ТОКСИКОЛОГИЯ УДК 616.151:616.25

42
ТОКСИКОЛОГИЯ
УДК 616.151:616.25-007
ИММУННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ
СОЕДИНЕНИЙ БЕРИЛЛИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
М.А. Газалиева
Национальный центр гигиены труда и профзаболеваний МЗ РК,
Карагандинский государственный медицинский университет, г. Караганда
Показано нарушение иммунной системы при воздействии фторбериллата
аммония и гидроокиси бериллия у экспериментальных животных в хроническом
опыте. При изучении клеточности иммунокомпетентных органов, фагоцитарной
активность нейтрофилов выявлен токсический эффект на органы иммунопоэза,
аллергизирующий потенциал бериллия, в основе которого могут лежать механизмы псевдоаллергии.
Ключевые слова: бериллий, иммунотоксичность, клеточность иммунокомпетентных органов, адгезия и фагоцитоз нейтрофилов
Актуальность. Нарушение функционирования иммунной системы – важное условие возникновения патологических процессов в организме. Иммунная
система является высоко специализированной, сложно регулируемой системой, её
клеточные элементы находятся в состоянии постоянной пролиферации. В этой
связи любое токсическое воздействие обязательно амплифицируется. При этом
повреждение иммунной системы может привести к усилению или супрессии иммунных функций организма, либо вообще не проявляться [1].
Иммунотоксичность ксенобиотиков промышленного производства может
проявляться в двух аспектах: как собственно повреждающее действие веществ на
иммунную систему (иммуносупрессия) и как участие иммунной системы в реализации механизмов токсического действия ксенобиотиков (аутоиммунные реакции,
реакции гиперчувствительности) [2].
Цель исследования. Изучение иммунных механизмов у экспериментальных животных при воздействии соединений бериллия.
Материал и методы. Экспериментальные исследования проводились на
44 половозрелых беспородных белых крысах-самцах, массой 180-200 грамм, находящихся на обычном рационе вивария.
Влияние соединений бериллия (растворимых – фторбериллата аммония и
нерастворимых – гидроокиси бериллия) на клеточность и жизнеспособность центральных и периферических органов иммунной системы было проведено одноISSN 1727-9712
Гигиена труда и медицинская экология. №4 (25), 2009
43
кратным интратрахеальным введением 17 крысам фторбериллата аммония в дозе
0,5 мг/кг, 19 крысам гидроокиси бериллия в дозе 5 мг/кг в течение 5 месяцев. Контроль составили 8 крыс, которым интратрахеально вводился физиологический
раствор - I группа. II и III группы – особи, которым соответственно вводился
фторбериллат аммония и гидроокись бериллия, IV и V группы - особи, которым
после введения соответственно фторбериллата аммония и гидроокиси бериллия
проводилась коррекция биологически активной добавкой «Бронхоастмин» в дозе
3 мг/кг массы тела per os ежедневно в течение всего периода эксперимента в
соответствии с методическими рекомендациями, утвержденными Фармакологическим комитетом «Методические рекомендации по оценке фармакологических
средств» МЗ СССР, 1988 г. Препарат вводился растолченным в порошок с манной
кашей в виде шариков. В основе препарата содержатся экстракты естественных
продуктов растительного происхождения, в составе которых важную роль играет
корень солодки голой, содержащий 23% тритерпенового сапонина глицирризина,
1,8-14,6% глицирризиновой кислоты. Тритерпеновые соединения по строению
близки к гормонам надпочечных желез. Глицирризиновая кислота обладает действием, несколько напоминающим дезоксикортикостерон. Она улучшает всасывание биоактивных веществ лекарственных растений из желудочно-кишечного
тракта, разжижает мокроту, стимулирует эвакуаторную функцию реснитчатого
эпителия бронхов, регенерацию клеток слизистой оболочки, общую неспецифическую резистентность организма. Флавоноиды подземных органов солодки обладают спазмолитическим действием, оказывая противовоспалительный эффект.
Представленный комплекс биологически активных веществ, содержащихся в препарате, повышает иммунологическую реактивность, неспецифическую резистентность организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей и производственной среды, связывает и выводит ксенобиотики, поддерживает адаптивнокомпенсаторные механизмы.
Через 5 месяцев животных забивали декапитацией, кровь отбирали для гематологических исследований. Органы иммунной системы описывали, взвешивали и пробы тканей отбирали для гистологического изучения. В ходе эксперимента
изучались следующие показатели: масса и клеточность иммунокомпетентных органов (селезенка, костный мозг), фагоцитарная активность нейтрофилов, относительное содержание В-лимфоцитов, клеточный состав периферической крови.
