СОДЕРЖАНИЕ РАСТВОРИМОГО CD50 АНТИГЕНА И

УДК 576.8.097.2: 616.972=616-002.6
СОДЕРЖАНИЕ РАСТВОРИМОГО CD50 АНТИГЕНА
И ГЕТЕРОДИМЕРА «β2-МИКРОГЛОБУЛИН-HLA
АНТИГЕНЫ I КЛАССА» В КРОВИ БОЛЬНЫХ
МАНИФЕСТНЫМИ ФОРМАМИ СИФИЛИСА
Е.С. Вязьмина, Н.А. Добротина, А.И. Речкин, В.В. Новиков
Нижегородский госуниверситет
Ю.С. Птицына, Т.Г. Мартынова
Нижегородский НИИЭМ
Л.М. Абалкина
Областной КВД г. Нижнего Новгорода
Проведена количественная оценка содержания растворимой формы
дифференцировочного антигена CD50 и гетеродимера «β2-микроглобулинHLA антигены I класса» в крови больных манифестными формами сифилиса. Показано, что большая часть исследованных сывороток от больных сифилисом имеет повышенный уровень sCD50 антигена и пониженный уровень гетеродимера, что, вероятно, отражает особенности иммунных реакций
при этом заболевании.
Антигены главного комплекса гистосовместимости, как и многие другие мембранные поверхностные белки, являются гликопротеидами. Молекулы антигенов
HLA I класса построены из α-цепи, кодируемой областью генов HLA, и нековалентно ассоциированной с ней β-цепи. Последняя называется также β2-микроглобулином и не кодируется областью генов HLA. Молекула HLA I класса имеет
4 домена. Три из них относятся к α-цепи, четвертый — к β2-микроглобулину. Молекулы HLA I класса доставляют к клеточной поверхности пептиды из цитозоля.
Комплекс HLA-пептид узнается CD8+ цитотоксическими Т-лимфоцитами. Растворимые антигены HLA I класса (sHLA) могут быть продуктами шеддинга (протеолитического отщепления с мембраны клетки) или альтернативного сплайсинга
(Rhynes et al., 1993). sHLA I класса в сыворотке крови присутствует как в виде гетеродимера «β2-микроглобулин-HLA антигены I класса», так и в виде мономерной α-цепи. Уровень антигенов sHLA I класса повышается в условиях активации
Т-клеток при вирусных инфекциях, аутоиммунных процессах, трансплантации
органов (Moore et al., 1997).
Отмечено повышение уровня sHLA I класса при аутоиммунном заболевании
системная красная волчанка, причем его повышенное содержание коррелировало
с активностью заболевания. Результаты предполагают, что повышение уровня
sHLA I при этой патологии отражает усиление шеддинга антигенов гистосовместимости с клеточных мембран (Brecsiani et al., 1998; Hagihara et al., 1993). Обнаружено повышение уровня sHLA I класса в сыворотке крови и моче больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом. Концентрация sHLA I класса
218
в сыворотке крови и моче может служить объективным параметром для оценки
тяжести заболевания (Park et al., 1997). Растворимая форма sHLA I класса широко
исследуется при вирусных гепатитах В и С (Piazzola et al., 1998; Птицына и др.,
2000). Повышение уровня sHLA I класса при хроничесих вирусных гепатитах может говорить о сходе этих молекул с мембран гибнущих гепатоцитов, пораженных вирусом (Sakaguchi et al., 1992).
СD50 антиген (ICAM-3) по структурным характеристикам входит в семейство
иммуноглобулинов и относится к группе молекул адгезии, обеспечивающих различные аспекты взаимодействия клеток крови друг с другом и компонентами экстраклеточного матрикса (Козлов и др., 1995). Молекула CD50, наряду с CD54 и
CD102 антигенами, взаимодействует с молекулой LFA-1. ICAM-3 — главный лиганд для LFA-1 при инициации иммунного ответа, в том числе при адгезии покоящихся Т-лимфоцитов на антиген-презентирующих В-клетках. Установлено,
что увеличение уровня растворимого CD50 антигена в сыворотке крови наблюдается при различных патологических состояниях, сопровождающихся длительной
активацией клеток и может иметь диагностическое и прогностическое значение.
