зависимости от ожидаемого и допустимого уровней
ошибок (для уровня надежности 95%) для большинства микроорганизмов составил 190.
При определении дисбактериоза кишечника выявлено наличие разных
степеней дисбиоза у клинически здоровых студентов. Нормальный биоценоз
кишечника обнаружен всего у 25% здоровых людей, I степень дисбиотических
изменений – у 52%, II степень – у 15% и III степень – у 8% студентов (рисунок 5).
67
Рисунок 5. Степени дисбактериоза у здоровых людей, % (n=156)
В зависимости от степени дисбактериоза микроорганизмы встречались в
разных ассоциациях. При нормобиоценозе в ассоциации входило от 2 до 6 родов
микроорганизмов,
чаще
всего
встречались
представители
нормальной
микрофлоры родов Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, реже Bacteroides и
Peptostreptococcus, и иногда условно-патогенные микроорганизмы рода Actinomyces.
При 1 степени дисбактериоза микроорганизмы встречались от 2 до 8
ассоциаций родов, и были представлены такими родами, как Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Bacteroides и Actinomyces, реже Bacillus, Candida и Peptostreptococcus.
Дисбактериоз 2 степени характеризовался ассоциациями от 3 до 7 родов
микроорганизмов, представителями нормофлоры (Lactobacillus и Bifidobacterium),
так и УПМ (Bacillus, Candida), реже встречались – Enterococcus, Bacteroides,
Actinomyces, Peptostreptococcus и Clostridium.
При 3 степени дисбиотических нарушений в ассоциации входило 3-4 рода
микроорганизмов, чаще всего представители условно-патогенных родов: Bacillus,
Actinomyces и Candida, а также нормальной микрофлоры – Bacteroides, Enterococcus, Peptostreptococcus. Микроорганизмы родов Lactobacillus и Bifidobacterium
при 3 степени дисбактериоза обнаружены не были (таблица 13).
68
Таблица 11
Ассоциации родов микроорганизмов у лиц с разной степенью дисбактериоза
Степень
Ассоциации родов микроорганизмов
дисбактериоза
Нормобиоценоз Lactobacillus+Bifidobacterium;
Lactobacillus+Actinomyces+Bifidobacterium;
Lactobacillus+ Bacteroides+Enterococcus+Bifidobacterium;
Lactobacilus+ Enterococcus+ Peptostreptococcus+ Bifidobacterium;
Lactobacillus+Actinomyces+Enterococcus+Bifidobacterium;
Lactobacillus+Peptostreptococcus+Bifidobacterium;
Lactobacillus+ Bacteroides+ Enterococcus+ Peptostreptococcus+ Bifidobacterium
1
Lactobacillus+Bacillus+Bacteroides+Enterococcus
Lactobacillus+Enterococcus+Bifidobacterium
Lactobacillus+Actinomyces; Lactobacillus+Enterococcus
Lactobacillus+Actinomyces+Enterococcus
Lactobacillus+Bacillus+Bacteroides
Lactobacillus+Enterococcus+Peptostreptococcus
Lactobacillus+Candida+Enterococcus+Bifidobacterium
Lactobacillus+Bacteroides+Actinomyces
Lactobacillus+Bacteroides+Enterococcus
Bifidobacterium+Enterococcus; Bifidobacterium+Actinomyces
2
Lactobacillus+Bacteroides+Candida+Enterococcus
Lactobacillus+Bacillus+Bacteroides+Actinomyces+Escherichia coli
Lactobacillus+Staphylococcus
aureus+Bacillus+Actinomyces+
Enterococcus
Bacillus+Actinomyces+Escherichia
coli+Peptostreptococcus+
Clostridium + Bifidobacterium
3
Bacillus+Bacteroides+Candida+Enterococcus
Bacillus+Bacteroides+Enterococcus +Clostridium
69
2.2. Отбор антагонистически активных штаммов лактобацилл и
бифидобактерий
Критерием отбора служило первичное определение антагонистической
активности штаммов лактобацилл и бифидобактерий, которая изучалась методом
перпендикулярных
штрихов
(прямого
антагонизма)
по
отношению
к
индикаторному штамму.
Из 124 изолятов лактобацилл и 87 бифидобактерий было выделено 6
антагонистически активных штаммов лактобацилл и 5 штаммов бифидобактерий
от людей с нормобиоценозом, проявляющих антагонизм к индикаторным
культурам Staphylococcus aureus 25923, Candida albicans АТСС 885-653, Escherichia coli АТСС 25922. Далее проводили накопление чистой культуры на MRS и
Schaedler Agar для идентификации и дальнейшего изучения.
2.3. Биохимическая идентификация антагонистически активных
штаммов лактобацилл и бифидобактерий
Биохимическая активность лактобацилл определялась с помощью тестсистемы api® 50 CH (bio Mérieux) и программного обеспечения API WEB по 50
параметрам (рисунок 6).
Рисунок 6. Тест система api® 50 CH
70
В результате биохимической идентификации лактобацилл выявлено, что из
6 изолятов 4 принадлежат к виду L.plantarum, 2 - к L.rhamnosus (таблица 12).
Таблица 12
Результаты биохимической идентификации лактобацилл
№ Название
Биохимические тесты
штамма
лактобацилл
1 L.plantarum 46 к.
Glycerol + (48 h), Erythritol + (48 h), D-Arabinose + (48 h), L-Arabinose
+ (24 h), D-Ribose +, D-Xylose + (48 h), L-Xylose –, D-Adonitol –, Methyl-вD-Xylopyranoside –, D-Galactose +, D-Glucose +, D-Fructose +, DMannose +, L-Sorbose + (48 h), L-Rhamnose +, Dulcitol –, Inositol -, DMannotol +, D-Sorbitol +, Methyl-бD-Mannopyranoside + (48 h), MethylбD-Glucopyranoside + (48 h), N-AcetylGlucosamine +, Amygdaline +,
Arbutine +, Esculine citrate Fe +, Salicine +, D-Cellobiose +, D-Maltose +,
D-Lactose +, D-Melibiose +, D-Saccharose +, D-Trehalose +, Inuline + (48
h), D-Melezitose +, D-Raffinose +, Amidon -, Glycogene -, Xylitol -, Gentiobiose +, D-Turanose +, D-Lyxose + (48 h), D-Tgatose -, D-Fucose -, LFucose -, D-Arabitol -, L-Arabitol -, K Gluconate +, K 2-Cetogluconate -,
K 5-Cetogluconate 2 L.plantarum
36 Glycerol - (48 h), Erythritol - (48 h), D-Arabinose - (48 h), L-Arabinose ст.
(24 h), D-Ribose +, D-Xylose - (48 h), L-Xylose –, D-Adonitol –, MethylвD-Xylopyranoside –, D-Galactose +, D-Glucose +, D-Fructose +, DMannose +, L-Sorbose - (48 h), L-Rhamnose -, Dulcitol –, Inositol -, DMannotol +, D-Sorbitol -, Methyl-бD-Mannopyranoside + (48 h), MethylбD-Glucopyranoside - (48 h), N-AcetylGlucosamine +, Amygdaline +,
Arbutine +, Esculine citrate Fe +, Salicine +, D-Cellobiose +, D-Maltose +,
D-Lactose +, D-Melibiose +, D-Saccharose +, D-Trehalose +, Inuline - (48
h), D-Melezitose +, D-Raffinose +, Amidon -, Glycogene -, Xylitol -, Gentiobiose +, D-Turanose -, D-Lyxose - (48 h), D-Tgatose -, D-Fucose -, LFucose -, D-Arabitol -, L-Arabitol -, K Gluconate +, K 2-Cetogluconate -,
K 5-Cetogluconate 3 L.rhamnosus 38 к. Glycerol -, Erythritol -, D-Arabinose -, L-Arabinose -, D-Ribose +, DXylose -, L-Xylose -, D-Adonitol –, Methyl-вD-Xylopyranoside -, DGalactose +, D-Glucose +, D-Fructose +, D-Mannose +, L-Sorbose -, LRhamnose +, Dulcitol -, Inositol -, D-Mannotol +, D-Sorbitol +, MethylбD-Mannopyranoside
-,
Methyl-бD-Glucopyranoside
+,
NAcetylGlucosamine +, Amygdaline +, Arbutine +, Esculine citrate Fe +,
Salicine +, D-Cellobiose +, D-Maltose +, D-Lactose +, D-Melibiose -, DSaccharose +, D-Trehalose +, Inuline -, D-Melezitose +, D-Raffinose -,
Amidon -, Glycogene -, Xylitol -, Gentiobiose +, D-Turanose +, D-Lyxose
-, D-Tgatose +, D-Fucose -, L-Fucose -, D-Arabitol -, L-Arabitol -, K Gluconate +, K 2-Cetogluconate -, K 5-Cetogluconate 4 L. plantarum 17 к. Glycerol -, Erythritol -, D-Arabinose -, L-Arabinose + (48 h), D-Ribose +,
D-Xylose -, L-Xylose –, D-Adonitol –, Methyl-вD-Xylopyranoside –, DGalactose +, D-Glucose +, D-Fructose +, D-Mannose +, L-Sorbose + , LRhamnose -, Dulcitol –, Inositol + (48 ч), D-Mannotol +, D-Sorbitol +,
71
5 L.rhamnosus 32 к.
6 L. plantarum К9 L
Methyl-бD-Mannopyranoside -, Methyl-бD-Glucopyranoside -, NAcetylGlucosamine +, Amygdaline -, Arbutine -, Esculine citrate Fe + (48
ч), Salicine -, D-Cellobiose -, D-Maltose +, D-Lactose +, D-Melibiose -,
D-Saccharose +, D-Trehalose +, Inuline +, D-Melezitose +, D-Raffinose -,
Amidon -, Glycogene -, Xylitol -, Gentiobiose -, D-Turanose +, D-Lyxose
+, D-Tgatose +, D-Fucose -, L-Fucose -, D-Arabitol -, L-Arabitol -, K Gluconate +, K 2-Cetogluconate -, K 5-Cetogluconate Glycerol + (48 h), Erythritol –, D-Arabinose -, L-Arabinose + (48 h), DRibose +, D-Xylose -, L-Xylose –, D-Adonitol –, Methyl-вDXylopyranoside –, D-Galactose +, D-Glucose +, D-Fructose +, D-Mannose
+, L-Sorbose -, L-Rhamnose +, Dulcitol –, Inositol + (48 h), D-Mannotol
+, D-Sorbitol +, Methyl-бD-Mannopyranoside + (48 h), Methyl-бDGlucopyranoside +, N-AcetylGlucosamine +, Amygdaline +, Arbutine +,
Esculine citrate Fe +, Salicine +, D-Cellobiose +, D-Maltose +, D-Lactose
+, D-Melibiose -, D-Saccharose +, D-Trehalose +, Inuline -, D-Melezitose
+, D-Raffinose -, Amidon -, Glycogene -, Xylitol -, Gentiobiose +, DTuranose +, D-Lyxose -, D-Tgatose +, D-Fucose -, L-Fucose -, D-Arabitol
-, L-Arabitol -, K Gluconate +, K 2-Cetogluconate -, K 5-Cetogluconate Glycerol - (48 h), Erythritol –, D-Arabinose - (48 h), L-Arabinose + (24 h),
D-Ribose +, D-Xylose - (48 h), L-Xylose –, D-Adonitol –, Methyl-вDXylopyranoside –, D-Galactose +, D-Glucose +, D-Fructose +, D-Mannose
+, L-Sorbose - (48 h), L-Rhamnose -, Dulcitol –, Inositol - (48 h), DMannotol +, D-Sorbitol +, Methyl-бD-Mannopyranoside + (48 h), MethylбD-Glucopyranoside -, N-AcetylGlucosamine +, Amygdaline +, Arbutine
+, Esculine citrate Fe +, Salicine +, D-Cellobiose +, D-Maltose +, DLactose +, D-Melibiose -, D-Saccharose +, D-Trehalose +, Inuline - (48 h),
D-Melezitose +, D-Raffinose -, Amidon -, Glycogene -, Xylitol -, Gentiobiose +, D-Turanose +, D-Lyxose - (48 h), D-Tgatose -, D-Fucose -, LFucose -, D-Arabitol -, L-Arabitol -, K Gluconate +, K 2-Cetogluconate -,
K 5-Cetogluconate -
Биохимическая активность бифидобактерий определялась с помощью тестсистемы api® 20 A (bio Mérieux) и программного обеспечения API WEB по 20
параметрам (рисунок 7).
Рисунок 7. Тест система api® 20 A
Из 5 антагонистически активных штаммов бифидобактерий 2 принадлежит
к виду B. bifidum, 1 – к B. adolescentis, 1 – B.longum, 1 – B. spp. (таблица 13).
