Автореферат - Научно-исследовательский институт общей
реклама
На правах рукописи НЕЧАЕВ ИЛЬЯ НИКОЛАЕВИЧ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПАТОГЕНЕЗА ОТЕЧНО-ИНФИЛЬТРАТИВНОЙ ФОРМЫ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.03.03 – Патологическая физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2013 2 Работа выполнена в Лаборатории молекулярной физиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук. Научный руководитель: Доктор биологический наук, профессор, член-корреспондент Российской академии наук Александр Григорьевич Тоневицкий Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела патоморфологии и лабораторной диагностики Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научный центр рентгенрадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Боженко Владимир Константинович Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией клинической биохимии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук, Кушлинский Николай Евгеньевич Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научноисследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации Защита диссертации состоится «____» __________ 2013 года в ____часов на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук, по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, дом 8. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук Автореферат разослан «______» _________________ 2013 г. Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат медицинских наук Л.Н. Скуратовская 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Рак молочной железы (РМЖ) занимает одно из ведущих мест в структуре общей онкологической заболеваемости, определяя высокие показатели инвалидности и смертности женского населения, негативно влияя на демографическую обстановку в стране. При этом отёчно-инфильтративная форма рака молочной железы (ОИФРМЖ) является наиболее агрессивной, характеризуется высокой злокачественностью, ранним и быстрым метастазированием, высокой летальностью [Hance и др., 2005]. Согласно 7-ому изданию TNM классификации Международного Союза по контролю за раком к ОИФРМЖ относятся первично-воспалительная форма – T4d, и вторичновоспалительная – T4b, [Sinn, Helmchen, Wittekind, 2010]. Средняя пятилетняя выживаемость пациентов при ОИФРМЖ составляет не более 20% [Piras и др., 2011]. Лечение этой формы РМЖ является комплексным и интенсивным, а его эффективность во многом зависит от того, насколько быстро поставлен верный диагноз и начата терапия, так как уже через два-три месяца со времени появления первых симптомов у трети пациенток регистрируют отдаленные метастазы опухоли [Yamauchi и др., 2012]. Вместе с тем, диагностика ОИФРМЖ крайне сложна. Начальные стадии заболевания имеют схожую симптоматику с воспалительными заболеваниями молочной железы (маститом, рожистым воспалением). При первичной ОИФРМЖ в ткани молочной железы отсутствует четко отграниченный, определяемый пальпаторно и при рентгенологическом исследовании опухолевый узел. Кроме того, для ОИФРМЖ не характерна какая-либо определенная гистологическая форма опухоли, которая может быть представлена инфильтрирующим протоковым, дольковым, медуллярным, слизистым или другим гистологическим вариантом. Таким образом, постановка диагноза ОИФРМЖ по-прежнему основана на субьективной оценке клинических проявлений болезни, а его правильность и своевременность зависит от квалификации и опыта лечащего врача. В этой связи актуальной задачей является объективизация и стандартизация процесса диагностики ОИФРМЖ. Эта задача может быть решена в результате выявления молекулярно-генетических маркеров, характерных для данной формы РМЖ. Однако в настоящее время, несмотря на наличие публикаций в этой 4 проблемной области, общепринятый перечень маркеров болезни не сформирован. Большинство проводимых до сих пор исследований ОИФРМЖ затрагивало лишь небольшое число молекулярных показателей: рецепторы гормонов (рецепторы эстрогена и прогестерона), факторы роста (рецептор эпидермального фактора роста) и онкосупрессоры (p53) [Zell et al., 2009; Bertucci et al., 2010]. При этом на сегодняшний день общепринятые молекулярно-биологические критерии ОИФРМЖ до сих пор не выявлены. С помощью экспериментальных моделей (клеточные линии SUM149 и SUM190) удалось выявить несколько аберрантно-активированных сигнальных путей, включающих гены ARHC и WISP3, ассоциированных с инвазивностью и метастатической активностью ОИФРМЖ [Kleer и др., 2004]. Были предприняты попытки установить молекулярно-генетические особенности ОИФРМЖ непосредственно на образцах тканей после оперативного лечения [Bieche et al., 2004; Bekhouche, 2011; Bertucci et al., 2004; Van Laere et al., 2005]. Однако, списки генов, выявленных в ходе проведенных различными авторами исследований, пересекаются мало [Bertucci et al., 2010]. Таким образом, перспективным представляется глубокое исследование патогенеза ОИФРМЖ методами