получение и исследование цитотоксических свойств

Биология
Вестник Нижегородского
университета
им.
Н.И. Лобачевского,
2014,
№ 2 (1), с. 122–126
Е.А. Малеханова,
Т.А.
Здобнова,
А.А. Брилкина
и др.
122
УДК 577.27
ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОТОКСИНА,
СПЕЦИФИЧНОГО К РЕЦЕПТОРУ ErbB2,
НА ОСНОВЕ ПСЕВДОМОНАДНОГО ЭКЗОТОКСИНА А
 2014 г.
Е.А. Малеханова, Т.А. Здобнова, А.А. Брилкина,
Н.Ю. Шилягина, И.В. Балалаева, С.М. Деев
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
malehanova@mail.ru
Поступила в редакцию 07.11.2013
Получен рекомбинантный иммунотоксин на основе фрагмента псевдомонадного экзотоксина А и
антитела 4D5 формата scFv, специфичного к рецептору ErbB2. Показано сохранение аффинности антитела в составе рекомбинантного белка к рецептору ErbB2. Оценена цитотоксичность полученного иммунотоксина на линиях клеток с различным уровнем экспрессии ErbB2. Результаты свидетельствуют о
высокой специфичности и эффективности действия иммунотоксина в отношении линий опухолевых клеток, характеризующихся экспрессией поверхностного онкомаркера ErbB2.
Ключевые слова: рекомбинантный иммунотоксин, антитела формата scFv, псевдомонадный экзотоксин А, рецептор ErbB2, цитотоксичность.
Введение
Поиск новых терапевтических агентов для
лечения опухолевых заболеваний – одна из
важнейших задач современной биологии и медицины. Развитие методов молекулярной диагностики опухолей и выявление целого ряда
специфических маркеров, характерных для того
или иного типа опухолевых клеток, сделало
возможной широкую реализацию идеи «магической пули»: использование препаратов, способных избирательно поражать очаги заболевания в организме человека. В рамках этого подхода в последние годы активно ведется разработка новых противоопухолевых терапевтических агентов – иммунотоксинов [1].
Иммунотоксины представляют собой бифункциональные молекулярные конструкции,
способные, во-первых, специфически связываться с клетками-мишенями, во-вторых – ингибировать их рост. Наиболее оптимальным
строением иммунотоксинов является такое, при
котором эти функции выполняются двумя разными структурными модулями – направляющим и эффекторным (токсическим). Первоначально иммунотоксины получали с использованием методов химической конъюгации направляющего и токсического модулей. Однако ряд
недостатков этого подхода (гетерогенность получаемых комплексов, сложность их синтеза,
потеря функциональных свойств составляющих
модулей) обусловил широкое распространение
генно-инженерных технологий получения ре-
комбинантных иммунотоксинов – белков слияния токсина с направляющим модулем. Такие
иммунотоксины легко нарабатываются в бактериальных продуцентах, отличаются постоянством состава, в достаточной мере сохраняют
свойства отдельных модулей (специфичность и
токсичность) и более стабильны [2].
Одной из наиболее клинически значимых
мишеней для направленной терапии опухолей
является рецептор ErbB2 – член семейства рецепторов эпидермального фактора роста человека. Данный рецептор играет важную роль в
контроле пролиферации и дифференцировки
клеток, в то время как его нерегулируемая экспрессия (гиперэкспрессия) сопровождает развитие многих опухолей и ассоциируется с повышенным риском метастазирования и устойчивостью к химиотерапии [3].
Среди широкого спектра существующих на
сегодняшний день иммунотоксинов и подходов
к их конструированию особый интерес вызывают соединения на основе бактериальных токсинов, таких как дифтерийный или псевдомонадный экзотоксины. Модульная структура
этих экзотоксинов и соответствующий механизм действия, связанный с отдельными структурными модулями, делают их удобными для
различных модификаций, приводящих к изменению направленности их действия или корректировке уровня их токсичности. Замена исходного рецептор-узнающего домена бактериального экзотоксина на другой направляющий модуль белковой природы позволяет легко созда-
Получение и исследование цитотоксических свойств рекомбинантного иммунотоксина
вать токсины с одинаковым цитотоксическим
действием, но с разной специфичностью [4].