72
Таблица 13
Результаты биохимической идентификации бифидобактерий
№ Название
Биохимические тесты
штамма
бифидобактерий
1 B. bifidum 172
2 B. bifidum 191
3 B. adolescentis 201
4 B. spp 212
5 B. longum 264
Tryptophane -, Urease -, Glucose +, Mannitol -, Lactose +, Saccharose -,
Maltose -, Salicine -, Xylose +, Arabinose -, Gelatin -, Esculin -, Glycerol -, Cellobiose -, Mannose -, Melezitose -, Raffinose -, Sorbitol -,
Rhamnose -, Trehalose -, Catalase Tryptophane -, Urease -, Glucose +, Mannitol -, Lactose +, Saccharose
+, Maltose +, Salicine -, Xylose -, Arabinose +, Gelatin -, Esculin -,
Glycerol -, Cellobiose -, Mannose -, Melezitose +, Raffinose +, Sorbitol
-, Rhamnose -, Trehalose -, Catalase Tryptophane -, Urease -, Glucose +, Mannitol -, Lactose +, Saccharose
+, Maltose +, Salicine -, Xylose +, Arabinose +, Gelatin -, Esculin -,
Glycerol -, Cellobiose -, Mannose +, Melezitose +, Raffinose +, Sorbitol
-, Rhamnose -, Trehalose -, Catalase Tryptophane -, Urease -, Glucose +, Mannitol +, Lactose +, Saccharose
+, Maltose +, Salicine +, Xylose +, Arabinose +, Gelatin -, Esculin -,
Glycerol -, Cellobiose -, Mannose -, Melezitose -, Raffinose +, Sorbitol , Rhamnose -, Trehalose -, Catalase Tryptophane -, Urease -, Glucose +, Mannitol +, Lactose +, Saccharose
+, Maltose +, Salicine -, Xylose -, Arabinose +, Gelatin -, Esculin -,
Glycerol -, Cellobiose -, Mannose -, Melezitose +, Raffinose +, Sorbitol
+, Rhamnose -, Trehalose -, Catalase -
2.4. Генетическая идентификация антагонистически активных
штаммов лактобацилл и бифидобактерий
Генетическую идентификацию лактобацилл и бифидобактерий проводили
на базе лаборатории генетики микроорганизмов Учреждения Российской
академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Определение
нуклеотидной
последовательности
ПЦР-продуктов
позволяет
подтвердить
видовое определение штаммов и выявляет штаммовые различия (обычно 1-3
нуклеотида). Для определения вида лактобацилл по гену 16S РНК использовали
стандартные
праймеры
27f
(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)
и
1492r
(GGTTACCTTGTTACGACTT); ожидаемый размер ПЦР-фрагментов – 1465 пн
[163]. Результаты представлены в таблице 14.
73
Таблица 14
Результаты генетической идентификации лактобацилл
Штамм
№ Ближайший гомолог по данным BLASTN
Ближайший гомолог другого вида по
№
данным BLASTN
Вид, штамм
Идентифи %
катор
Вид, штамм
в идентичных
GenBank
Идентифик %
атор
нуклеотидов
в идентич-
GenBank
ных
нуклеотидов
1
2
46к
36ст
L.plantarum
NC_00456 780/780=100 L.brevis ATCC NC_008497 731/789=
WCFS1
7
L.plantarum
NC_01455 780/780=100 L.brevis ATCC NC_008497 732/789=
s.plantarum ST-III 4
3
38к
L.rhamnosus
705
4
17к
6
32к
K9L
367
%
93%
367
93%
Lc NC_01319 780/780=100 L.casei BL23
9
NC_010999 766/782=
%
98%
L.casei str.Zhang NC_01433 780/780=100 L.rhamnosus Lc NC_013199 765/782=
L.paracasei
5
%
4
%
705
98%
subsp. paracasei NR_02588
Lactobacillus
strain R094
zeae strain RIA
0
L.rhamnosus
Lc NC_01319 780/780=100 L.casei BL23
705
9
L.plantarum
NC_01455 780/780=100 L.brevis
s.plantarum ST-III 4
NR_037122 769/780=
98,5%
NC_010999 766/782=
%
%
98%
ATCC NC_008497 732/789=
367
93%
L. pentosus str. NR_02913 780/780=100 L.paraplantarum NR_025447 777/780=
124-2
Результаты,
идентификации
3
полученные
%
после
str. DSM 10667
биохимической
лактобацилл, показали, что
у 5
99%
и
генетической
штаммов лактобацилл,
подтверждена видовая принадлежность, полученная по биохимическим тестам. У
1 штамма генетическое исследование изменило его видовое название: L. plantarum 17 к. на L.casei 17 к. (таблица 15).
74
Таблица 15
Результаты биохимической и генетической идентификации лактобацилл
№
Результаты
биохимической Результаты
генетической
идентификации по тест-системе api идентификации (ген 16S РНК)
50 CH ―bio Mérieux‖
1
L.plantarum 46 к.
L.plantarum 46 к.
2
L.plantarum 36 ст.
L.plantarum 36 ст.
3
L.rhamnosus 38 к.
L.rhamnosus 38 к.
4
L. plantarum 17 к.
L.casei 17 к.
5
L.rhamnosus 32 к.
L.rhamnosus 32 к.
6
L. plantarum К9 L
L. plantarum К9 L
Для определения вида бифидобактерий по гену 16S РНК использовали
родовые и видовые праймеры (таблица 16).
Таблица 16
Результаты генетической идентификации бифидобактерий
№№
Штамм Ближайший гомолог по данным BLASTN
Вид, штамм
% идентичных нуклеотидов
1
191
B.adolescentis ATCC 15703
1372/1379=99%
2
201
B.longum strain THT-010301
1411/1411=100%
B.longum strain BG
1411/1411=100%
3
264
B.longum strain NCC2705
1400/1401=99%
4
172
B. bifidum S17 strain S17
1405/1405=100%
5
212
B.angulatum strain B677
1408/1410=99%
Результаты,
полученные
после
биохимической
и
генетической
идентификации бифидобактерий (таблица 17), показали, что у 2 штаммов
бифидобактерий
подтверждена
видовая
принадлежность,
полученная
по
биохимическим тестам. У 2 штаммов генетическое исследование изменило его
видовое название: B. bifidum 191 на B. adolescentis 191, B. adolescentis 201 на B.
75
longum 201, и у 1 штамма биохимическая идентификация не определила видовую
принадлежность штамма.
Таблица 17
Результаты биохимической и генетической идентификации бифидобактерий
№
Результаты
биохимической Результаты
генетической
идентификации по тест-системе api идентификации (ген 16S РНК)
20 A ―bio Mérieux‖
1
B. bifidum 172
B. bifidum 172
2
B. bifidum 191
B. adolescentis 191
3
B. adolescentis 201
B. longum 201
4
B. spp 212
B. angulatum 212
5
B. longum 264
B. longum 264
2.5. Характеристика пробиотического потенциала лактобацилл и
бифидобактерий
2.5.1. Определение антагонистической активности лактобацилл и
бифидобактерий методом агаровых слоев
Определение антагонистической активности методом агаровых слоев или
методом отсроченного антагонизма проводили, используя в качестве тестовых
штаммов Candida albicans ATCC 885-653, Salmonella typhimurium 415, Shigella
sonnei I фазы 941, Bacillus subtilis 534 из коллекции музейных культур НИИЭМ
им. Н. Ф. Гамалеи РАМН г. Москва; Escherichia coli 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus 25923 из государственной коллекции
патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
В результате отобранные штаммы лактобацилл и бифидобактерий проявили
антагонизм
ко
всем
тест-культурам
условно-патогенных
и
патогенных
микроорганизмов, зоны, подавления роста которых составили более 20 мм (таблицы 18, 19, рисунок 8).
76
Таблица 18
Антагонистическая активность лактобацилл
Объект
исследования
Candida
albicans
ATCC
885653
L. plantarum 46 к.
Salmonella
typhimurium
415
Shigella
sonnei I
фазы
941
21,1+1* 22,2+1*
22,5+2*
Bacillus
subtilis
534
22,5+2*
E. coli
АТСС
25922
24,5+2*
Pseudomonas aeruginosa
ATCC
9027
25,3+2*
S.aureus
25923
23,0+2*
L. plantarum 36 ст. 22,3+1* 22,6+2*
23,5+2*
22,5+2*
24,5+2*
25,3+2*
23,7+2*
L. rhamnosus 38 к. 22,5+2* 22,0+1*
25,2+2*
23,5+2*
27,5+2*
23,9+3*
25,4+3*
L. casei 17 к.
24,2+2* 20,1+2*
23,0+2*
25,8+3*
25,5+3*
23,0+1*
27,1+2*
L. rhamnosus 32 к. 21,3+3* 23,8+1*
24,2+2*
25,0+1*
26,1+2*
23,5+2*
25,7+1*
L. plantarum К9 L 23,2+2* 25,5+3*
24,2+2*
23,5+2*
25,7+1*
22,5+2*
25,4+2*
*Примечание:
зоны задержки
роста
тест-культур
условно-патогенных и
патогенных
микроорганизмов (мм)
Все штаммы бифидобактерий не проявляют антагонистической активности
в отношении дрожжевых грибов рода Candida. Штаммы не подвергались генноинженерным воздействиям.
Таблица 19
Антагонистическая активность бифидобактерий
Объект
исследования
Candida albicans
ATCC
885-653
Salmonella
typhimurium
415
Shigella
sonnei I
фазы
941
Bacillus
subtilis
534
E. coli
АТСС
25922
Pseudomonas
aeruginosa
ATCC
9027
S.aureus
25923
B. bifidum 172
0*
22+1*
35+2*
35+2*
35+2*
35+2*
35+2*
B.adolescentis 191
0*
35+2*
35+2*
35+2*
35+2*
35+2*
30+1*
B. longum 201
0*
35+2*
30+1*
35+2*
30+1*
35+2*
35+2*
B.angulatum 212
0*
35+2*
34+2*
35+2*
30+1*
35+2*
25+1*
B. longum 264
0*
21+1*
25+1*
21+1*
21+1*
21+1*
28+1*
*Примечание:
зоны задержки
микроорганизмов (мм)
роста
тест-культур
условно-патогенных и
патогенных
77
Рисунок 8. Антагонистическая активность бифидобактерий по отношению к
Bacillus subtilis
2. 5.2. Факторы патогенности лактобацилл и бифидобактерий
При исследовании 6 антагонистически активных штаммов лактобацилл и 5
антагонистически активных штаммов бифидобактерий на наличие каталазной
активности, микробных протеаз (казеиназа и желатиназа), нуклеазной активности
(ДНК-аза и РНК-аза), гемолитической, уреазной и лецитиназной активности не
обнаружено вышеупомянутой активности у данных бактерий.
Все исследуемые штаммы не имеют указанных фенотипических признаков,
ассоциированных с синтезом ферментов агрессии.
2.5.3. Чувствительность лактобацилл и бифидобактерий к желчи
Cкорость размножения исследуемых бульонных культур характеризовалась
величиной оптической плотности растущих бульонных культур по отношению к
стерильному бульону. Величина оптической плотности сравнивалась с контролем,
где происходило размножение исследуемого штамма в отсутствие желчи.
При исследовании чувствительности лактобацилл к желчи (рисунок 9, таблица 20) было выявлено, что желчь не подавляет рост данных штаммов. У двух
штаммов происходило периодическое увеличение и уменьшение оптической
плотности при различных концентрациях желчи (L.rhamnosus 38 k. и L.plantarum
46 k.). У трех штаммов после достижения минимального пика оптической
78
плотности происходило равномерное ее повышение (L.rhamnosus K9 L,
L.plantarum 32 k., L.casei 17 k.). И у одного штамма после достижения
максимального пика оптической плотности происходило равномерное ее
снижение (L.plantarum 36 ст.).
Рисунок 9. Чувствительность лактобацилл к желчи
Наибольшими концентрациями желчи, стимулирующими рост лактобацилл,
являлись: 0,625%, 2,5%, 5% и 10%, наименьшими – 1,25% и 20%.
Таблица 20
Чувствительность лактобацилл к желчи
% желчи
№ культуры
0,625 контроль МИК,%
20
10
5
2,5
1,25
0,051*
0,022*
0,11*
0,048*
0,109*
0,04*
0,015*
10
L. plantarum 36 ст. 0,253*
0,605*
0,506*
0,475*
0,103* 0,092*
0,087*
0,625
L. rhamnosus 38 к. 0,196*
0,496*
0,297*
0,102*
0,091*
0,092*
0,625
L. casei 17 к.
0,052*
0,038*
0,03*
0,046*
0,062* 0,076*
0,098*
5
L. rhamnosus 32 к. 0,056*
0,035*
0,036*
0,028*
0,027* 0,028*
0,02*
0,625
L. plantarum К9 L 0,053*
0,045*
0,042*
0,03*
0,039*
0,079*
2,5
L. plantarum 46 к.
0,4*
*Примечание: оптическая плотность при длине волны 600 нм
0,05*
79
При исследовании чувствительности бифидобактерий к желчи выявлено,
что 10 и 20% концентрация желчи подавляла рост всех штаммов бифидобактерий.
Минимальная концентрация желчи, подавляющая рост всех бифидобактерий за
исключением B. longum 264, составила 0,625% (таблица 21). B. longum 264 была
чувствительна ко всем концентрациям желчи, даже к минимальной 0,625%.
Таблица 21
Чувствительность бифидобактерий к желчи
% желчи
№ культуры
20
10
5
2,5
1,25
0,625
контроль
B. bifidum 172
0*
0*
0*
2*
10*
450*
Сплошной рост*
B.adolescentis 191
0*
0*
0*
0*
1*
25*
Сплошной рост*
B. longum 201
0*
0*
0*
1*
2*
300*
Сплошной рост*
B.angulatum 212
0*
0*
28*
110*
360*
0*
B. longum 264
*Примечание: КОЕ
0*
0*
0*
0*
Сплошной рост* Сплошной рост*
0*
Сплошной рост*
2.5.4. Чувствительность лактобацилл и бифидобактерий к антимикробным
препаратам
Все штаммы лактобацилл проявляют чувствительность к левомицетину и
гентамицину,
83,3%
–
к
стрептомицину,
доксициклину,
меропенему
и
тетрациклину, 66,7% - к эритромицину и рифампицину, 50% – к линезолиду и
фурадонину, 33,3% - к ампициллину, 16,7% – к бензилпенициллину, все были
резистентны к ципрофлоксацину, ванкомицину и левофлоксацину (рисунок 10).
80
Рисунок 10. Чувствительность лактобацилл к антимикробным препаратам
Все
антагонистически
чувствительностью
выраженности,
за
к
активные
штаммы
антимикробным
исключением
лактобацилл
препаратам
левофлоксацина,
разной
обладают
степенью
ванкомицина
и
ципрофлоксацина, к которым они проявили резистентность.
Все штаммы бифидобактерий проявляют чувствительность к цефуроксиму,
цефаклору, ципрофлоксацину, фузидину, цефалотину, цефазолину, цефалексину,
рокситромицину, клиндамицину, линезолиду и меропенему, 80% - к оксациллину,
эритромицину, линкомицину, рифампицину, бензилпенициллину, ванкомицину и
амикацину, 60% - к гентамицину (рисунок 11).