полногеномного анализа экспрессии генов, в том числе в сочетании с анализом на других уровнях молекулярной организации (генетическом, эпигенетическом, белковом). В настоящее время убедительно доказана перспективность исследования микро РНК (миРНК) как потенциальных диагностических и прогностических маркеров заболеваний [Paranjape et al., 2009]. В работе [Lu et al., 2005] продемонстрировано, что профиль экспрессии миРНК может позволить дифференцировать типы опухоли, которые нельзя классифицировать на основании анализа профиля экспрессии в клетках опухоли матричных РНК (мРНК). В США анализ экспрессии миРНК уже предлагается использовать для диагностики рака поджелудочной железы и хронического панкреатита [Asuragen's CLIA laboratory], некоторых типов рака легких и почек [Rosetta Genomics]. Это обосновывает целесообразность исследования миРНК при выявлении молекулярно-генетических особенностей ОИФРМЖ. 5 Цель исследования Изучение патогенеза отечно-инфильтративной формы рака молочной железы на молекулярно-генетическом уровне Задачи исследования: 1. Сформировать коллекцию биопсий рака молочной железы и разработать принципы скринингового дигностического исследования биоптатов рака молочной железы на основе их экспрессионного анализа. 2. Исследовать молекулярно-генетические особенности патогенеза отечноинфильтративной формы рака молочной железы по результатам полногеномного транскриптомного профилирования. 3. Выявить дифференциально-экспрессированные инфильтративной форме рака молочной мРНК железы и при отечно- подтвердить результаты с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. 4. Выявить наиболее характерные для отечно-инфильтративной формы рака молочной железы микроРНК и осуществить биоинформационный поиск их потенциальных мишеней. Научная новизна Впервые исследована одна из систем эпигенетической регуляции патогенеза отечно-инфильтративной формы рака молочной железы – регуляторные микроРНК. Впервые исследованы особенности патогенеза отечно-инфильтративной формы рака молочной железы по результатам полногеномного транскриптомного профилирования ткани опухоли в сочетании с одновременной характеристикой транскриптома микроРНК. Впервые разработаны принципы скринингового диагностического исследования биоптатов рака молочной железы на основе экспрессионного анализа рецепторов к эстрогену, прогестерону и эпидермальному фактору роста 2. 6 Теоретическая и практическая значимость Полученные данные об аберрантно-активных сигнальных путях при ОИФРМЖ вносят важный вклад в понимание этиологии и патогенеза заболевания и являются основанием для разработки новых патогенетически обоснованных молекулярнонаправленных методов его её терапии. Разработанные принципы скринингового диагностического исследования биоптатов рака молочной железы на основе экспрессионного анализа рецепторов к эстрогену, прогестерону и эпидермальному фактору роста 2 могут быть реализованы в качестве нового эффективного метода диагностики ОИФРМЖ в клинической практике, что будет способствовать повышению точности диагностики на ранних этапах заболевания. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Разработанная экспрессионная методика типирования РМЖ по основным молекулярно-генетическим параметрам: для рецепторов эстрогена, прогестерона и эпидермального фактора роста 2, может быть применена в клинико-лабораторной практике как скрининговый метод совместно с иммуногистохимическим, что повысит чувствительность и специфичность определения данных рецепторов. 2. Гены ERBB2IP, IGF2, TGFB2, IL20, OLFM4 PROM1, OLFM4, C4orf7, FLRT3, MUC15 участвуют в патогенезе ОИФРМЖ. 3. В основе патогенеза ОИФРМЖ лежат нарушения в следующих сигнальных путях: регуляция воспаления, хемотаксис и адгезионный процесс. 4. В регуляцию патогенеза ОИФРМЖ вовлечены mir-26b, mirlet-7a3, mir-331, находящиеся в антикорреляционной связи с соответствующими мРНК мишенями: GSR, IGF2, KIF23. Апробация работы Основные результаты работы доложены на Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века», VIII Международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы медицины», Всероссийской научной конференции 7 молодых ученых-медиков 2012 года, Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013». Апробация диссертации состоялась на межлабораторной конференции ФГБУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН 16 апреля 2013 г. Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 4 тезиса докладов на конференциях, из рецензируемых которых научно-практических две международные, 4 биолого-медицинских статьи в журналах рекомендованных ВАК и подана одна заявка на Патент №2012146626 «Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы и набор для его осуществления». Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав изложения собственных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 13 рисунков и 19 таблиц. Список литературы включает 174 источника. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Формирование коллекции биопсийного материала В исследовании был использован биопсийный материал 41 пациента, проходивших оперативное лечение в Московской Городской Онкологической больнице №62 и Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А. Герцена (19 образцов отечно-инфильтративной формы РМЖ и 22 образца контрольной группы с не отечно-инфильтративными формами РМЖ) (Таблица 1). Все пациенты дали письменное информированное согласие на участие в исследовании. Иммуногистохимические исследования включали определение экспрессии рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PR), а также рецептора эпидермального 8 фактора роста (HER2/neu). Срезы толщиной 4 мкм монтировались на позитивно заряженные стёкла (SuperFrost Plus, ThermoFisher Scientific). Окраска гематоксилином и эозином производилась по стандартной методике. Иммунное окрашивание производилось в иммуностейнере Benchmark Ultra (Ventana, Roche) с использованием антител к рецепторам эстрогена (Confirm Estrogen Receptor, клон SP1, Ventana), рецепторам прогестерона (Confirm Progesterone Receptor, клон 1Е2, Ventana), c-erbB-2 (Confirm HER-2/neu, Ventana) и системы детекции ultraVIEW Universal DAB Detection Kit (Ventana, Roche) в соответствии с инструкциями производителя. Отечноинфильтративной форма была диагностирована согласно критериям 7-ого пересмотра TNM классификации Международного Союза по контролю над раком (2009 г.). Образцы опухолевой ткани подвергались макродиссекции и помещались в пробирки со стабилизирующим раствором с RNAlater RNA Stabilization Reagent (Qiagen, Cat.no. 76106) не позднее 30 минут после мастэктомии. После 24-часой инкубации при +4°C пробирки замораживались и хранились до исследования в жидком азоте при -180°C. Доля опухолевых клеток в образце составляла не менее 10% (Рисунок 1). А Б Рисунок 1 – Опухолевые клетки ОИФРМЖ после химиотерапевтического лечения. а – окраска гематоксилином и эозином, х 20; б – окраска антителами к c-erbB-2, х 20. 9 Таблица 1 – Гистологические характеристики образцов опухоли * значимость различий между группой ОИФРМЖ и неОИФРМЖ Характеристики ОФРМЖ неОФРМЖ суммарное кол-во образцов 19 22 Возраст (года) 51 (43-86) 53 (35-75) Медиана (min-max) Стадия опухолевого процесса I 0 4 II 0 10 III 15 8 IV 4 0 T (TNM) 1 0 2 2 0 12 3 0 6 4a 0 2 4b 4 0 4c 0 0 4d 15 0 N (TNM) 0 0 14 1 10 6 2 9 2 ER статус ER-положительный 9 12 ER-негативный 10 10 PR статус ER-положительный 9 12 ER-негативный 10 10 HER2 статус HER2-положительный 6 6 HER2-негативный 13 16 P-value* 0,477 0,403 0,301 0,941 0,012 0,012 0,861 Подготовка биопсийного материала к полногеномному транскриптомному анализу Гомогенизация образцов осуществлялась механическим перетиранием в жидком азоте керамическим пестиком и ступкой с использованием QIAzol Lysis Reagent (Qiagen, Cat.no. 79306). Выделение РНК производилось по стандартной методике набором реагентов Qiagen miRNeasy mini kit (Qiagen, Cat.no. 217004). Оценка качества и количества выделенной РНК производилась с помощью системы Experion (Bio-Rad, США) и спектрофотометра NanoDrop 1000 NP (Thermo Scientific, США) соответственно. Для образцов с концентрациями от 25 нг/мкл при анализе 10 качества РНК использовались чипы типа «RNA StdSense Chip». В качестве численной характеристики степени деградации РНК использовали показатель RQI (RNA Quality Indicator, BioRad), где значение RQI равное 10 соответствовало РНК максимального качества, а значение равное 1 – полностью деградированной РНК (Рисунок 2). Для проведения полногеномного транскриптомного анализа использовались образцы тотальной клеточной РНК со значением RQI не ниже 7 (7 из 10). Рисунок 2 – Электрофоретическое исследование препаратов РНК. На графиках приведены профили флуоресценции окрашенных молекул тотальной клеточной РНК, разделенных в ходе капиллярного электрофореза на микроканальных чипах BioRad Experion RNA StdSens, где на изображении (А) представлен вид РНК высокого качества, на (Б) – практически полностью деградированная РНК. На графиках подписаны пики флуоресценции, соответствующие подвижности 28S и 18S рибосомных РНК. Полногеномный транскриптомный анализ Анализ транскриптома образцов РМЖ проводили с помощью микрочипов GeneChip Human Gene 1.0 ST Array производства фирмы Affymetrix в соответствии с протоколами “The Ambion WT Expression Kit”, “GeneChip WT Terminal Labeling and Hybridization User Manual” и “GeneChip Expression Wash, Stain and Scan User Manual”, рекомендованными производителем. Анализ результатов микрочипового анализа осуществли с помощью пакета программного обеспечения Bioconductor XPS. Алгоритм обработки включал в себя несколько последовательных этапов. На первом этапе производилась коррекция фона относительно общей модели распределения проб. Квантиль алгоритма нормализации (уровень зонда нормализации) был применен к препроцессированным данным. На последнем шаге устанавливалась линейная модель, использующая процедуру Тукея, с 11 помощью которой интенсивность проб была конвертирована в уровень экспрессии наборов проб. На следующем этапе анализ проводился на обобщенной линейной модели. В рамках этого подхода строилась линейная модель данных и определялся макет эксперимента, затем эта модель подвергалась проверке на фактических данных. Линейная модель определялась в качестве матрицы. Значение i-строки и j-столбца матрицы демонстрировали влияние фактора j на образец i. Каждая измеряемая величина (т.