ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЕВМАТОЛОГИИ имени В.А. НАСОНОВОЙ»
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЕВМАТОЛОГИИ имени В.А. НАСОНОВОЙ» На правах рукописи НОВИКОВ Александр Александрович МНОГОПАРАМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛАБОРАТОРНЫХ БИОМАРКЕРОВ В ДИАГНОСТИКЕ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА 14.03.10 – Клиническая лабораторная диагностика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, АЛЕКСАНДРОВА Елена Николаевна МОСКВА – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………….. ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………. 1.1.Общая характеристика лабораторных биомаркеров ревматоидного артрита………………………………………………………………….... 1.2. Аутоантитела……………………………………………………………. 1.3. Показатели острой фазы воспаления………………………………….. 1.4. Маркеры метаболизма костной и хрящевой ткани…………………... 1.5. Цитокины……………………………………………………………….. 1.6. Многопараметрический анализ лабораторных биомаркеров при ревматоидном артрите………………………………………………….. 1.6.1. Кандидатные биомаркеры ревматоидного артрита………………… 1.6.2. Многопараметрические диагностические индексы в лабораторной диагностике и оценке активности ревматоидного артрита………... 1.6.3. Многопараметрический анализ биомаркеров в оценке эффективности терапии ревматоидного артрита генноинженерными биологическими препаратами………………………. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………. 2.1. Общая клиническая характеристика больных………………………... 2.2. Методы исследования………………………………………………….. 2.2.1. Методика определения IgM ревматоидного фактора……………… 2.2.2. Методика определения IgA ревматоидного фактора………………. 2.2.3. Методика определения антител к циклическому цитруллинированному пептиду……………………………………... 2.2.4. Методика определения антител к модифицированному цитруллинированному виментину…………………………………... 2.2.5. Методика определения антител к кератину………………………… 2.2.6. Методика определения С-реактивного белка………………………. 2.2.7. Методика определения кальпротектина…………………………….. 2.2.8. Методика определения лиганда рецептора активатора транскрипционного фактора κB……………………………………... 2.2.9. Методика определения олигомерного матриксного белка хряща… 2.2.10. Методика определения матриксной металлопротеиназы-3……… 2.2.11. Методика очистки сыворотки крови от IgM ревматоидного фактора……………………………………………………………………….. 2.2.12. Методика определения цитокинового профиля…………………... 2.2.13. Методы оценки диагностического значения биомаркеров при ревматоидном артрите…………………………………………….. 2.2.14. Методы статистической обработки результатов исследования…. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………… 3.1. Клиническое значение аутоантител при ревматоидном артрите….. 3.1.1. Ревматоидные факторы………………………………………………. стр. 4 6 18 18 18 22 23 25 41 41 42 43 53 53 57 58 59 59 60 61 61 62 63 63 64 65 65 68 69 71 71 71 3 3.1.1.1. Ревматоидный фактор класса IgM………………………………… 3.1.1.2. Ревматоидный фактор класса IgА…………………………………. 3.1.2. Антитела к цитруллинированным белкам………………………….. 3.1.2.1. Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду…….. 3.1.2.2. Антитела к модифицированному цитруллинировнному виментину…………………………………………………………... 3.1.2.3. Антитела к кератину……………………………………………….. 3.1.3 Многопараметрический анализ аутоантител при ревматоидном артрите………………………………………………………………… 3.2. Клиническое значение белков острой фазы воспаления при ревматоидном артрите………………………………………………… 3.2.1. С-реактивный белок…………………………………………………. 3.2.2. Кальпротектин……………………………………………………….. 3.3. Характеристика маркеров метаболизма костной и хрящевой ткани при ревматоидном артрите……………………………………………... 3.3.1. Лиганд рецептора активатора транскрипционного фактора κB…. 3.3.2. Олигомерный матриксный белок хряща……………………………. 3.3.3. Матриксная металопротеиназа-3………………………………….. 3.4. Мультиплексный анализ цитокинов при ревматоидном артрите…… 3.4.1. Оценка влияния IgM РФ на результаты измерения концентраций цитокинов……………………………………………………………... 3.4.2. Клиническое значение оценки цитокинового профиля при ревматоидном артрите………………………………………………… 3.5. Сравнение уровней биомаркеров ревматоидного артрита в крови и синовиальной жидкости………………………………………………... 3.6. Клинико-лабораторные особенности пациентов с ревматоидным артритом в зависимости от позитивности по антителам к цитруллинированным белкам…………………………………………... 3.7. Мультиплексный анализ биомаркеров в диагностике и оценке активности ревматоидного артрита…………………………………… 3.7.1. Многопараметрический анализ биомаркеров в лабораторной диагностике раннего ревматоидного артрита……………………….. 3.7.2. Многопараметрический анализ биомаркеров в лабораторной диагностике развернутого ревматоидного артрита…………………. 3.7.3. Применение многопараметрического анализа лабораторных биомаркеров для оценки активности ревматоидного артрита……... 3.8. Мультиплексный анализ биомаркеров для оценки эффективности применения генно-инженерных биологических препаратов при ревматоидном артрите…………………………………………………... 3.8.1. Прогнозирование эффективности применения химерных моноклональных антител к TNF-α (инфликсимаба)……………….. 3.8.2. Прогнозирование эффективности химерных моноклональных антител к мембранному CD20-антигену В-клеток (ритуксимаба)... 3.8.3. Прогнозирование эффективности гуманизированных моноклональных антител к рецепторам IL-6 71 80 88 88 97 106 113 114 114 115 117 117 118 119 120 120 121 134 139 144 144 148 152 156 156 165 4 (тоцилизумаба)………………………………………………………… ОБСУЖДЕНИЕ…………………………………………………………….. ВЫВОДЫ…………………………………………………………………… ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ………………………………… СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………... СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ BAFF COMP CTX-I ENA ENA-78 EULAR FGF G-CSF GM-CSF GRO-α HELIX-II ICAM ICTP IFN- γ IL IP-10 LIF MCP-1 MHC MIP NF-kB OPG PIIANP PINP RANKL RANTES SAA sIL-6R TGF TNF-α VEGF YKL-40 АCR АДА АКА АМЦВ АНФ АПФ АС АЦБ АЦЦП фактор активации B-клеток олигомерный матриксный белок хряща С-терминальный телопептид антитела к экстрагируемым антигенам эпителиальный нейтрофил – активирующий пептид 78 Европейская лига по борьбе с ревматизмом фактор роста фибробластов гранулоцитарный колониестимулирующий фактор гранулоцитарно-макрофогальный колониестимулирующий фактор рост-регулирующий онкоген α спиральный пептид коллагена II типа межклеточная молекула адгезии карбокситерминальный телопептид колагена 1-го типа интерферон- γ интерлейкин ИФН-γ-индуцибельный белок 10 лейкемию ингибирующий фактор моноцитарный хемоаттрактный белок-1 главный комплекс гистосовместимости макрофагальный белок воспаления ядерный фактор kB остеопротегерин N-терминальный пропептид проколлагена IIA типа N-терминальный пропептид проколлагена I типа лиганд рецептора активатора транскрипционного фактора κB хемокин, выделяемый Т-клетками при активации сывороточный амилоидный белок А растворимые рецепторы интерлейкина - 6 трансформирующий фактор роста фактор некроза опухоли α васкулоэндотелиальный фактор роста Хрящевой гликопротеин 39 Американская коллегия ревматологов адалимумаб антикератиновые антитела антитела к модифицированному цитрулинированному виментину антинуклеарный фактор антиперинуклеарный фактор анкилозирующий спондилит антитела к цитруллинсодержащим белкам антитела к циклическому цитруллинированному пептиду 173 181 208 211 212 5 АЧ ВГН ГИБП ДИ ДНК ДС ДЧ Ед/мл ЕИ ИНФ ИФА КП мг/л МДИ Ме МЕ/мл мм/ч ММП-3 мРНК НА ОА ОПОР ОППР пг/мл ППК ПСА РА РЗ РТМ РФ СКВ СОЭ СП СРБ СШ ТЦЗ ЧБС ЧПС аналитическая чувствительность верхняя граница нормы генно-инженерные биологические препараты доверительный интервал дезоксирибонуклеиновая кислота диагностическая специфичность диагностическая чувствительность Единицы/миллилитр единицы измерения инфликсимаб иммуноферментный анализ кальпротектин миллиграмм/литр индексы полученные путем многопараметрического анализа “in vitrо”, In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay, IVDMIA медиана международные единицы/миллилитр миллиметров/час матриксная металлопротеиназа-3 матричная рибонуклеиновая кислота недифференциированный артрит остеоартрит отношение правдоподобия отрицательного результата отношение правдоподобия положительного результата Пикограмм/мл площадь под кривой псориатический артрит ревматоидный артрит ревматические заболевания ритуксимаб ревматоидный фактор системная красная волчанка скорость осаждения эритроцитов системные проявления С-реактивный белок синдром Шегрена тоцилизумаб число болезненных суставов число припухших суставов 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Ревматоидный артрит (РА) – аутоиммунное ревматическое заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся хроническим эрозивным артритом (синовитом) и системным поражением внутренних органов [1]. В основе патогенеза РА лежит генетически детерминированная и индуцированная факторами внешней среды (курение, инфекции и др.) персистирующая активация приобретенного и врожденного иммунного ответа против разнообразных патогенов, что ведет к потере иммунологической толерантности в отношении собственных антигенов организма [2, 3]. Важной особенностью иммунопатологического процесса при РА является дефект В-клеточной толерантности, сопровождающийся продукцией аутоантител, и антиген-специфическая активация CD4+ Tлимфоцитов по Th-1 типу с преобладанием синтеза провоспалительных (интерлейкин – IL-12, интерферон γ – IFN-γ, фактор некроза опухоли α – TNF-α, IL-1β, -6, -7, -15 -17, -18) над противовоспалительными (IL-4, -5, -10, 13, трансформирующий фактор роста-β-TGF-β) цитокинами [4, 5]. При РА ранняя лабораторная диагностика и активная противовоспалительная и иммуносупрессивная терапия в дебюте болезни увеличивают вероятность достижения ремиссии и снижают риск развития необратимого повреждения внутренних органов и тканей. Однако диагностика данного заболевания является сложной задачей в связи с недостаточной специфичностью клинических признаков и низкой чувствительностью клинико-лабораторных критериев [6]. Современная лабораторная диагностика РА включает определение широкого спектра биомаркеров (аутоантител, показателей острой фазы воспаления, цитокинов, маркеров активации эндотелия, субпопуляций лимфоцитов, продуктов метаболизма костной и хрящевой ткани, генетических маркеров) в крови, синовиальной жидкости и синовиальной ткани [7, 8]. Наряду с «классическими», униплексными методами иммунодиагностики (ИФА, 7 непрямая реакция иммунофлюоресценции, нефелометрия, хемилюминисценция и др.) все шире применяется мультиплексный анализ биомаркеров, основанный на генетических, эпигеномных, транскриптомных и протеомных технологиях с использованием ДНК- и белковых микрочипов, ПЦР, проточной цитометрии, при этом наиболее перспективными в ревматологии являются протеомные исследования [9]. Результаты определения лабораторных биомаркеров позволяют получить объективную информацию о характере иммунопатологических нарушений при РА и являются важным активности, инструментом тяжести течения, для ранней прогноза диагностики, болезни и оценки эффективности проводимой терапии [10].Среди биомаркеров, ассоциирующихся с РА, наибольшее клиническое значение имеют аутоантитела (ревматоидный фактор – РФ класса IgM, антитела к цитруллинированным белкам – АЦБ) и острофазовые показатели (СОЭ, С-реактивный белок - СРБ), которые относятся к диагностическим критериям РА и могут использоваться при оценке прогноза этого заболевания [11]. РФ – аутоантитела IgM, IgA и IgG классов, реагирующие с Fc-фрагментом IgG. Наибольшее значение в клинической практике имеет IgM РФ, так как положительные результаты его определения в сыворотке крови являются диагностическим критерием РА [11]. IgМ РФ - диагностически чувствительный, но недостаточно специфичный показатель, так как может обнаруживаться в сыворотках при других ревматических заболеваниях (РЗ), хронических инфекциях, болезнях легких, злокачественных новообразованиях, первичном биллиарном циррозе и в пожилом возрасте [12]. Определение IgM РФ в высоких титрах полезно для прогнозирования быстропрогрессирующего деструктивного поражения суставов и системных проявлений при РА [2]. IgA РФ часто обнаруживается при РА с полиартикулярным вариантом начала заболевания и внесуставными (системными) проявлениями. Обнаружение IgA PФ может обладать 8 определенной прогностической ценностью в отношении развития тяжелой эрозивной деструкции суставов [13, 14]. Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП) – высокоспецифичный и чувствительный серологический маркер РА, превосходящий по своему диагностическому значению IgM РФ. Определение АЦЦП используется для диагностики раннего РА, подтверждения диагноза серонегативного РА, прогнозирования тяжелого эрозивного поражения суставов и дифференциальной диагностики с другими РЗ [15] Литературные источники указывают диагностическую эффективность модифицированному цитруллинированному на достаточно определения высокую антител виментину (АМЦВ) к для диагностики РА, при этом описывается более низкая диагностическая специфичность (ДС) данных антител по сравнению с АЦЦП [16, 17]. Показано, что АМЦВ может являться лучшим, чем АЦЦП предиктором крайне неблагоприятного прогноза суставной деструкции [18]. При этом, данные о взаимосвязи АМЦВ с активностью заболевания носят противоречивый характер. Антикератиновые антитела (АКА), являются еще одним представителем АЦБ и обладают высокой ДС при РА [19]. Отмечена связь позитивности по АКА с тяжестью заболевания и выраженностью суставной деструкции [20]. Несмотря на это, они не нашли широкого применения в клинической лабораторной практике из-за технических трудностей, связанных со стандартизацией субстрата и субъективностью оценки результатов иммунофлюоресцентного теста. Другим важным аспектом лабораторной диагностики РА является исследование уровня маркеров воспаления в крови, среди которых наиболее часто используются скорость осаждения эритроцитов СОЭ и СРБ [21]. СРБ – наиболее чувствительный и стандартизованный маркер воспаления, инфекции и тканевого повреждения. Уровень СРБ лучше всего коррелирует с индексом активности заболевания – Disease Activity Score 28 (DAS28) по 9 сравнению с другими острофазовыми белками [20]. Увеличение базальной концентрации СРБ рентгенологических ассоциируется изменений, с повышенным риском свидетельствующих развития о тяжелом деструктивном поражении суставов [21]. При РА в синовиальных ткани и жидкости, а также в сыворотке крови происходит повышение содержания такого провоспалительного маркера, как кальпротектин (КП), представляющего собой гетерокомплекс белков S100A8/S100A9. Описана корреляция сывороточной концентрация данного показателя с маркерами острой фазы воспаления (СОЭ, СРБ) активностью заболевания и прогрессированием суставной деструкции [22]. У пациентов с РА повышенные сывороточные концентрации таких показателей костного и хрящевого метаболизма, как: лиганд рецептора активатора транскрипционного фактора κB (RANKL) и олигомерный матриксный белкок хряща (COMP), матриксная металлопротеиназа-3 (ММП3) могут служить предикторами развития тяжелого деструктивного поражения суставов [23-25]. Провоспалительные цитокины способствуют развитию локальных провоспалительных эффектов, вызывая активацию эндотелия и накопление лейкоцитов в полости сустава, секрецию протеаз и матриксных металлопротеиназ; индуцируют костную деструкцию и образование паннуса; участвуют в развитии аутоиммунных нарушений и системных проявлений при РА. [26-32]. противовоспалительными Цитокины, свойствами, обладающие способны выраженными замедлять суставную деструкцию. Существуют данные об участии не только Th1 но и Th2 цитокинов в развитии раннего РА. Эти факты свидетельствуют о необходимости более тщательного изучения баланса между Th1 и Th2 типами иммунного ответа на разных стадиях заболевания [33-35]. В основе стратегии поиска биомаркеров лежит выявление из общего количества исследуемых показателей, так называемых “кандидатных” обладающих наилучшей диагностической чувствительностью (ДЧ) и 10 специфичностью (ДС). К настоящему времени не удалось обнаружить “идеальный” биомаркер РА обладающий высокими ДЧ и ДС - выявление которого позволяет поставить верный диагноз в отсутствие клинических признаков заболевания. В связи с этим, для повышения клинической информативности теста, начинают создаваться диагностические индексы полученные путем многопараметрического анализа “in vitrо” (In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay, IVDMIA, МДИ) [36-39]. Одной из наиболее актуальных задач иммунодиагностики является разработка и клиническая валидация МДИ для диагностики РА. Инструментом для этого может служить мультиплексный анализ – принципиально новый уровень лабораторных исследований в ревматологии, позволяющий проводить одновременное тестирование множества аналитов в одном образце биоматериала идентифицируя, таким образом, индивидуальные профили белковых биомаркеров [40]. Разработка и быстрое внедрение в клиническую практику генноинженерных биологических препаратов (ГИБП), включая моноклональные антитела против определенных детерминант иммунокомпетентных клеток, или провоспалительных цитокинов, обуславливает необходимость совершенствования иммунологических методов мониторинга и поиска предикторов эффективного ответа на проводимую терапию[5]. Данные, касающиеся использования прогнозирования эффективности иммунологических лечения ГИБП маркеров при РА, для являются достаточно противоречивыми. В последние годы в качестве предиктивных биомаркеров ответа на терапию ГИБП наряду с рутинными клиниколабораторными показателями все шире применяется мультиплексный анализ биомаркеров, основанный на протеомных технологиях, открывающий новые возможности в поиске иммунологических предикторов ответа на терапию ГИБП при РА [41]. Таким образом, применение многопараметрических иммунологических методов исследования открывает новые перспективы для идентификации 11 индивидуальных профилей лабораторных биомаркеров и создания МДИ, что в свою очередь позволит радикально улучшить раннюю диагностику РА (возможно, на доклинической стадии), оценку активности, тяжести заболевания, прогнозирование исходов патологического процесса и ответа на проводимое лечение. Цель исследования: Оценить значение многопараметрического анализа лабораторных биомаркеров в изучении особенностей иммунологических нарушений при РА, диагностике, оценке активности заболевания и прогнозировании эффективности терапии ГИБП. Задачи исследования: 1. Оценить клинико-диагностическое значение определения аутоантител (IgM/IgA РФ, АЦЦП, АМЦВ, АКА) в сыворотке крови при РА. 2. Изучить связь кальпротектин) в уровней белков сыворотке крови острой с фазы воспаления активностью (СРБ, заболевания и деструктивным поражением суставов при РА. 3. Проанализировать уровни маркеров метаболизма костной и хрящевой ткани (sRANKL, COMP, MMП-3,) в сыворотке крови при РА и их взаимосвязь с лабораторными показателями аутоиммунитета, воспаления и эрозивным поражением суставов. 