81
Рис. 11. Чувствительность бифидобактерий к антимикробным препаратам
Все антагонистически активные штаммы бифидобактерий обладают
высокой
чувствительностью
ко
всем
протестированным
антимикробным
препаратам.
2.5.5. Способность бактерий створаживать молоко
Все штаммы лактобацилл показали способность створаживать молоко через
12-14 часов. B. bifidum 172 створаживал молоко через 18-20 часов, B.longum 264 –
через 48 часов, у остальных штаммов бифидобактерий не выявлена способность
створаживать молоко.
2.6. Адгезивная активность лактобацилл и бифидобактерий
Степень
адгезии
микроорганизмов
определяли,
пользуясь
средним
показателем адгезии (СПА) по методу Брилис В.И. [39] на эритроцитах человека
О (I) группы Rh+ (рисунки 12, 13).
82
Адгезивность считалась нулевой при СПА от 0 до 1,0; низкой при СПА от
1,01 до 2,0; средней при СПА от 2,01 до 4,0; высокой при СПА свыше 4,0.
Вариации результатов при данном методе 15%.
Рисунок 12. Адгезия лактобацилл на эритроцитах человека О(I) группы Rh+
Были исследованы 6 антагонистически активных штаммов лактобацилл.
Средний показатель адгезии лактобацилл кишечника колебался от 2,12 до 4,52 и в
среднем составил 3,87±0,32. Таким образом, лактобациллы имели среднее
значение адгезивности (таблица 22).
Таблица 22
Средний показатель адгезии у лактобацилл
Штаммы
СПА
Ср. значение СПА
лактобацилл
(M±m)
лактобацилл (M±m)
L.plantarum 46 к.
3,6±0,21
L.plantarum 36 ст.
2,44±0,27
L.rhamnosus 38 к.
4,16±0,39
L.casei 17 к.
2,12±0,27
L.rhamnosus 32 к.
4,52±0,36
L. plantarum К9 L
4,32±0,39
3,87±0,32
83
Рисунок 13. Адгезия бифидобактерий на эритроцитах человека О (I) группы Rh+
Были исследованы 5 антагонистически активных штаммов бифидобактерий.
Средний показатель адгезии бифидобактерий кишечника колебался от 1,24 до
2,12 и в среднем составил 1,74±0,2. Таким образом, бифидобактерии имели
низкое значение адгезивности (таблица 23).
Таблица 23
Средний показатель адгезии у бифидобактерий
Штаммы
СПА
бифидобактерий
(M±m)
B. bufidum 172
2,12±0,21
B. adolescentis 191
1,24±0,19
B. longum 201
2,08±0,16
B. angulatum 212
1,56±0,22
B. longum 264
1,68±0,24
Ср. значение СПА
бифидобактерий (M±m)
1,74±0,2
2.7. Симбиоз лактобацилл и бифидобактерий
Симбиоз исследуемых лактобацилл и бифидобактерий определялся методом
совместного культивирования на плотной питательной среде (рисунки 14, 15).
84
В
результате
бифидобактерии
не
установлено,
оказывают
что
исследуемые
антагонистического
лактобациллы
воздействия,
о
и
чем
свидетельствует отсутствие зоны задержки роста чувствительной культуры
(рис.16, 17).
Рисунок 14. Совместное культивирование на плотной питательной среде
Рисунок 15. Совместное культивирование на плотной питательной среде
85
Рисунок 16. Биосовместимость лактобацилл и бифидобактерий
Рисунок 17. Биосовместимость лактобацилл и бифидобактерий
86
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Микрофлора человека принимает участие в различных метаболических и
биосинтетических процессах: синтезе витаминов, гормонов, антибиотических
веществ,
усилении
физиологической
активности
кишечника,
гидролизе
токсических продуктов метаболизма белков, липидов, углеводов, деконъюгации
солей желчных кислот и др. Она обеспечивает колонизационную резистентность
желудочно-кишечного тракта в отношении патогенных и условно-патогенных
микроорганизмов [53]. Микробиота человека неодинакова у людей разных
континентов, стран и даже регионов, так как существует тесная взаимосвязь
между индигенной микрофлорой человека, макроорганизмом и экзогенными
факторами окружающей среды. При дисбиотических нарушениях в кишечнике
наблюдается снижение представителей нормофлоры, избыточный рост условнопатогенных и патогенных микроорганизмов, общее снижение иммунной защиты
макроорганизма, что требует коррекции препаратами-пробиотиками. Создание
эффективных пробиотиков, направленных на коррекцию микрофлоры людей,
проживающих в определенном регионе, является в настоящее время актуальной и
важной задачей.
В связи с этим цель нашей работы охарактеризовать микробиоту кишечника
здорового человека, проживающего в Центральном федеральном округе Российской Федерации, и селекционировать новые штаммы лактобацилл и бифидобактерий для создания региональных пробиотических препаратов.
В данной работе определен качественный и количественный состав
микробиоты кишечника здоровых людей в возрасте от 18 до 21 года,
проживающих на территории ЦФО РФ. Показано, что нарушения микроэкологии
кишечника выявляются у 75% здоровых людей. Нами были не только
подтверждены данные литературы о превалировании родов Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium, Bacteroides среди представителей нормофлоры [2, 7], но и
внесены дополнения, которые показали, что частота встречаемости лактобацилл
87
составила 79%, энтерококков - 61%, бифидобактерий – 55%, бактероидов - 42%.
Распространенность других микроорганизмов составила менее 40%, а именно
пептострептококки встречались в 26% случаях, эшерихии - в 11%, лептотрихии и
клостридии - в 5%, непатогенные стафилококки - в 1%.
В нашем исследовании некоторые представители патогенной и условнопатогенной микрофлоры высевались в большем процентном соотношении, чем по
данным научных источников: бациллы - в 35% случаев (по данным литературы не превышает 30%), актиномицеты - в 26% [13, 26]. Кандиды высевались только в
17% случаев, хотя анализ литературы показывает, что частота носительства
грибов рода Candida у здоровых лиц достигает в кишечнике 65–80% [7,9].
Патогенные стафилококки были выявлены лишь в 4%, хотя в последних
исследованиях Е.В. Диц и П.Н. Соколов указывают на то, что чаще всего при
дисбактериозе выделяется S. аureus (30%) [26].
При определении количества представителей нормофлоры выявлено, что
средние значения колебались от 6,26 до 7,72 lg КОЕ/г. Количество лактобацилл
составило – 7,25±0,08 lg КОЕ/г, энтерококков - 7,17±0,09 lg КОЕ/г, бактероидов –
7,25±0,09 lg КОЕ/г, пептострептококков – 7,15±0,13 lg КОЕ/г, эшерихий –
7,58±0,18 lg КОЕ/г, стафилококков – 6,26±0,74 lg КОЕ/г, лептотрихий – 7,33±0,17
lg КОЕ/г, клостридий – 7,04±0,28 lg КОЕ/г, что соответствует последним данным
экспериментальных исследований [13, 26]. По данным М.Д. Ардатской (2010)
бифидобактерии обнаруживаются в количестве более 8 lg КОЕ/г, а по нашим
данным количество бифидобактерий оказалось ниже, составив 7,72±0,07 lg КОЕ/г.
Количество патогенных и условно-патогенных микроорганизмов было
высоким по сравнению с данными литературы и составило для бацилл – 7,86±0,14
lg КОЕ/г, актиномицет – 7,74±0,08 lg КОЕ/г, кандид – 6,43±0,17 lg КОЕ/г,
стафилококков – 6,48±0,3 lg КОЕ/г. Данные литературы указывают на
присутствие этих микроорганизмов в количестве, не превышающем 6 lg КОЕ/г
[7].
88
Нами впервые определена ведущая роль представителей рода Bacillus в
дисбиотических нарушениях кишечника у клинически здоровых людей. Наши
исследования выявили у здоровых людей представителей рода Bacillus, которые
встречались в 35% случаев. Данный микроорганизм превалировал среди условнопатогенной микрофлоры и высевался в большом количестве - 7,86±0,14 lg КОЕ/г.
По
данным
литературы,
в
последнее
время
подобная
тенденция
не
прослеживается.
В результате наших исследований нормобиоценоз кишечника выявлен
только у 25% клинически здоровых людей, что соответствует данным
литературы. По мнению разных авторов, дисбактериоз кишечника встречается у
70–90% здорового населения разных возрастных групп [5, 26]. В нашей работе у
большинства добровольцев (52%) определена 1 степень микробиоценозных
изменений, причем количество ассоциаций микроорганизмов в среднем составило
3 рода представителей в основном нормофлоры и УПМ (Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Bacteroides, Peptostreptococcus, реже Bacillus, Candida и Actinomyces). С увеличением степени дисбактериоза количество ассоциаций
микроогранизмов уменьшается, но в состав микробиоты начинают входить
условно-патогенные
представителей
микроорганизмы
нормофлоры
(Bacillus,
(Lactobacillus
и
Candida),
вытесняя
Bifidobacterium).
При
бактериологическом обследовании кишечной микрофлоры некоторыми авторами
[51] было выявлено, что выделение грибов всегда сопровождалось обнаружением
других видов условно-патогенных бактерий, и кандиды не обнаруживались в
монокультуре. В нашей работе кандиды часто выделялись с бациллами, но также
присутствовали и в ассоциациях с представителями нормофлоры.
В настоящее время для профилактики и лечения дисбактериоза желудочнокишечного тракта применяют препараты-пробиотики [3, 4, 24, 43, 101, 190, 191,
192, 211]. Наиболее перспективными препаратами пробиотиками являются
лактобациллы и бифидобактерии, которые обладают высокой биологической и
89
функциональной активностью, что определяет их практическое использование в
качестве пробиотиков и в производстве пищевых продуктов.
Микрофлора людей, проживающих в разных регионах, различающихся
неоднородным климатом, бытовыми условиями, рационами питания и т.д., не
является одинаковой по спектру встречаемости и количеству. В нашей работе
была проведена селекция антагонистически активных штаммов лактобацилл и
бифидобактерий от здоровых людей Центрального федерального округа России
по
набору
свойств:
морфологических,
тинкториальных,
культуральных,
биохимических, нуклеотидной последовательности гена 16S РНК, отсутствию
ферментов ассоциированных с факторами патогенности, адгезивной способности,
по
чувствительности
антагонистической
к
антимикробным
активности
к
препаратам,
патогенным
и
а
также
по
условно-патогенным
микроорганизмам.
В результате изучения антагонистической активности было отобрано 6
антагонистически активных штаммов лактобацилл и 5 штаммов бифидобактерий,
проявивших антагонизм в методе перпендикулярных штрихов по отношению к
тестовым штаммам Staphylococcus aureus 25923, Candida albicans АТСС 885-653,
Escherichia coli АТСС 25922. Штаммы не подвергались генно-инженерным
воздействиям.
Недавние исследования [100] показали, что 3 штамма, идентифицированные
с помощью API 50 CHL системы как L. plantarum, оказались микроорганизмами
вида
L.
pentosus,
что
подтверждают
данные
изучения
нуклеотидной
последовательности гена 16S рРНК. Причиной тому является одинаковая
последовательность гена 16S рРНК, отличающаяся только 2 pb [116]. В других
работах показано [130], что результаты идентификации лактобацилл, полученные
с помощью генетических методов (16S рРНК), полностью подтверждают
биохимические исследования (API 50 CHL системы), а иногда являются
единственными в идентификации штаммов.
90
В
нашей
работе
в
результате
биохимической
идентификации
6
антагонистически активных штаммов лактобацилл с помощью тест системы api ®
50 CH (bio Mérieux) и программного обеспечения API WEB по 50 параметрам
выявлено, что 4 принадлежат к виду L.plantarum, 2 - к L.rhamnosus. Генетическая
идентификация этих лактобацилл по нуклеотидной последовательности гена 16S
РНК показала, что 3 штамма относятся к виду L.plantarum, 2 - к L.rhamnosus, 1 – к
L.casei. При исследовании наших данных, полученных после биохимической и
генетической идентификации лактобацилл, показано, что в 83% случаях, т.е. у 5
штаммов лактобацилл, подтверждена видовая принадлежность, полученная по
биохимическим тестам. В 17%, у 1 штамма, генетическое исследование изменило
его видовое название: L. plantarum на L.casei.
Биохимическая идентификация бифидобактерий с помощью системы api®
20А (bio Mérieux) включает 20 параметров, и в большинстве случаев необходимо
провести дополнительные биохимические тесты. В связи с этим для видовой
идентификации бифидобактерий более эффективным является применение
молекулярно-генетических методов на основе секвенирования нескольких
мишеней в геноме, что подтверждает анализ литературы [45].
В результате биохимической идентификации пяти антагонистически
активных штаммов бифидобактерий с помощью тест системы api ® 20 A (bio
Mérieux) и программного обеспечения API WEB по 20 параметрам обнаружено,
что 2 принадлежит к B. bifidum, 1 – к B. adolescentis, 1 – B.longum, 1 – B. spp.
Генетическая идентификация этих бифидобактерий показала, что 2 штамма
относятся к виду B. longum, 1 - B. bifidum, 1 - B. adolescentis, 1- к B. angulatum. При
исследовании данных, полученных после биохимической и генетической
идентификации бифидобактерий, показано, что в 40 % случаях, т.е. у 2 штаммов
бифидобактерий,
подтверждена
видовая
биохимическим тестам. В 40%, у
принадлежность,
полученная
по
2 штаммов, генетическое исследование
изменило его видовое название: B. bifidum 191 на B. adolescentis 191, B. adoles-
91
centis 201 на B. longum 201, и в 20% случаев (у 1 штамма) биохимическая
идентификация не определила видовую принадлежность штамма.
