На правах рукописи ШИЛОВ ЕВГЕНИЙ СЕРГЕЕВИЧ Модель
реклама
На правах рукописи ШИЛОВ ЕВГЕНИЙ СЕРГЕЕВИЧ Модель генетического нокдауна соматического цитохрома c мыши Специальность 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2015 г. Работа выполнена на кафедре иммунологии Биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова». Научный руководитель: член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Недоспасов Сергей Артурович Официальные оппоненты: Казначеева Елена Валентиновна, доктор биологических наук, заведующая лабораторией ионных каналов клеточных мембран Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт цитологии Российской академии наук Мазуров Дмитрий Вячеславович, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунохимии Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук Защита состоится 19 мая 2015 г. в 17 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д501.001.52 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы д.1, стр. 12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1. С диссертацией можно ознакомиться в отделе диссертаций Фундаментальной библиотеки МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: Ломоносовский просп., д. 27, сектор «А», 8 этаж, комн. 812 и на сайте биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу http://www.bio.msu.ru/dissertations/view.php?ID=690 Автореферат разослан _____________________ 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Исследования биологических систем зачастую осложняются тем, что одни и те же белки в живых организмах могут быть использованы в разных типах клеток и в разное время, проявляя при этом различающиеся функции и особенности регуляции. Для изучения подобных ситуаций существует способ кондиционной генетической манипуляции, отдельных основанный на использовании прецизионного редактирования генома в типах клеток либо в определенный момент времени. Для подобного редактирования можно использовать трансгенные высокоспецифические рекомбиназы под тканеспецифическими промоторами и трансгены-мишени, фланкированные узнаваемыми данными рекомбиназами последовательностями нуклеотидов (Gu et al., 1993). Такой подход позволяет преодолеть проблему летальности, вызванной полным нарушением функции генамишени во всех клетках организма, и исследовать отдельные частные функции отдельных генов и их белковых продуктов в определенных типах клеток на определенных этапах развития. В то же время вместе с высокой продуктивностью данного подхода необходимо отметить довольно большую сложность его реализации на уровне животных объектов. Создание новых моделей на основе кондиционных генетических дефектов представляется оправданным в отношении белка, обладающего несколькими различающимися функциями и клинической значимостью их нарушения. Обоими этими свойствами обладает цитохром c – один из наиболее пристально изучаемых эукариотических белков на протяжении последних десятилетий. Для него известны как минимум три различающихся функции: перенос электронов между III и IV комплексами дыхательной цепи митохондрий (Cooper, Lehninger, 1956), обеспечение электронами цитохром с-перокcидазы, фермента, утилизирующего перекись водорода (Yonetani, Ray, 1965), и активация белка Apaf-1, образующего апоптосому (Liu et al., 1996). Кроме того, в отсутствие цитохрома c в митохондриях не происходит сборки функциональных комплексов дыхательной цепи (Vempaty et al., 2009). Генетический нокаут цитохрома c вызывает гибель мышиных эмбрионов к середине периода внутриутробного развития (Li et al., 2000). Цитохром c является весьма консервативным белком, а исследования in vitro и с использованием генномодифицированных животных показали важность для сохранения его функций некоторых ключевых аминокислотных остатков. Популяционно-генетические исследования выявили у человека две изоформы цитохрома c, G41S (Morison et al., 2008) и Y48H (De Rocco et al., 2014), в гомозиготном состоянии обе они приводят к тромбоцитопении. Особый интерес связан с использованием цитохрома c для моделирования митохондриальных заболеваний. Как правило, эти заболевания связаны с мутациями генов, расположенных в геноме митохондрий. При этом митохондриальные заболевания затрагивают 3 строго определенные типы клеток и отличаются по своей симптоматике (Toracco et al., 2009). С учетом того, что генная инженерия надежно позволяет манипулировать ядерными генами в разных типах клеток, представляется перспективной разработка генетической модели, имитирующей митохондриальные заболевания с использованием технологии кондиционного нокдауна генов с ядерной локализацией, таких как ген Cycs. Этот подход и был реализован в данной диссертационной работе. Цели исследования. Целями данной работы являлись анализ значимости количества цитохрома c для жизнедеятельности отдельных типов клеток организма и определение последствий его кондиционного генетического нокдауна в клетках иммунной системы. В соответствии с этим, были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) Получение линии мышей со специфическим снижением количества цитохрома c в Тлимфоцитах, в макрофагах, а также в нестин-экспрессирующих стволовых клетках. 2) Определение степени снижения уровня цитохрома c в клетках-мишенях на уровне мРНК и белка, анализ генетического механизма, обеспечивающего данное снижение. 