4. Исследовать концентрацию цитокинов (IL-1β,-1ra,-2,-4,-5,-6,-7,-9,-10,-12,15,-17 TNF-α, IFN-γ, G-CSF, GM-CSF), хемокинов (IL-8,-10, MCP-1, MIP-1α,1β, IP-10, RANTES) и факторов роста (FGF-2, PDGF-BB, VEGF) в сыворотке крови при РА в сопоставлении с клинико-лабораторными проявлениями заболевания, оценить динамику показателей цитокинового профиля на фоне терапии ГИБП. 5. Сопоставить уровни биомаркеров в сыворотке крови и синовиальной жидкости у больных РА. 12 6. Сравнить профили протеомных маркеров у АЦБ-позитивных и АЦБнегативных пациентов с РА. 7. Разработать многорапаметрические лабораторные индексы для диагностики, оценки активности и прогнозирования эффективности терапии ГИБП при РА. Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение белковых биомаркеров, отражающих основные звенья иммунопатогенеза РА, включая исследование уровней аутоантител (РФ, АЦБ), белков острой фазы воспаления (СРБ, кальпротектин), маркеров костного и хрящевого метаболизма (RANKL, COMP, ММП-3), цитокинов, хемокинов, ростовых факторов в зависимости от клинических проявлений заболевания. Показано, что для ранней диагностики РА наибольшее значение имеет определение АЦБ, при этом АЦЦП обладают более высокой ДС, а АМЦВ ДЧ. При изучении белков острой фазы воспаления отмечена связь уровня кальпротектина с активностью РА. Установлена взаимосвязь между уровнями маркеров костного (sRANKL) и хрящевого метаболизма (СОМP) в сыворотке крови, активностью заболевания и степенью рентгенологической прогрессии при РА. Показана связь повышения уровней провоспалительных, антивоспалительных, Th1, Th2, Th17 цитокинов и колониестимулирующих факторов с гиперпродукцией аутоантител, белков острой фазы воспаления и изменением концентрации маркеров костного и хрящевого метаболизма. Установлено, что сывороточная концентрация белков острой фазы (СРБ), аутоантител (IgM РФ, АЦБ), провоспалительных, антивоспалительных, Th1, Th2 цитокинов и колонистимулирующих факторов отражает уровень данных биомаркеров в синовиальной жидкости. 13 Обнаружено, что цитокиновый профиль АЦБ-позитивных пациентов c РА в отличии от АЦБ-негативных, характеризуется более высокими уровнями провоспалительных (TNF-α, IL-15), антивоспалительных (IL-1rа,-2,-5,-9-10,12, эотаксин) цитокинов, колонистимулирующего фактора GM-CSF и хемокина MCP-1. Описаны различия в изменениях уровней аутоантител, белков острой фазы воспаления и цитокинового профиля на фоне применения различных классов ГИБП: ингибитора TNF-α (ИНФ), химерных моноклональных антител к мембранному CD20-антигену В-клеток (РТМ) и гуманизированных моноклональных антител к рецепторам интерлейкина-6 (TЦЗ). С использованием мультипараметрических методов исследования идентифицированы профили белковых биомаркеров при раннем РА и РА длительностью более 6 месяцев, и тем самым значительно расширены представления о клинико-патогенетическом и предиктивном значении аутоантител, острофазовых белков, маркеров костного и хрящевого метаболизма, цитокинов, хемокинов, ростовых факторов при данном заболевании. Впервые разработаны МДИ, основанные на измерении биомаркеров отражающих основные звенья иммунопатогенеза РА, обладающие высокой клинической информативностью и позволяющие на качественно новом уровне осуществлять прогнозировать раннюю эффективность диагностику, терапии оценку данного активности и заболевания с использованием ГИБП. Практическая значимость. На основе полученных данных определены наиболее клинически информативные биомаркеры РА. Обнаружение в сыворотках больных IgM РФ и АЦЦП рекомендуется использовать в качестве лабораторных критериев диагностики РА, а IgA РФ и АМЦВ в качестве дополнительных серологических маркеров заболевания у IgM РФ- и/или АЦЦП-негативных 14 пациентов. Высокие сывороточные концентраци IgM РФ, АЦЦП, АМЦВ, sRANCL и COMP могут свидетельствовать о развитии тяжелого эрозивного поражения суставов при РА. Измерение сывороточной концентрации острофазовых белков (СРБ, кальпротектина), маркеров костного и хрящевого метаболизма (sRANKL, COMP) и цитокинов (IL-6, G-CSF) позволяет уточнить активность РА. Мультиплексный анализ аутоантител, маркеров острой фазы воспаления, костного и хрящевого метаболизма; цитокинов; колониестимулирующих, стромальных, ангиогенных факторов, хемокинов позволяет идентифицировать персонифицированные белковые профили при РА, мониторировать их изменения в ходе прогрессирования заболевания, на фоне проводимой терапии, уточнить связь их особенностей с развитием деструктивного поражения суставов и активностью заболевания. Разработанные на основе мультиплексного анализа МДИ позволяют проводить раннюю диагностику, определять степень активности заболевания и прогнозировать эффективность терапии РА с использованием ГИБП. Положения, выносимые на защиту: 1. Протеомные биомаркеры (аутоантитела, белки острой фазы воспаления, показатели костного и хрящевого метаболизма, цитокины, хемокины, факторы роста), являются важным инструментом для диагностики, оценки активности, суставной деструкции и эффективности проводимой терапии с использованием ГИБП при РА. 2. Мультипараметрический анализ протеомных биомаркеров объективно отражает сложность и многообразие молекулярных механизмов патогенеза РА, что позволяет создавать МДИ. 3. Применение МДИ обладающих более высокой клинической информативностью по сравнению с результатами однопараметрических иммунологических исследований, является качественно новым уровнем в ранней диагностике, определении эффективности терапии ГИБП при РА. активности и прогнозировании 15 Конкретное участие автора в получении научных результатов. На основе анализа имеющихся литературных данных автором определены цель и задачи исследования, выбраны оптимальные методы для проведения научной работы, разработаны протоколы исследований, сформированы специальные электронные базы для хранения, накопления и использования данных на 993 больного РА и 616 лиц контрольной группы; выполнена статистическая обработка материала. На клинической базе ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой автором лично проведены лабораторные исследования и проанализированы их результаты. Автор самостоятельно разработал и применил алгоритм многопараметрического исследования биомаркеров у пациентов с РА. Полученные результаты были обобщены, проанализированы, обсуждены и сопоставлены с литературными данными, на их основании сформулированы выводы и практические рекомендации, которые были внедрены в практику. Результаты исследования отражены в публикациях, в которых личный вклад автора составляет 85%. Внедрение в практику. Основные результаты работы, проведённые в рамках научных тем ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой РАМН “Значение мультиплексных молекулярноклеточных технологий в лабораторной диагностике ревматических заболеваний” (Государственный регистрационный номер 01201180902, УДК 616.72-02.77-074) внедрены в практику ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой и регионы Российской Федерации. Методы определения РФ, АЦБ, sRANKL, COMP, цитокинов, хемокинов, ростовых факторов внедрены в работу клинических подразделений ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой, НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГУ РКНПК Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи, ММА им. И.М. Сеченова, и других лечебных учреждений г. Москвы. Материалы работы использованы в написании главы «Лабораторная диагностика» в национальном руководстве по ревматологии (М.: Гэотар-Медиа, 2008), главы “Лабораторная 16 диагностика ревматических заболеваний” в книге «Ревматология: клинические рекомендации» (под. ред. акад. Е.Л. Насонова, М.: ГэотарМедиа, 2010), диагностике главы “Инновационные ревматических технологии заболеваний” в книге в лабораторной “Лаборатория в современной клинике. Взгляд ведущих клиницистов России” (под ред. проф. В.В. Меньшикова, М., Лабора, 2010), главы “В-клетки при аутоиммунных ревматических заболеваниях” в книге “Анти-В-клеточная терапия в ревматологии: фокус на ритуксимаб” (под. ред. акад. Е.Л. Насонова. М.: ИМА-ПРЕСС, 2011), в главе “Роль лабораторных биомаркеров в оценке эффективности терапии ревматоидного артрита генно-инженерными биологическими препаратами” в книге “Генно-инженерные биологические препараты в лечении ревматоидного артрита” (под. ред. акад.Е.