е. каждый набор проб) в данном подходе анализировался независимо друг от друга. Для каждого набора проб значение вектора E представлялось в виде E=Dβ+ε, D – форма матрицы, β – вектор коэффициентов, указывающий значения реального влияния каждого фактора на анализируемый набор проб, ε – вектор ошибки. Для двух исследуемых групп были найдены гены с существенной разницей в уровне дифференциальной экспрессии. Считалось, что группы имеют существенную разницу в уровне дифференциальной экспрессии по наборам проб, если P-value меньше чем 0,05, а Fold Change (изменение экспрессии) имело значение более чем 1.41. Для расчета мультитестового анализа был использован алгоритм БенжаминиХохберга [Benjamini, 2009]. Верификация данных полногеномного транскриптомного анализа с помощь количественной ОТ-ПЦР в реальном времени а) Разработка методики и проверка технических характеристик праймеров и зондов выбранных генов. Для выбранных дифференциально экспрессированных генов были подобраны праймеры и зонды для верификационных постановок количественной ОТ-ПЦР в реальном времени; б) Проверка испытаний функциональных характеристик праймеров и зондов была проведена на основе полученных экспериментальных данных количественной ОТ-ПЦР в реальном времени и данных электрофореза в 2% агарозном геле. В качестве программы для стандартизованную программу: амплификации использовали разработанную 12 1. 94.0°C - 10:00 2. 94.0°C - 00:20 50 циклов 64.0°C - 00:10 72.0°C - 00:15 3. 10.0°C - хранение В качестве набора реагентов использовали 2.5х набор для ПЦР («Синтол»), для микроРНК использовался TaqMan® Universal PCR Master Mix 2✕, No AmpErase® UNG (Applied Biosystem Cat.no. 4324020); в) Значение эффективности использованных систем праймеров и зондов вычислялось на основе метода последовательных разведений образцов кДНК. Значения эффективности лежали в пределах 1.83-2.01, при этом стандартная ошибка расчета не превышала 10%; г) Отбор кандидатов в референсные гены был первично произведен на основе анализа ранее опубликованных работ и результатов, посвященных выбору референсных генов в биопсиях рака молочной железы, и по микрочипам 1.0 St Affymetrix. С использованием метод биологических повторов и обсчета с помощью методов ΔCt, geNorm и Халлера были отобраны референсные гены для верификационных постановок ПЦР. Обратную транскрипцию проводили с помощью набора реагентов ПЦР-ОТ («Синтол») по стандартизованному протоколу. После завершения протокола, полученные образцы кДНК замораживались и хранились при -20°С, при ОТ микроРНК использовался набор TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystem Cat.no. 4366597) и процедуру по стандартной схеме, предоставленной производителем. д) Для верификации данных, полученных микрочиповым анализом, был проведен ПЦР c генами-кандидатами в маркеры ОИФРМЖ. Значение относительного уровеня экспрессии по данным количественной ОТ-ПЦР в реальном времени рассчитывалось по следующей формуле: 13 √∏ где Ri – нормированное значение уровня экспрессии для гена i, Еi– эффективность проведения ПЦР для i-го гена, Сti – значение порогового цикла для i-го гена, Ctj – значение порогового цикла для референсных генов, Еj – эффективность проведения ПЦР для референсных генов. Выявление регуляторных микроРНК ОИФРМЖ Анализ микроРНК в образцах РМЖ проводили с помощью микрочипов GeneChip Human Gene 1.0 ST Array производства фирмы Affymetrix в соответствии с протоколами “The Ambion WT Expression Kit”, “GeneChip WT Terminal Labeling and Hybridization User Manual” и “GeneChip Expression Wash, Stain and Scan User Manual”, рекомендованными производителем. Поиск валидированных мишеней для микроРНК производился с использованием интерактивных ресурсов TARBASE , miRecords и miRTarBase. В ходе статистического анализа были найдены такие микроРНК, которые находятся в антикорреляционной связи с дифференциально-экспрессированными мРНК Изучение аберрантно-активированных сигнальных путей, ассоциированных с антикрорреляционными парами мРНК и микроРНК, проводили в интерактивной системе изучения сигнальных путей David [Huang, Sherman, Lempicki, 2009]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Определение молекулярно-генетических критериев РМЖ с помощью экспрессионного анализа. а) Разработка критериев определения рецепторного статуса эстрогена (ER) и прогестерона (PR) с помощью экспрессионного анализа. В клинической практике наиболее