3) Анализ фенотипов мышей с вышеуказанными кондиционными нарушениями экспрессии цитохрома c. 4) Изучение процессов жизнедеятельности цитохромдефицитных иммуноцитов, включая клеточное дыхание, дифференцировку, апоптоз, а также специфические функции: фагоцитоз, генерацию АФК и способность к презентации антигенов. Новизна диссертационной работы. Впервые были получены и проанализированы мыши с генетически детерминированным снижением количества цитохрома c в выбранных популяциях клеток-мишеней. Показана возможность нормального функционирования дыхательной цепи в условиях десятикратного снижения количества цитохрома c в клетках иммунной системы. Научно-практическое значение. В ходе работы была подтверждена принципиальная возможность создания генетической модели митохондриальных заболеваний, основанной на перестройке ядерного гена-мишени с помощью технологии кондиционных тканеспецифических рекомбиназ. Полученное в данной работе снижение экспрессии гена цитохрома c представляется более физиологически релевантным для такой модели, чем известный ранее кондиционный полный нокаут этого же митохондриальные заболевания сопровождаются гена, так как реальные постепенным падением активности дыхательной цепи вследствие неравномерной сегрегации митохондриальной ДНК между клетками. Апробация работы. Диссертация апробирована и рекомендована к защите на объединенном семинаре кафедры иммунологии биологического факультета МГУ имени М.В. 4 Ломоносова и лаборатории молекулярных механизмов иммунитета ИМБ им. В.А. Энгельгардта. Результаты работы были представлены в 2013 г. на конгрессе FEBS Congress 2013 «Mechanisms in biology», Санкт-Петербург, и на школе-конференции Германского общества иммунологов «10th Spring school on immunology», Этталь, Бавария в 2014 г. Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, включая 3 статьи в рецензируемых научных изданиях и 4 тезисов международных конференций. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», изложена на 97 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка и 3 таблицы. Список литературы включает 179 работ, из них 174 на иностранных языках. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Получение мышей с кондиционным дефицитом цитохрома с в Т-клетках и макрофагах. Исходная родительская линия мышей с генотипом cfKW была описана ранее (Муфазалов и др., 2009). Для получения мышей с дефицитными по цитохрому c макрофагами использовали описанных ранее мышей-делитеров LysM-cre (Takeda et al., 1999), для Т-клеток использовали делитеров Cd4-cre (Lee et al., 2001), в случае стволовых клеток - Nes-cre (Tronche et al., 1999), а для полного удаления аллели дикого типа - CMV-cre (Schwenk et al., 1995). Все использованные в работе мыши были на генетической основе линии C57BL/6, происходили из Пущинского питомника лабораторных животных и содержались в апатогенных условиях при искусственном световом режиме 12/12 и доступности воды и корма ad libitum. Генотипирование мышей. Генотипирование проводили методом ПЦР на матрице ДНК из кончиков хвостов мышей возраста >Р25, ДНК выделяли по стандартному протоколу от Jackson Laboratory, для генотипирования мышей использовали праймеры, описанные в работах, указанных в предыдущем разделе. Выделение и поляризация костномозговых макрофагов. Мышей возраста 6-8 недель эвтаназировали, препарировали, извлекали бедренные кости и выделяли из них костный мозг, вымывая его стерильной бессывороточной средой DMEM. Клетки культивировали с использованием 20% лошадиной сыворотки и 30% среды, кондиционированной M-CSF клетками фибросаркомы L929 (Boltz-Nitulescu et al., 1987). На 7 день культивирования макрофаги снимали с чашек стерильным раствором 0.05% EDTA в PBS и пересевали для поляризации. Для поляризации макрофагов использовали рекомбинантные мышиные цитокины IFN-гамма и IL-4 («Peprotech»), а также ЛПС E. coli («Sigma»). Для каждого клона 5 использовали М1 поляризацию (IFN-гамма в концентрации 50 нг/мл и ЛПС в концентрации 50 нг/мл) и М2 поляризацию (IL-4 в концентрации 20 нг/мл). Через сутки производили окрашивание клеток на специфические маркеры, а также проводили выделение ДНК и РНК. Выделение спленоцитов и тимоцитов. Мышей возраста 8-10 недель эвтаназировали, препарировали, извлекали тимус и селезенку, проводили механическое ресуспендирование этих органов в фосфатно-солевом буфере, а затем фильтровали суспензию через клеточные ситечки («BD Falcon») с диаметром пор 100 мкм. Вестерн-блоттинг. Для вестерн-блоттинга использовали макрофаги, лизированные в буфере Лэммли, в количестве по 2х106 клеток на пробу. Лизат макрофагов подвергали процедуре SDS-PAGE в системе Mini-Protean («Bio-Rad»), затем переносили методом влажного переноса на активированную метанолом PVDF- мембрану Amersham Hybond-P («GE Healthcare»), блокировали раствором бычьего сывороточного альбумина («Sigma») на PBS и проявляли при помощи первичных моноклональных антител к цитохрому с («BD Pharmingen») и поликлональных кроличьих антител к гистону H2B («Аbcam»). Для проявки использовали вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, и набор для люминисцентной проявки ECL West Dura («Pierce»), сигнал регистрировали с помощью люминесцентного имиджера ChemiDoc («Bio-Rad»). Выделение РНК. Выделение РНК для последующего синтеза первой цепи кДНК и анализа экспрессии методом ПЦР в реальном времени для культур костномозговых макрофагов проводили по методу Хомчинского с реактивом TRI Reagent («Sigma») по протоколу производителя. Обратная транскрипция. Реакцию обратной транскрипции проводили со случайными девятинуклеотидными праймерами с помощью набора Reverse Transcriptase SS III («Invitrogen») по