Л. Насонова. М.: Има-Пресс, 2013), книге «Современные стандарты лабораторной диагностики ревматических заболеваний» (М.: Биохиммак, 2012). Полученные данные последипломного используются образования для в лекционном практических врачей материале (Школа ревматологов). Апробация работы. Результаты диссертации доложены на ежегодных Европейских конгрессах ревматологов EULAR (Амстердам 2006, Барселона, 2007; Париж 2008; Копенгаген 2009, Рим 2010, Лондон 2011, Берлин 2012, Мадрид 2013), V съезде ревматологов России (Москва 2009), VI съезде ревматологов России (Москва 2013), ежегодных научно-практических конференциях Института Ревматологии РАМН (Москва 2009-2014), ежегодных школах ревматологов (Москва 2009-2014), Национальных днях лабораторной медицины России (Москва 2010-2013), XI Международном конгрессе “Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии” (Москва 2011), II Всероссийском конгрессе ревматологов России (Ярославль 2011), VII Всероссийской Конференции “Ревматология в реальной клинической практике” (Владимир, 2011), XVI научно-практической конференции 17 “Высокие технологии и модернизация в лабораторной медицине” (Москва, 2011), Национальной аллергология – конференции Практическому «клиническая здравоохранению» иммунология (Москва, и 2012), Межрегиональном форуме “Клиническая иммунология и аллергология – Междисциплинарные проблемы” (Казань, 2012), Евразийском конгрессе ревматологов (Алма-Ата, 2012), X научно-практической конференции ревматологов Южного Федерального округа (Краснодар, 2014), XIX Всероссийской научно-практической конференции “Консолидация науки и практики в лабораторной медицине” (Москва, 2014), II Евразийском конгрессе ревматологов (Москва, 2014), Всероссийской научно-практической междисциплинарной конференции с международным участием “Реабилитация и профилактика” (Москва, 2014). Первичная экспертиза диссертации проведена на заседании учёного совета ФГБУ «НИИР им. В.А. Насоновой» РАМН 23 июня 2014 года. Публикации. По материалам диссертации опубликована 91 печатная работа, из них 2 главы в монографиях, 46 статей опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертации на соискание степени доктора биологических наук, 1 статья и 26 тезисов опубликованы в международных рецензируемых журналах. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 260 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, клинической характеристики больных, методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографии. Работа иллюстрирована 101 таблицей, 25 рисунками и 2 графиками. Указатель литературы содержит 410 источников, в том числе 21 отечественный и 389 зарубежных. 18 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Общая характеристика биомаркеров ревматоидного артрита Прогресс в области современной экспериментальной и клинической иммунологии позволяет проводить эффективную лабораторную диагностику РА. Применяемые методики дают возможность получить объективную информацию о характере иммунопатологических изменений, являясь важным инструментом для диагностики, оценки активности, определения прогноза, выбора метода лечения болезни и мониторинга эффективности проводимой терапии [42, 43]. Лабораторная диагностика РА основанная на принципах доказательной медицины обеспечивает оптимальный выбор и использование иммунологических информативными являются методов, тесты, среди связанные которых с наиболее обнаружением циркулирующих аутоантител и маркеров острой фазы воспаления [44-46]. Следует отметить, значительно что превышает количество число “кандидатных” показателей биомаркеров вошедших в РА последние классификационные критерии данного заболевания (табл. 1) [11]. 1.2. Аутоантитела Основными диагностическими лабораторными маркерами РА являются РФ и АЦБ (IgM РФ и АЦЦП входят в классификационные критерии РА, EULAR/ACR, 2010 г.) [11]. Кроме этого существует ряд аутоантител, обнаружение которых в силу ряда причин не получило широкого распространения в лабораторной практике (антитела к RA-33, иммуноглобулин-связывающему белку, кальпастатину, α-энолазе, антитела к карбамилировнным белкам). Предполагается, что аутоантитела являются не только диагностическим маркером РА, но и принимают непосредственное участие в патогенезе заболевания [47]. 19 Таблица 1. Лабораторные биомаркеры РА Клиническое значение Активность Рентгенологическая Тяжесть прогрессия течения Аутоантитела IgM РФ* AЦЦП* АМЦВ Маркеры острой фазы воспаления СОЭ* СРБ* SAA Цитокины, хемокины, факторы роста TNF-α, IFN-γ, IL-1β, -2, -4, -7, 8, -6, -12, -13, -15, -17, рIL-6Р, YKL-40, MIF, MCP-1, VEGF, EGF-1 и др. Маркеры хрящевого метаболизма COMP, ММП, HELIX-II, ICTP, CTX-II Маркеры костного метаболизма RANKL, OPG, CTX-I, βCTX, PINP, PIIANP, остеокальцин + + + + Оценка эффективности терапии + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + *-биомаркеры вошедшие в классификационные критерии ACR/EULAR 2010 года. IgM РФ – чувствительный, но недостаточно специфичный маркер РА, так как обнаруживается в сыворотках при других РЗ, хронических инфекциях, болезнях легких, злокачественных новообразованиях, первичном биллиардном циррозе и в пожилом возрасте (табл. 2) [12, 15, 47-50]. Определение IgM РФ в высоких титрах является полезным тестом для прогнозирования быстропрогрессирующего деструктивного поражения суставов и системных проявлений при РА [52, 53]. IgA РФ часто обнаруживается при РА с полиартикулярным вариантом начала заболевания и внесуставными (системными) проявлениями, при IgAнефропатии, синдроме Шегрена, пурпуре Шенлейна-Геноха и инфекционном эндокардите. Обнаружение IgA PФ может обладать определенной прогностической ценностью в отношении развития тяжелой деструкции 20 суставов. Высокий уровень IgA РФ может быть предиктором отсутствия положительного клинического эффекта при использовании ряда ГИБП [13, 14]. IgG РФ обнаруживается при различных заболеваниях человека и в настоящее время его клиническое значение до конца не ясно [54]. В 1964 г. при изучении антиядерных антител у больных РА был выявлен антиперинуклеарный фактор (АПФ), чувствительности (40-91%) и аутоантитела показавший специфичности высокие (73-99%) значения [55-57]. Эти присутствовали как в сыворотке, так и в синовиальной жидкости больных [58]. Через 15 лет были обнаружены АКА, реагирующие с эпителием пищевода крысы, и установлена их высокая специфичность (9597%) при РА [19]. Во всех исследованиях отмечалась связь между позитивностью по АПФ и АКА с тяжестью заболевания и выраженностью деструкции суставов [20]. Несмотря на высокую специфичность этих маркеров для диагностики РА, они не нашли широкого применения в клинической лабораторной практике из-за технических трудностей, связанных со стандартизацией субстрата и субъективностью оценки результатов иммунофлюоресцентного теста. В 1993 г. было установлено, что мишенью для АКА в эпителии человека является белок филаггрин и на основании этого разработано определение антител к филаггрину иммуноблотингом и иммуноферментным анализом (ИФА). В качестве субстрата использовался очищенный филаггрин, выделенный из эпителиальной ткани человека [59-61]. Недостатком тестирования АФА с помощью иммуноблотинга и ИФА при использовании филаггрина, выделенного из кожи человека, является сложность получения его стандартизованных высокоочищенных препаратов. В 1998 г. Shellekens и соавт. обнаружили, что антигеном для всех перечисленных выше аутоантител является атипичная аминокислота цитруллин, а уже в 2000 г. был создан набор для определения АЦЦП IgG изотипа методом ИФА (АЦЦП1) [63, 64]. АЦЦП – наиболее высокоспецифичный и информативный диагностический маркер РА особенно, на ранней стадии болезни (табл. 2) 21 [50, 51, 61, 62, 65-70]. Определение АЦЦП имеет важное значение для диагностики серонегативного РА (частота обнаружения АЦЦП у РФотрицательных больных РА составляет 34,0-69,3%), дифференциальной диагностики РА с другими РЗ, прогнозирования тяжелого эрозивного поражения суставов [51, 64, 69, 71- 76]. Таблица 2 Диагностическое значение IgM РФ и АЦБ при РА IgM РФ Диагностическая чувствительность % Диагностическая специфичность % Предсказательная ценность положительных результатов % Предсказательная ценность отрицательных результатов % Отношение правдоподобия положительных результатов Отношение правдоподобия отрицательных результатов ROC-анализ (площадь под кривой) 50-90 80-93 84 89 4,9 0,4 0,8 РА 91 99 87,5 86,5 17,0 0,2 0,9 АЦЦП АМЦВ ранний РА 71 77 99 89 96 60 81 82 6,0 3,0 0,7 0,3 0,9 0,9 В настоящее время IgM РФ и АЦЦП рассматривают как различные системы аутоантител, что позволяет выделить два клинико-лабораторных субтипа РА (АЦЦП-позитивный и АЦЦП-негативный), отличающихся по молекулярным механизмам патогенеза, тяжести течения и подходам к проводимой терапии [77, 78]. АЦЦП – более стабильный серологический маркер РА по сравнению с IgM РФ, реже подвергается сероконверсии в течение заболевания и не зависит от возраста [67, 79]. По данным ряда исследователей повышение концентрации IgM РФ достоверно коррелирует с острофазовыми показателями (СОЭ, СРБ) и в большей степени отражает активность воспаления, чем АЦЦП [79]. На доклинической стадии заболевания АЦЦП можно обнаружить в сыворотках пациентов за 14 лет до первых симптомов РА, что на 4-5 лет предшествует появлению РФ [79]. Серопозитивность по АЦЦП является важным предиктором развития РА у больных ранним недифференцированным артритом в течение 1-3 лет от начала заболевания и сопровождается ускоренной суставной деструкцией, 22 тяжелым течением заболевания с повышением общей летальности и более частым развитием коморбидных состояний [80, 81]. В биоптатах синовиальной ткани у АЦЦП-позитивных больных РА отмечено образование значительного количества воспалительных инфильтратов, очагов лимфонеогенеза и зародышевых центров [77]. Cинтез АЦЦП ассоциируется с определенными генетическими маркерами (HLA-DRВ1, PTPN 22, PAD14, TRAF1-C5, STAT4, OLIG3-AIP3) и внешними факторами (курение и др.) [82]. Имеются данные, что АЦЦП-позитивные больные РА характеризуются более эффективным ответом на лечение РТМ и метотрексатом, в то время как АЦЦП-отрицательные пациенты лучше отвечают на применение ингибиторов TNF-α [77, 83]. Определение антител к АМЦВ также является эффективным тестом для диагностики РА (табл. 2) [84, 85]. По данным 10-летнего проспективного исследования, обнаружение АМЦВ тесно связано с развитием тяжелого деструктивного поражения суставов [86]. 