В данной работе описан новый рекомбинантный иммунотоксин на основе псевдомонадного экзотоксина А, в котором природный
рецептор-связывающий домен экзотоксина заменен на антитело 4D5scFv [5], специфичное к
рецептору ErbB2 и хорошо зарекомендовавшее
себя в качестве направляющего модуля для создания диагностических агентов [6–10] иммуноРНКаз и иммунофотосенсибилизаторов [11–13].
Экспериментальная часть
Наработка, выделение и очистка иммунотоксина
Для наработки рекомбинантного иммунотоксина 4D5scFv-ETA в бактериальных продуцентах клетки Escherichia coli (E. coli) штамма
BL21(DE3) трансформировали плазмидой pIG64D5scFv-ETA, содержащей ген соответствующего белка под контролем lac-промотора. Свежетрансформированные бактерии культивировали в среде YTPS (1% дрожжевой экстракт, 1%
триптон, 0.5% NaCl, 80 мМ K2HPO4, 20 мМ
KH2PO4) при 28оС до достижения оптической
плотности культуры на 550 нм 0.6 оптических
единиц и индуцировали lac-промотор добавлением изопропил-1-тио-β-D-галактозида (ИПТГ)
до конечной концентрации 0.5 мМ. Затем бактерии культивировали при интенсивном перемешивании в течение 12 ч при температуре
28оС и осаждали центрифугированием.
Осадок бактерий, содержащий целевой белок 4D5scFv-ETA, ресуспендировали в буфере
УЗ (20 мМ трис-HCl, 10 мМ KH2PO4, 10 мМ
ЭДТА, 100 мМ NaCl, pH 8). Клетки лизировали
с помощью ультразвукового дезинтегратора,
полученный клеточный экстракт центрифугировали при 18500 g 10 мин при 4оС.
Надосадочную жидкость, содержащую растворимую форму целевого белка 4D5scFv-ETA,
очищали на колонке «HisTrap FF 1 ml» (GE
Healthcare) в нативных условиях согласно инструкциям производителя. Иммобилизованный
на колонке белок элюировали градиентом имидазола от 0 до 200 мМ. Собранные фракции,
содержащие нужный белок, затем очищали методом ионообменной хроматографии на колонке «Q Sepharose FF 1 ml» (GE Healthcare), согласно инструкциям производителя; целевой
белок элюировали градиентом NaCl от 25 до
500 мМ. Фракции, содержащие целевой белок,
анализировали с помощью электрофореза в 12%
ПААГ в денатурирующих условиях согласно
стандартному протоколу.
Определение константы связывания
Константу
связывания
иммунотоксина
4D5scFv-ETA с рецептором ErbB2 определяли с
123
помощью иммуноферментного анализа (ИФА)
по методике, разработанной J.D. Beatty и соавторами [14]. В качестве антигена использовали
рекомбинантный белок р185HER2-ECD, представляющий собой фрагмент внешнего домена рецептора ErbB2, сорбированный на 96-луночный
планшет в двух концентрациях, отличающихся
в два раза – 8 и 16 нг на лунку. Связавшийся с
рецептором иммунотоксин проявляли с помощью кроличьих анти-4D5scFv антител, полученных в Лаборатории молекулярной иммунологии ИБХ РАН, и козьих анти-кроличьих антител, конъюгированных с пероксидазой хрена
(Pierce). В качестве субстрата использовали
oрто-фенилендиаминдигидрохлорид
(ОФД).
Оптическое поглощение измеряли при 492 нм с
использованием планшетного спектрофотометра Synergy Mx (BioTek).
По результатам ИФА стоили графики зависимости оптической плотности от концентрации иммунотоксина при определенной концентрации сорбированного в лунке антигена. Константу связывания вычисляли по формуле Ка =
= 1/2(2[IT']–[IT]), где Ка – константа связывания; [IT] – молярная концентрация иммунотоксина в лунке, соответствующая OD50 на графике
для концентрации антигена 16 нг/лун.; [IT'] –
молярная концентрация иммунотоксина в лунке, соответствующая OD'50 на графике для концентрации антигена 8 нг/лун. За OD100 (OD'100)
при этом принимается значение оптической
плотности на уровне верхнего плато. Константу
диссоциации (Кd) вычисляли по формуле
Кd = 1/Ка.
Определение цитотоксичности иммунотоксина
В работе использовали клетки аденокарциномы молочной железы человека линии SKBR3 (номер по каталогу ATCC – HTB-30), гиперэкспрессирующие рецептор ErbB2 ( ~ 1106 молекул на клетку [15]), а также клетки карциномы шейки матки человека HeLa (номер по каталогу ATCC – CCL-2) с нормальным уровнем
экспрессии ErbB2 ( ~ 1104 молекул на клетку
[16]) и контрольные клетки яичника китайского
хомячка CHO (номер по каталогу ATCC – CCL61), не экспрессирующие данный рецептор [17].