часто используемый метод оценки ER и PR экспрессии рецепторов основан на иммуногистохимическом анализе (IHC). Другой возможный подход к классификации рецепторного статуса опухолей основан на применении количественной ОТ-ПЦР в реальном времени и анализе экспрессии мРНК для ESR1 и PGR генов. В нашем исследовании мы использовали четыре гена 14 для нормализации результатов: TPT1, RPL37A, GUSB, SF3A1. Два из этих генов (TPT1 и RPL37A) были выбраны с помощью анализа микрочипов. Относительный уровень экспрессии гена-мишени был нормирован на среднее геометрическое из относительных уровней экспрессии четырех генов, результат умножался на 100. Значение, равное 1, было использовано в качестве классификационного порога: значения выше 1 и ниже 1 были классифицированы как положительный и негативный гормональный статус соответственно. Соответствие между ИГХ и данными ПЦР было проверено на 41 образце рака молочной железы. Число совпадений с результатами ИГХ составило 100% для ER-статуса и 97,7% для PR-статуса. б) Разработка критериев определения рецепторного статуса эпидермального фактора роста 2 (ERBB2), с помощью экспрессионного анализа Методика проведения FISH коммерческим набором HER2 FISH PHarmDx (DAKO, Glostrup, Дания) предполагает гибридизацию двух ДНК-проб: проба дающая флуоресцентный сигнал в красной области спектра присоединяется к гену ERBB2, а проба с флуоресценцией в зеленом спектре к перицентромерному участку хромосомы 17 [Press и др., 2002]. По аналогии, в качестве генов-кандидатов для определения относительного уровня экспрессии гена ERBB2 из генов перицентромерной области нами были выбраны 106 генов, расположенных на длинном плече хромосомы 17 человека между центромерным регионом и геном ERBB2. Гены были проверены на отсутствие совместной амплификации с геном ERBB2. Данные об ампликоне гена ERBB2 взяты из литературных источников [Järvinen и др., 1996; Kauraniemi и др., 2003; Kauraniemi, Kallioniemi, 2006; Sahlberg и др., 2012; Staaf и др., 2010]. Стабильность экспрессии этих генов была проверена по данным полногеномного транскриптомного анализа (выборка GSE5847 [Boersma и др., 2008]). В результате были отобраны 6 генов (WSB1, TNFAIP1, POLDIP2, GIT1, GOSR1, PSMD11), соответствующие следующим критериям: коэффициент вариации менее 5%, относительный уровень экспрессии в интервале от 7 до 9 (Log2). Величину уровня экспрессии гена ERBB2 определяли для каждого из 5 модельных случаев (Таблица 2) и рассчитывали как отношение ERBB2 в конкретном образце к Ri каждого из 6 генов-кандидатов для определения относительного уровня 15 экспрессии гена ERBB2 (POLDIP2, GIT1, TNFAIP1, GOSR1, PSMD11 и WSB1). Нормирование экспрессии на ген POLDIP2 наиболее соответствовало линейной модели (Таблица №3). Уровень экспрессии гена ERBB2 относительно гена POLDIP2 в пропорционально-смешанных клеточных культурах SKBR-3 (ERBB2 – гиперэкспрессирующая клеточная линия, 4-8 кратное амлификация гена ERBB2) и MCF7 (экспрессия ERBB2 соответствует здоровой ткани молочной железы, отсутствует амлификация гена ERBB2) представлен на рисунке №3. Для всех шести генов-кандидатов была определена величина достоверности аппроксимации, результаты указаны в таблице №3. Таблица 2 – Уровень экспрессии мРНК и амплификация ERBB2 в модельной системе Модель 1 2 3 4 5 Доля клеток линии 100 75 50 25 0 SK-BR-3, % Доля клеток линии 0 25 50 75 100 MCF7, % Гиперэкспрессия 128 96 65 33 1 мРНК ERBB2* Амплификация 4–8 3–6 2–5 1–3 1 ERBB2** * – кратность увеличения экспрессии мРНК ERBB2 по сравнению с нормальными фибробластами и линией HBL100 [Kraus и др., 1987] ** – количество копий гена ERBB2 на одну клетку модельной системы (Kraus и др., 1987) Таблица 3 – Величины достоверности линейной аппроксимации для генов-кандидатов при определении относительного уровня экспрессии ERBB2 Ген Величина достоверности аппроксимации, R^2 POLDIP2 0,9943 WSB1 0,7396 PSMD11 0,9655 TNFAIP1 0,9513 GIT1 0,9764 GOSR1 0,9538 В нашем исследовании был проанализирован 41 образец биопсий РМЖ с различным HER2/neu статусом (согласно ИГХ и FISH), соответственно 0, 1+, 2+ и 3+. Относительные значения экспрессии HER2, полученные для биопсий со статусом 1+ и 0, не превышали 0,29. Кроме того образцы с ИГХ-статусом 2+, не показавшие амплификацию по результатам FISH, имели относительные уровни экспрессию от 16 0,37 до 0,49. В то же время образцы со статусом ИГХ 2+ и 3+, показавшие амплификацию ERBB2 по результатам FISH, при оценке нашим методом показали значение не менее 1,02. Исходя из полученных данных, можно предположить, что пороговое значение, отличающее клетки с гиперэкспрессией от клеток с нормальным уровнем ERBB2, лежит в пределах интервала 0,5-1 относительных единиц экспрессии. Для более точного определения уровня порога необходимо проведение дальнейших Относительный уровень экспрессии ERBB2 исследований с большим количеством биописйного материала. 