В настоящее время существует много работ, посвященных исследованию
антагонистической активности лактобацилл и бифидобактерий по отношению к
представителям нормофлоры, а также условно-патогенной и патогенной
микрофлоры ЖКТ [43, 80, 81, 153, 214]. Наши исследования существенно
дополняют имеющиеся сведения, касающиеся антагонистической активности
лактобацилл
кишечника,
и
бифидобактерий.
эффективно
Штаммы
проявляют
свои
лактобацилл,
выделенные
антагонистические
свойства
из
в
отношении Staphylococcus aureus 25923, Escherichia coli АТСС 25922, Candida albicans АТСС 885-653, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Shigella sonnei 941,
Salmonella typhimurium 415, Bacillus subtilis 534. Штаммы бифидобактерий
проявляют антагонизм в отношении Staphylococcus aureus 25923, Escherichia coli
АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Shigella sonnei 941, Salmonella
typhimurium 415, Bacillus subtilis 534. В отношении дрожжевых грибов рода Candida у бифидобактерий антагонистической активности не выявлено.
Факторы патогенности у лактобацилл и бифидобактерий определяли путем
обнаружения ферментов агрессии, пользуясь общепринятыми методиками.
Лактобациллы и бифидобактерии исследовали на наличие микробных протеаз
(казеиназа и желатиназа), нуклеазной (ДНК-аза и РНК-аза), гемолитической,
каталазной, уреазной, антилизоцимной и лецитиназной активности. У всех
штаммов
выявлено
отсутствие
указанных
фенотипических
признаков,
ассоциированных с синтезом ферментов агрессии. Отсутствие гемолитической
активности у лактобацилл указывает на то, что эти бактерии являются
невирулентными [207]. Наши результаты подтверждают имеющиеся данные
экспериментальных исследований. В ряде исследований получены доказательства
наличия казеинолитической и уреазной активности у некоторых штаммов В.
infantis и В. bifidum [48]. Отсутствие данной активности у выделенных нами
штаммов бифидобактерий указывают на отсутствие вирулентности этих бактерий.
92
При исследовании адгезивной способности 6 антагонистически активных
штаммов лактобацилл, выделенных из кишечника здоровых людей выявлено, что
средний показатель адгезии лактобацилл кишечника колебался от 2,12 до 4,52 и в
среднем составил 3,87±1,02. Таким образом, лактобациллы имели среднее
значение
адгезивности.
антагонистически
При
активных
исследовании
штаммов
адгезивной
бифидобактерий,
способности
выделенных
5
из
кишечника здоровых людей выявлено, что средний показатель адгезии колебался
от 1,24 до 2,12 и в среднем составил 1,74±0,2. Таким образом, бифидобактерии
имели низкое значение адгезивности. По данным литературы [70] лактобациллы
обладают более высоким показателем адгезии, чем бифидобактерии, которые
обычно имеют низкий и средний показатели адгезивности, что подтверждают
наши исследования. Степень адгезии, полученная in vitro на эритроцитах
человека, косвенно свидетельствует о реальной адгезивной способности штаммов
лакто- и бифидобактерий, которая зависит от соответствия к рецепторам эпителия
конкретного пациента. Наряду с лактобациллами бифидобактерии, обладая
достаточной степенью адгезии, могут входить в состав биопленок, осуществляя
колонизационную резистентность.
В нашей работе была исследована чувствительность всех выделенных
штаммов лактобацилл и бифидобактерий к антибиотикам и химиопрепаратам. В
результате исследования лактобациллы показали среднюю, а бифидобактерии
высокую чувствительность к антимикробным препаратам. Известно [76, 118], что
лактобациллы обладают чувствительностью к антибиотикам, подавляющим
синтез белка, эритромицину и тетрациклину. Наши данные указывают, что 83,3%
штаммов лактобацилл кишечника чувствительны к тетрациклину и доксициклину,
66,7% – к эритромицину. A.S. Hummel et al. [82] в своей работе показал
резистентность лактобацилл к хинолонам, ципрофлоксацину и налидиксовой
кислоте. S. Mayrhofer et al. [83]
выявил нечувствительность лактобацилл к
фузидиевой кислоте, налидиксовой кислоте и полимиксину B, а также
аминогликозидам (гентамицину, канамицину, неомицину и стрептомицину).
93
Наши данные показывают, что лактобациллы проявили резистентность к
хинолонам
(к
ципрофлоксацину),
высокую
чувствительность
–
к
аминогликозидам (100% – к гентамицину, 83,3% – к стрептомицину). Имеются
данные [219] о проявлении чувствительности лактобацилл к ампициллину,
пенициллину G, амоксициллину, оксациллину. В нашем исследовании показано,
что бактерии проявляют чувствительность в 33,3% – к ампициллину, 16,7% – к
бензилпенициллину.
Также
нами
выявлена
высокая
чувствительность
лактобацилл к левомицетину (100%), меропенему (83,8%), рифампицину (66,7%),
фурадонину
и
линезолиду
(50%);
резистентность
-
к
ванкомицину
и
левофлоксацину.
По данным литературы, бифидобактерии чувствительны к пенициллинам:
пенициллин G, амоксициллин, пиперациллин, тикарциллин, имипенем, и к
антибиотикам против грамположительных бактерий (макролиды, клиндамицин,
пристинамицин, ванкомицин и тейкопланин). Чувствительность к цефалотину и
цефотетану непостоянна. Большинство культур устойчивы к фузидиевой кислоте.
Высокая
степень
сопротивляемости
наблюдалась
для
аминогликозидов.
Телитромицин, линезолид и гатифлоксацин были активны при МПК50 1 мг/л.
Единственное изменение чувствительности наблюдалось среди различных видов
в отношении штамма Bifidobacterium breve,который оказался в целом более
резистентным. Потенциально приобретенная резистентность наблюдалась только
в отношении тетрациклина и миноциклина, у 14% штаммов [74, 153]. В нашей
работе
все
штаммы
бифидобактерий
проявили
высокую
степень
чувствительности к антимикробным препаратам: 100% - к цефуроксиму,
цефаклору, ципрофлоксацину, ванкомицину, фузидину, цефалотину, цефазолину,
цефалексину, рокситромицину, клиндамицину, линезолиду и меропенему, 80% - к
оксациллину, эритромицину, линкомицину, рифампицину, бензилпенициллину и
амикацину, 60% - к гентамицину.
При исследовании чувствительности лактобацилл к желчи было выявлено,
что
желчь
не
подавляет
рост
данных
штаммов.
При
исследовании
94
чувствительности бифидобактерий к желчи выявлено, что 10 и 20% концентрация
желчи
подавляла
рост
всех
штаммов
бифидобактерий.
Минимальная
концентрация желчи, подавляющая рост всех бифидобактерий за исключением B.
longum 264, составила 0,625%. B. longum 264 была чувствительна ко всем
концентрациям желчи.
Все штаммы лактобацилл показали способность створаживать молоко через
12-14 часов. B. bifidum 172 створаживал молоко через 18-20 часов, B.longum 264 –
через 48 часов, у остальных штаммов бифидобактерий не выявлена способность
створаживать молоко.
В
результате
исследований
установлено,
что
выделенные
нами
лактобациллы и бифидобактерии не оказывают взаимного антагонистического
воздействия, о чем свидетельствует отсутствие зоны задержки роста культур при
их совместном культивировании на твердой питательной среде.
По современным представлениям эффективные пробиотики должны
содержать потенциально безвредные пробиотические штаммы, не обладающие
факторами
патогенности,
имеющие
широкий
спектр
пробиотического
и
адаптационного потенциала, а также оказывающие высокую антагонистическую
активность по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, но не
влияющие на представителей нормофлоры. Пробиотические препараты, создание
которых
основано
ориентировано
на
на
принципах
определенную
персонализированной
региональную
группу,
медицины
будут
и
более
эффективными для жителей этого региона.
В
нашем
исследовании
селекционированные
лактобациллы
и
бифидобактерии, отвечающие предъявленным требованиям, характеризуются
высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условнопатогенным
микроорганизмам
и
разным
спектром
адаптационного
и
пробиотического потенциала. Лактобациллы обладают средним показателем
адгезивности и чувствительности к антимикробным препаратам, бифидобактерии
–
низким
показателем
адгезивности
и
высокой
чувствительностью
к
95
антибиотикам и химиопрепаратам. Исходя из имеющихся данных можно
комбинировать данные штаммы лактобацилл и бифидобактерий для создания
эффективного
комплексного
пробиотического
Центрального федерального округа России.
препарата
для
населения
96
ВЫВОДЫ
1. У 25% клинически здоровых людей в возрасте от 18 до 21 года, коренных жителей Центрального федерального округа Российской Федерации, выявлен
нормальный микробиоценоз кишечника, у 52% – выявлена I степень
дисбиотических изменений, у15% - II степень и 8% – дисбактериоз III степени.
2. Выявлена ведущая роль представителей рода Bacillus в дисбиотических
нарушениях кишечника у клинически здоровых людей.
3. Одиннадцать штаммов лактобацилл и бифидобактерий обладают высокой
антагонистической активностью по отношению к патогенным и условнопатогенным бактериям: Staphylococcus aureus 25923, Escherichia coli АТСС
25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Shigella sonnei 941, Salmonella typhimurium 415, Bacillus subtilis 534. В отношении дрожжевых грибов рода
Candida антагонистическая активность выявлена только у лактобацилл.
4. Генетическая идентификация выделенных из кишечника антагонистически
активных лактобацилл и бифидобактерий показала, что 3 штамма лактобацилл
относятся к виду L.plantarum, 2 - к L.rhamnosus, 1 – к L.casei; 2 штамма
бифидобактерий – к виду B. longum, 1 - B. bifidum, 1 - B. adolescentis, 1- к B.
angulatum.
5. Все высокоантагонистические штаммы лактобацилл и бифидобактерий не
имеют фенотипических признаков, ассоциированных с синтезом ферментов
агрессии. Лактобациллы растут при различных концентрациях желчи, в то
время как бифидобактерии чувствительны даже к 0,625% желчи. Лактобациллы способны створаживать молоко через 12-14 часов, у бифидобактерий такая
способность менее выражена и проявляется только у двух исследуемых штаммов через 24-48 часов.
6. Лактобациллы
обладают
средним
показателем
адгезивности
и
чувствительности к антимикробным препаратам, бифидобактерии – низким
показателем адгезивности и высокой чувствительностью к антимикробным
препаратам.
97
7. Селекционированные
взаимного
лактобациллы
антагонистического
и
бифидобактерии
воздействия
культивировании на плотной питательной среде.
при
не
их
оказывают
совместном
98
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Селекционированные высокоантагонистические штаммы лактобацилл и
бифидобактерий, выделенные из кишечника здоровых людей Центрального
федерального округа, могут быть использованы в качестве основы для создания
новых пробиотических препаратов для коррекции дисбиотических нарушений
микрофлоры населения данного региона.
2.
Селекционированные
штаммы
лактобацилл
и
бифидобактерий,
L.rhamnosus 38 k., L.plantarum 46 k., L.plantarum 36 ст, L.rhamnosus K9 L,
L.plantarum 32 k., L.casei 17 k., B. bifidum 172, могут использоваться в качестве заквасок прямого внесения.
3. Выделенные штаммы лактобацилл и бифидобактерий, обладающие разным спектром пробиотического и адаптационного потенциала и не оказывающие
взаимного антагонистического воздействия, можно комбинировать для создания
эффективного
комплексного
пробиотического
Центрального федерального округа России.
препарата
для
населения
99
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
УПМ – условно-патогенные микроорганизмы
ЖКТ – желудочно-кишечный тракт
ЦФО РФ – Центральный федеральный округ Российской Федерации
КОЕ – колониеобразующая единица
ПЦР – полимеразная цепная реакция
СПА – средний показатель адгезии
Api WEB для ПК - программное обеспечение по биохимической идентификации
микроорганизмов для персонального компьютера
MRS – специализированная среда для роста лактобацилл
ОМП – опухоль мочевого пузыря
BI – Bifidobacterium infantis
ФНО – фактор некроза опухоли
ВПЧ – вирус папилломы человека
МИК – минимальная ингибирующая концентрация
100
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Авдеев, В.Г. Пробиотики и пребиотики в лечении заболеваний желудочнокишечного тракта / В. Г. Авдеев // Клиническая фармакология и терапия. 2006. - № 15. - С. 36 - 40.
2. Александрович, Н.Ж. Нарушение микробного пейзажа человека и пути их
коррекции / Н.Ж. Александрович, З.И. Пирогова // Клиническое питание. 2005. - № 2. - С. 43 - 46.
3. Алешкин, А.В. Поликомпонентные пробиотические препараты - конструирование, производство и стратегия их продвижения на российском фармацевтическом рынке: автореф. дис. … докт. биол. наук: 03.01.06; 03.02.03 /
Алешкин Андрей Владимирович. - Москва, 2011. – С. 36 - 37.
4. Амерханова, А.М. Научно-производственная разработка новых препаратов
синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности: автореф.
дис. … докт. мед. наук : 03.00.07 ; 03.00.23 / Амерханова Аделаида Михайловна. - Москва, 2009. - С. 40 - 41.
5. Андреева, И.В. Потенциальные возможности применения пробиотиков в
клинической практике // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2006. - № 8. - С. 151 - 172.
6. Анохин, В.А. Роль основных представителей анаэробной кишечной микрофлоры в норме и патологии / В.А. Анохин, Ю.А. Тюрин // Казанский медицинский журнал. - 2001. - T. 82. - № 2. - С. 149 - 151.
7. Ардатская, М.Д. Микробиоценоз кишечника и его роль в развитии и поддержании заболеваний желудочно-кишечного тракта / М.Д. Ардатская // Газета «Новости медицины и фармации» Гастроэнтерология (тематический
номер) / Научный обзор. - 2010. - № 313.
8. Аруин, Л. И. Helicobacter pylori : каким образом один возбудитель вызывает
разные болезни // Эксперим. и клин. гастроэнтерол. - 2004. - № 1. - C. 36 41.