1.3. Показатели острой фазы воспаления При РА процесс системного хронического воспаления сопровождается повышением СОЭ и концентрации таких острофазовых белков, как СРБ, кальпротектин др. СОЭ и ЦРБ являются классификационными критериями РА, EULAR/ACR, 2010 г. [11, 47]. СОЭ – высокочувствительный, но неспецифичный и нестабильный маркер системного воспаления. На результаты определения СОЭ влияют возраст, пол, уровень фибриногена, РФ, гипергаммаглобулинемия и анемия. Измерение СОЭ может быть полезным для мониторирования активности РА (является компонентом DAS28). При раннем РА повышение СОЭ отражает активность и рентгенологическую прогрессию заболевания. Показано, что наиболее важными факторами несовпадения СОЭ и СРБ служат инфекция, почечная недостаточность и низкий уровень альбумина в крови [87-89]. 23 СРБ - классический острофазовый белок плазмы крови, рассматривающийся как наиболее чувствительный лабораторный маркер инфекции, воспаления и тканевого повреждения [90]. Синтез СРБ происходит в гепатоцитах и регулируется провоспалительными цитокинами, в первую очередь IL-6, а также IL-1 и TNF-α. На фоне воспаления, инфекции или травматического повреждения уровень СРБ быстро возрастает в 100 и более раз [91]. Определение СРБ классическими методами является “полезным” тестом для оценки активности патологического процесса (служит компонентом DAS28, SDAI), прогноза тяжести деструктивного поражения суставов и дифференциальной диагностики РА и системной красной волчанки [92, 93]. Определение СРБ является более стабильным, валидированным и воспроизводимым маркером воспаления, чем СОЭ. Показано, что использование именно СРБ, а не СОЭ при подсчете DAS28 позволяет более достоверно оценить активность заболевания [94]. При РА происходит повышение содержания в синовиальной ткани, жидкости и сыворотке крови гетерокомплексa белков S100A8/S100A9 – КП [95]. КП высвобождается при активации или гибели нейтрофилов и макрофагов и вовлекается в воспалительный процесс. КП составляет до 60% цитоплазматических белков циркулирующих полиморфно ядерных лейкоцитов и также присутствует в моноцитах, макрофагах, эозинофилах [96]. Описана корреляция сывороточной концентрации КП с уровнями IgM/IgA РФ, АЦЦП, маркерами острой фазы воспаления (СОЭ, СРБ), активностью заболевания (DAS28) и рентгенологической прогрессией суставной деструкции [22, 97-100]. L.Grevers и соавт. показали способность S100A8 участвовать в процессах костной деструкции “in vitro” [101]. 1.4. Маркеры метаболизма костной и хрящевой тканей sRANKL – растворимый лиганд RANK, играет ключевую роль в регуляции метаболизма костной ткани. Он продуцируется остеобластами и 24 активированными стимулирующим Т-лимфоцитами. фактором в RANKL образовании является зрелых основным остеокластов, соответственно его гиперпродукция приводит к резорбции костной ткани [102]. Следует отметить, что развитие костной резорбции на фоне хронического ревматоидного воспаления связано c дисбалансом в системе RANKL/RANK/остеопротегерин, провоспалительных и вызванным недостаточным гиперпродукцией синтезом антивоспалительных цитокинов [103-108]. COMP - неколлагеновый гликопротеин, принадлежащий семейству тромбоспондинов - белков, присутствующих в синовиальной оболочке и внеклеточном матриксе суставного хряща [109]. Основной его функцией является связывание коллагенов I, II и IX типов. [110-112]. Сывороточный уровень COMP является показателем метаболических изменений в хрящевом матриксе при различных заболеваниях суставов, отражая степень деградации суставного хряща при РА [113, 114]. У пациентов с активным РА повышенные сывороточной концентрации COMP может служить предикторами развития тяжелого деструктивного поражения суставов [23, 24, 115]. ММП-3, являющуюся небольшом количестве представителем продуцируют семейства клетки стромелезинов, соединительной в ткани. Стимуляторами гиперпродукции ММП-3 при РА могут служить различные факторы, включая провоспалительные цитокины и ростовые факторы [116]. Показано, что высокий уровень ММП-3 на ранних стадиях заболевания является предиктором развития костной деструкции. Кроме этого предполагается, что контроль уровня данного биомаркера может быть полезен при мониторинге эффективности терапии ГИБП [117, 118]. 25 1.5. Цитокины В основе патогенеза РА лежат два тесно взаимосвязанных процесса: антиген - специфическая активации CD4+ Т-лимфоцитов по Th1 типу, характеризующаяся синтезом интерлейкина-2 (IL-2), интерферона-γ (IFN-γ) и IL-17, а также возникновение дисбаланса между гиперпродукцией провоспалительных и противовоспалительных цитокинов с преобладанием синтеза первых над вторыми [2]. При РА в синовиальной мембране значительно увеличивается количество активированных B- и Т-лимфоцитов, тучных клеток, макрофагов вовлеченных в процессы неоваскуляризации и лимфоангиогенеза. Хронизация воспаления достигается за счет нарастания количества активированных в процессе хрящевой и костной деструкции тканевых фибробластов, хондроцитов и остеокластов. Осуществление рекрутинга, активации и эффекторных функций клеток, участвующих в развитии аутоиммунного воспалительного процесса при РА, невозможно без участия широкого спектра цитокинов (табл.3) [35, 119]. Таблица 3 Цитокины и хемокины экспрессирующиеся в синовиальной ткани при РА Цитокины IL-1α/β, IL-1Ra, TNF-α, IL-6 IL-8, IL-15, IL-16, GM-CSF, FGF, TGF-β1, LIF, MCP-1, MCP-1α, RANTES, ENA-78, фрактаклин IL-7 IL-10 IL-12 IL-17 IL-18, TGF, VEGF, GRO-α мРНК Белковая молекула Клетки продуценты + + Макрофаги и фибробласты + + + + + + + + + + Фибробласты Макрофаги и Т клетки Макрофаги и дендритные клетки T клетки Макрофаги Для изучения патогенеза РА наиболее информативным является исследование цитокинового профиля синовиальной ткани, однако в клинической практике получить ее образцы возможно в основном на поздних стадиях заболевания. В связи с этим для оценки изменений, происходящих на ранних стадиях РА, а также в диагностических и прогностических целях, 26 измерение уровня цитокинов производится в синовиальной жидкости и периферической крови (табл.4) [5]. Таблица 4 Концентрация цитокинов на разных стадиях РА в синовиальной ткани, жидкости и сыворотке крови. Классы цитокинов Провоспалительные IL-1 IL-6 IL-15 TNF-α Антивоспалительные IL-10 IL-13 Th1 IFN-γ IL-2 IL-12 Th2 IL-4 Эотаксин Th17 IL-17 Колониестимулирующие факторы IL-7 G-CSF GM-CSF Стромальные и ангиогенные факторы FGF-2 VEGF Хемокины IL-8 IL-18 IP-10 MCP-1 MIP-1a MIP-1b RANTES Синовиальная ткань ранний развернутый РА* РА** Уровень цитокинов Синовиальная жидкость ранний развернутый РА РА Сыворотка крови ранний развернутый РА РА ? ? ? ? ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ? ▲ ▲ ▲ ? ? ▼▲ ▲ ? ▲ ▲ ▲ ▲ ? ? ? ▼ ? ? ▲ ? ▲ ▲ ▲▼ ? ? ? ? ▼ ? ? ? ▲ ? ▼ ? ▲ ▼ ▲ ▲ ? ? ▲ ? ? ▼ ? ▲ ? ? ? ▼ ? ? ? ▲ ▲ ▲ ▲ ? ? ? ? ▲ ? ? ? ? ? ▲ ▲ ▲ ? ? ▼ ▲▼ ▲ ? ? ? ? ▲ ▲ ? ▲ ▲ ? ? ? ▲ ? ? ? ? ? ? ? ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ? ▲ ? ? ? ? ? ? ? ▲ ? ? ▲ ▲ ? ▲ ? ? ? ? ? ▲ ? ? ▼ ? ▲ ▲ ? ? ▲-повышение концентрации, ▼-понижение концентрации, -концентрация не меняется, ?-нет данных; *-длительность <6 мес., **-длительность заболевания >6 мес. Изучение роли цитокинов в развитии хронического аутоимунного воспалительного процесса при РА является актуальной задачей, в связи с 27 разработкой и применением в терапевтических целях антагонистов их провоспалительного действия - генно-инженерных биологических препаратов (ГИБП) [5, 120, 121]. При РА TNF-α продуцируется макрофагами синовиальной ткани и его максимальная концентрация достигается в активную стадию заболевания. Основными патогенетическими эффектами TNF-α при РА являются увеличение продукции фактора дифференцировки остеокластов – лиганда остеопротегерина - RANKL отвечающего за резорбцию костной ткани, а также индукция гиперэкспрессии молекул адгезии, металлопротеиназ, коллагеназ, хемокинов и простагландинов [122, 123]. TNF-α способен индуцировать продукцию двух форм растворимых рецепторов: ФНОР-I (p55) и ФНОР-II (p75). Важно отметить, что концентрация этих рецепторов возрастает именно при РА, что может способствовать дифференцировке этого заболевания с подагрическим артритом и остеоартрозом. ФНОР реагируя с мембранной протеиназой “TNF-α конвертирующим энзимом” (TACE) переходит в растворимую форму (рФНОР) являющуюся антагонистом TNF-α [124]. Одним из важнейших медиаторов воспаления при РА является IL-1. Его продукция осуществляется макрофагами, синовиоцитами, хондроцитами и остеокластами. У пациентов с РА отмечается значительное увеличение продукции IL-1 в синовиальной ткани, с последующим ростом его концентрации в синовиальной жидкости и сыворотке крови, коррелирующей с активностью заболевания [125, 126]. IL-1 стимулирует выход нейтрофилов из костного мозга, рост и дифференцировку лимфоцитов, участвует в запуске ассоциированного с синовитом неоангиогенеза, активирует макрофаги. Данный цитокин способен индуцировать синтез многих цитокинов, хемокинов, матриксных металлопротеиназ и ферментов способствующих разрушению хряща и костной ткани. Существует две формы IL-1: IL-1α