5 R² = 0,9943 4 3 2 1 0 0 25 50 75 100 Процент клеток, гиперэкспрессирующих ERBB2 Рисунок 3 – Относительный уровень экспрессии гена ERBB2 относительно гена POLDIP2 Полученные результаты свидетельствуют о том, что предложенный нами метод на основе количественной ОТ-ПЦР в реальном времени может потенциально использоваться в качестве скринингового метода совместно с иммуногистохимическим анализом после уточнения порогового значения уровня экспрессии ERBB2 относительно экспрессии гена POLDIP2. В сравнении с ИГХ наша методика лишена фактора субъективной оценки, т.к. уровень экспрессии гена ERBB2 определяется численно. Кроме того метод, основанный на количественной ОТ-ПЦР в реальном времени, занимает меньше времени, чем ИГХ и FISH, и позволяет проводить параллельный анализ сразу нескольких образцов, полученных от разных пациентов. В дополнение к этому данная методика способна выявить те случаи, когда 17 в клетке наблюдается гиперэкспрессия ERBB2 без амплификации гена, что делает наш метод ценным дополнением к FISH. Полногеномный транскриптомный анализ молекулярно-генетических маркеров патогенеза ОИФРМЖ а) с После нормализации данных полногеномного транскриптомного анализа помощью линейных моделей, были определены 30 дифференциально экспрессированных мРНК (adj p-value<0,05 после t-Стьюдента). 21 ген имел пониженную экспрессию, а 9 – повышенную относительно группы контроля (Рисунок №4). Рисунок 4 – Иерархическая кластеризация 30 дифференциально экспрессированных генов. Кластеризация выявленных дифференциально экспрессированных генов с помощью базы данных David [Huang, Sherman, Lempicki, 2009] позволила выявить 18 среди них две основные функциональные группы: регуляция воспалительного процесса (Enrichment Score: 2.47), адгезия и миграция (Enrichment Score: 1.94) (Таблица 4). Таблица 4 – Ключевые биологические процессы, ассоциированные с ОИФРМЖ Процесс Воспаление Адгезия миграция Ген ERBB2IP, IGF2, TGFB2, IL20, OLFM4, и PROM1, OLFM4, C4orf7, FLRT3, MUC15 Были рассмотрены гены, причастные к данным патогенетическим путям, после чего стали понятны основные процессы, происходящие при развитии ОИФРМЖ. Так выявленные гены показали, что основное внимание необходимо акцентировать на сигнальных путях, связанных с адгезией, миграцией, инвазией и воспалением. Необходимо дальнейшее изучение данных сигнальных путей, но уже сейчас можно говорить о вовлеченности этих сигнальных путей в патогенез ОИФРМЖ. К настоящему времени предложено несколько характерных для ОИФРМЖ профилей экспрессии [Bertucci и др., 2005; Bièche и др., 2004; Laere Van и др., 2005]. Исследования были проведены на различных по объему выборках пациентов как до, так и после химиотерапевтического лечения с последующей мастэктомией. Стоит отметить, что только пять генов, выявленных в нашей работе, входили в профили экспрессии предложенные авторами ранее: PROM1, TGFB2, ERBB2IP, INTS2, NPAS2. Ген INTS2 [Bekhouche и др., 2011] отвечает за синтез белковой субъединицы, участвующей в процессинге малых ядрышковых РНК U1 и U2. Продукт гена NPAS2 – транскрипционный фактор, участвующий в регуляции циркадианных ритмов [Bertucci и др., 2005]. Столь низкий уровень гомологии профилей экспрессии ОИФРМЖ можно объяснить высокой молекулярно-генетической гетерогенностью данной формы РМЖ и низким количеством целевых опухолевых клеток в анализируемых образцах. Для поиска возможных механизмов патогенеза ОИФРМЖ были проанализированы биологические процессы, в которых участвуют выявленные нами, а также определенные ранее гены, ассоциированные с развитием данного заболевания (Таблица 5). Результаты анализа позволяют сделать заключение о том, что различные профили экспрессии ОИФРМЖ отражают активность одних и тех же биологических 19 процессов. Прежде всего, в них представлены гены, регулирующие процессы передачи сигнала между клетками сигнальных (Идентификатор путей по Европейской информационной базе – GO:0006935, GO:0030593), адгезионные процессы (GO:0030054, GO:0007155), процессы воспаления (GO:0006915) и транскрипционные процессы (GO:0006915). Таблица 5 – Сравнительный анализ профилей экспрессии ОИФРМЖ Процесс Нечаев, 2013 Воспаление (GO:0006954) Клеточная адгезия (GO:0007155) Передача межклеточного сигнала (GO:0007165) Регуляция транскрипции (GO:0006355) Хемотаксис (GO:0006935) Позитивная регуляция транскрипции через промотер РНК-полимеразы II (GO:0045944) Негативная регуляция апоптоза (GO:0043066) Последовательности конкретных ДНК связывающей активности транскрипционных факторов (GO:0003700) Негативная регуляция транскрипции через промотер РНК-полимеразы II (GO:0000122) Негативная регуляция транскрипции (GO:0006935) ДНК репликация (GO:0006260) Ответ острой фазы (GO:0006953) Регуляция клеточной пролифирации (GO:0042127) Клеточные плотные контакты (GO:0030054) Апоптоз (GO:0006915) 18 Количество генов участвующих в процессе Bekhouche, Bertucci, Bieche, Dressman, 2011 2004 2004 2006 [Bekhouche [Bertucci и [Bièche и [Dressman и др., 2011] др., 