протоколу производителя. Для каждого образца в реакции использовали по 400 нг суммарной РНК, прошедшей предварительную обработку ДНКазой I для удаления остаточной геномной ДНК. Аллелеспецифическая ПЦР в реальном времени. Относительную экспрессию и соотношение аллелей Cycs определяли с помощью метода ∆∆Сt (Livak, Schmittgen, 2001). Для определения экспрессии в качестве референсного гена использовали ген β-актина мыши, при определении соотношения аллелей wt и K72W референсной считали аллель K72W, которая не подвержена Cre-зависимому вырезанию. Для определения экспрессии аллели дикого типа использовали общий прямой праймер Cyc-1exF (на 1-й экзон) и специфический обратный праймер CycLys-R, для аллели K72W - праймеры Cyc-1exF и специфический обратный праймер CycTrp-R. При определении соотношения аллелей wt и K72W на геномной ДНК для аллели wt и K72W использовали соответствующие приведенные ранее специфические 6 обратные праймеры и прямой праймер Cyc-2intF (граница 2-го экзона и 2-го интрона). РТ-ПЦР для определения экспрессии β-актина, TNF, IL-6 и гена тестикулярного цитохрома Cyct проводили с использованием праймеров, описанных в литературе ранее. Проточная цитофлуориметрия. Перед окрашиванием макрофагов и Т-клеток Fcрецепторы на клетках блокировали при помощи специфических антител анти-Fcγ. Долю дифференцировавшихся макрофагов в популяции оценивали путем окрашивания на макрофагальный маркер F4/80 либо на Mac-1. Для окрашивания на маркеры поляризации применяли антитела против CD206 и MHCII, также в работе использовали антитела к поверхностным маркерам CD11c, CD68 и CD301. Для всех антител использовали рабочие разведения 1:400, окрашивание на поверхностные маркеры проводили по стандартной методике, время инкубации с антителами составляло 30 минут. Для оценки количества мертвых клеток, потерявших целостность плазматической мембраны, использовали окраску иодидом пропидия. Уровень активных форм кислорода измеряли с помощью окрашивания дигидродихлорфлуоресцеин диацетатом (H2DCFDA). Для внутриклеточного окрашивания цитохрома с макрофаги и лимфоциты фиксировали 2% раствором параформальдегида, затем пермеабилизовали 0,5% раствором тритона Х-100 и окрашивали специфическими антителами по протоколам производителей. Для окрашивания цитохрома с использовали специфические моноклональные антитела мыши клона 6Н2.В4 в разведении 1:200 и вторичные моноклональные анти-IgG1-антитела крысы, конъюгированные с PE в разведении 1:200. Клеточный сортинг лимфоцитов проводили на проточном цитометре BD FacsAria, для выделения отдельных популяций CD4+ и CD8+ Т-клеток использовали антитела к CD3, CD4 и CD8. Для этой процедуры использовали мышей возраста 17 - 40 недель. Для определения фагоцитарной активности макрофагов использовали смесь меченых флуоресцентными красителями бусин Flow-Check Pro. Суспензию бусин (размером 3, 6 и 10 мкм) добавляли к суспензии макрофагов в среде DMEM из расчета 106 бусин на 2х106 макрофагов и инкубировали в течение часа при 370С. Фагоцитарную активность определяли по доле высокофлуоресцентных объектов (макрофаг+бусина) в макрофагальном гейте от общего числа высокофлуоресцентных объектов. Измерения проводили на капиллярном проточном цитофлуориметре Guava 8HT. Индукция апоптоза и анализ клеточной гибели. Для индукции апоптоза макрофагов использовали неспецифический блокатор протеинкиназ стауроспорин в концентрации 500 нМ, а также обратимый ингибитор гликолиза 2-дезоксиглюкозу в концентрации 20 мМ. Макрофаги инкубировали с обоими веществами по отдельности или в сочетании в течение 6 часов, затем клетки снимали с культурального пластика холодным фосфатно-солевым 7 буфером на льду, и окрашивали аннексином V, конъюгированным с APC или FITC, и иодидом пропидия. Анализ окрашивания проводили на проточном цитофлуориметре BD FacsCanto II. Измерение дыхательной активности клеток. Интенсивность дыхания суспензии клеток проводили с помощью полярографического электрода Кларка на приборе Oxygraph c использованием 2-3 млн. макрофагов либо 10 млн. тимоцитов/спленоцитов (количество клеток предварительно подсчитывали в камере Горяева) в объеме 0.3 мл среды DMEM. После записи кривой нормального потребления клетками кислорода из среды в течение 2-3 минут в рабочую камеру добавляли протонофор карбонилцианид хлорфенилгидразона до конечной концентрации 6,7 мкМ. Затем пересчитывали потребление кислорода в пикомолях на 1 млн клеток за 1 мин в нормальном состоянии и в присутствии протонофора. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Описание модели с различными вариантами кондиционного нокдауна гена Cycs Для получения мышей с кондиционным нокдауном цитохрома c в клетках-мишенях была использована созданная ранее линия генотипа cfKW/cfKW, имеющая в локусе Cycs две копии кодирующей последовательности этого гена (Рис. 1). Рис 1. Схема организации локуса Cycs у использованных в работе мышей различных генотипов. Генотип cfKW отличается от Cycs дикого типа наличием на 3`-конце дополнительной аллели с заменой четырех нуклеотидов (CAAA/ATGG), приводящей к аминокислотной замене K72W, фланкированием аллели дикого типа LoxP-сайтами и наличием FRT-фланкированной neor-кассеты. Генотип fKW (∆cyt) возникает из генотипа cfKW после удаления рекомбиназой cre аллели Cycs дикого типа. Первая копия гена содержит последовательность Cycs дикого типа, фланкированную LoxP-сайтами, вторая копия несет замену размером в четыре нуклеотида, 8 приводящую к аминокислотной замене K72W. У обеих аллелей