Для оценки клеточности органов иммунитета с помощью гомогенизатора
из каждого органа готовили клеточную взвесь на растворе Хенкса. Полученные
суспензии из селезенки и костного мозга бедренной кости отфильтровывали через
капроновую сетку от элементов стромы и подсчитывали концентрацию ядросодержащих клеток стандартным методом с использованием камеры Горяева. Количество В-лимфоцитов определяли методом розеткообразования с эритроцитами
барана, а фагоцитарную активность нейтрофилов с пекарскими дрожжами. ОбISSN 1727-9712
Гигиена труда и медицинская экология. №4 (25), 2009
44
щий анализ крови включал в себя подсчет лейкоцитов, гемоглобина с применением унифицированных методик [3]. Клеточный состав гемограммы определяли
путем подготовки мазков из периферической крови, окраски по РомановскомуГимзе и микроскопированием препаратов. Подсчет вели на 100 клеток и выражали в процентах. На каждого животного приготавливали по 2 препарата.
Для оценки аллергизирующего действия растворимого и нерастворимого
соединений бериллия использовали пероксидазный тест, который позволяет точно определить развитие гиперчувствительности к промышленным аллергенам [4].
При проведении пероксидазного метода кровь в объеме 0,2 мл добавляли в центрифужную пробирку с 8 мл физиологического раствора и центрифугировали
дважды при 1000 об/мин в течение 5 минут. Ресуспендировали осадок в 5 мл физиологического раствора. Взвесь клеток в объеме 0,110 мл инкубировали с растворимой и нерастворимой формами бериллия в восьми 10-кратных разведениях
объемом 0,170 мл в течение 15 мин. В качестве контрольных служили 8 тестов с
физиологическим раствором. После этого клетки осаждали центрифугированием,
а в культуральной среде определяли количество пероксидазы, выделенной поврежденными в результате инкубации клетками. Для этого добавляли тетраметилбензидин и через 20 минут реакцию останавливали 5% серной кислотой. Интенсивность окрашивания измеряли фотометрически при длине волны 450 нм. Оценку результатов проводили по формуле:
КФ=( (Σо - Σк) + (Δо – Δк) )/Σк,
КФ- коэффициент чувствительности;
Σо – среднее арифметическое значений оптической плотности в опытных
пробах;
Σк – среднее арифметическое значений оптической плотности контрольных
проб;
Δо – max – min (разность между максимальным и минимальным значениями оптической плотности в опытных пробах);
Δк - max – min (разность между максимальным и минимальным значениями оптической плотности в контрольных пробах).
Статистическая обработка полученных результатов проводилась методами
параметрической статистики с оценкой значимости различий по Стьюденту.
Результаты исследования. По результатам общего анализа крови и гемограммы выявлено, что в опытных группах крыс, получавших бериллий, отмечалось значимое снижение количества лейкоцитов при воздействии растворимых
соединений - 4,381,40, нерастворимых - 3,461,10. У крыс, получавших нерастворимые соединения бериллия (гидроокись бериллия), после проведенной коррекции наблюдалось увеличение содержания количества лейкоцитов (4,301,40),
ISSN 1727-9712
Гигиена труда и медицинская экология. №4 (25), 2009
45
однако этот показатель все равно значимо ниже значений в контрольной группе
крыс. В группе крыс, получавших растворимые соединения бериллия, помимо
снижения количества лейкоцитов, отмечалось и понижение гемоглобина. Стойкая
лейкопения у крыс может быть следствием длительной персистенции соединений
бериллия в организме и прямым токсическим действием на лейкоциты [5]. Проводимая коррекция не привела к нормализации данных показателей (таблица 1).
Таблица 1 - Общий анализ крови, средние значения (М±m)
Группа
I
группа,
n=8
II
группа,
n=9
III
группа,
n=10
IV
группа,
n=8
V
группа,
n=9
Гемоглобин,
г/л
Лейкоциты, 109/л
п/я
нейтрофилы,%
с/я
нейтрофилы,%
Моноциты,
%
Эозинофилы,%
Лимфоциты, %
142,25
47,87
7,05
2,44
1,0±
0,68
18,25±
5,42
0,11±
0,02
1,0±
0,28
79,75±
12,83
129,25
53.87
4,38
1,40*
0,25±
1,17
11,25±
5,10
0,11
0,03
0,50±
0,82
88,00±
35,66
153,60
72,70
3,46
1,10*
0,20
0,02
8,80
4,85*
0,14±
0,06
0,60±
0,46
90,40±
32,92
104,50
46,23*
4,00
1,40*
0,02±
0,01 *
14,50±
5,14
0,2±
0,12
0,75±
0,56
84,75±
27,12
141,60
60,22
4,30
1,40*
0,60
0,29
11,25±
5,10
0,41±
0,08
0,20±
0,37
87,80±
36,22
Примечание - * - достоверность (p<0,05) различий с контрольной группой,  - достоверность (p<0,05) различий
с группой сравнения
Оценка клеточности органов иммунной системы показала, что спустя 5 месяцев после однократного интратрахеального введения обеих форм соединений
бериллия в одинаковой степени определялось его токсическое воздействие на
центральные и периферические органы иммуногенеза: костный мозг и селезенку.