101
9. Бельмер, С.В. Микробиоценоз кишечника и иммунитет / С.В. Бельмер, А. И.
Хавкин // Лекции по педиатрии. Гастроэнтерология. - М. , 2003. - Т.3. - С.
101 - 111.
10.Биологическая активность микроорганизмов-пробиотиков /
Г.И. Новик,
А.А. Самарцев, Н.И. Астапович // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - Т. 42. - № 2. - С. 187 - 194.
11.Блинкова, Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, методы выявления / Л.П. Блинкова // Журн. микробиол. - 2003. - № 3. - С. 109 - 113.
12. Бойцов, А.Г. Методы определения количества бактерий и статистической
обработки результатов: справочник / А.Г. Бойцов, О.Н. Ластовка, А.А. Порин. - С-Петербург.: ООО «Ладога», 2003. - 51 с.
13.Бондаренко, В.М. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный
синдром: современное состояние проблемы / В.М. Бондаренко, Т.В. Мацулевич. - М.: ГЭОТАР–Медиа, - 2007. - С. 8 - 35.
14.Бондаренко, В.М. Дисбактериозы кишечника у взрослых / В.М. Бондаренко,
Н.М. Грачева, Т.В. Мацулевич. - М. , 2003. - 224 с.
15.Бондаренко, В.М. Механизм действия пробиотических препаратов / В.М.
Бондаренко, Р.П. Чуприна, М.А. Воробьева // Биопрепараты. - 2003. - № 3. С. 2 - 5.
16.Бондаренко, В.М. Микроэкологические изменения кишечника и их коррекция с помощью лечебно-профилактических препаратов / В.М. Бондаренко,
Н.М.Грачева, Т.В.Мацулевич, А.А.Воробьев // Российский журнал гастроэнтерология, гепатология, колопроктология. - 2003. - № 4. - С. 66 - 75.
17.Бондаренко, В.М. Поликомпонентные пробиотики: механизм действия и
терапевтический эффект при дисбиозах кишечника / В.М. Бондаренко //
Фарматека. - 2005. - Т. 20. - № 115. - С. 46 - 54.
18.Брудастов, Ю.А. Выживание бактерий при взаимодействии с эффекторными механизмами защиты хозяина: автореф. дис. … докт. мед. наук: 03.00.07
/ Брудастов Юрий Авенирович. - Оренбург. - 2004. - С. 37 - 40.
102
19.Вахитов, Т.Я. Перспективы создания пробиотических препаратов на основе
«чувства кворума» у бактерий / Т.Я. Вахитов, Л.Н. Петров, В.М. Бондаренко // Журнал. микробиол. - 2006. - № 3. - С. 105 - 113.
20.Воробьев, А.А. Исследование пристеночной микрофлоры желудочно–
кишечного тракта у человека в норме и при патологии / А.А. Воробьев,
Ю.В. Несвижский, Е.А. Богданова // Вестник Российской Академии Медицинских наук. - 2004. - № 2. - С. 43 - 47.
21.Гарбузов, Г.А. Дисбактериоз. Лечение и профилактика без лекарств / Г.А.
Гарбузов. - Санкт-Петербург: Питер Пресс, 2009.
22.Генетическое разнообразие бактерий рода Lactobacillus из гастроинтестинальной микробиомы людей / С.Г. Ботина, Н.В. Коробан, К.М. Климина, А.А. Глазова, Н.В. Захаревич, В.В. Зинченко, В.Н. Даниленко // Генетика. - 2010. - № 12.
23. Глушанова, Н.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл в условиях совместного культививрования in vitro / Н.А. Глушанова,
Б.А. Шендеров // Журнал микроб. эпидемиол. и иммунобиол. - 2005. - № 2. С. 56 - 61.
24.Давыдкин, В.Ю. Технология и конструирование сухих биопрепаратов на
основе микрокапельных порошков: автореф. дис. … докт. биол. наук :
03.01.06 / Давыдкин Валерий Юрьевич. – М., 2011. - С. 44 - 45.
25.Дисбиоз кишечника. Руководство по диагностике и лечению. 2-е изд. , испр.
и доп. / Под ред. Е.И. Ткаченко, А.Н. Суворова // СПб. : ИнформМед. - 2009.
- 276 с.
26.Диц, Е.В. Микробиологические аспекты дисбактериоза кишечника у детей
первого года жизни и взрослых / Е.В. Диц, П.Н. Соколов // Материалы российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии», посвященной 85-летию кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Сибирского государственного медицинского университета (Томск, ноябрь 2009). - Томск, 2009. - С. 45 - 47.
103
27.Доронин, А.Ф. Функциональное питание / А.Ф. Доронин, Б.А. Шендеров. М. , Грант, 2002. - 296 с.
28.Конев, Ю.В. Дисбиозы и их коррекция / Ю.В. Конев // Consilium medicum. 2005. - Т. 7. - № 6. - С. 432 - 437.
29.Конев, Ю.В. Нарушение микробиоценоза кишечника и его лечение / Ю.В.
Конев // Справочник поликлинического врача. - 2007. - № 7. - С. 34 - 38.
30.Корниенко, Е.А. Современные принципы выбора пробиотиков / Е.А. Корниенко // Детские инфекции. - 2007. - Т. 6. - № 3. - С. 63 - 68.
31.Коршунов, В.М. Качественный состав нормальной микрофлоры кишечника
у лиц различных возрастных групп / В.М. Коршунов, Л.В.Поташник //
Микробиология. - 2001. - № 2. - С. 57 - 62.
32.Коршунов, В.М. Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функционального питания и коррекции микрофлоры кишечника /
В.М. Коршунов, Б.А. Ефимов, А.П. Пикина // Журн. микробиол. - 2000. № 3. - С. 86 - 91.
33.Куваева, И.Б. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей / И.Б.
Куваева, К.С. Ладодо. - М.: Медицина, 1991. - 240 с.
34.Кузнецова, Г.Г. Об оценке состояния микробиоценоза толстой кишки / Г.Г.
Кузнецова, С.А. Шевелева // Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования: Материалы международной научно-практической конференции с междунар участием. - М. ,
2002. - С. 30 - 31.
35.Леванова, Л.А. Микроэкология кишечника жителей Западной Сибири. Коррекция дисбиотических состояний: автореф. дис. … докт. мед. наук :
03.00.07 / Леванова Людмила Александровна. - М., 2003. - С. 40 - 45.
36.Лыкова, Е.А. Дисбиозы тонкой кишки у детей и их коррекция / Е.А. Лыкова
// сб.: Основы и принципы лечения воспалительных заболеваний кишечника. Международный Workshop Фалька. – СПб., 1996. - С. 55 - 56.
104
37.Малов, В.А. Антибиотик-ассоциированные диареи // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2002. - Т. 4. - № 1.
38.Малов, В.А. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта: современное
состояние проблемы / В.А. Малов, Н.М. Гюлазян // Лечащий Врач . - 2007. № 2. - С. 16 - 18.
39. Методика изучения адгезивного процесса / В.И. Брилис, Т.А. Брилене,
X.П. Ленцнер, А.А. Ленцнер // Лаб. дело. - 1986. - № 4. - С. 210 - 212.
40.Младзиевская, Ю.А. Совершенствование биотехнологического производства и методов контроля качества пробиотиков на основе бифидобактерий и
лактобацилл: дис. ... канд. биол. наук : 03.00.23 / Младзиевская Юлия Артуровна. - СПб., 2005. - 208 с.
41.Несвижский, Ю.В. Изучение изменчивости кишечного микробиоценоза человека в норме и патологии / Ю.В. Несвижский // Вестник Российской
АМН. - 2003. - № 1. - С. 49 - 53.
42. Никитин, В.М. Справочник методов биохимической экспресс-индикации
микробов / В.М. Никитин. - Кишинев, 1986. - 294 с.
43.Нилова, Л.Ю. К вопросу о применении пробиотиков для коррекции дисбактериоза толстого кишечника / Л.Ю. Нилова, А.Г. Бойцов, Е.А. Оришак //
Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова. - 2008. - № 3. - С. 154 - 157.
44.Новик, Г.И. Продукция гидролаз и антибиотикорезистентность молочнокислых и бифидобактерий / Г.И. Новик, Н.И. Астапович, Н.Е. Рябая // Прикладная биохимия и микробиология. - 2007. - Т. 43. - № 2. - С. 184 - 192.
45.Новикова, Н.А. Разработка метода индикации лакто- и бифидобактерий на
основе мультиплексной полимеразной цепной реакции / Н.А. Новикова,
А.Г.Мочалова, К.Я. Соколова // Материалы международной конференции
Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы. - М., 2004. - С. 59 - 60.
105
46.Общая фармакопейная статья. Требования к штаммам микрорганизмов, используемым для производства пробиотиков для медицинского применения.
- 2013. – С. 4 - 5.
47.Онищенко, Г.Г. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии / Г.Г. Онищенко, В.А. Алѐшкин, С.С. Афанасьев //
М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002. - 608 с.
48.Отраслевой Стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004-2003, утверждѐн Приказом Министерства здравоохранения РФ № 231 от 09.06.2003).
49.Попкова, С.М. Микробная экология человека в условиях техногенного
прессинга промышленных городов Восточной Сибири: автореф. дис. …
докт. биол. наук: 03.00.16, 14.00.07 / Попкова София Марковна. - Иркутск. 2004. - С. 40 - 45.
50. Савицкая, К.И. Современные представления о роли и составе кишечной
микрофлоры у здоровых взрослых людей / К.И. Савицкая, А.А. Воробьев,
Е.Ф. Швецова // Вестник Российской АМН. - 2002. - № 2. - С. 50 - 53.
51. Савченко, Т.Н. Микроэкология новорожденных: автореферат дис. ... докт.
мед. наук: 03.02.03 / Савченко Татьяна Николаевна. - Волгоград, 2011. - 37
с.
52.Семенов, А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных
взаимодействиях: автореф. дис. … канд. биол. наук 03.00.07 / Семенов
Александр Васильевич. – Оренбург, 2009. - С. 19-20.
53.Симбионтное пищеварение человека. Физиология. Клиника, диагностика и
лечение его нарушений / В.В. Чернин, А.И. Парфенов, В.М. Бондаренко,
О.В. Рыбальченко, В.М. Червинец. - Тверь: ООО «Издательство «Триада»,
2013. - С. 82 - 83.
106
54.Точилина, А.Г. Биохимическая и молекулярно-генетическая идентификация
бактерий рода Lactobacillus: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.04,
03.00.07 / Точилина Анна Георгиевна. - Нижний Новгород, 2009. - 25 с.
55.Урсова, Н.И. Современные технологии в коррекции дисбактериозов кишечника у детей / Н. И. Урсова // Фарматека. - 2008. - № 2. - C. 19 - 24.
56.Ушкалова, Е.А. Роль пробиотиков в гастроэнтерологии / Е. А. Ушкалова
// Фарматека. - 2007. - № 6. - С. 16 - 23.
57.Функциональная эффективность различных кисломолочных и пробиотических продуктов / С.А. Шевелева, Г.Г. Кузнецова, С.Ю. Батищева, Н.Р. Ефимочкина // Сборник материалов международной конференции: пробиотики,
пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы. - М., 2004. - С. 11 - 12.
58. Хавкин, А.И. Микробиоценоз кишечника и иммунитет / А.И. Хавкин //
Русский медицинский журнал. - 2003. - № 3. - С. 17 - 21.
59.Червинец, В.М. Дисбактериоз кишечника : современные аспекты изучения
проблемы, принципы диагностики и лечения / В. М. Червинец, В.Ф. Виноградов, Л.Е. Смирнова, Ю.В. Червинец, В.М. Бондаренко - Тверь, 2004. 124 с.
60. Червинец, В.М. Изменение микробиоценоза при воспалительных и эрозивно-язвенных поражениях пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки
и пути ее коррекции: автореф. дис. … докт. мед. наук : 03.00.07 / Червинец
Вячеслав Михайлович. – М., 2002. - С. 34 - 36.
61. Черкасов, С.В. Ассоциативный симбиоз как биологическая основа колонизационной резистентности хозяина (на модели женского репродуктивного
тракта): автореф. дис. … докт. мед. наук : 03.00.07 / Черкасов Сергей Викторович. – Оренбург, 2011.
62.Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том 3: Пробиотики и функциональное питание / Б.А. Шендеров. М.: Грант, 2001. - С. 151 - 159.
107
63.Шендеров, Б.А. Современное состояние и перспективы развития концепции
пробиотики, пребиотики и синбиотики / Б.А. Шендеров // Пищевые ингредиенты. - 2005. - № 2. - С. 23 - 26.
64.Щербаков, П.Л. Микроэкология кишечника у детей и ее нарушения // Фарматека. - 2007. - № 14. - С. 28 - 34.
65.Широбоков, В.П. Мікробна екологія людини з кольоровим атласом / В.П.
Широбоков, Д.С. Янковський, Г.С. Димент. - К.: ТОВ «Червона Рута-Турс»,
2008. - 312 c.
66. Экспресс-метод диагностики дисбактериоза кишечника / В.М. Бондаренко,
B.M. Виноградов, Ю.В. Червинец // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. 2004. - № 2. - М163 с.
67.Эрадикационная терапия, включающая пробиотики: консенсус эффективности и безопасности / Е.И. Ткаченко, Е.Б. Авалуева, Ю.П. Успенский, М.Ю.
Волков, Е.В. Сказываева, Ю.В. Можелис, Н.В. Барышникова, М.М. Захарченко // Клиническое питание. - 2005. - № 1. - С. 14 - 20.
68. Янковский, Д.С. Микрофлора и здоровье человека / Д.С. Янковский, Г.С.
Дымент. - К. : ТОВ «Червона Рут-Турс», 2008. - 552 c.