общие промоторный участок и первый экзон, между копиями расположена neor – кассета. В норме в локусе cfKW транскрибируется последовательность дикого типа, причем её уровень экспрессии соответствует нормальному уровню экспрессии соматического цитохрома c. Аллель K72W не присутствует в пуле мРНК клеток cfKW/cfKW, поскольку на 3`- конце аллели дикого типа находится последовательность, терминирующая транскрипцию. В присутствии рекомбиназы сre аллель Cycs дикого типа может быть удалена путем рекомбинации по LoxP-сайтам, и таким образом возникает новый генотип, обозначаемый fKW. Ранее была показана летальность генотипа fKW/fKW, и было высказано предположение о том, что эта летальность связана с нарушением работы гена Cycs, вплоть до полного нокаута. В ходе данной работы было установлено, что такое снижение количества действительно происходит, однако не до полного исчезновения цитохрома c, а до уровня, приблизительно в десять раз меньшего, чем его нормальное содержание. Рис 2. Схема скрещивания для получения потомства с кондиционным снижением экспрессии цитохрома с. Экспрессия рекомбиназы сre контролируется специфическим промотором и позволяет удалять ген цитохрома с в отдельных типах клеток, таких как макрофаги (на рисунке) или Тклетки. После удаления аллели дикого типа начинается экспрессия аллели K72W, однако она недостаточна по сравнению с базовым уровнем экспрессии. Во втором поколении от скрещивания гомозиготных мышей cfKW/cfKW и мышейделитеров, имеющих трансген cre под тканеспецифическим промотором, можно ожидать мышей, сочетающих генотип cfKW/cfKW и рекомбиназу cre (Рис. 2). У таких мышей в клеткахмишенях будет происходить переход генотипа cfKW/cfKW в fKW/fKW, что позволяет создать 9 модель дефицита цитохрома c в определенном типе клеток организма. В данной работе подобный подход был применен с использованием трех типов кондиционных мышейделитеров: Cd4-cre (затрагивает Т-клетки), LysM-cre (затрагивает миелоидные клетки, преимущественно макрофаги), Nes-cre (мишенью являются стволовые клетки, экспрессирующие белок нестин), а также убиквитарный делитер CMV-cre, обеспечивающий удаление Cycs во всех типах клеток организма. Влияние снижения количества цитохрома c на жизнеспособность мышей Все мыши генотипа cfKW/cfKW CMV-cre с полной делецией аллели Cycs дикого типа погибали в период Е9,5-Е11,5, как и было показано ранее в диссертационной работе И.А. Муфазалова (Муфазалов, 2011). Однако впервые полученные мыши генотипов cfKW/cfKW Cd4-cre и cfKW/cfKW LysM-cre оказались жизнеспособны и морфологически неотличимы от мышей дикого типа. Генотип cfKW/cfKW Nes-cre был ассоциирован с аномалиями развития в эмбриогенезе, например, с увеличенной вентрикулярной зоной больших полушарий. Кроме того, в потомствах от скрещиваний наблюдался значительный дефицит мышей cfKW/cfKW Nes-cre, и, хотя часть мышат с таким генотипом рождалась, частота этого события была примерно в 5 раз меньше ожидаемой (Таб. 1). Таблица 1. Мыши cfKW/cfKW Nes-cre недостаточно представлены в потомстве Период Число пометов Число мышат Ожидаемое число Реальное число мышат cfKW/cfKW мышат cfKW/cfKW Nes-cre Nes-cre Скрещивание: cfKW/wt Nes-cre х cfKW/wt Nes-cre Р14 (мышата) 5 38 7 1 Скрещивание: cfKW/wt Nes-cre х cfKW/cfKW Р14 (мышата) 3 23 6 1 Скрещивание: cfKW/wt Nes-cre х cfKW/cfKW Е18 (эмбрионы) 3 26 7 2 Определение механизма снижения количества цитохрома с в клетках иммунной системы В ходе работы нами была определена причина снижения суммарного количества цитохрома c у мышей генотипа cfKW/cfKW после удаления обеих аллелей дикого типа. Такое снижение не является тривиальным фактом – кассета neor оказывается после удаления аллели дикого типа по сути внутри первого интрона гена Cycs, причем сохраняются исходные донорный и акцепторный сайты сплайсинга, а также последовательность в середине интрона, необходимая для замыкания структуры «лассо» во время сплайсинга. Критически нарушает экспрессию цитохрома c то, что внутри neor – кассеты находится последовательность, интерпретируемая сплайсосомой как альтернативный акцепторный сайт сплайсинга. Этот 10 акцепторный сайт находится проксимальнее к 5`-концу пре-мРНК, чем канонический акцепторный сайт сплайсинга первого интрона Cycs, что делает его выбор более предпочтительным. В результате большая часть первичного транскрипта сплайсируется с образованием химерной мРНК, содержащей первый экзон Cycs и часть neor (Рис 3А). Последовательность химерной мРНК была секвенирована и количественно охарактеризована. Тем не менее, параллельно с альтернативным часть пре-мРНК претерпевают исходный вариант сплайсинга с использованием канонического сайта сплайсинга на границе первого интрона и второго экзона Cycs, однако при этом происходит образование мРНК, кодирующей изоформу цитохрома c K72W. Транскриптом цитохромдефицитных костномозговых макрофагов был изучен при помощи реакции обратной транскрипции и последующей аллелеспецифической ПЦР (Рис. 3Б). Рис 3. Механизм снижения экспрессии гена Cycs основан на образовании химерных транскриптов. А) Схема образования химерной мРНК Cycs-neor и фрагмент её секвенированной последовательности. Курсивом и размером шрифта выделены границы донорного и акцепторного сайтов сплайсинга. Б) Некоторые фрагменты транскриптов, детектируемых в ∆cyt-макрофагах при помощи ПЦР на кДНК: 1– первый интрон Cycs, 2, 3 и 7 – различные ПЦР-продукты на основе химерной мРНК Cycs-neor, 4 – фрагмент мРНК neor, 5) мРНК аллели K72W, 6) мРНК аллели wt, 8) – отсутствие