В обоих случаях происходило значимое снижение числа ядросодержащих клеток
и снижение их жизнеспособности (таблица 2, 3). Объяснение этому факту можно
найти в более ранних публикациях Архиповой О.Г. и соавт., 1972 г. [6], в которых
сообщается о том, что в органах животных бериллий обнаруживался в заметных
количествах не только в ранние сроки, но и через 8,5 месяцев после однократного
интратрахеального введения окиси бериллия, что обеспечивало длительное сохранение токсического эффекта бериллия на все органы и системы. При этом в селезенке отмечена наиболее стойкая фиксация бериллия [7] .
ISSN 1727-9712
Гигиена труда и медицинская экология. №4 (25), 2009
46
Таблица 2 - Влияние гидроокиси бериллия на клеточность иммунокомпетентных органов
(М±m)
Группа
I группа,
n=8
III группа,
n=10
V группа,
n=9
I группа,
n=8
III группа,
n=10
V группа,
n=9
Масса органа, г
Жизнеспособность, %
Ядросдержащие клетки,
106/г
5,241,64
Селезенка
43,5015,20
455,62149,61
6,510,14
28,2012,48*
243,74100,02*
6,702,20
33,4014,93
321,29112,35*
Костный мозг
3,721,34
66,5022,88
91,3932,19
4,990,11
59,6025,83
51,3022,46*
5,071,66
54,4022,89*
62,4025,69*
Примечание - * - достоверность (p<0,05) различий с контрольной группой,  - достоверность (p<0,05) различий
с группой сравнения
Применение биологически активной добавки вызывало неоднозначные
сдвиги. Ни в одном из случаев не удалось добиться полной коррекции измененных показателей. Наилучший эффект наблюдался во IV группе крыс, которым
вводили фторбериллат аммония. В этой группе в селезенке отмечался лучший
восстановительный эффект клеточности органа и показатель содержания ядросодержащих клеток достоверно превосходил данные группы сравнения. В костном
мозге у данной группы крыс после коррекции также происходило значимое повышение содержания ядросодержащих клеток и жизнеспособности клеток костного
мозга. Однако все эти изменения не достигают контрольных величин (таблица 3).
В V группе, подвергавшейся воздействию гидроокиси бериллия после коррекции количество ядросодержащих клеток значимо повышалось (321,29112,35),
не достигая однако контрольных величин. Помимо этого, отмечалось и увеличение количества жизнеспособных клеток в селезенке, однако в костном мозге
после коррекции выявлено снижение данного показателя (54,4022,89), значение
которого опустилось ниже показателей группы сравнения (p<0,05). Снижение
жизнеспособности клеток костного мозга, вероятнее всего, является отражением
высокой иммунотоксичности соединений бериллия, в частности гидроокиси
бериллия.
ISSN 1727-9712
Гигиена труда и медицинская экология. №4 (25), 2009
47
Таблица 3 - Влияние фторбериллата аммония на клеточность иммунокомпетентных органов (М±m)
Группа
Масса органа, г
I группа, n=8
II группа, n=9
IV группа, n=8
5,241,64
5,181,61
5,481,84
I группа, n=8
II группа, n=9
IV группа, n=8
3,721,34
3,421,04
4,801,51
Жизнеспособность, %
Селезенка
43,5015,20
29,5012,26*
33,0011,92
Костный мозг
66,5022,88
56,0023,04*
63,7520,07
Ядросдержащие
клетки, 106/г
455,62149,61
337,56154,76*
393,95110,28*
91,3932,19
50,1021,61*
56,7021,77*
Примечание - * - достоверность (p<0,05) различий с контрольной группой,  - достоверность (p<0,05) различий
с группой сравнения
Изученные состояния никак не отразились на изменение содержания Влимфоцитов в крови крыс (таблица 4).