Функциональное значение растворимого CD50 антигена, вероятно, заключается в
ограничении процессов адгезии. Например, известно увеличение уровня растворимого CD50 антигена при системной красной волчанке, причем его содержание в
сыворотке крови коррелирует с уровнем растворимого CD27 антигена, характерного для Th1 клеток. Повышение сывороточного уровня данных молекул рассматривают как один из способов торможения чрезмерной активации иммунной
системы, наблюдающейся при красной системной волчанке.
Весьма ограничена информация о роли растворимых антигенов в механизмах
патогенеза широко распространенных бактериальных инфекций. Отсутствуют
данные об их роли в развитии такой социально-значимой инфекции, как сифилис.
Не исследовано участие растворимых форм мембранных антигенов в формировании особенностей иммунного ответа хозяина на инфицирование организма бледной трепонемой. Целью настоящей работы явилось проведение количественной
оценки содержания растворимого CD50 антигена и sHLA антигена I класса у
больных манифестными формами сифилиса.
Материалы и методы. Материалом для исследования явились 136 образцов
сыворотки крови больных манифестными формами сифилиса, имеющих положительные значения комплекса стандартных серологических реакций (КСР), полученных в Областном кожно-венерологическом диспансере г. Нижнего Новгорода.
В качестве контрольной группы использовали сыворотку крови здоровых доноров. Исследования проводили с помощью коммерческой иммуноферментной тестсистемы «ИФА-анти-СИФ» производства НПК «Препарат», а также иммуноферментных тест-систем для количественного определения содержания растворимой
формы дифференцировочного антигена CD50 и растворимого комплекса: антигены главного комплекса гистосовместимости HLA I класса, ассоциированные с
молекулой β 2-микроглобулина. Коммерческая тест-система «ИФА-анти-СИФ»
предназначена для выявления суммарных антител класса IgG и IgM, направленных к антигенам возбудителя сифилиса Treponema pallidum, в сыворотке крови, и
основана на использовании смеси рекомбинантных белковых антигенов и синтетического пептида, воспроизводящего аминокислотную последовательность иммунодоминантного эпитопа одного из белков Treponema pallidum.
Диагностикум для количественного определения растворимого CD50 антигена
в сыворотке крови человека был сконструирован авторами на основе поликло219
нальных антител против мембранных антигенов мононуклеарных клеток крови
человека и моноклональных антител (МКА) ИКО-60, направленных против CD50
антигена и конъюгированных с пероксидазой хрена (Птицына и др., 2000). Концентрацию растворимого CD50 антигена оценивали в условных единицах (УЕ).
Для определения в сыворотке крови растворимого гетеродимера «β2-микроглобулин-HLA антигены I класса» была использована разработанная авторами
иммуноферментная тест-система с использованием пары моноклональных антител: МКА ИКО-53 − против молекул HLA I класса и МКА ИКО-216 — против β2микроглобулина. МКА ИКО-53 предварительно очищали риванолом по общепринятой методике (Фримель, 1987) и сорбировали на твердую фазу. МКА ИКО-216
конъюгировали с пероксидазой хрена перйодатным методом (Фримель, 1987) и
использовали в качестве конъюгата. Концентрацию растворимого комплекса «β2микроглобулин-HLA антигены I класса» также оценивали в условных единицах
(УЕ).