69. A novel Bifidobacterium infantis-mediated TK/GCV suicide gene therapy system exhibits antitumor activity in a rat model of bladder cancer / W. Tang, Y. He,
S. Zhou, Y. Ma, G. Liu // Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2009. -№ 28. - 155 p.
70.Adhesion, autoaggregation and hydrophobicity of 13 strains of Bifidobacterium
longum / B.Del Re, A. Busetto, G.Vignola, B.Sgorbati , D. Palenzona // Lett.
Appl. Microbiol. - 2000. - № 31 - P. 438 - 442.
71.Adhesion of different bifidobacteria strains to human enterocyte-like Caco-2 cells
and comparison with in vivo study / J.Crociani, J.P. Grill, M. Huppert, J. Ballongue / Lett. Appl. Microbiol. - 1995. - № 21. - P. 146 - 148.
108
72.Adhesion of human Lactobacillus acidophilus strain LB to human enterocytelike Caeo-2 cells / G.J. Chauviere, M. Coconnier, S. Kernéis, J. Fourniat, A.L.
Servin // Gen. Microbiol. - 1992. - № 138. - P. 1689 - 1696.
73.Afa/Dr-expressing, diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 triggers
F1845 fimbria-dependent phosphatidylserine externalization on neutrophil-like
differentiated PLB-985 cells through an apoptosis-independent mechanism / N.
Sémiramoth, A. Gleizes, I. Turbica, C. Sandré, V. Marin-Esteban, R. Gorges, A.
Servin, S. Chollet-Martin // Infect Immun. - 2010. - № 78 (7). - P. 2974 - 83.
74. D'Aimmo,
M.R.
Antibiotic
resistance
of
lactic
acid
bacteria
and Bifidobacterium spp. isolated from dairy and pharmaceutical products / M.
R. D'Aimmo, M. Modesto, B. Biavati // Int J Food Microbiol. - 2006. - 12 p.
75.Alternative therapies for Helicobacter pylori: probiotics and phytomedicine / J.M.
Vítor, F.F. Vale // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2011. - №63 (2). - P. 153 64.
76.Ammor, M.S. Antibiotic resistance in non-enterococcal lactic acid bacteria and
bifidobacteria / M.S. Ammor, A.B. Mayo // Food Microbiol. - 2007. - № 24. - P.
559 - 570.
77.Antagonism of Helicobacter pylori by bacteriocins of lactic acid bacteria / T. S.
Kim, J.W. Hur, M.A. Yu, C.I. Cheigh, K.N. Kim , J.K. Hwang, Y.R. Pyun // J.
Food Protect. - 2003. - № 66. - P. 3 - 12.
78.Antagonistic activity exerted in vitro and in vivo by Lactobacillus casei (strain
GG) against Salmonella typhimurium C5 infection [Text] /
S. Hudault, V.
Liévin, M.F. Bernet-Camard, A.L. Servin // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. № 63. - P. 513 - 518.
79.Antagonistic activity of Lactobacillus acidophilus LJJ against intracellular
Salmonella enterica serovar Typhimurium inFecting human enterocyte-like Caeo2/TC-7 Cells / M.H. Coconnier, V. Lievin, M.F. Bernet-Camard // Appl.
Environ. Microbiol. - 2000. - № 66. - P. 1152 - 1157.
109
80.Antagonistic activity of Lactobacillus bacteria strains against anaerobic
gastrointestinal tract pathogens (Helicobacter pylori, Campylobacter coli,
Campylobacter jejuni, Clostridium difficile) / M. Strus, K. Pakosz, H. Gościniak,
A. Przondo-Mordarska, E. Rozynek, H. Pituch, F. Meisel-Mikołajczyk, P.B.
Heczko // Med. Dosw. Microbiol. - 2001. - № 53. - P. 133 - 142.
81.Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against enteroand uropathogens / P. Hütt, J. Shchepetova, K. Lõivukene, T. Kullisaar,
M..Mikelsaar // J Appl Microbiol. - 2006. - № 100 (6). - P. 1324 - 32.
82.Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria / A.S.
Hummel, C. Hertel, W.H. Holzapfel, C.M.Franz // Appl. Environ. Microbiol. 2007. - № 73. - P. 730 - 739.
83.Antibiotic susceptibility of members of the Lactobacillus acidophilus group using
broth microdilution and molecular identification of their resistance determinants /
S. Mayrhofer, A.H. van Hoek, C. Mair, G. Huys, H.J. Aarts, W. Kneifel, K.J.
Domig // Int J Food Microbiol. - 2010. - № 144 (1). - P. 81 - 7.
84. Anti-inflammatory activity of probiotic Bifidobacterium: enhancement of IL-10
production in peripheral blood mononuclear cells from ulcerative colitis patients
and inhibition of IL-8 secretion in HT-29 cells / A. Imaoka, T. Shima, K. Kato, S.
Mizuno, T. Uehara , S. Matsumoto, H. Setoyama, T. Hara, Y. Umesaki // World J
Gastroenterol. - 2008. - Apr 28. - № 14 (16). - P. 2511 - 2516.
85.Antimicrobial peptides: properties, and applicability / W. van Hof, E.C. Veerman,
E.J. Helmerhorst, A.V. Amerongen // Biol. Chem. - 2001. - № 382. - P. 597 619.
86.Antiviral activity of Bifidobacterium adolescentis SPM1005-A on human papillomavirus type 16/ C. Min-Kyeong, L. Do-Kyung, A. Hyang-Mi, L. Si-Won //
BMC Medicine. - 2012. - № 10. - 72 p.
87.Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation / J. Cleveland, T.J.
Montville, I.F. Nes, M.L. Chikindas // Int. J. Food Microbiol. - 2001. - № 71. - P.
1 - 20.
110
88.Bals, R. Antimicrobial peptides and peptide antibiotics / R. Bals // Med. Clin. 2000. - № 95. - P. 496 - 502.
89.Bifidobacterium longum as an oral delivery system of endostatin for gene therapy
on solid liver cancer / F. Geng-Feng, L. Xi, H. Ya-Yi, F. Yan-Rong // Cancer
Gene Therapy. - 2005. - № 12. - P. 133 - 140.
90.Bifidobacterium strains from resident infant human gastrointestinal microflora
exert antimicrobial activity / V. Lievin, I. Peiffer, S. Hudault, F. Rochat, D. Brassart // Gut. - 2000. - № 47. - P. 646 - 652.
91.Biodiversitybased identification and functional characterization of the mannosespecific adhesin of Lactobacillus plantarum / G. Pretzer, J. Snel, D. Molenaar, A.
Wiersma // J. Bacteriol. - 2005. - № 187. - P. 6128 - 6136.
92.Blandino, G. Probiotics: overview of microbiological and immunological characteristics / G. Blandino, D. Fazio, R. Marco // Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2008. - V.6. - № 4. - P. 497 - 508.
93.Blomberg, L. Inhibition of adhesion of Escherichia coli K88 to piglet ileal mucus
by Lactobacillus spp. / L. Blomberg, A. Henriksson, P. L. Conway // Appl. Environ. Microbiol. - 1992. - № 59. - P. 34 - 39.
94.Boirivant, M. The mechanism of action of probiotics / M. Boirivant, W. Strober //
Curr. Opin. Gastroenterol. - 2007. - № 23. - P. 679 - 692.
95.Boman, H.G. Innate immunity and the normal microflora / H.G. Boman // Immunol. Rev. - 2000. - № 173. - P. 5 - 16.
96.Boyle, R. J. The role of probiotics in the management of allergic disease / R.J.
Boyle, M.L.K. Tang // Clin. Exp. Allergy. - 2006. - № 36. - P. 568 - 576.
97.Callewaert, R. Bacteriocin production with Lactobacillus amylovorus DCE 471 is
improved and stabilized by fed-batch fermentation / R. Callewaert, De Vuyst // L.
Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - № 66. - P. 606 - 613.
98.Camilleri, M. Probiotics and irritable bowel syndrome: rationale, putative mechanisms, and evidence of clinical efficacy/ M.Camilleri // J. Clin. Gastroenterol.
- 2006. - № 40. - P. 264 - 269.
111
99.Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment
of Lactobacillus johnsonii La1 to human eneterocyte-like Caco-2 cells / D. Granato, G.E. Bergonzelli, R.D. Pridmore, L. Marvin, M.Rouvet // Appl. Environ.
Microbiol. - 1999. - № 65. - P. 1071 - 1077.
100.Characterization of Lactobacillus from Algerian goat’s milk based on phenotypic, 16S rDNA sequencing and their technological properties / A. Marroki, M.
Zúñiga, M. Kihal, G. Pérez-Martínez // Brazilian Journal of Microbiology. 2011. - № 42. - P. 158 - 171.
101. Chen, C.C. Probiotics and prebiotics: role in clinical disease states / C. C. Chen,
W.A. Walker // Adv. Pediatr. - 2005. - № 52. - Р. 77 - 113.
102. Class IIa bacteriocins: biosynthesis, structure and activity / S. Ennahar, T. Sashihara, K. Sonomoto, A. Ishizaki // FEMS Microbiol. Rev. - 2000. - № 24. P.85 - 106.
103.Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum / M. Kleerebezem, J.
Boekhorst, R. van Kranenburg, D. Molenaar, O.P. Kuipers // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. - 2003. - № 100. - P. 1990 - 1995.
104. Cunliffe, R.N. Antimicrobial peptides in innate intestinal host defence / R.N.
Cunliffe, Y.R. Mahida // Gut. - 2000. - № 47. - P. 16 - 17.
105.Defense factors of vaginal lactobacilli / A. Aroutcheva, D. Gariti, M. Simon, S.
Shott, J. Faro, J.A. Simoes, A. Gurguis, S. Faro // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2001.
- № 185. - P. 375 - 379.
106. Deshpande, G. Probiotics for prevention of necrotising enterocolitis in preterm
neonates with very low birthweight: a systematic review of randomised controlled trials / G. Deshpande, S. Rao, S. Patole // Lancet. - 2007. - № 369. - P.
1614 - 1620.
107. Dietary synbiotics reduce cancer risk factors in polypectomized and colon cancer patients/ J. Rafter, M. Bennett, G. Caderni, Y. Clune, R. Hughes // Am. J.
Clin. Nutr. - 2007. - № 85. - P. 488 - 496.
112
108.Diversity, phylogenetic relationship and antibacterial potential of Bifidobacterium species isolated from raw milk production chain in Abidjan (Côte d'Ivoire) /
S.M. Kouamé-Sina, A. Dadié, K. Makita, D. Grace, M. Dje // African Journal of
Microbiology Research. - 2011. - V. 5. - № 21. - P. 3394 - 3403.
109. Durant, J.A. Short-chain volatile fatty acids modulate the expression of the hilA
and invF genes of Salmonella Typhimurium / J. A. Durant, D. E. Corrier, S. C.
Ricke // J. Food Prot. - 2000. - № 63. - P. 573 - 578.
110.Effect of Bifidobacterium longum ingestion on experimental in salmonellosis in
mice / A.M. Silva, F.H. Barbosa, R. Duarte, L.Q. Vieira, R.M. Arantes,
J.R. Nicoli // J Appl Microbiol. - 2004. - № 97. - P. 29 - 37.
111. Effect of different probiotic preparations on anti-Helicobacter pylori therapyrelated side effects: a parallel group, triple blind, placebo-controlled study / F.
Crеmonini, S. Di Caro, M. Covino, A. Armuzzi, M. Gabrielli, L. Santarelli, E.C.
Nista // Am. J. Gastroenterol. - 2002. - № 97. - P. 2744 - 2749.
112.Effects of four Bifidobacteria on obesity in high-fat diet induced rats / Ya-Ni
Yin, Q. Yu, N. Fu, X.-W. Liu, F.-G. Lu // World J Gastroenterol. - 2010. - July
21. - № 16 (27). - P. 3394 - 3401.
113.Effects of ingesting Lactobacillus- and Bifidobacterium containing yogurt in
subjects with colonized Helicobacter pylori / K.Y. Wang, S.N. Li, C.S. Liu, D.S.
Perng, Y.C. Su, D.C. Wu, C.M. Jan, C.H. Lai, T.N. Wang , W.M. Wang //Am J
Clin Nutr. - 2004. - № 80. - P. 737 - 741.
114. Efficacy of probiotics in prevention of acute diarrhoea: a meta-analysis of
masked, randomised, placebo-controlled trials / S. Sazawal, G. Hiremath, U.
Dhingra, P. Malik, S. Deb, R.E.Black // Lancet Infect. Dis. - 2006. - № 6. - P. 374
- 382.
115. Emerging molecular insights into the interactions between probiotics and the
host intestinal mucosa / P. A. Bron, P. van Baarlen, M. Kleerebezem // Nature reviews. Microbiology. - 2011.
113
116. Ennahar, S. Phylogenetic diversity of lactic acid bacteria associated with paddy
rice silage as determined by 16S ribosomal DNA analysis / S. Ennahar, Y. Cai,
Y. Fujita // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - № 69. - P. 444 - 451.
117. Enterotypes of the human gut microbiome / M. Arumugam, E.D. Harrington,
K.U. Foerstner, J. Raes // Nature. - 2011. - № 473. - P. 174 - 180.
118. Essid, I. Technological and safety properties of Lactobacillus plantarum strains
isolated from a Tunisian traditional salted meat / I. Essid, M. Medin, M. Hassouna // Meat Sci. - 2009. - № 81. - P. 203-208.
119. Evaluation of probiotic characteristics of newly isolated Lactobacillus spp.:
immune modulation and longevity / J. Lee, H.S. Yun, K.W. Cho, S. Oh // Int J
Food Microbiol. - 2011. - № 148 (2). - P. 80 - 6.
120. Evaluation of the antagonistic effect of Lactobacillus acidophilus on clinical
strains of Helicobacter pylori / E Andrzejewska, А. Szkaradkiewicz // Med Dosw
Mikrobiol. - 2007. - № 59 (1). - P. 59 - 64.
121. Falagas, M.E. Probiotics for the treatment of women with bacterial vaginosis /
M. E. Falagas, G. I. Betsi, S. Athanasiou // Clin. Microbiol. Infect. - 2007. - №
13. - P. 657 - 664.