Известно, что фагоцитоз один из наиболее общих механизмов гомеостаза,
который проявляет активность при разнообразных нарушениях здоровья [8]. Воспринимая многочисленные сигналы о дестабилизации внутренней среды, фагоциты активируют свои функции, нацеленные на ее восстановление. Это универсальный принцип, который лежит в основе всех фагоцитарных реакций, делая их
индикатором нормы и патологии, благополучия и неблагополучия организма в
целом [9].
Таблица 4 - Влияние бериллия на относительное содержание В-лимфоцитов и фагоцитоз
нейтрофилов (М±m)
Группа
I группа, n=8
III группа, n=10
V группа, n=9
II группа, n=9
IV группа, n=8
В-лимфоциты, %
Адгезия нейтрофилов, %
Фагоцитоз, %
34,0015,55
33,6014,15
28,4016,03
28,7514,00
33,5018,50
51,0024,37
41,2219,14
37,4017,45*
23,5012,22*
28,2515,87*
24,0011,41
24,0010,36
26,4010,86
28,0012,90
24,5011,27
Примечание - * - достоверность (p<0,05) различий с контрольной группой
Клиническое значение функциональных показателей фагоцитоза можно
рассматривать с двух точек зрения. Во-первых, они могут быть использованы для
суждения о резервах иммунитета. Во-вторых, такая информация может быть
полезна для определения глубины и динамики патологических сдвигов [9].
ISSN 1727-9712
Гигиена труда и медицинская экология. №4 (25), 2009
48
В нашем случае мы фиксировали два показателя из системы фагоцитоза –
адгезия и поглощение (эндоцитоз) инородных частиц (таблица 4).
Исследование функциональной активности нейтрофилов выявило неоднозначные изменения. Под воздействием растворимых соединений бериллия (II
группа) значимо снижалась адгезионная активность нейтрофилов (23,5012,22),
тогда как фагоцитарная активность не претерпевала изменений. Однако и адгезия,
и фагоцитоз - формы клеточного движения, поэтому нарушению адгезионной
функции будет сопутствовать и недостаточность поглотительной. Токсическое
действие бериллия на один из важных этапов фагоцитоза может провоцировать
развитие нейтрофилзависимых заболеваний, в частности хроническую персистенцию инфекции в организме.
Проведенная коррекция в наших исследованиях не привела к нормализации адгезионной активности нейтрофилов, а в группе крыс, подвергавшихся воздействию гидроокиси бериллия (V группа), продолжала снижаться - 37,4017,45
(таблица 4).
Нарушение активности нейтрофилов является достаточно частым спутником различных аллергических состояний [10]. Эта популяция иммуннокомпетентных клеток приобретает особое значение при развитии аллергии по нескольким
причинам: нейтрофилы участвуют практически во всех звеньях любого воспаления, в том числе и аллергического. Они осуществляют первую линию защиты от
аллергенов: захватывают, переваривают, представляют антиген и отвечают за его
дальнейший путь в организме. Также нейтрофилы содержат фермент гистаминазу, которые является основным фактором дезактивации гистамина – главного
медиатора аллергической реакции немедленного типа. Исход аллергического воспаления неотделим от функционального состояния гранулоцитов [10]. Учитывая
результаты большого количества экспериментальных исследований при бериллиозе, показавших неспецифический псевдоаллергический характер развития аллергических реакций, токсическое поражение нейтрофильного звена является патогномоничным при данной патологии.
Исследование сенсибилизирующего действия бериллия пероксидазным методом показало высокую его аллергенность (таблица 5). При исследовании чувствительности клеток к фторбериллату аммонию и гидроокиси бериллия была выявлена высокая степень аллергочувствительности, даже в группе интактных животных. В группе крыс, подвергавшихся воздействию гидроокиси бериллия наблюдалась наиболее высокая степень гиперчувствительности к исследуемому препарату
(0,35 0,17). Следует отметить, что после коррекции наблюдается снижение
аллер-гочувствительности к соединению бериллия (0,22 0,08). А в группе крыс,
подвер-гавшихся воздействию фторбериллата аммония и вовсе получено
исчезновение аллергической реакции in vitro к данной форме бериллия
(0,10 0,04).