представлен в виде молекулы, способной проводить сигнал в мембраносвязанном состоянии, и IL-1β, действие которого возможно только 28 после перехода в активную растворимую форму посредством взаимодействия с IL-1-конверирующим ферментом ICE (каспаза-1). Обе формы связываются с одним рецептором (IL-1R1) и далее взаимодействуют с белком IL-1RAcP, играющим критическую роль в процесс передачи сигнала. Участие IL-1 в патогенезе РА подтверждено его способностью усиливать тяжесть коллаген-индуцированного артрита и при введении интраартикулярно вызывать артритоподобные изменения [33]. IL-6 представляет собой гликопротеин, синтезируемый лимфоцитами, моноцитами, нейтрофилами, эозинофилами, В-клетками, фибробластами, тучными клетками, фибробластами и эндотелиальными макрофагами. При клетками, РА синовиальными наблюдается значительное увеличение уровня IL-6 в синовиальной ткани, синовиальной жидкости и плазме крови. IL-6 способен активировать продукцию острофазовых белков, антител B-клетками, хемокинов эндотелиальными клетками, экспрессию молекул адгезии, вызывать пролиферацию синовиальных фибробластов и активировать остеокласты [33, 127, 128]. Действие IL-6 реализуется через взаимодействие с рецептором (IL-6R), являющимся мономером, состоящим из 468 аминокислотных остатков и обладающим участком из 90 аминокислот гомологичным определенным доменам иммуноглобулинов. В отличие от рецепторов к другим цитокинам, IL-6R имеет цитоплазматический участок, состоящий из 82 аминокислотных остатков, однако он не способен участвовать в передаче сигнала внутрь клетки, так как в его составе отсутствуют места связывания тирозинкиназ [129]. Механизм передачи сигнала IL-6 внутрь клетки состоит из связывания IL-6 с α-цепью IL-6R, присоединения комплекса IL-6/IL-6R к gp130, ковалентной гомодимеризации gp130 и последующего каскада внутрицитоплазматического фосфорилирования с участием JAK1, JAK2, TYK2, STAT1, STAT3 [130]. Биологическая активность IL-6 может быть ингибирована блокадой непосредственно цитокина, IL-6R или молекулы gp130. Патологическое действие IL-6 при РА состоит в стимуляции 29 пролиферации B-клеток, секреции иммуноглобулинов, синтеза СРБ, дифференцировки плазматических клеток и цитотоксических Т- лимфоцитов. IL-6 может принимать участие в развитии околосуставного остеопороза и суставной деструкции через влияние на дифференцировку остеокластов и увеличение активности протеолитического фермента аггреканазы и ускорения деградации протеогликана. Уровень IL-6 при РА коррелирует с активностью заболевания и степенью эрозивного поражения суставов [131]. IL-15 впервые был идентифицирован по своему биологическому действию – способности стимулировать пролиферацию Т-клеточных клонов. IL-15 проявляет функциональное сходство с IL-2 и может использовать IL-2Р β и IL-2Rγ для передачи сигнала в клетку, но, в отличие от последнего, продуцируемого только активированными Т-лимфоцитами, IL-15 вырабатывается многими типами клеток: макрофагами, дендритными клетками, кератиноцитами и эпителиальными клетками [132, 133]. IL-15 и его мРНК обнаруживаются в периферической крови пациентов с РА, и их количественное содержание коррелирует с длительностью заболевания [134]. IL-15 обнаруживается в синовиальной ткани, ревматоидных узелках как в мембраносвязанной, так и в растворимой формах [135]. Этот цитокин способен активировать нейтрофилы, Т-клетки, NK-клетки, B-клетки и поддерживает взаимодействие T-клеток с макрофагами. При РА он способен повышать экспрессию CD40L и рецепторов хемокинов CCR5 на Т-клетках. Более того, IL-15 способен напрямую стимулировать продукцию TNF-α синовиальными Т-клетками и опосредованно участвовать в усилении синтеза TNF-α макрофагами. Синовиациты могут продуцировать IL-15 только после прямого контакта с T-клетками [136-139]. IL-18 играет одну из ключевых ролей в реализации иммунного ответа по Th1 типу. Основными продуцентами IL-18 являются макрофаги, а также лимфоциты, дендритные клетки, остеобласты. Он стимулирует пролиферацию Т-клеток, FasL-опосредованную цитотоксическую активность NK-клеток, продукцию Тh1 клетками IL-12 и IFN-γ, GM-CSF, снижает 30 продукцию IL-10 Th2 клетками. IL-18 существует в виде неактивного пропептида и только после протеолитического расщепления под воздействием ICE или другой каспазы он преобретает возможность выполнять свои биологические функции. Его рецепторы экспрессируются на нейтрофилах, макрофагах, NK-клетках, CD4+ T клетках, зндотелиальных клетках. Рецептор IL-18 не может функционировать без стимуляции его βцепи IL-12 [140, 141]. При РА IL-18 обнаруживается в синовиальной оболочке сустава и синовиальной жидкости, причем высокий уровень в очаге воспаления ассоциируется со снижением его продукции мононуклеарными клетками периферической крови [142, 143]. Повышение уровня IL-18 коррелирует с активностью заболевания. “In vitro” IL-18 способен индуцировать продукцию TNF-α, GM-CSF, IFN-γ в синовиальной мембране и синовиальной жидкости. Интенсивность продукции IL-18 значительно возрастает в присутствии таких цитокинов, как IL-12 и/или IL-15, а IL-10 и PDGF-β, наоборот, снижают его синтез [144, 145]. IL-12 продуцируется макрофагами, моноцитами, дендритными клетками, активированными В-лимфоцитами и является ярко выраженным провоспалительным цитокином. Он способен индуцировать продукцию следующих цитокинов: IL-6, IL-15, IL-18, TNF-α и GM-CSF. Под влиянием IL-12 повышается активность NK-клеток, цитотоксических Т-лимфоцитов, антигенспецифических киллеров, дендритных клеток и В-лимфоцитов. По совокупности действий данный цитокин осуществляет связь между врожденным и приобретенным звеньями иммунитета [146-149]. IL-12 представляет собой гетеродимерную молекулу, состоящую из двух белков, соединенных дисульфидной связью, кодируемой двумя различными генами р35 и р40, локализованных в 3 и 5 хромосомах соответственно. Рецепторы этого цитокина (IL-12R), экспрессирующиеся на активированных T- и NK-клетках, состоят из двух субъединиц и принадлежат к подгруппе, характеризующейся наличием общей сигнальной субъединицы gp 130 [150]. 31 При РА IL-12 экспрессируется на макрофагах и клетках синовиальной выстилки [151]. Существует два возможных пути запуска гиперпродукции этого цитокина: опосредованный CD40-CD154 взаимодействием – (Тклеточно-зависимый) и опосредованный TNF-α (Т-клеточно-независимый) [152]. При ревматических заболеваниях одним из способов ингибирования IL-12 является применение препаратов золота [153]. В настоящее время роль IL-17 в развитии аутоиммунного воспалительного процесса при РА еще недостаточно изучена. Известно, что он проявляет выраженную провоспалительную активность “in vitro” и “in vivo”, а также способен индуцировать синтез различных медиаторов воспаления, включая ФНО, IL-6 , IL-1 [154]. Важным медиатором гиперпродукции IL-17 является IL-23 [155]. При РА секреция IL-17 происходит в основном CD4+ T-клетками. Этот цитокин участвует в развитии ранней стадии воспаления, и его повышенная концентрация обнаруживается в синовиальной жидкости и периферической крови [156]. IL17 стимулирует продукцию IL-6, IL-8, лейкемию ингибирующего фактора (LIF) и простогландина E2 в синовиальных фибробластах, что подтверждает участие CD4+ Т-клеткок синовиальной оболочки в развитии суставного воспаления и последующего тканевого повреждения. Кроме этого, IL-17 может напрямую участвовать в разрушении хрящевой ткани, вызывая увеличение продукции оксида азота хондроцитами. Он также усиливает процесс костной резорбции через взаимодействие с RANKL [157, 158, 159]. IL-17 совместно с IL-1 и TNF-α вызывает гиперпродукцию цитокинов синовиоцитами и может регулировать баланс мРНК циклооксигеназы-2 и матриксных металлопротеиназ влияя на р38-МАПК-каскад. На модели коллаген-индуцированного артрита показано, что повышенное содержание IL-17 ассоциируется с развитием костных эрозий, а его дефицит или блокада оказывает протективный эффект, подавляя коллаген специфические Т-клетки и продукцию IgG2a [161-164]. 32 IL-10 продуцируется макрофагами, СD5+ B-клетками, CD4+ Т-клетками и моноцитами. Этот цитокин способен подавлять экспрессию IL-1, -6, -8, TNF-α и матриксных металлопротеаз. IL-10 блокирует Т-клеточный ответ на специфические антигены и ингибирует костимуляторную активность макрофагов, одновременно этот противовоспалительный эффект снижается активацией B-клеточной пролиферации и усилением экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) II класса. При РА отмечено снижение уровня IL-10 [33]. Перенос с помощью аденовирусного вектора гена IL-10 подавляет развитие коллаген- индуцированного артрита, однако у людей подобного результата достичь не удается. Возможно, это связано с повышением экспрессии Fcγ-R при терапии IL-10, что способствует значительному снижению противовоспалительного эффекта [165]. IL-4 продуцируется T-хелперами 2 класса и подобно IL-10 способен ингибировать продукцию таких Th1 цитокинов, как IL-1, IL-2, IL-6, TNF-α, IFN-γ, макрофагальную активацию NF-kB, оказывать пролиферативный и активационный эффект на В-клетки, стимулировать продукцию IgE. IL-4 индуцирует экспрессию молекул MHC II класса на макрофагах и дендритных клетках, принимая участие в созревании и активации последних. Важно отметить, что этот цитокин способен подавлять пролиферацию синовиоцитов [33, 166]. IFN-γ продуцируется Т-лимфоцитами и способен активировать мононуклеарные фагоциты, повышать экспрессию молекул МНС I и II класса, влиять на дифференцировку Т- и В-лимфоцитов, активировать эндотелиальные клетки, нейтрофилы и естественные киллеры. Данные о роли IFN-γ в развитии синовита противоречивы. Внесение этого цитокина в смешанную культуру T-клеток и моноцитов приводило к стимуляции синтеза TNF-α. Одновременно IFN-γ способен замедлять суставную деструкцию, снижать продукцию IL-1, матриксных металлопротеиназ и пролиферацию фибробластподобных синовиоцитов [167, 168]. 