Проведение иммуноферментного анализа (ИФА). МКА ИКО-53 и поликлональные антитела для сорбции разводили 0.85%-ным NaCl и вносили в лунки
планшетов в объеме 100 мкл. Планшеты инкубировали 24 часа при комнатной
температуре, затем промывали 0.85%-ным раствором NaCl, содержащим 0.01 М
Na-фосфатный буфер рН 7.4 и 0.1%-ный твин-20 (ФСРТ). Затем образцы сывороток крови, предварительно разведенные в соотношении 1:10 (для определения
HLA I класса) и 1:2 (для определения растворимого CD50 антигена), вносили в
лунки планшетов в обьеме 100 мкл и инкубировали 24 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали, как описано выше, и в лунки вносили по 100 мкл
конъюгата в рабочем разведении. Планшеты инкубировали 50 минут при температуре 370С. После промывки планшетов в лунки вносили по 100 мкл раствора
субстратной смеси, содержащей 0.01% ортофенилендиамина и 0.05% Н2О2 в 0.05
М цитратном буфере рН 5.0. Планшеты инкубировали 10 минут при комнатной
температуре и затем для остановки реакции в лунки добавляли по 50 мкл 0.1 М
раствора Н2SO4. Учет результатов проводили при длине волны 492 нм с использованием фотометра АИФ-М/340.
Результаты и обсуждение. Как указано в разделе «Материалы и методы», в
работе были использованы образцы сыворотки крови от больных манифестными
формами сифилиса, характеризующейся положительными значениями комплекса
стандартных серологических реакций (КСР), а также наличием высокого титра
антител класса IgG к возбудителю сифилиса Treponema pallidum. В 63 образцах
сыворотки крови было проведено определение уровня растворимой формы CD50
антигена, а в 73 образцах своротки крови проводили оценку содержания растворимого комплекса «β2-микроглобулин-HLA антигены I класса».
Сравнение усредненного уровня гетеродимера «β2-микроглобулин-HLA антигены I класса» в крови больных манифестными формами сифилиса и в крови здоровых доноров не выявило статистически достоверных различий между группами
по значениям данного показателя. У больных уровень гетеродимера соответствовал 795.1±150.0 УЕ (n = 73), у здоровых доноров он был равен 998.5±115.3 УЕ
(n = 35), т. е. наблюдалось небольшое понижение уровня гетеродимера, однако,
оно не выходило за рамки статистически достоверных различий. Более детальный
анализ результатов показал, что группу больных манифестными формами сифилиса по уровню содержания гетеродимера «β2-микроглобулин-HLA антигены I
класса» можно разделить на три подгруппы: с нормальным ( M ± 2σ ) содержанием (24.6% обследованных), с повышенным содержанием (16.4% обследован220
ных) и с пониженным содержанием (58.9% обследованных). Интересно отметить,
что большая часть обследованных больных (58.9%, 43 образца сыворотки) показала значительно пониженный уровень гетеродимера (в 3.3 раза) по сравнению с
группой здоровых доноров. Содержание гетеродимера в этой группе составляло
303.8±19.9 УЕ и статистически достоверно отличалось от уровня гетеродимера у
здоровых доноров (р < 0.05). 12 образцов (16.4%) показали значительно повышенные значения исследуемого показателя, соответствующие 2504.1±291.2 УЕ и
отличающиеся в 2.5 раза от нормы (p < 0.05). 18 образцов сыворотки (24.6%) укладывались в пределы нормы (рис. 1).
УЕ
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
1
2
3
4
Рис. 1. Содержание растворимого гетеродимера «β2-микроглобулин-HLA
антигены класса I» в сыворотке больных манифестными формами сифилиса
1 — здоровые доноры; 2 — больные сифилисом с пониженным содержанием
антигена sHLA I класса; 3 — больные сифилисом с нормальным содержанием sHLA
I класса; 4 — больные сифилисом с повышенным содержанием sHLA I класса
Сравнение усредненного уровня растворимого CD50 антигена (sCD50) в сыворотках крови больных манифестными формами сифилиса с уровнем sCD50 у здоровых доноров выявило статистически достоверные различия в содержании данного показателя. У здоровых доноров уровень растворимого CD50 антигена составил 342.8±32.4 УЕ (n = 35), у больных сифилисом — 644.7±86.0 УЕ (n = 63),
что в 1.8 раза превышает значение показателя у здоровых доноров (р < 0.05). Детальный анализ результатов показал, что группу больных сифилисом по уровню
содержания sCD50 антигена также можно разделить на три подгруппы: с повышенным содержанием антигена (55.5% обследованных), с нормальным ( M ± 2σ )
его содержанием (25.3% обследованных) и с пониженным содержанием (19.0%
обследованных). В сыворотке крови больных первой подгруппы (35 человек) содержание sCD50 антигена было в 2.8 раза выше по сравнению со здоровыми донорами и составляло 964.0±98.9 УЕ. В то же время, в сыворотке крови больных
221
третьей подгруппы (12 человек) уровень растворимого CD50 антигена составил
величину, равную 138.5±20.4 УЕ, что в 2.4 раза ниже нормы (р < 0.05) (рис. 2).