Клетки выращивали в культуральных флаконах
объемом 50 см3 в среде RPMI-1640 (HyClone) с
10% эмбриональной сывороткой теленка (HyClone) и 2 мМ глутамином (ПанЭко). Клетки
культивировали при 37оС в атмосфере с 5%
СО2. Для предотвращения ферментативного
удаления поверхностных рецепторов при субкультивации снятие клеток с подложки проводили раствором Версена (ПанЭко), без использования трипсина. Для проведения эксперимента
124
Е.А. Малеханова, Т.А. Здобнова, А.А. Брилкина и др.
Рис. 1. Схема строения иммунотоксина 4D5scFvETA. VL, VH – легкая и тяжелая цепи антитела
4D5scFv соответственно; ETA – фрагмент экзотоксина А из Pseudomonas aeruginosa; НННННН – олигогистидиновая последовательность
по оценке цитотоксичности полученного в работе
иммунотоксина суспензию клеток с концентрацией 2104 кл/мл высевали на 96-луночные планшеты и культивировали в течение ночи.
Для определения цитотоксичности иммунотоксина из лунок удаляли культуральную среду,
клетки промывали буфером PBS (ПанЭко). Затем клетки инкубировали в течение 40 мин при
4оС с иммунотоксином в различной концентрации (от 1 пМ до 1 нМ) в буфере PBS. По окончании времени инкубации несвязавшийся иммунотоксин отмывали PBS, к клеткам добавляли ростовую среду и инкубировали их при 37оС
в атмосфере с 5% СО2 в течение 72 ч. Выживаемость клеток после их обработки иммунотоксином оценивали с помощью стандартного МТТтеста [18]. Выполняли три независимых эксперимента по три повторности в каждом.
Результаты и их обсуждение
Рекомбинантный иммунотоксин 4D5scFvETA представляет собой белок, в котором антитело 4D5scFv (фрагмент моноклонального антитела 4D5, известного также как Trastuzumab,
или Herceptin) соединено с фрагментом экзотоксина А из Pseudomonas aeruginosa (252–613
а.о.) в единую полипептидную цепь с помощью
гибкого линкера из 10 аминокислот. Этот линкер в расправленной конформации имеет длину
2.5–2.7 нм, что позволяет доменам белка не испытывать стерических затруднений и сохранять
свои функциональные свойства. На С-конце
молекула иммунотоксина содержит олигогистидиновую последовательность, облегчающую
выделение этого белка из клеток E. сoli (рис. 1).
Полученный препарат очищенного белка был
гомогенен и не содержал примесей, детектируемых с помощью электрофореза при нанесении
Рис. 2. Электрофорез в 12% ПААГ очищенного рекомбинантного иммунотоксина 4D5scFv-ETA. P –
очищенный 4D5scFv-ETA, М – белковый маркер
молекулярного веса
образца с перегрузом (рис. 2). Молекулярная масса полученного белка 4D5scFv-ETA по результатам электрофореза, с учетом влияния на скорость
движения белка олигогистидиновой последовательности, совпадала с расчетной (69 кДа).
Результаты ИФА показали, что полученный
иммунотоксин специфически связывается с очищенным рекомбинантным фрагментом внешнего
домена рецептора ErbB2 (рис. 3). Константа диссоциации иммунотоксина составила около 20.2
нМ, что сравнимо с константой диссоциации свободного антитела 4D5scFv (5.2 нМ) [19].
Оценка цитотоксического эффекта 4D5scFvETA была проведена на линиях эукариотических клеток с различным уровнем экспрессии
рецептора ErbB2. Было показано, что полученный ErbB2-специфичный иммунотоксин не оказывает влияния на жизнеспособность ErbB2отрицательных клеток CHO (рис. 4, квадрат),
при этом значительно снижая жизнеспособность ErbB2-положительных клеток линий
SKBR-3 (рис. 4, треугольник, пунктир) и HeLa
(рис. 4, круг, сплошная линия). Концентрации
иммунотоксина, уменьшающие жизнеспособность клеток в 2 раза относительно контроля
(ИК50), для клеток с нормальным уровнем экспрессии рецептора (HeLa) и его гиперэкпрессией (SKBR-3) составили 4.3 и 2.2 нМ соответственно. Следует отметить, что даже при кратковременной экспозиции (40 мин) токсическое
действие 4D5scFv-ETA для клеток с более высоким уровнем экспрессии рецептора ErbB2
было более выраженным.