33 Одним из наиболее важных цитокинов, участвующих в процессе развития иммунного ответа, является IL-2. В основном IL-2 секретируется T(CD4+)-хелперами. Связывание этого цитокина со специфическими IL-2R, присутствующими на различных клетках иммунной системы, вызывает пролиферацию В-лимфоцитов, активирует цитотоксические Т-лимфоциты, стимулирует естественные киллеры и генерацию лимфокин-активированных киллеров [169-171]. Установлено, что IL-2 стимулирует синтез и секрецию таких цитокинов как: IL-4 , IL-6 , IFN-γ, КСФ, TNF-α [169, 172, 173]. Основными клетками-продуцентами IL-7 в организме человека являются клетки нелимфоидного происхождения: стромальные (эпителиальные) клетки тимуса и костного мозга. Кроме этого, синтез IL-7 может осуществляться в эпителии тонкого кишечника, эндотелии, печени, а также дендритными клетками и кератиноцитами. Основными мишенями IL-7 являются Т- и B- лимфоциты, дендритные клетки. Показано, что IL-7 способен cтимулировать пролиферацию и выживание B-клеток, однако в организме человека его активность ограничивается популяцией про-Влимфоцитов [174]. У пациентов с РА отмечается повышенный сывороточный уровень IL-7, коррелирующий с воспалительной активностью заболевания [175, 176]. При РА клетки синовиальной оболочки экспрессируют IL-7 и его мРНК в значительно большем количестве, чем при остром реактивном артрите. IL-7 индуцирует продукцию моноцитами и макрофагами TNF-α, IL1β, IL-6 и IL-8 [177]. Рецептор для IL-7 (IL-7R) состоит из двух компонентов - α-цепи (CD127) и γ-цепи (CD132). α –цепь рецептора экпрессируется на CD4+ Т-клетках, что позволяет IL-7 стимулировать продукцию ими TNF-α и IFN-γ [174]. Еще одним свойством IL-7 является индукция гиперпродукции Т-клетками RANKL, приводящей к развитию костной резорбции [159]. IL-8 является хемокином, ответственным за хемотаксис нейтрофилов в зону воспаления. IL-8 синтезируется макрофагами, лимфоцитами, фибробластами, клетками эпителия и эпидермиса. Индукторами его продукции могут служить IL-1 , IL-3 , ФНО-α , GM-CSF и др. IL-8 обладает 34 выраженными провоспалительными свойствами, вызывая экспрессию молекул межклеточной адгезии и усиливая прилипание нейтрофилов к эндотелиальным клеткам и субэндотелиальным матричным белкам [178, 179]. При РА значительно возрастает концентрация IL-8 в синовиальной жидкости за счет его гиперпродукции нейтрофилами [180]. Основными продуцентами IL-9 являются Тh2 хелперы. Главным эффектом IL-9 является активация цитотоксических и тучных клеток, кроме этого, он является синергистом IL-1,-2,-4,-5 [181]. Уровень IL-9 повышается при многих патологических состояниях, в частности, лимфомообразовании и астме. Рецептор к IL-9 (IL-9R) состоит из двух цепей: α-специфичной только для данного цитокина и γ- способной взаимодействовать с IL-2, -4, -7, -15 [182]. Данные об участии этого цитокина в патогенезе РА отсутствуют. IL-13 продуцируется в основном тучными и активированными Тлимфоцитами. Наряду с IL-4 и IL-10 принимает участие в развитии Th2 иммунного ответа. IL-13 является модулятором активности моноцитов и Вклеток, при этом не оказывает прямого влияния на Т-клетки. IL-13 способен подавлять продукцию IL-1β и IFN-γ в культурах мононуклеарных клеток, изолированных из периферической крови и синовиальной жидкости больных РА [183]. На моделях “in vivo” показан противовоспалительный эффект IL13, выражающийся в уменьшении припухлости суставов и торможении развития ангиогенеза [184]. Эотаксин - негликозилированный полипептид, генетически тесно связанный с моноцитарными хемотаксическими белками и относящийся к “СС” подсемейству хемокинов, являющийся хемоаттрактантом для эозинофилов и регулятором клеточной активности. Он продуцируется лимфоцитами, взамодействует эозинофилами с СС и моноцитами/макрофагами. хемокиновым рецептором 3 Эотаксин (ССR3), экспрессирующимся на T-лимфоцитах, эозинофилах, базофилах, дендритных клетках и остеокластах. Отмечается обратная корреляция уровня эотаксина 35 со степенью эрозивного поражения суставов при раннем РА, что может указывать на наличие у него протективных свойств [185]. Фактор роста фибробластов (FGF-2) является членом семейства гепаринсвязывающих ростовых факторов. увеличение концентрации При РА наблюдается значительное FGF-2 в синовиальной жидкости, ассоциирующееся с тяжестью течения заболевания [186]. FGF-2 усиливает пролиферацию синовиальных фибробластов и, обладая способностью увеличивать синтез VEGF, стимулирует ангиогенез. Кроме этого, связываясь с рецептором (FGFР-1) на синовиальных фибробластах и активируя ERKкиназу, он ускоряет RANKL- и ICAM-1 опосредованное созревание остеокластов, приводящее к развитию костной резорбции [187]. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) является главным регулятором продукции гранулоцитов. Он продуцируется стромальными клетками костного мозга, эндотелиальными клетками, макрофагами и фибробластами. “In vitro” показан синтез G-CSF хондроцитами и синовиальными фибробластами под действием IL-1 и TNFα. G-CSF взаимодействует с G-CSF рецептором (G-CSFR) экспрессирующемся на ранних прогениторных клетках миелоидного ряда, нейтрофилах, моноцитах/макрофагах, эндотелиальных клетках, Т- и Bлимфоцитах. Воздействуя на макрофаги, G-CSF способен увеличивать количество экспансирующихся моноцитов/макрофагов, повышая интенсивность фагоцитоза, и регулировать продукцию провоспалительных цитокинов и хемокинов [188]. При РА повышенный уровень G-CSF обнаруживается как в периферической крови, так и в синовиальной жидкости. В экспериментах “in vivo” продемонстрирована способность GCSF усугублять течение коллаген-индуцированного артрита. Предполагается, что он стимулирует развитие воспалительного процесса в суставе, увеличивая продукцию клеток миелоидного ряда и их мобилизацию из костного мозга, а также локальную активацию этих клеток в периферических тканях [189]. 36 Гранулоцитарно-макрофогальный колониестимулирующий фактор (GMCSF) индуцирует экспрессию на моноцитах/макрофагах MHC II класса, презентацию антигенов дендритными клетками, синтез моноцитами цитокинов и продукцию моноцитами/макрофагами активатора плазминогена, стимулирует фагоцитоз и продукцию перекиси водорода нейтрофилами, а также является хемоаттрактантом для этих клеток. При РА мРНК данного цитокина широко экспрессируется в синовиальной ткани, повышенный уровень GM-CSF определяется в синовиальной жидкости, а также обнаруживается увеличение количества рецепторов GM-CSF на моноцитах периферической крови. В ряде экспериментов продемонстрирована IL-1 и TNF-α опосредованная гиперпродукция GM-CSF в культурах хондроцитов и синовиальных фибробластов, также показана способность этого цитокина стимулировать продукцию этих и других провоспалительных цитокинов [190]. IFN-γ-индуцибельный белок (IP-10) принадлежит к семейству CXCхемокинов, его синтез и экспрессия моноцитами, фибробластами и эндотелиальными клетками стимулируется IFN-γ и TNF-α. IP-10 играет важную роль в миграции Т-клеток в зону воспаления. Показана способность этого хемокина игнгибировать ангиогенез. При РА IP-10 может экспрессироваться в синовиальной ткани и участвовать в привлечении Th1лимфоцитов в лимфоцитов с пораженный сустав. Взаимодействие фибробластподобными синовиоцитами активированных приводит к значительному увеличению экспрессии и секреции IP-10. Индукция синтеза IP-10 может быть подавлена с помощью антител к ICAM-1, а также такими интегринами как CD11b и CD18 [191]. Моноцитарный хемоаттрактный белок-1 (MCP-1) синтезируется макрофагами, фибробластами, эндотелиальными и опухолевыми клетками в ответ на стимуляцию IL-6, TNF-α и IL-1β. MCP-1 участвует в патогенезе различных заболеваний, характеризующихся инфильтрацией мононуклеарных клеток, в том числе и РА. При РА отмечается более 37 высокий уровень этого хемокина по сравнению с ОА и здоровыми лицами, а также корреляция с уровнем IL-18. В изолированной синовиальной ткани отмечен синтез мРНК MCP-1 в ответ на стимуляцию липополисахаридом, IL1β и TNF-α [167]. MCP-1 усиливает пролиферацию фибробластподобных синовиоцитов и продукцию IL-15, IL-18 и TNF-α. На фибробластподобных синовиоцитах экспрессируются такие изоформы рецептора к MCP-1, как CCR2A и ССR2B. Увеличение уровня экспрессии CCR2A в синовиальной ткани, стимулированной эндогенными MCP-1, PDGF-β , CD40L и IL-15, дает возможность считать его одним из основных медиаторов передачи провоспалительных сигналов при РА [192]. Макрофагальный белок воспаления-1 (MIP-1) являясь членом ССподсемейства хемокинов существует в виде -α и -β форм. MIP-1 способствует хемотаксису моноцитов и Т-клеток, увеличению содержания внутриклеточного кальция, усилению экспрессии интегринов и повышению адгезивных свойств по отношению к эндотелиальным клеткам. MIP-1 усиливают пролиферацию Т-клеток и секрецию IL-12 и экспрессию его рецептора. Продуцентами MIP-1α являются