фрагмента, соответствующего мРНК Cyct – гена тестикулярного цитохрома с. 11 Вероятно, ещё одной причиной падения суммарной экспрессии Cycs в цитохромдефицитных клетках может служить механизм РНК-интерференции. Последовательность химерной мРНК комплементарна последовательности мРНК neor, которая транскрибируется со второй нити ДНК локуса fKW, таким образом, вместе они могут образовать двунитевую РНК. Следует отметить, что в транскриптоме популяции цитохромдефицитных клеток присутствуют как мРНК K72W, так и мРНК дикого типа, что связано с неполным вырезанием соответствующей аллели, но отсутствует РНК тестикулярного цитохрома с. Для оценки степени делеции LoxP-фланкированной аллели дикого типа с помощью метода блотгибридизации по Саузерну (Рис. 4А) было определено соотношение аллелей cfKW и fKW, а также с помощью метода аллелеспецифической ПЦР в реальном времени (Рис. 4Б) соотношение аллелей wt («Lys») и К72W («Trp»). Рис 4. Определение степени делеции лизиновой (wt) аллели Cycs в макрофагах мышей cfKW/cfKW LysM-cre. А) Метод блот-гибридизации по Саузерну. Геномную ДНК подвергали специфическому расщеплению рестриктазой BamHI, электрофорезу, а затем гибридизовали с зондом, связывающим последовательность первого интрона Cycs. Фрагмент размером 1183 п.н. соответствует аллели cfKW, фрагмент размером 3143 п.н. – аллели fKW, их соотношение составляет 6:94. Боковые дорожки соответствуют отрицательному контролю - макрофагам cfKW/cfKW. Б) Метод аллелеспецифической ПЦР в реальном времени. Амплификацию последовательностей WT и K72W проводили на геномной ДНК, количественное соотношение аллелей определяли методом ∆∆СТ. Для контрольного генотипа cfKW/wt соотношение аллелей wt:K72W составляет 2:1, для генотипа cfKW/cfKW LysM-cre – примерно 6:100. Оба метода показали эффективность работы рекомбиназы Cre под промотором LysM со степенью делеции около 94 – 95%, что соответствует её ожидаемой эффективности. Степень делеции аллели wt в T-клетках посредством Cd4-cre составляет примерно 97-98%, что подробно рассмотрено в следующем разделе (Рис. 8). Метод Саузерн-блоттинга позволяет отличить перестроенный локус от не перестроенного при помощи зонда на первый интрон 12 Cycs, поскольку сайты рестрикции для BamHI находятся перед промотором Cycs, внутри LoxP-фланкированной аллели дикого типа и перед вторым экзоном аллели K72W. Таким образом, в случае перестроенного локуса cfKW зонд гибридизуется с фрагментом размером 3143 п.н., от промотора до аллели K72W, а в случае не перестроенного локуса fKW – с фрагментом 1183 п.н., от промотора до аллели дикого типа. Метод аллелеспецифической ПЦР использовал один общий прямой праймер, картируемый на границу второго экзона и второго интрона Cycs, а также два специфических обратных праймера, различающихся четырьмя нуклеотидами на 3`-конце, соответствующим последовательностям аллелей K72W и wt. Поскольку в локусе cfKW содержатся обе аллели, а в локусе fKW – только аллель K72W, определив количественное соотношение аллелей, можно напрямую оценить эффективность работы рекомбиназы Cre. Для определения уровня экспрессии цитохрома c в клетках fKW/fKW (также обозначаются как ∆cyt) были использованы методы РТ-ПЦР, вестерн-блоттинга, а также проточной цитофлуориметрии (Рис. 5). В результате было показано, что суммарная экспрессия цитохрома с на уровне мРНК в ∆cyt клетках для разных особей варьирует от 5% до 20% относительно его нормального количества (Рис. 5А и 5Б), что подтверждается на уровне белка данными вестерн-блоттинга (Рис. 5В). В тех случаях, когда оценка проводилась не в количественном, а в качественном формате, также было показано значительное снижение количества цитохрома с в ∆cyt клетках (Рис. 5 Г-Е). Резюмируя количественные данные по определению экспрессии цитохрома с, можно отметить, что в нашей модели достигается снижение количество этого белка на клетку-мишень примерно до 10% от его исходного уровня, при этом преобладающей изоформой становится K72W. Таким образом, ∆cyt-генотип fKW/fKW представляет собой сочетание генетических нокина и нокдауна. По поводу замены K72W необходимо отметить, что ранее не было выявлено эффектов этой мутации на дыхательную функцию цитохрома с, хотя отмечалось некоторое повышение устойчивости к апоптозу части первичных клеточных линий мышиных эмбриональных фибробластов (Муфазалов и др., 2009). Следует подчеркнуть, что имелись первичные клеточные линии (клоны) мышиных эмбриональных фибробластов того же генотипа, которые не показывали такого эффекта. Более того, выведенные в результате серии возвратных скрещиваний на чистый генетический бэкграунд мыши K72W/K72W утратили свой морфологический фенотип, поэтому данные об антиапоптотическом эффекте замены K72W в соматическом цитохроме с нельзя считать окончательно подтвержденными и однозначно объясненными. 