ISSN 1727-9712
Гигиена труда и медицинская экология. №4 (25), 2009
49
Таблица 5 - Определение аллергизирующего действия бериллия
Группа
I группа, n=8
III группа, n=10
II группа, n=9
Коэффициент чувствительности, М±m
Отрицательный контроль,
физ.раствор
Гидроокись бериллия
Фторбериллат аммония
До коррекции
После коррекции
До коррекции
После коррекции
0,11 0,01
0,23
0,25
0,35
0,22
0,17
0,10
0,05*
0,07*
0,17*
0,08*#
0,11*
0,04*&
Примечание - * - достоверность (p<0,05) различий с отрицательным контролем, & - достоверность (p<0,05)
различий с контрольной группой,  - достоверность (p<0,05) различий с группой сравнения
Таким образом, выявленное в результате эксперимента подавление и ослабление токсико-аллергических реакций на фоне коррекции биологически активной добавки явилось ярким доказательством дезинтоксикационных свойств природного энтеросорбента.
Выводы
1. Результаты проведенного комплексного исследования иммунотоксичности фторбериллата аммония и гидроокиси бериллия выявили токсический эффект на органы иммунопоэза – тимус и селезенку. Данные соединения бериллия
вызывают значимую лейкопению и поражение нейтрофильного звена иммунной
системы.
2. Установлен аллергизирующий потенциал бериллия, в основе которого
могут лежать механизмы псевдоаллергии. Нарушения, сопровождающиеся гиперчувствительностью к антигенам, могут являться наиболее частой формой проявлений иммунотоксического действия промышленных токсикантов.
3. Полученные результаты свидетельствуют о ярко выраженном биологическом действии бериллия, его высокой токсичности, политропности его воздействия на различные системы живой клетки и организма в целом.
4. Положительный эффект биологически активной добавки «Бронхоастмин», выявленный в результате проведенного эксперимента позволяет рекомендовать его для дальнейшего изучения возможности предупреждения токсико-аллергических состояний у людей, вызванных воздействием соединений бериллия.
Литература
1. Петров Р.В. Иммунология и иммуногенетика. -М., 2000. -256 с.
ISSN 1727-9712
Гигиена труда и медицинская экология. №4 (25), 2009
50
2. Иммунологическая инженерия /Под ред. Д.У.Джирша: Пер. с англ. -М.,
2002. - 236 с.
3. Федосеева В.Н., Порядин Г.В., Ковальчук Л.В. Руководство по иммунологическим и аллергологическим методам в гигиенических исследованиях. – М.,
1993. – 320 с.
4. Газизов У.М., Тулебаев Р.К., Козаченко Н.В., Годунова М.И., Мухамедиева Г.А. Способ выявления профессиональной аллергии к угольной пыли
//Предварительный патент на изобретение № 19122. -2007.- 8с.
5. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. - М.:
Наука, 1989. – 125 с.
6. Архипова О.Г., Иванова А.С., Розенберг П.А. Применение и токсические
свойства бериллия и его соединений //В кн.: Бериллиоз. -М.: Медицина, 1972. С.7-20.
7. Уран и бериллий. Проблемы выведения из организма /Под.ред В.С. Балабуха. - М.: Атомиздат, 1976. -216с.
8. Пикуза О.И., Маянский А.Н. Клинические перспективы изучения фагоцитоза // Казанский медицинский журнал.-1994.-Т.LXXY.-В.3.- С.193-196.
9. Земское М.В., Земское А.М. Клиническое значение функциональных
показателей фагоцитоза //Иммунология. -2004.-№ 1.- С.5-10.
10. Бережная Н.М. Нейтрофилы и иммунологический гомеостаз. –Киев:
Наукова думка, 1988. -326 с.
Тұжырым
Ұзақ сынаудағы эксперименттік жануарлардың аммоний фторбериллатының жəне берилий гидрототығының əсер етуі кезінде иммундық жүйесінің бұзылуы көрсетілген. Толық иммундық органдардың жасушаларын, нейтрофилдардың
фагоцитарлық белсенділігін зерттеу кезінде берилийдің потенциалын тұспалдайтын иммунопоэз органдарына улы əсері анықталған. Олардың негізінде псевдоаллергия механизмдері жатуы мүмкін.
Түйінді сөздер: берилий, иммун улылығы, толық иммундық органдар, нейтрофилдардың адгезиясы жəне фагоцитозі
Summary
There are shown the damage of the immune system after effect of ammonium
fluorine-beryllate and beryllium hydro oxide at experimental animals in the chronic
experiment. During study the cell-forming of immune-competent organs, phagocyte
activity of neutrophiles there were revealed toxic effect to the organs of immuneISSN 1727-9712
Гигиена труда и медицинская экология. №4 (25), 2009
51
forming, allergenic potential of beryllium, in which basis there can be mechanisms of
pseudo-allergy.
Key words: beryllium, immune-toxic, cell-forming of immune-competent organs,
adhesion and phagocytosis of neutrophiles
ISSN 1727-9712
Гигиена труда и медицинская экология. №4 (25), 2009