Выводы и заключение
В работе получен новый рекомбинантный
иммунотоксин, специфичный к рецептору
ErbB2 – члену семейства рецепторов эпидер-
Получение и исследование цитотоксических свойств рекомбинантного иммунотоксина
Рис. 3. Результаты иммуноферментного анализа взаимодействия полученного иммунотоксина 4D5scFv-ETA с
антигеном p185HER2-ECD, сорбированным на подложку в
двух концентрациях – 16 нг/лун. (сплошная линия, ■) и 8
нг/лун. (пунктирная линия, ●). OD100 (OD'100) – оптическая
плотность, соответствующая уровню верхнего плато на
графике для концентрации антигена 16 нг/лун. (8 нг/лун.);
OD50 (OD'50) – оптическая плотность, соответствующая
точке перегиба на графике для концентрации антигена 16
нг/лун (8 нг/лун.)
мального фактора роста, являющемуся клинически важным онкомаркером и эффективной
мишенью для направленной (таргетной) терапии опухолей. Белковая природа обоих составляющих модулей этого иммунотоксина – направляющего (антитело 4D5scFv) и токсического
(фрагмент псеводомонадного экзотоксина А) позволила объединить эти модули без потери их
функциональных свойств. Полученный рекомбинантный иммунотоксин 4D5scFv-ETA ингибирует
жизнеспособность опухолевых клеток с экспрессией рецептора ErbB2 и является потенциальным
противоопухолевым агентом.
Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (соглашение № 14.B37.21.1113) и РФФИ (проекты № 12-0431322, № 12-04-3313012 и № 13-04-40228-Н).
Список литературы
1. Sharkey R.M., Goldenberg D.M. // CA Cancer J.
Clin. 2006. V. 56. P. 226–243.
2. Dosio F., Brusa P., Cattel L. // Toxins. 2011. V. 3.
P. 848–883.
3. Поляновский О.Л., Лебеденко Е.Н., Деев С.М.
// Биохимия. 2011. Т. 77. С. 289–311.
4. Weldon J.E., Pastan I. // FEBS J. 2011. V. 278.
P. 4683–4700.
5. Willuda J., Honegger A., Waibel R. et al. // Cancer
Res. 1999. V. 59. P. 5758–5767.
125
Рис. 4. Кривые дозовой зависимости жизнеспособности эукариотических клеток с разным уровнем
экспрессии рецептора ErbB2 после их обработки
рекомбинантным иммунотоксином 4D5scFv-ETA:
клеток аденокациномы молочной железы человека
SKBR-3 с гиперэкспрессией ErbB2 (▲, пунктирная
линия), клеток карциномы шейки матки человека
HeLa с базовым уровнем экспрессии (●, сплошная
линия) и ErbB2-отрицательных клеток яичника
китайского хомячка CHO (■). Планки погрешностей представлены стандартной ошибкой среднего
6. Zdobnova T.A., Dorofeev S.G., Tananaev P.N. et
al. // J. Biomed. Opt. 2009. V. 14. P. 021004.
7. Здобнова Т.А., Дорофеев С.Г., Тананаев П.Н. и
др. // Докл. АН. 2010. Т. 430. C. 705–708.
8. Generalova A.N., Sizova S.V., Zdobnova T.A. et
al. // Nanomedicine. 2011. V. 6. P. 195–209.
9. Balalaeva I.V., Zdobnova T.A., Krutova I.V. et al.
// J. Biophotonics. 2012. V. 5. P. 860–867.
10. Генералова А.Н., Зубов В.П., Мочалов К.Е. и
др. // Докл. АН. 2011. Т. 439. № 1. С. 1–4.
11. Edelweiss E., Balandin T.G., Ivanova J.L. et al. //
PLoS ONE. 2008. V. 3. P. e2434.
12. Serebrovskaya E.O., Edelweiss E.F., Stremovskiy
O.A. et al. // Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 9221–
9225.
13. Mironova K.E., Proshkina G.M., Ryabova A.V.
et al. // Theranostics 2013. V. 3. P. 831–840.
14. Beatty J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G. et al. // J.
Immunol. Methods. 1987. V. 100. P. 173–179.