122. FAO/WHO. Evaluation of health and nutritional properties of powder milk and
live lactic acid bacteria/ FAO/WHO // Food and Agriculture Organization of the
United Nations and World Health Organization expert consultation report. Rome, FAO. - 2001.
123. Fedorak, R.N. Probiotics and the management of inflammatory bowel disease
[Text] / R.N. Fedorak, K.L. Madsen // Inflamm. Bowel Dis. - 2004. -№ 10. - P.
286 - 299.
124. Fermentation characteristics of six probiotic strains in soymilk / L. Haiping, L.
Yan, J. Wang, Q. Zhang // Annals Of Microbiology. - 2012.
125. Functional analysis of promoters involved in quorum sensing-based regulation
of baсteriocin production in Lactobacillus / P.A. Risoen, M.B Brurberg, V.G. Eijsink, I.F. Nes // Mol. Microbiol. - 2000. - № 37. - P. 619 - 628.
114
126. Ganz, T. Antimicrobial proteins and peptides in host defense / T. Ganz // Serain. Respir. Infect. - 2001. - № 16. - P. 4 - 10.
127. Genetic diversity of the pln locus among oenological Lactobacillus plantarum
strains / Y. Saenz, B. Rojo-Bezares, L. Navarro, L. Díez, S. Somalo // Int.J.Food
Microbiol. - 2009. - № 134. - P. 176 - 183.
128. Genome-scale analyses of health-promoting bacteria: probiogenomics / M.
Ventura, S. O'Flaherty, M.J. Claesson, F. Turroni, T.R. Klaenhammer // Nature
Rev. Microbiol. - 2009. - Vol. 7. - P. 61 - 71.
129. Genome sequence of Lactobacillus helveticus, an organism distinguished by selective gene loss and insertion sequence element expansion / M. Callanan, P. Kaleta, J. O'Callaghan, O. O'Sullivan, K. Jordan, O. McAuliffe, A. SangradorVegas, L. Slattery, G.F. Fitzgerald // J. Bacteriol. - 2008. - № 190. - P. 727-735.
130. Genomic diversity of cultivable Lactobacillus populations residing in the neonatal and adult gastrointestinal tract / R. Wall, G. Fitzgerald, S. Hussey, T. Ryan,
B. Murphy, P. Ross, C..Stanton // FEMS Microbiol. Ecol. - 2007. - № 59. - P.
127 - 137.
131.Gusils, C. Preliminary studies to design a probiotic for use in swine feed / C.
Gusils, M. Bujazha, S. González // Interciencia. - 2002. - № 27. - P. 409 - 413.
132. Gut Microflora / J.-C. Rambaud, R. Ducluzeau, M. Cooperstock // John Libbey
Eurotext. - Paris. - 2006. - 247 p.
133. H. pylori colocatises with MUC5AC in the human stomach / G.R. Van Den
Brink, K. Tytgat, R.W.M. Van der Hulst, C.M. Van der Loos, A. Einerhand, H.
Buller, J. Dekker // Gut. - 2000. - № 46. - P. 601 - 607.
134. Hancock, R.H. Clinical development of cationic antimicrobial peptides: from
natural to novel antibiotics / R.H. Hancock, A. Patrzykat // Curr. Drug Targets
Tnfect. Disord. - 2002. - № 2. - P. 79 - 83.
135. Hedin, C. Evidence for the use of probiotics and prebiotics in inflammatory
bowel disease: a review of clinical trials / C. Hedin, K. Whelani, J.O. Lindsay //
Proc. Nutr. Soc. - 2007. - № 66. - P. 307 - 315.
115
136. Helander, I.M. Permeability barrier of the gram-negative bacterial outer membrane with special reference to nisin / I.M. Helander, T. Mattila-Sandholm // Int.
J. Food Microbiol. - 2000. - № 60. - P. 153 - 161.
137. Henriksson, A. Isolation of human faecal bifidobacteria which reduce signs of
Salmonella infection when orogastrically dosed to mice / A. Henriksson, P.L.
Conway / J. Appl. Microbiol. - 2001. - № 90. - P. 223 - 228.
138. Hiemstra, P.S. Еpithelial antimicrobial peptides and proteins: their role in host
defence and inflammation / P.S. Hiemstra // Paediatr. Respir. -2001. - Rev. 2. - P.
306 - 310.
139.HPV E6 down-regulation and apoptosis induction of human cervical cancer cells
by a novel lipid-soluble extract (PE) from Pinellia pedatisecta Schott in vitro/
G.L. Li, W. Jiang, Q. Xia, S.H. Chen, X.R. Ge, S.Q. Gui, C.J. Xu // J Ethnopharmacol. - 2010. - № 132. - P. 56 - 64.
140.Hydrogen peroxide production by Lactobacillus johnsonii NCC 533 and its role
in anti-Salmonella activity / R.D. Pridmore, A.C. Pittet, F. Praplan, C.Cavadini
// FEMS Microbiol. Lett. - 2008. - № 283. - P. 210 - 215.
141. In vitro adherence properties of Lactobacillus rhamnosus DR20 and Bifidobacterium lactis DR10 strains and their antagonistic activity against an enterotoxigenic Escherichia coli / P.K. Gopal, J. Prasad, J. Smart, H.S. Gill // Int. J. Food
Microbiol. - 2001. - № 67. - P. 207 - 216.
142. In Vitro and In Vivo Inhibition of Helicobacter pylori by Lactobacillus casei
Strain Shirota / D. Sgouras, P. Maragkoudakis, K. Petraki, B. Martinez-Gonzalez,
E. Eriotou // Applied and Environmental Microbiology, January. - 2004. - Vol.
70. - № 1. - P. 518 - 526.
143. In vitro evaluation of Lactobacillus gasseri strains of infant origin on adhesion
and aggregation of specific pathogens / C.L. Ferreira, L. Grześkowiak, M.C. Collado, S. Salminen // J Food Prot. - 2011. - № 74 (9). - P. 1482 - 7.
116
144. Inactivation of Salmonella Enteritidis strains by combination of high hydrostatic pressure and nisin / J. Lee, G.Kaletunç // Int J Food Microbiol. - 2010. - № 140
(1). - P. 49 - 56.
145. Influence of intensive and extensive breeding on lactic acid bacteria isolated
from Gallus gallus domesticus ceca / M.R. Souza, J.L. Moreira, F.H. Barbosa,
M.M. Cerqueira, A.C. Nunes, J.R. Nicoli // Vet Microbiol. - 2007. - № 120 (1-2).
- P. 142 - 50.
146. Inhibition of adhesion of enteroinvasive pathogens to human intestinal Caco-2
cells by Lactobacillus acidophilus strain LB decreases bacterial invasion / M.-H.
Coconnier, M.F. Bernet, S. Kernéis, G. Chauvière, Fourniat J, Servin AL. //
FEMS Microbiol. Lett. - 1993. - № 110. - P. 299 - 306.
147. Inhibition of binding of Helicobacter pylori to the glycolipid receptors by probiotic Lactobacillus reuteri / T. Mukai, T. Asasaka , E. Sato, K. Mori, M. Matsumoto // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2002. - № 32. - P.105 - 110.
148. Inhibition of in vitro growth of Shiga toxin-producing Escherichia coli
O157:H7 by probiotic Lactobacillus strains due to production of lactic acid / M.
Ogawa, K. Shimizu, K. Nomoto, R. Tanaka, T. Hamabata, S. Yamasaki, T. Takeda, Y. Takeda // Int. J. Food Microbiol. - 2001. - № 68. - P. 135 - 140.
149.Interactions of macrophages with probiotic bacteria lead to increased antiviral
response against vesicular stomatitis virus / M. Ivec, T. Botić, S. Koren, M. Jakobsen, H. Weingartl, A. Cencic // Antiviral Res. - 2007. - № 75. - P. 266 - 274.
150. Intestinal stem cells and epithelial-mesenchymal interactions in the crypt and
stem cell niche / A. Shaker, D.C. Rubin // Transl Res. - 2010. - № 156 (3). – P.
180 - 7.
151. Isolauri, E. Probiotics: a role in the treatment of intestinal infection and inflammation? / E. Isolauri, P.V. Kirjavaiuen, S. Salminen // Gut. - 2002. - № 50. Suppl. 3. - P. III54 - III59.
152.Jagtar, S. Classification, regulatory acts and applications of nutraceuticals for
health / S. Jagtar, S. Shweta // Int J Pharm Biol Sci. - 2012. - № 2. - P. 177 - 187.
117
153. Kaboosi, H. Antibacterial effects of probiotics isolated from yoghurts against
some common bacterial pathogens / H. Kaboosi // African Journal of Microbiology Research. - 2011. - Vol. 5 (25). - P. 4363 - 4367.
154. Kirchgatterer, A. Natural therapy instead of chemistry? Probiotics in gastroenterology / A. Kirchgatterer, P. Knoflach // Acta Med. Austriaca. - 2004. - № 31
(1). - Р. 13 - 17.
155. Klaenhammer, T.R. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria /
T. R. Klaenhammer // FEMS Microbiol. Rev. - 1993. - № 12. - P. 39 - 85.
156. Koczulla, A.R. Antimicrobial peptides: current status and therapeutic potential
/ A.R. Koczulla, R. Bals // Drugs. - 2003. - № 63. - P. 389 - 406.
157.Lactic acid bacteria secrete metabolites retaining anti-inflammatory properties
after intestinal transport / S. Menard, C. Candalh, J.C. Bambou, K. Terpend //
Gut. - 2004. - № 53. - P. 821 - 828.
158. Lactic acid permeabilizes gram-negative bacteria by disrupting the outer membrane / H.L. Alakomi, E. Skyttä, M. Saarela, T. Mattila-Sandholm, K. Latva-Kala
// Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - № 66. - P. 2001 - 2005.
159. Lactobacillus delbrueckii subsp lactis strain CIDCA 133 inhibits nitrate reductase activity of Escherichia coli / A.A. Hugo, G.L. De Antoni, P.F. Pérez // Int J
Food Microbiol. - 2006. - № 111 (3). - P. 191 - 6.
160.Lactobacillus GG effect in increasing INF-gamma production in infants with
cow's milk allergy / E. Pohjavuori, M. Viljanen, R. Korpela, M. Kuitunen, M.
Tiittanen, O. Vaarala, E.Savilahti // J Allergy Clin Immunol. - 2004. - № 114. P. 131 - 136.
161. Lactobacillus reuteri ATCC 55730 and L22 display probiotic potential in vitro
and protect against Salmonella-induced pullorum disease in a chick model of infection / D. Zhang, R. Li , J. Li // Res Vet Sci. - 2011.
162. Lactobacillus strains and vaginal ecology / P. Cadieux, J. Burton, G. Gardiner,
I. Braunstein, A.W. Bruce, C.Y. Kang, G. Reid // JAMA. - 2002. - № 287. - P.
1940 - 1941.
118
163.Lane, D.J. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic Acid Techniques in Bacterial
Systematics / D.J. Lane. - Chichester: Wiley. - 1991. - P. 115 - 175.
164. Leroy, F.A combined model to predict the functionality of the bactcriocinproducing Lactobacillus sakei strain CTC 494 / F. Leroy, L.De Vuyst // Appl.
Environ. Microbiol. - 2003. - № 69. - P. 1093 - 1099.
165. Liong, M.T. Safety of probiotics: translocation and infection / M.T. Liong //
Nutr. Rev. - 2008. - № 66. - P. 192 - 202.
166. Lorea, G.L. Characterization of the protein synthesis dependent adaptive acid
tolerance response in Lactobacillus acidophilus / G.L. Lorea, G.F. de Valdez, A.
Ljungh // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. - 2002. - № 4. - P. 525 - 532.
167. Lysate of probiotic Lactobacillus casei DN-114 001 ameliorates colitis by
strengthening the gut barrier function and changing the gut microenvironment / Z.
Zakostelska, M. Kverka, K. Klimesova, P. Rossmann, J. Mrazek, J. Kopecny, M.
Hornova, D. Srutkova // PLoS One. - 2011. - № 6 (11).
168. Marco, M.L. Towards understanding molecular modes of probiotic action /
M.L. Marco, S. Pavan, M. Kleerebezem // Curr. Opin. Biotechnol. -2006. - № 17.
- P. 204 - 210.
169. Mcauliffe, O. Luntibiotics: structure, biosynthesis and mode of action / O.
Mcauliffe, R.P. Ross, C. Hill // FEMS Microbiol. Rev. - 2001. - № 25. - P. 285 308.
170. Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response / R. Medzhitov // Nature. - 2007. - № 449. - P. 819 - 826.
171.Mode of action of acidocin D20079, a bacteriocin produced by the potential
probiotic strain, Lactobacillus acidophilus DSM 20079 / S. Deraz, E. N.
Karlsson, A. A. Khalil, B. Mattiasson // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. - 2007. - №
34. - P. 373 - 379.
172. Modeling growth and baeteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE
471 in response to temperature and pH values used for sourdough fermentations /
119
W. Messens, P. Neysens, W. Vansieleghem, J. Vanderhoeven, L. De Vuyst //
Appl. Environ. Microbiol. - 2002. - № 68. - P. 1431 - 1435.
173.Natural history of cervical human papillomavirus infection in young women: a
longitudinal cohort study / C.B. Woodman, S. Collins, H. Winter, A. Bailey, J.
Ellis, P. Prior // Lancet. - 2001. - № 357. - P. 1831 - 1836.
174. Nes, I.F. Class II antimicrobial peptides from lactic acid bacteria / I.F. Nes, H.
Holo // Biopolymers. - 2000. - № 55. - P. 50 - 61.
175. New methods for selecting and evaluating probiotics / M. Gueimond, S. Salminen // Dig Liver Dis. - 2006. - № 38 (suppl 2). - P. 242 - 247.