2004] др., 2004] и др., 2006] 2 8 3 3 Van Laere, 2005 [Laere Van и др., 2005] 5 13 2 5 2 1 2 10 1 10 5 1 9 4 2 7 2 4 1 3 1 8 6 5 1 8 8 4 5 1 5 4 3 5 1 4 2 5 4 6 4 3 3 3 1 2 1 3 1 1 3 3 2 3 1 2 9 1 2 Можно заключить, что определение сложных регуляторных сетей имеет важное значение. В этом исследовании было показано, что в процессе патогенеза ОИФРМЖ активируются гены, участвующие в организации воспалительного процесса, адгезии и хемотаксисе. Полученные данные помогут прояснить причины и 20 механизмы патогенеза и высокого метастатического потенциала ОИФРМЖ. Необходимы дополнительные функциональные исследования выявленных генов, а также изучение их пригодности в качестве экспрессионных маркеров ранней диагностики ОИФРМЖ. б) Верификация данных, полученных полногеномным транскриптомным анализом с помощью, метода количественной ОТ-ПЦР в реальном времени Данные полученные после анализа полногеномного транскриптомного анализа были верифицированы с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Подробное описание методики описано в разделе «Материалы и методы» в пункте «Верификация данных полногеномного транскриптомного анализа с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени», а отбор референсных генов в главе «результаты исследования», в подпункте «определение молекулярно-генетических критериев РМЖ с помощью экспрессионного анализа». Проведенные верификационные мероприятия для генов ERBB2IP, IGF2, TGFB2, IL20, CCL28, PROM1, OLFM4, C4orf7, FLRT3, MUC15 с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени, показали высокую сходимость результатов полногеномного анализа и данных ПЦР (R2=0,9413; R2=0,9221, усредненный коэффициент корреляции по всем генам в группе ОИФРМЖ и неОИФРМЖ соответственно). Поиск и верификация значимых антикорреляционных взаимодействий микроРНК-мРНК В ходе исследования было выявлено 3 достоверно дифференциальноэкспрессированных микроРНК: mir-26b, mirlet-7a3, mir-331, которые находятся в антикорреляционном взаимодействии с соответствующими мРНК мишенями: GSR, IGF2, KIF23. При помощи биоинформационного анализа были обнаружены следующие пары микроРНК-мРНК, находящихся в противофазе по уровню экспрессии: mir-331 и гены KIF23 и ERBB2IP , mir26b и ген GSR, mirlet7a3 и ген IGF2. Эти результаты могут означать, что данные регуляторные элементы задействованы в процессе патогенеза ОИФРМЖ. Для подтверждения экспериментальных результатов взаимодействия 21 микроРНК-мРНК были использованы электронные ресурсы: TARBASE, miRecords и miRTarBase. Первая пара mir-331 и целевой ген KIF23 – кинезин подобный белок митоза. Из ее мРНК транслируется белок, компонента цитоскелета, регулирующий Rhoзависимую передачу сигнала о формировании сократительного кольца миозина на стадии цитокинеза [Chatterjee и др., 2013]. Вторая пара, которую удалось определить – mir26b и целевой ген GSR, кодирующий фермент глутатионредуктазу. Физиологическая роль глутатионредуктазы до конца не выяснена, но ее активность и количество в сыворотке крови повышается при инфаркте миокарда и онкологических заболеваниях, и, что особенно интересно, при других формах РМЖ уровень глутатионредуктазы остается неизменным [Oestergaard и др., 2006], что теоретически позволяет использовать глутатионредуктазу в диагностических целях. Третья выявленная регуляторная пара – это mirlet7a3 и ген IGF2, кодирующий белок инсулиподобного фактора роста 2. Данный белок на сегодняшний день является одним из сильнейших известных аутомитогенов [Bergman и др., 2012]. Что так же может играть роль в процессе развития опухоли и метастазировании. Данные, полученные при изучении взаимодействий микроРНК и мРНК, хорошо коррелируют с найденными на предыдущем этапе исследования аберрантноактивированными сигнальными путями. Данный вывод согласуется с теоретической знанием о процессах развития ОИФРМЖ, что экспериментально подтверждается в данном исследовании. Проведенные верификационные мероприятия для генов GSR, IGF2, KIF23, ERBB2IP и микроРНК mir-26b, mirlet-7a3, mir-331 с помощью количественной ОТПЦР в реальном времени, показали высокую сходимость результатов полногеномного транскриптомного анализа и данных ПЦР ( усредненный коэффициент корреляции по всем генам в группе ОИФРМЖ и неОИФРМЖ соответственно R2=0,9276; R2=0,9179). В нашем исследовании мы использовали две микроРНК для нормализации данных: miR-25; miR-187; которые были выбраны с помощью микрочипового анализа. 22 ВЫВОДЫ 1 В результате установлены полногеномного патогенетически транскриптомного значимые профилирования дифференциально- экспрессированные при ОИФРМЖ гены: ERBB2IP, IGF2, TGFB2, IL20, OLFM4 PROM1, OLFM4, C4orf7, FLRT3, MUC157. 2 Установлено, что в основе патогенеза ОИФРМЖ лежат изменения функционирования внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих воспаление, хемотаксис и адгезию. 