15. Hynes N.E., Gerber H.A., Saurer S., Roner B. //
J. Cell. Biochem. 1989. V. 39. P. 167–173.
16. Zhao J., Zhang L.-H., Jia L.-T. et al. // J. Biol.
Chem. 2004. V. 279. P. 21343–21348.
17. Ray D., Ahsan A., Helman A. et al. // Neoplasia.
2011. V. 13. P. 570–578.
18. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. М.:
БИНОМ. Лаборатория знаний, 2010. 691 с.
19. Zdobnova T.A., Stremovskiy O.A., Lebedenko
E.N., Deyev S.M. // PLos ONE. 2012. V. 7. P. e48248.
126
Е.А. Малеханова, Т.А. Здобнова, А.А. Брилкина и др.
PREPARATION AND INVESTIGATION OF CYTOTOXIC PROPERTIES OF RECOMBINANT
ANTI-ERBB2 IMMUNOTOXIN BASED ON PSEUDOMONAS EXOTOXIN
E.А. Malekhanova, Т.А. Zdobnova, А.А. Brilkina, N.Yu. Shilyagina,
I.V. Balalaeva, S.М. Deyev
Recombinant immunotoxin based on Pseudomonas exotoxin A fragment and antibody 4D5scFv specific to ErbB2
receptor has been expressed and purified. The immunotoxin has been shown to save the affinity of 4D5scFv for ErbB2
in the fusion protein. The cytotoxicity of the immunotoxin was estimated using cell lines expressing different levels of
ErbB2. The results obtained testify to high specificity and efficacy of the immunotoxin against ErbB2-positive cancer
cell lines.
Keywords: recombinant immunotoxin, scFv antibodies, Pseudomonas aeruginosa exotoxin A, ErbB2 receptor, cytotoxicity.
References
1. Sharkey R.M., Goldenberg D.M. // CA Cancer J.
Clin. 2006. V. 56. P. 226–243.
2. Dosio F., Brusa P., Cattel L. // Toxins. 2011. V. 3.
P. 848–883.
3. Polyanovskij O.L., Lebedenko E.N., Deev S.M. //
Biohimiya. 2011. T. 77. S. 289–311.
4. Weldon J.E., Pastan I. // FEBS J. 2011. V. 278.
P. 4683–4700.
5. Willuda J., Honegger A., Waibel R. et al. // Cancer
Res. 1999. V. 59. P. 5758–5767.
6. Zdobnova T.A., Dorofeev S.G., Tananaev P.N. et
al. // J. Biomed. Opt. 2009. V. 14. P. 021004.
7. Zdobnova T.A., Dorofeev S.G., Tananaev P.N. i
dr. // Dokl. AN. 2010. T. 430. C. 705–708.
8. Generalova A.N., Sizova S.V., Zdobnova T.A. et
al. // Nanomedicine. 2011. V. 6. P. 195–209.
9. Balalaeva I.V., Zdobnova T.A., Krutova I.V. et al.
// J. Biophotonics. 2012. V. 5. P. 860–867.
10. Generalova A.N., Zubov V.P., Mochalov K.E. i
dr. // Dokl. AN. 2011. T. 439. № 1. S. 1–4.
11. Edelweiss E., Balandin T.G., Ivanova J.L. et al. //
PLoS ONE. 2008. V. 3. P. e2434.
12. Serebrovskaya E.O., Edelweiss E.F., Stremovskiy O.A. et al. // Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P.
9221–9225.
13. Mironova K.E., Proshkina G.M., Ryabova A.V.
et al. // Theranostics 2013. V. 3. P. 831–840.
14. Beatty J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G. et al. // J.
Immunol. Methods. 1987. V. 100. P. 173–179.
15. Hynes N.E., Gerber H.A., Saurer S., Roner B. //
J. Cell. Biochem. 1989. V. 39. P. 167–173.
16. Zhao J., Zhang L.-H., Jia L.-T. et al. // J. Biol.
Chem. 2004. V. 279. P. 21343–21348.
17. Ray D., Ahsan A., Helman A. et al. // Neoplasia.
2011. V. 13. P. 570–578.
18. Freshni R.YA. Kul'tura zhivotnyh kletok. M.:
BINOM. Laboratoriya znanij, 2010. 691 s.
19. Zdobnova T.A., Stremovskiy O.A., Lebedenko
E.N., Deyev S.M. // PLos ONE. 2012. V. 7. P. e48248.