176. Neysens, P. Effect of sodium chloride on growth and baeteriocin produc-tion by
Lactobacillus amvlovorw DCE 471 / P. Neysens, W. Messens, L. De Vuyst // Int.
J. Food Microbiol. - 2003. - № 88. - P. 29 - 39.
177. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms / K.E. Pavia, S.A. Spinella, D.E. Elmore // Biochim Biophys Acta. 2011.
178.Novel Probiotic Bifidobacterium longum subsp.infantis CECT 7210 Strain Active against Rotavirus Infections / J.A. Moreno Muñoz, E. Chenoll, B. Casinos, E.
Bataller, D. Ramón, S. Genovés // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. - V. 77. - №
24. - P. 8775 - 8783.
179. Optimum bacteriocin production by Lactobacillus plantarum 17.2b requires absence of NaCl and apparently follows a mixed metabolite kinetics / A. Delgado,
F.N. Arroyo López, D. Brito, C. Peres, P. Fevereiro, A.Garrido-Fernández // J
Biotechnol. - 2007. - № 15. - P. 193 - 201.
180.Oral feeding of Bifidobacterium bifidum (BGN4) prevents CD4(+) CD45RB
(high) T cell-mediated inflammatory bowel disease by inhibition of disordered T
cell activation / N. Kim, J. Kunisawa, M.N. Kweon, G. Eog, H. Kiyono // Clin
Immunol. - 2007. - Apr. - 123 (1). - P. 30 - 39.
120
181. Ouwehand, A.C. Probiolics: an overview of beneficial effects / A.C. Ouwchand, S. Salmincn, E. Isolauri // Antonie Van Leeuwenhoek. - 2002. - № 82. - P.
279 - 289.
182.Partial purification and characterization of two bacteriocin-like inhibitory substances produced by bifidobacteria / A. Zouhir, E. Kheadr, I. Fliss, J. Ben Hamida
// African Journal of Microbiology Research. - 2011. - V. 5 (4). - P. 411 - 418.
183.Patterns of cytokine induction by gram-positive and gram-negative probiotic
bacteria / M.L. Cross, A. Ganner, D. Teilab, L.M. Fray // FEMS Immunol Med
Microbiol. - 2004. - № 42. - P. 173 - 180.
184. Probiotic activities of Lactobacillus casei rhamnosus: in vitro adherence to intestinal cells and antimicrobial properties / C. Forestier, C. De Champs, C. Vatoux, B. Joly // Res. Microbiol. - 2001. - № 152. - P. 167 - 173.
185. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised,
double-blind, placebo-controlled trial / M.G.H. Besselink, H.C. van Santvoort, E.
Buskens, M.A. Boermeester, H. van Goor, H.M. Timmerman, V.B. Nieuwenhuijs
// Lancet. - 2008. - № 371. - P. 1246.
186. Probiotics and Helicobacter pylori eradication / F. Canducci, F. Cremonini, A.
Armuzzi, S. Di Caro, M. Gabrielli, L. Santarelli, E. Nista // Dig. Liver Dis. 2002. - № 34. - Suppl. 2. - P.SSI - 83 p.
187. Probiotics: delineation of prophylactic and therapeutic benefits / I.P. Kaur, A.
Kuhad, A. Garg, K. Chopra // J. Med. Food. - 2009. - V. 12. - № 2. - P. 219 - 235.
188. Probiotics: from myth to reality: Demonstration of functionality in animal models of disease and in human clinical trials / C. Dunne, L. Murphy, S. Flynn, L.
O'Mahony, S. O'Halloran, M. Feeney, D. Morrissey // Antonie Van Leeuwenhoek. - 1999. - № 76. - P. 279 - 292.
189. Probiotics in food: their potential to impact human health / M.E. Sanders, G.R.
Gibson, H.S. Gill, F. Guarner // Council for agricultural science and technology
(CAST). - 2007.
121
190.Probiotics inhibit nuclear factor-kappa B and induce heat shock proteins in colonic epithelial cells through proteasome inhibition / E.O. Petrof, K. Kojima, M.J.
Ropeleski, M.W. Musch, Y. Tao, C. De Simone, E.B. Chang. // Gastroenterology. - 2004. - № 127. - P. 1474 - 1487.
191.Probiotics inhibit TNFa-induced interleukin-8 secretion of HT29 cells / A.P.
Bai, Q. Ouyang, W. Zhang, C.H. Wang // World J Gastroenterol. - 2004. - № 10.
- P. 455 - 457.
192.Probiotics modulate inflammatory cytokine secretion from inflamed mucosa in
active ulcerative colitis / A.P. Bai, Q. Ouyang, W. Zhang, C.H. Wang // Int J
Clin Pract. - 2006. - № 60. - P. 284 - 288.
193. Production kinetics of acidophilin 801, a baeteriocin produced by Lactobacillus
acidophilus IBB 801 / M. Zamfir, R. Callewaert, P.C. Cornea, L. De Vuyst //
FEMS Microbiol. Lett. - 2000. - № 190. - P. 305 - 308.
194. Production of antibacterial substances by bifidobacterial isolates from infant
stool active against Listeria monocytogenes / R. Touré, E. Kheadr, C. Lacroix, O.
Moroni // J. Appl. Microbiol. - 2003. - № 95. - P. 1058 - 1069.
195.Production of antimicrobial substances by lactic acid bacteria I: determination of
hydrogen peroxide / M.S. Tomás, M.C. Otero, V. Ocana, M.E. Nader-Macias //
Methods Mol Biol. - 2004. - № 268. - P. 337 - 346.
196. Production of class II bacteriocins by lactic acid bacteria; an example of biological warfare and communication / V.G.H. Eijsink, L. Axelsson, D.B. Diep, L.S.
Havarstein, H. Holo, I.F. Nes // Antonie van Leeuwenhoek. - 2002. - № 81. - P.
639 - 654.
197. Rauch, M. The potential for probiotic manipulation of the gastrointestinal microbiome / M. Rauch, S.V. Lynch // Current Opinion in Biotechnology. - 2011. № 23. - P. 1-10.
198. Regulation of bacteriocin production in Lactobacillus plantarum depends on a
conserved promoter arrangement with consensus binding sequence / P.A. Risoen,
122
O. Johnsborg, D.B. Diep, L. Hamoen, G. Venema, I.F. Nes // Mol. Genet. Genomics. - 2001. - № 265. - P. 198 - 206.
199. Reid, G. The potential role of probiotics in pediatric urology / G. Reid // J. Urol.
- 2002. - № 168. - P. 1512 - 1517.
200. Rojas, M. Colonization by lactobacilli of piglet small intestinal mucus / M. Rojas, P.L. Conway // J. Appl. Bact. - 1996. - № 81. - P. 474-480.
201. Ruby, J. Nature of Symbiosis in Oral Disease / J. Ruby, M. Goldner // Journal
of Dental Research. - 2007. - Vol. 86. - № 1. - P. 8 - 11.
202. Sablon, R. Antimicrobial peptides of lactic acid bacteria: mode of action, genetics and biosynthesis / R. Sablon, B. Contreras, E. Vandamme // Adv. Biochem.
Eng. Biotcchnol. - 2000. - № 68. - P. 21 - 60.
203. Safety and persistence of orally administered human Lactobacillus sp. strains in
healthy adults / P. Hütt, P. Kõll , J. Stsepetova, B. Alvarez, R. Mändar, K. KroghAndersen, H. Marcotte // Benef Microbes. - 2011. -№ 2 (1). - P. 79 - 90.
204. Sallivan, A. Probiotics in human infections / A. Sullivan, C.E. Nord // J. Antimicrob. Chemother. - 2002. - № 50. - P. 625 - 627.
205. Sallivan, A. The place of probiotics in human intestinal infections / A. Sullivan,
C.E. Nord // Int. J. Antimicrob. Agents. - 2002. - № 20. - P. 313 - 319.
206. Savage, D.C. Microbial ecology of the gastrointestinal tract / D.C. Savage //
Annu. Rev. Microbiol. - 1977. - 3 K. - P. 107 - 133.
207.Screening of autochthonous Lactobacillus species from Algerian raw goats’
milk for the production of bacteriocin-like compounds against Staphylococcus
aureus / M. Anas, B.A. Zinedine, H.A. Rizk, H.J. Eddine // African Journal of
Biotechnology. - 2012. - Vol. 11 (20). - P. 4595 - 4607.
208.Secreted bioactive factors from Bifidobacterium infantis enhance epithelial cell
barrier function / J.B. Ewaschuk, H. Diaz, L. Meddings, B. Diederichs, A. Dmytrash, J. Backer, M. Looijer-van Langen, K.L.Madsen / Am J Physiol Gastrointest
Liver Physiol. - 2008. - № 295. - P.1025 - 1034.
123
209. Servin, A.L. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against
microbial pathogens / A.L. Servin // FEMS Microbiol. Rev. - 2004. - № 28. - P.
405 - 440.
210. Shai, Y. Mode of action of membrane active antimicrobial peptides / Y. Shai //
Biopolyificrs. - 2002. - № 66. - P. 236-248.
211. Shanahan, F. Probiotics: a perspective on problems and pitfalls / F. Shanahan //
Scand. J. Gastroenterol. Suppl. - 2003. - P. 34 - 36.
212. Sitaram, N. The therapeutic potential of host-defense antimicrobial peptides / N.
Sitaram, R. Nagaraj // Curr. Drug Targets. - 2002. - № 3. - P. 259 - 267.
213.St Amant, D.C. Inhibition of Neisseria gonorrhoeae by Lactobacillus species
thai arc commonly isolated from the female genital tract / D.C. St Amant, I.E.
Valentin-Bon, A.E. ami Jerse // Infect. Immun. - 2002. - № 70. - P. 7169 - 7171.
214. Stamatova, I.V. Probiotic activity of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
in the oral cavity / I.V. Stamatova // An in vitro study. - 2010.
215. Strong antimicrobial activity of Lactobacillus rhamnosus GG against Salmonella typhimurium is due to accumulation of lactic acid / S.C.J. De Keersmaecker,
L.A. Tine, J.D. Verhoeven, K. Marchal, J. Vanderleyden // FEMS Microbiol.
Lett. - 2006. - № 259. - P. 89 - 96.
216.Supernatant from bifidobacterium differentially modulates transduction signaling pathways for biological functions of human dendritic cells / C. Hoarau, L.
Martin, D. Faugaret, C. Baron, A. Dauba // PLoS One. - 2008. - №3. - 2753 p.
217.Supernatant of Bifidobacterium breve induces dendritic cell maturation, activation and survival through a Toll-like receptor 2 pathway / C. Hoarau, L. Martin,
D. Faugaret, C. Baron, A. Dauba //J Allergy Clin Immunol. - 2006. - № 117. - P.
696 - 702.
218.Surface characterization and adhesive properties of Bifidobacteria / R. Bibiloni,
P.F. Pérez, G.L Garrote, E.A Disalvo, G.L. De Antoni // Methods Enzymol. 2001. - № 336. - P. 411 - 427.
124
219. Susan, R. Lactobacillus hordei sp. nov., a bacteriocinogenic strain isolated from
malted barley / R. Susan, C. Canchaya, D. van Sinderen // International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology. - 2008. - Vol. 58. - № 9. - P. 2013 2017.
220. Tennyson, C.A. Microecology, obesity and probiotics / C.A. Tennyson, G.
Friedman // Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. - 2008. - V. 15. - № 5. - P.
422 - 427.
221. Tuomola, E.M. Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus strains to
Caco-2 cell cultures / E.M. Tuomola, S.J. Salminen // Int. J. Food Microbiol. 1998. - № 41. - P.45 - 51.
222. Van Dе Guchte, M. Production of growth-inhibiting factors by Lactobacillus
delbrueckii / M. Van De Guchte, S.D. Ehrlich, E. Magiiin // J. Appl. Microbiol. 2001. - № 91. - P. 147 - 153.
223. Zasloff, M. Antimicrobial peptides in health and disease / M. Zasloff // N. Engl.
J. Med. - 2002. - № 347. - P. 1199 - 1200.
224.Zinedine, A. Isolation and Characterization of Strains of Bifidobacteria with
Probiotic proprieties In vitro / A. Zinedine, M. Faid // World Journal of Dairy &
Food Sciences. - 2007. - № 2 (1). - P. 28 - 34.
125
ПРИЛОЖЕНИЕ
Анкета для опроса потенциальных доноров микроорганизмов
Пол________________
Фамилия______________________ Для женщин – девичья фамилия__________________
Имя_________________________ Отчество _____________________________________
Год рождения __________________ Национальность ______________________________
Место рождения (область, р-н, город, село) ______________________________________
Место проживания (город РФ) _________________________________________________
С какого времени проживаете _________________________________________________
Наличие острых и хронических заболеваний (полость рта, ЖКТ, мочеполовой систем и
др.) ______________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
Аллергия (если есть, то с какого возраста и на что)________________________________
___________________________________________________________________________
Сахарный диабет (если есть, то какого типа и с какого возраста) ____________________
__________________________________________________________________________
Принимал ли антибиотики или пробиотики в последние 7 суток: ДА или НЕТ
Конституция: рост _________ вес ________ Переносимость молока: ДА или НЕТ
Характер принимаемой пищи (вегетарианство, смешанной) ________________________
Была ли операция по поводу аппендицита: ДА или НЕТ
__________________________________________________________________________
Все гены, которые Вы имеете, унаследованы от Ваших родителей, а их гены – от их родителей. Укажите, пожалуйста, сведения о них:
Предки
Год
рождения
+ Место рождения
Национальность
(степень родства) наличие хр. забол-ий
Ваша мать
Ваша бабка
матери
по
Ваш дед по матери
Ваш отец
Ваша
отцу
бабка
по
Ваш дед по отцу
Все личные данные будут доступны только специалисту, проводящему исследование. Результаты исследования будут представлены в анонимной форме.
Согласен (на) на использование моего образца кала в анонимном популяционногенетическом исследовании ______________________________________ (Дата/Подпись)