13 Рис. 5. Экспрессия цитохрома c в цитохромдефицитных клетках снижена приблизительно на порядок. А и Б) Соотношение количества кДНК разных аллельных вариантов гена Cycs для нормальных и цитохромдефицитных макрофагов (А) и спленоцитов/тимоцитов (Б), определенное при помощи РТ-ПЦР и нормированное на нормальный уровень экспрессии цитохрома c. В и Г) Суммарное количество цитохрома c в клетках, определенное методом вестерн-блоттинга для макрофагов (В) и спленоцитов/ тимоцитов (Г). Д и Е) Внутриклеточное окрашивание на цитохром c нормальных и цитохромдефицитных макрофагов (Д), а также лимфоцитов из селезенки и тимуса мыши с Т-клеточным нокдауном цитохрома c. Анализ жизнеспособности цитохромдефицитных лимфомиелоидных клеток После подтверждения эффективной работы предложенной модели у мышей с дефицитом цитохрома c в Т-клетках и макрофагах был исследован их клеточный фенотип. Поскольку генотип fKW/fKW приводит к эмбриональной летальности аналогично полному генетическому нокауту Cycs, ожидалось, что и для отдельных клеток, включая иммуноциты, этот генотип будет воспроизводить последствия полной функциональной утраты цитохрома c. Сразу следует сказать, что это ожидание не подтвердилось, более того, снижение количества 14 цитохрома c практически никак не затронуло жизнедеятельность и функции Т-лимфоцитов и макрофагов. Очевидно, что летальность эмбрионов со сниженным количеством цитохрома c во всех клетках организма объясняется нарушением функцией других клеток-мишеней, более чувствительных, чем рассмотренные в данной работе клетки иммунной системы. Мыши линий cfKW/cfKW Cd4-cre и cfKW/cfKW LysM-cre имели нормальную клеточность костного мозга, тимуса и селезенки. Количество Т-клеток а также соотношение популяций СD4+ и CD8+ у цитохромдефицитных мышей не отличалось от нормы (Рис. 6А), также как и доля CD11b+ клеток моноцитарно-макрофагального ряда в костном мозге (Рис. 6Б). А Б Рис 6. Соотношение популяций клеток-мишений у нормальных и цитохромдефицитных мышей одинаково. А) Соотношение субпопуляций CD4+, CD8+ и CD4+CD8+ клеток в тимусе и селезенке контрольных cfKW/cfKW и цитохромдефицитных мышей cfKW/cfKW Cd4-cre. Б) Доля CD11b+ (Mac-1) клеток в костном мозге контрольных cfKW/cfKW и цитохромдефицитных мышей cfKW/cfKW LysM-cre. В ходе культивирования клеток костного мозга in vitro и стимуляции их дифференцировки в направлении костномозговых макрофагов было показано, что ∆cyt-клетки не имеют отличий в исходной численности на мышь, уровне пролиферации и скорости дифференцировки от контрольных клеток (Рис. 7 А-В). При этом параллельно дифференцировке и созреванию культуры костномозговых макрофагов происходит удаление аллели Cycs wt, которое прекращалось на девятый день культивирования (Рис. 7Г). В дальнейшем доля цитохромдефицитных макрофагов не изменялась, что указывает на их одинаковую жизнеспособность с теми макрофагами в культуре, которые не удалили аллель Cycs wt. 15 Рис 7. Созревание культур цитохромдефицитных костномозговых макрофагов in vitro проходит нормально. А) Количество клеток костного мозга, млн на 2 бедренные кости (1 мышь). Б) Количественный выход зрелых макрофагов на 1 культивируемую клетку костного мозга. В) Созревание костномозговых макрофагов контрольной и ∆cyt мыши с 7 по 10 день с момента выделения костного мозга. Окрашивание на маркер макрофагов Mac-1, проточная цитофлуориметрия. Г) Динамика количества остаточной аллели дикого типа в ходе созревания костномозговых макрофагов. В качестве контроля использованы клетки генотипа cfKW/wt, у которых соотношение аллелей Lys и Trp составляет 2:1, аллелеспецифическая ПЦР в реальном времени. Рис 8. Доля цитохромдефицитных Т-лимфоцитов не меняется после выхода Т-клеток на периферию. Соотношение аллелей wt и K72W у CD4+CD8+ тимоцитов, а также CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток остается одинаковым, около 2:100, что указывает на сохранение доли клеток без делеции аллели дикого типа в общем пуле лимфоцитов. Для того чтобы сопоставить жизнеспособность ∆cyt клеток с нормальными, было проанализировано соотношение аллелей K72W и wt у отсортированных популяций Т-клеток CD4+, CD8+ и CD4+CD8+ (для тимуса) мышей генотипа cfKW/cfKW Cd4-cre. Соотношение этих аллелей определяется эффективностью работы рекомбиназы Сre и формируется в тимусе 16 на стадии двойных положительных тимоцитов. Предположение о том, что дефицит цитохрома c влияет на селекцию лимфоцитов в тимусе или на их жизнеспособность в периферических органах иммунной системы, давало основание ожидать различного соотношения аллелей для CD4+, CD8+ тимоцитов и CD4+ и CD8+ Т-клеток селезенки. Однако это соотношение оставалось постоянным для всех проанализированных типов клеток, а, следовательно, ∆cyt лимфоциты проходят тимус-зависимую селекцию так же и обладают такой же жизнеспособностью на периферии, как и клетки с нормальным содержанием цитохрома c (Рис. 8). Влияние снижения количества цитохрома c на клеточный метаболизм и апоптоз Особый интерес представляло изучение дыхания цитохромдефицитных клеток. Можно было ожидать, что десятикратное снижение количества незаменимого переносчика электронов дыхательной цепи будет приводить к снижению дыхательной активности клеток, однако этого не произошло. Ни для тимоцитов (рис. 9А), ни для спленоцитов (Рис. 9Б), ни для макрофагов (Рис. 9В) не было показано достоверных различий между интенсивностью потребления кислорода контрольными и цитохромдефицитными клетками как в состоянии покоя, так и в результате действия протонофора карбонилцианид хлорфенилгидразона, разобщающего окисление и фосфорилирование. Впрочем, коэффициенты дыхательного контроля (ДК) у всех типов цитохромдефицитных клеток были ниже, чем у контрольных клеток: у макрофагов на 12%, у спленоцитов на 14%, и у тимоцитов на 3%. Тем не менее, с учетом разбросов экспериментальных значений ДК можно говорить о наблюдаемой тенденции, но не о достоверных различиях. Безусловно, суммарное потребление клетками кислорода включает и его расход на другие метаболические процессы, помимо работы дыхательной цепи, однако наблюдение проявления дыхательного контроля позволяет считать, что расход кислорода на другие