УЕ
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
1
2
3
4
Рис. 2. Содержание растворимой формы CD50 антигена
у больных манифестными формами сифилиса:
1 — здоровые доноры; 2 — больные сифилисом с повышенным содержанием sCD50
антигена; 3 — больные сифилисом с нормальным содержанием sCD50 антигена;
4 — больные сифилисом с пониженным содержанием sCD50
Полученные результаты свидетельствуют о том, что у большинства больных
манифестными формами сифилиса в крови происходит изменение уровня растворимой формы CD50 антигена и гетеродимера «β2-микроглобулин-HLA антигены I
класса». Обнаруженные изменения в содержании растворимых антигенов указывают на нарушение активационных процессов иммунной системы при этой инфекции по сравнению с нормой. Неравномерное распределение уровня гетеродимера и sCD50 антигена в группе больных манифестными формами сифилиса,
большой разброс данных между подгруппами с повышенным и пониженным содержанием этих показателей может отражать особенности иммунитета в целом и
индивидуальные особенности иммунной системы макроорганизма в ответ на проникновение возбудителя. Нужно заметить, что широкий разброс данных в содержании растворимых антигенов зарегистрирован при самых разных патологических состояниях, например, при вирусных гепатитах В и С (Piazzola et al., 1998).
В литературе имеются сведения об исследованиях иммунитета у больных с
разными стадиями инфекции и различными клиническими формами. Авторы отмечают уменьшение при сифилисе количества Т-лимфоцитов, нейтрофилов, повышение уровня циркулирующих иммунных комплексов, изменение состава и
размера этих комплексов в сторону преобладания мелких при снижении уровня
крупных (Бахметьева, 1988). Наблюдается угнетение неспецифических факторов
защиты организма, изменение функционального состояния иммунной системы:
торможение спонтанного розеткообразования, снижение митогенного ответа Тлимфоцитов на фитогемагглютинин, гиперфункция В-лимфоцитов, выражающаяся в повышенной продукции IgG и IgM (Захаров, 1986). Усиленная продукция IgG
антител при ранних формах сифилиса сопровождается активацией Т-супрессоров
(Цераиди, 1985). При манифестной форме сифилиса отмечается возбужденное со222
стояние покоящихся нейтрофилов (Резайкина и др., 1997). Установлено, что у
больных сифилисом отмечается снижение содержания Т-лимфоцитов и снижение
иммунорегуляторного индекса (Цераиди, 1986). У больных разными формами сифилиса самый высокий уровень интерлейкина-2 наблюдается при раннем и позднем скрытом сифилисе. При сравнительном изучении показателей неспецифической иммунологической реактивности у больных с активными проявлениями сифилиса и у больных с латентными формами сифилитической инфекции были получены данные, свидетельствующие о разной напряженности неспецифического
иммунитета при различных стадиях инфекционного процесса (Прохоренков и др.,
2000).
Таким образом, по нашим данным, высокая полифункциональность главного
комплекса гистосовместимости взаимосвязана с регуляцией иммунного гомеостаза, межклеточными взаимоотношениями, общей реактивностью организма, что, в
частности, проявляется при такой патологии, как сифилис.
Можно предположить, что количественное содержание растворимых антигенов в сыворотке крови отражает особенности развития заболевания: переход активной формы сифилиса в скрытую (ранний, поздний скрытый сифилис), формирование серорезистентных состояний и т. д. Выявление таких состояний может
зависеть от генетически обусловленных особенностей иммунологического реагирования различных категорий больных (Данилов, Назаров, 2000). Генетические
различия также могут играть роль в регуляции резистентности и чувствительности организма к сифилису (Цераиди и др., 1992). Вероятно, обнаруженные изменения в содержании растворимых антигенов отражают особенности индивидуальных иммунных реакций больных на клеточном и молекулярном уровне, которые требуют дальнейшего изучения. Будущее за разработкой констелляций (сочетаний) различных адекватных иммунных реакций, которые могли бы включать
растворимые формы дифференцировочных антигенов наряду с другими показателями иммунологических реакций и диагностическими критериями.