3 По результатам биоинформационного анализа и данным полногеномного транскриптомного профилирования ткани опухоли при ОИФРМЖ выявлена группа дифференциально-экспрессированных микроРНК: mir-26b, mirlet7a3, mir-331 – которые находятся в антикорреляционном взаимодействии с соответствующими мРНК-мишенями: GSR, IGF2, KIF23 4 Проведенная верификация с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени показала, что дифференциально экспрессированные мРНК и микроРНК достоверно соответствуют данным полногеномного транскриптомного анализа. 5 В целях повышения эффективности диагностики ОИФРМЖ целесообразно исследовать методом количественной ОТ-ПЦР в реальном времени уровень экспрессии генов рецепторов эстрогена, прогестерона и эпидермального фактора роста 2 в ткани опухоли. 23 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1 Крайнова Н.А., Нечаев И.Н., Саматов Т.Р. / Разработка метода детекции уровня экспрессии Her-2, MUC-1 и EpCAM в цельной крови методом ПЦР на модельной системе циркулирующих раковых клеток// Всероссийскую научную конференцию молодых ученых-медиков “Инновационные технологии в медицине XXI века” – 2012. – С. 244-245 2 Шкурников М.Ю., Нечаев И.Н./ Опыт формирования коллекции РНК образцов рака молочной железы и проведения полногеномного транскриптомного анализа // Всероссийская научная конференция молодых ученых-медиков – 2012. – С 257-258 3 Шкурников М.Ю., Степанова В.В., Нечаев И.Н., Хаустова Н.А., Тоневицкий Е.А. / Роль пептидогликан-распознающих белков в механизмах врождённого иммунитета // Биотехнология. – 2013. – № 1. – С. 26-32. 4 Нечаев И.Н., Максименко Д.Г., Тоневицкий E.А., Шкурников М.Ю./ Роль дифференциально-экспрессированных патогенезе воспалительной формы комплексов рака miRNA-mRNA молочной железы // в VIII Международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы медицины» –2013– С. 92-100 5 Д.Г. Максименко, И.Н. Нечаев, Н.А. Хаустова, М.Ю. Шкурников, Т.Р. Саматов / Референсные гены для изучения процесса дифференцировки клеток линии CaCo-2 методом ПЦР-РВ // Биотехнология. – 2013. – № 1. – С. 33-41. 6 М.Ю. Шкурников, И.Н. Нечаев, Н.А. Хаустова, Н.А. Крайнова, Н.А. Савелов, В.Н. Гриневич, Э.К. Сарибекян / Экспрессионный профиль воспалительной формы рака молочной железы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2013. – Т.155. – № 4 – С.619624 7 Нечаев И.Н., Князев Е.Н., Крайнова Н.А., Н.А. Хаустова, Шкурников М.Ю. / Экспрессионный метод анализа HER2-статуса в образцах ткани рака молочной железы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2013. – Т.155. – № 4 – С.521-525 24 8 Князев Е.Н., Нечаев И.Н. / Экспрессионный метод анализа HER2-статуса в образцах ткани рака молочной железы // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2013» / Отв. ред. А.И. Андреев, А.В. Андриянов, Е.А. Антипов, М.В. Чистякова. [Электронный ресурс] — М.: МАКС Пресс, 2013. — 1 электрон. опт. диск (DVD-ROM); 12 см. — ISBN 978-5-317-04429-9 25 Nechaev Ilya Molecular-genetic markers of pathogenesis of inflammatory breast cancer Inflammatory breast cancer refers to diffuse common forms of cancer and occurs in approximately 6% of patients with breast cancer. IBC is highly malignant, early and rapid lymphatic and hematogenous metastasis, high mortality. The average 5-years survival of IBC is about 20%. Initial stages IBC have similar symptoms with inflammatory diseases of the breast (mastitis, erysipelas), which creates difficulties in making a diagnosis. Today there are no generally accepted biologically-molecular criteria of IBC. The problem of analyzing is a large number of molecular parameters in a limited number of tumor cells allowed to decide microarray technology. This is the first time been investigated genome miRNA and mRNA transriptom IBC and nonIBC on a modern technology platform, Affymetrix. And implemented a new method for analyzing molecular markers IBC involved in the pathogenesis of a form of breast cancer and identification of aberrantly-activated pathways by identifying IBC anticorrlation paired miRNA-mRNA interactions. During the identification of new molecular markers according to the pathogenesis IBC by 1.0 ST Affymetrix microarrays revealed five different microRNAs: mir-26b, mirlet7a3, mir-331, and mRNA: GSR, IGF2, INTS2, KIF23, ERBB2IP, PHLPP2, CEP120 and aberrantly-activated pathway of pathogenesis of IBC: regulation of inflammation, chemotaxis. 26 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ HER2 – мембранный белок, тирозиновая протеинкиназа семейства рецептора эпидермального фактора роста EGFR/ErbB, кодируемый геном человека ERBB2 RNA – ribonucleic acid TNM – международная классификация стадий развития раковых опухолей (tumor, nodus и metastasis) БМ – биологический материал ОИФРМЖ – отечно-инфильтративная форма рака молочной железы микроРНК – микро рибонуклеиновая кислота мРНК – матричная РНК ПЦР – полимеразная цепная реакция в реальном времени РМЖ – рак молочной железы ОТ-ПЦР – ПЦР с обратной транскрипцией FISH – Флюоресцентная гибридизация in situ