метаболические процессы составлял незначительную часть его потребления, по сравнению с дыханием. Наличие отдельных первичных культур цитохромдефицитных клеток, которые обладают нормальным клеточным дыханием и дыхательным контролем, показывает, что активность дыхательной цепи митохондрий не лимитируется цитохромом с. 17 Рис 9. Интенсивность клеточного дыхания нормальных и цитохромдефицитных иммуноцитов не имеет различий. Среднее потребление кислорода контрольными и ∆cyt тимоцитами (А), спленоцитами (Б) и макрофагами (В), пМоль О2 /мин х 106 клеток, в нормальном состоянии и на фоне добавления разобщителя окисления и фософорилирования (6,7 мкМ карбонилцианид хлорфенилгидразона). Показаны кривые падения концентрации О2 в среде, а также гистограммы средней скорости потребления кислорода. Красным обозначены цитохромдефицитные клетки, синим – контрольные. Числа над кривыми отображают скорость клеточного дыхания на данном участке показанной на рисунке кривой потребления кислорода. Моменты времени, в которые добавляли разобщитель, отмечены стрелками. Временной интервал для всех дыхательных кривых составляет 5 минут. Отдельно необходимо было рассмотреть чувствительность макрофагов с дефицитом цитохрома c к апоптозу. В качестве индукторов апоптоза были использованы 2- дезоксиглюкоза, вызывающая стресс эндоплазматического ретикулюма и являющаяся ингибитором фософгексозоизомеразы, подавляющим гликолиз, а также стауроспорин, неспецифический ингибитор протеинкиназ. Действие отдельно взятых стауроспорина и 2дезоксиглюкозы оказалось для контрольных и цитохромдефицитных макрофагов одинаковым, однако в случае сочетания этих двух агентов цитохромдефицитные клетки показали 18 достоверно большую устойчивость к апоптозу (Рис. 10). Однако из этих данных нельзя заключить, что сниженное количество цитохрома с само по себе вызывает повышение устойчивости костномозговых макрофагов к апоптозу, поскольку в ∆cyt клетках снижение количества цитохрома c сочетается с переключением на его изоформу K72W. Возможно, что большая устойчивость ∆cyt макрофагов к сочетанному воздействию дезоксиглюкозы и стауроспорина объясняется синэргичностью эффекта аминокислотной замены K72W и снижения количества цитохрома c в митохондриях. Следует учесть, что сами использованные индукторы имеют комплексный и неизвестный на данный момент в деталях механизм действия, так, например, стауроспорин, обычно рассматриваемый в качестве стимулятора митохондриального пути клеточной гибели, может вызывать аппотоз даже у нокаутных по Apaf-1 клеток (Imao, Nagata, 2013). Рис 10. Макрофаги генотипа fKW/fKW более устойчивы к апоптозу, вызываемому подавлением гликолиза. Окрашивание при помощи PI/AnnexinV-APC контрольных и ∆cyt макрофагов, у которых вызывали клеточную гибель, инкубируя в течении 6 часов с 20 мМ 2дезоксиглюкозой (2DG), 500 нМ стауроспорином (STS), а также с их сочетанием в тех же концентрациях. Проверка иммунных функций цитохромдефицитных макрофагов Помимо проверки клеточного дыхания для макрофагов были проанализированы также их специфические клеточные функции, такие как поляризация в М1 и М2 типы под действием экзогенных цитокинов (Рис. 11А), включая экспрессию MHC II при классической активации (Рис. 11Б) и маннозного рецептора CD206 при альтернативной активации (Рис. 11В), генерация активных форм кислорода (Рис. 12А), и фагоцитоз (Рис. 12В). Также методом проточной цитометрии были определены уровни поверхностных маркеров макрофагов: связанного с G-белками рецептора F4/80 (EMR1) и рецептора С3-компонента комплемента Mac-1 (Рис 12 Г и Д); методом РТ-ПЦР была измерена экспрессия провоспалительных цитокинов TNF и IL-6 (Рис 12Б). Однако оказалось, что цитохром с - дефицитные клетки по 19 всем этим параметрам не имеют отличий от контрольных макрофагов и являются вполне функциональными с точки зрения их роли в иммунной системе. Рис. 11. Цитохромдефицитные макрофаги экспрессируют MHC II и способны к нормальной поляризации. А) Поляризация макрофагов в М1 (повышение уровня MHC II) и М2направлениях (повышение уровня CD206). Б) Диаграмма уровня MHC II. В) Диаграмма уровня CD206. 20 Рис. 12. Цитохромдефицитные макрофаги функциональны с точки зрения иммунной системы. А) Цитохромдефицитные макрофаги имеют нормальный уровень внутриклеточных АФК. Показаны профили флуоресценции DCF неокрашенных клеток (К-), окрашенных, что отражает внутриклеточный уровень АФК, а также клеток, обработанных пероксидом водорода (К+), у которых H2DCFDА полностью окислен. Столбики указывают среднее значение флуоресценции нормальных (зеленый) и цитохромдефицитных (красный) макрофагов. Б) Базальный уровень экспресии TNF и IL-6 в нормальных и цитохромдефицитных макрофагах. Данные получены методом RT-PCR и нормированы на 1% от уровня экспрессии β-актина. В) Фагоцитарная активность макрофагов не зависит от количества цитохрома c. Верхний ряд показывает прямое и боковое светорассеивание флуоресцентных бусин, макрофагов и их смеси, нижний ряд – прямое и боковое светорассеяние объектов, имеющих высокий уровень флуоресценции от бусин. Г) и Д) – Количество специфических для макрофагов рецепторов F4/80 и Mac-1 не зависит от количества цитохрома с в митохондриях. Обсуждение функциональности цитохромдефицитных клеток Итак, несмотря на то, что в предложенной модели в иммунных клетках-мишенях было достигнуто десятикратное снижение содержания цитохрома с, не было обнаружено никаких последствий этого для их функций и жизнедеятельности, за исключением несколько