ЛИТЕРАТУРА
Бахметьева Т.М. Роль иммунных нарушений в развитии серорезистентности при сифилисе и эффективности спленина в комплексной терапии больных: Автореф. дис. ... канд.
мед. наук. М., 1988.
Данилов С.И., Назаров П.Г. Новая концепция формирования серорезистентности после лечения сифилиса // Инфекции, передаваемые половым путем. 2000. № 2. С. 16–19.
Захаров В.К. Сочетание неспецифических средств защиты и иммунологической реактивности у больных скрытым сифилисом в процессе лечения: Автореф. дис. ... канд. мед.
наук. Киев, 1986.
Козлов И.Г., Горлина Н.К., Чередеев А.Н. Рецепторы контактного взаимодействия //
Иммунология. 1995. № 4. С. 14–24.
Прохоренков В.И., Шергин С.Н., Карачева Ю.В. Скрытый сифилис: современное состояние проблемы // Инфекции, передаваемые половым путем. 2000. № 1. С. 9–14.
Птицына Ю.С., Матвеева Е.М., Мартынова Т.Г. и др. Растворимая форма CD50 антигена в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных лиц и больных гепатитами В и С // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. 2000. Т. 1, № 2. С. 47–48.
Резайкина А.В., Аковбян В.А., Куршакова Т.С. и др. Реактивность нейтрофилов у
больных сифилисом // Вестник дерматологии и венерологии. 1997. № 2. С. 39–41.
223
Фримель Г. Иммунологические методы. М., 1987.
Цераиди Н.Ф. Некоторые механизмы иммунодепрессии при сифилисе // Вестник дерматологии и венерологии. 1985. № 12. С. 29–34.
Цераиди Н.Ф. Т-клеточные субпопуляции у больных сифилисом // Вестник дерматологии и венерологии. 1986. № 5. С. 24–27.
Цераиди Н.Ф., Мажников А.Т., Поспелов Л.Е. Антигены HLA у больных ранним,
поздним и серорезистентным сифилисом // Вестник дерматологии и венерологии. 1992.
№ 8. С. 14–18.
Bresciani A., Pirozzi G., Spera M. et al. Increased level of soluble serum HLA class I antigens in patiens with systemic lupus erythematosus. Correlation with disease activity // Tissue Antigens. 1998. V. 52. P. 44−50.
Hagihara M., Shimura T., Yamamoto K. et al. Clinical significance of serum soluble HLA
class I antigens in systemic lupus erythematosus // Tokai J. Exp. Clin. Med. 1993. V. 18. P.
61−64.
Moore C., Ehlayel M., Inostroza J. et al. Elevated levels of soluble HLA class I (sHLA-I) in
children with atopic dermatitis // Ann. Allergy Asthma Immunology. 1997. V. 79. P. 113−138.
Park C.W., Yun S.N., Yang C.W. et al. Serum and urine soluble HLA class I antigen
conсentrations are increased in patients with hemmorragic fever with renal syndrome // Korean J.
Intern. Med. 1997. V. 12. P. 52−57.
Piazzola G., Tortorella C., Fiore G. et al. Immunoresponsiveness in chronic hepatitis C patients: correlation between tissue and serum findings // Immunopharmacol Immunotoxicol. 1998.
V. 20. P. 337−354.
Rhynes V.K., McDonald J.C., Gelder F.B. et al. Soluble HLA class I in the serum of transplantant recipients // Ann. Surg. 1993. V. 217. P. 485−499.
Sakaguchi K., Koide N., Takenami T. et al. Soluble HLA class I antigens in sera of patients
with chronic hepatitis // Gastroenterology Jpn. 1992. V. 27. P. 206−211.
224