большей устойчивости к апоптозу, причем в условиях его весьма специфической индукции. Повидимому, для лимфомиелоидных клеток млекопитающих такое сниженное количества цитохрома с вполне достаточно для нормальной работы дыхательной цепи. Учитывая данные о том, что отсутствие в митохондриях цитохрома с нарушает сборку не только полноразмерного комплекса IV, но также и сборку комплекса I (Vempati et al, 2009), который 21 не взаимодействует с цитохромом с, можно предположить, что цитохром с тесно ассоциирован с дыхательным суперкомплексом – респирасомой. Связь эта может осуществляться за счет известного взаимодействия молекулы цитохрома с и остатка жирной кислоты в составе кардиолипина либо других липидов. Можно предположить, что большая часть потока электронов между комплексами III и IV происходит не между отдельными дыхательными комплексами в ходе переноса их свободно плавающими молекулами цитохрома с, но в пределах одной респирасомы, которая обслуживается относительно небольшим и, возможно, стехиометрическим количеством мембраносвязанного цитохрома с. Архитектура и стехиометрия дыхательной цепи должна быть различна в разных типах клеток, поскольку митохондриальные заболевания, связанные с мутациями в митохондриальной ДНК, поражают определенные метаболически активные типы клеток (фоторецепторы, нейроны, мышечные клетки), и никогда не затрагивают другие типы клеток. В этом случае противоречие между летальностью полного генетического нокдауна Cycs и нормальной жизнеспособностью отдельных цитохромдефицитных клеток у кондиционных генетических нокдаунов объясняется тем, что для в последнем случае не было затронуто «уязвимое место» - тот тип клеток, в котором наблюдаемое снижение уровня цитохрома с приводило бы к более радикальным последствиям. Исходя из наблюдений за cfKW/cfKW Nescre мышами, таким уязвимым местом могут служить плюрипотентные клетки эмбриона и стволовые клетки взрослого организма. 22 ВЫВОДЫ 1. Получены и обоснованы новые генетические модели кондиционного снижения количества соматического цитохрома c в определенных типах клеток-мишеней, которые могут быть использованы для создания мышиных моделей митохондриальных заболеваний. 2. При снижении количества соматического цитохрома c во всех клетках организма наблюдается полная эмбриональная летальность, при снижении количества только в нестинэкспрессирующих клетках – дефекты развития эмбрионов. 3. Снижение уровня экспрессии цитохрома c после Cre-зависимого удаления аллели Cycs дикого типа вызвано нарушением сплайсинга аллели K72W и образованием химерных РНК Cycs-neor. 4. Для макрофагов десятикратное снижение количества цитохрома c не приводит к нарушению их жизнеспособности, не снижает интенсивности клеточного дыхания и не затрагивает их специфические иммунные функции. 5. Десятикратное снижение количества цитохрома c в Т-лимфоцитах не влияет на их жизнеспособность, клеточное дыхание, не приводит к дисбалансу популяций лимфоцитов и не влияет на селекцию Т-клеток. 6. Снижение количества цитохрома c вместе с аминокислотной заменой K72W повышает устойчивость клеток к комбинации стауроспорина и 2-дезоксиглюкозы, но не приводит к изменению устойчивости клеток к индукции апоптоза стауроспорином. 7. Предложена гипотеза об ассоциации цитохрома c и респирасомы, в её поддержку свидетельствует избыточность естественного количества цитохрома c для нормального функционирования дыхательной цепи Т-лимфоцитов и макрофагов. 23 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых научных изданиях 1) Kulikov A.V., Shilov E.S., Mufazalov I.A., Gogvadze V., Nedospasov S.A., Zhivotovsky B. Cytochrome c: the Achilles' heel in apoptosis. // Cellular and Molecular Life Sciences. –2012. –Т.69. №11. –С.1787-1797. 2) Шилов Е.С., Муфазалов И.А., Шебзухов Ю.В., Зварцев Р.В., Друцкая М.С., Недоспасов С.А. Кондиционный генетический нокдаун соматического цитохрома c мыши в лимфомиелоидных клетках. // Российский Иммунологический Журнал. –2013. –№4. – С. 361371. 3) Шилов Е.С., Кисляков И.В., Горшкова Е.А., Зварцев Р.В., Друцкая М.С., Муфазалов И.А., Скулачев В.П., Недоспасов С.А. Лимфомиелоидные клетки мыши способны нормально функционировать в условиях значительного снижения экспрессии цитохрома c. // Биохимия. – 2014. –№12. –С. 1726-1738. Тезисы конференций 1) Vdovenko D.J., Slinchenko D.I., Mufazalov I.A., Chaschina A.A., Zvartsev R.V., Shilov E.S., Gogvadze V., Yarilin A.A., Drutskaya M.S., Skulachev V.P., Zhivotovsky B., Nedospasov S.A. Phenotypic features of mice and cells carrying K72W mutation in somatic cytochrome c on C57BL/6 background. / Programmed cell death in biology and medicine, Москва, 4-5 июня, 2012, С. 61-62. 2) Shilov E. S., Mufazalov I. A., Shebzukhov Y. V., Drutskaya M. S., Nedospasov S. A. Novel mouse model with decreased levels of somatic cytochrome c in selected cell lineages. / FEBS Congress 2013 «Mechanisms in biology», Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013, С. 257. 3) Shilov E., Kislyakov I., Drutskaya M., Mufazalov I., Nedospasov S. Downregulation of somatic cytochrome c level has no impact on growth and development of murine macrophages and T cells in vivo and in vitro. 10-th Spring school on immunology. Этталь, Германия, 9-14 марта 2014, С. 139. 4) Кисляков И.В., Шилов Е.С. Кондиционный генетический нокдаун соматического цитохрома c мыши в костномозговых макрофагах. / XXI Международная конференция Ломоносов-2014, секция Биология, подсекция Биохимия. Москва, 7-11 апреля 2014, С. 58. 24