липополисахарид- индуцированные макрофаги, лимфоциты, нейтрофилы и фибробласты. У больных РА значительно повышается концентрация MIP-1α в синовиальной оболочке, синовиальной жидкости и периферической крови. Секреция и экспрессия MIP-1α нейтрофилами синовиальной жидкости может отражать активность воспаления при РА [193]. Экспрессия MIP-1α в очаге воспаления может регулироваться не только провоспалительными цитокинами, но и непосредственным взаимодействием между лейкоцитами и фибробластподобными синовиоцитами [194]. Антитела к MIP-1α способны снижать хемоаттрактивную активность макрофагов синовиальной жидкости. Макофаги изолированной синовиальной ткани способны экспрессировать мРНК MIP-1α, что позволяет предположить участие MIP-1α в их селективном рекрутинге при развитии воспалительного процесса в суставе при РА [195]. На модeлях РА “in vivo” показано наличие гиперсекреции MIP- 38 1α в зоне костной деструкции приводящей к миграции предшественников остеокластов, повышению остеокластогенеза и гиперсекреции RANKL [196, 197]. Тромбоцитарный фактор роста (ТФР) является представителем группы белковых факторов роста. ТФР является потенциальным митогеном для клеток крови, гладкой мезенхимальных клеток. мускулатуры, соединительной Предполагается, что ткани и ТФР может изменять пролиферативный статус клетки, влияя на интенсивность белкового синтеза, одновременно не оказывая действия на транскрипцию генов раннего ответа c-myc и c-fos. ТФР представлен в виде трех димеров с различными биологическими свойствами. Димеры АА и АВ обычно обнаруживаются в виде растворимых форм. ВВ напротив, связан с плазматической мембраной. Митогеные свойства различных изоформ ТФР неодинаковы. Наиболее мощным митогеном является ВВ [198]. AA, являясь более слабым митогеном, одновременно ингибирует действие AB из-за конкурентного связывания с рецептором [199, 200]. Однако при одновременном повышении концентраций PDGF-АА и АВ конкурентная способность димера снижается, что связано с наличием двух типов клеточных рецепторов к ТФР (PDGF-Р): первый тип обладает высокой аффинностью как к АА, так и к АВ, второй тип высокоаффинен только к ВВ и его активация является наиболее мощным митогенным стимулом для клетки [201, 202]. Изолированные клетки синовиальной ткани гиперпродукцию ТФР пациентов [203]. с Также РА демонстрируют отмечена стойкую способность ТФР стимулировать пролиферацию фибробластподобных синовиоцитов, которую в свою очередь возможно подавить иматиниб-мезилатом, являющимся ингибитором PDGF-R [204]. Хемокин, выделяемый Т-клетками при активации (Regulated on Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted -RANTES) - ветвь “СС” семейства хемокинов, регулирующая миграцию лимфоцитов в очаг воспаления. Синтез RANTES циркулирующими Т-клетками, 39 активированными IL-1 и TNF-α, связан с процессом высвобождения гистамина, а также с эндотелиальной адгезией моноцитов. При РА высокий уровень RANTES в синовиальной жидкости ассоциируется с неблагоприятным прогнозом в плане развития деструктивного поражения суставов, а также отражает интенсивность клеточной инфильтрации в суставе. Экспрессия его основного рецептора CCR5 в синовиальной жидкости значительно превышает таковую в периферической крови [205]. Васкулоэндотелиальный фактор роста (VEGF) участвует в неоангиогенезе, стимулируя пролиферацию эндотелиальных клеток и образование новых сосудов. Существует несколько типов VEGF: А, В, С, D, Е. VEGF-С участвует в образовании лимфатических сосудов. VEGF секретируется макрофагами, фибробластами, лимфоцитами, полиморфноядерными клетками [206, 207]. При РА отмечено повышение секреции VEGF клетками синовиальной оболочки и увеличение его концентрации в синовиальной жидкости и сыворотке крови. VEGF играет основную роль в развитии ангиогенеза при РА, являясь митогеном исключительно для эндотелиальных клеток . VEGF и TNF-α, продуцируемые макрофагами синовиальной ткани, изолированной у больных РА стимулируют неоангиогенез в экспериментах “in vivo” [206]. VEGF опосредованный рост сосудистой ткани играет важную роль в патогенезе РА и является характерным признаком ревматоидного синовита на ранних стадиях. VEGF способен повышать проницаемость сосудов, увеличивая отеки и соответственно припухлость суставов [207, 208]. Показано, что ингибирование тирозин киназного домена VEGF-1, ответственного за сигнал, модулирующий пролиферацию гематопоэтических клеток костного мозга, иммунологическую активность моноцитов/макрофагов и развитие хронического воспаления, приводит к замедлению прогрессирования РА [207, 210]. Функционирование ”цитокиновой сети” при РА определяется сложными взаимодействиями между двумя ее звеньями: провоспалительным и 40 противовоспалительным. В качестве основных провоспалительных цитокинов, принимающих участие в патогенезе заболевания следует выделить TNF-α, IL-6 и IL-1, отвечающих за прогрессирование тканевого повреждения, а также играющие ключевую роль в развитии системных проявлений при РА (табл. 5). Роль TNF-α, IL-6 и IL-1 в патогенезе РА Цитокины TNF-α Повышение уровня в + Воспаление периферической крови и СЖ Активация эндотелия + Миграция нейтрофилов + Секреция протеаз и + матриксных металлопротеаз Костная деструкция Активация остеокластов + Ингибирование функций + остеобластов Аутоиммунные Стимуляция B-клеток нарушения Презентация Th 17 Продукция острофазовых + Системные проявления белков Анемия + Поражение ЦНС + ТРФ-β, IL-10, IL-4, IL-1rа обладают Таблица 5 IL-6 + IL-1 + + + + + + + + + + + + + + ? + + + + + + выраженными противовоспалительными свойствами и способны замедлять суставную деструкцию. На ранних стадиях развития РА в синовиальной ткани наблюдается гиперэкспрессия мРНК таких цитокинов, как TNF-α, IL-10, IL15, IL-1β и IFN-γ. В меньших количествах представлена мРНК IL-6, IL-12, а мРНК IL-4 и IL-13 отсутствует. На более поздних стадиях РА в синовиальной ткани продолжает определяется повышенная концентрация TNF-α, IL-6, IL-1, VEGF, при этом отмечается высокая экспрессия мРНК IL-4, IL-10 [211]. Однако, имеются данные о повышении на ранней стадии РА концентраций IL-4, IL-13 и одновременном отсутствии следов IFN-γ в синовиальной жидкости [212], что может свидетельствовать об участии не только Th1, но и 41 Th2 цитокинов в развитии раннего РА. Эти факты говорят о необходимости более тщательного изучения баланса между Th1 и Th2 типами иммунного ответа на разных стадиях заболевания [213]. 1.6. Многопараметрический анализ лабораторных биомаркеров при ревматоидном артрите Поиск новых биомаркеров РЗ, обладающих высокой диагностической точностью является важной задачей современной ревматологии [214, 215]. Биомаркером принято считать показатель, который можно объективно измерить, оценить и использовать в качестве индикатора нормального или патологического процесса в организме или ответа на проводимую терапию. [216, 217]. Теоретически каждое заболевание должно обладать своим уникальным биомаркером [218, 219]. “Идеальный” биомаркер должен иметь высокую ДЧ, ДС и позволять поставить верный диагноз даже в отсутствие клинических признаков заболевания [220, 221]. 1.6.1. Кандидатные биомаркеры ревматоидного артрита В результате протеомных исследований синовиальной ткани, а также сыворотки и плазмы крови при РА с использованием масс-спектрометрии (MS) было выявлено около трех десятков ассоциирующихся с заболеванием белков (табл. 6) [222, 223]. Было установленочто при РА, в отличие от других РЗ, более часто обнаруживается КП [224, 225]. K. Raza и соавт., используя суспензионные биочипы провели исследование цитокинового профиля синовиальной жидкости у больных РА и пациентов с другими вариантами неревматоидного персистирующего артрита на ранней стадии развития [212]. Авторами показано транзиторное увеличение концентрации интерлейкина (ИЛ)-2, IL-4, IL-13, IL-17, IL-15, фактора роста фибробластов (FGF)-β и эпидермального фактора роста (ЭФР) у больных с ранним РА и повышение уровня интерферона (ИФН)-γ при недифференцированном и псориатическом 42 артрите. W. Hueber и совт. выявили при раннем РА достоверное увеличение концентрации провоспалительных цитокинов: IL-1α, фактора некроза опухоли (ФНО)-α, IL-12р40, IL-13 и хемокинов: IFN-γ-индуцибельного белка (IP-10), моноцитарного хемоаттрактного белка (МХБ)-1, эотаксина, а при псориатическом артрите и спондилоартрите – IL-8 [226]. S. Syversen и соавт. сделали вывод об ассоциации содержания эотаксина в сыворотке крови с рентгенологической прогрессией суставной деструкции [185]. W. Jager и соавт. выявили повышение уровня TNF-α, MCP-1, макрофагального белка воспаления (МВБ)-1α, эотаксина-1, макрофаг-производного (МПХ) хемокина и CXCL9 в плазме крови больных ювенильным идиопатическим артритом. При этом в синовиальной жидкости увеличение концентрации IL-6, IL-8, IL15, MCP-1, МВБ-1α и IFN-γ-индуцибельного белка (IP-10) было более выраженным, чем в плазме [227]. 1.6.2. Многопараметрические диагностические индексы в лабораторной диагностике и оценке активности ревматоидного артрита К настоящему времени не удалось обнаружить лабораторный маркер который выявлялся бы только при одном конкретном РЗ, поэтому с целью повышение диагностической точности, в лабораторной практике начинают применять индексы полученные путем многопараметрического анализа данных лабораторных тестов “in vitrо” (In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay, IVDMIA, МДИ) [228]. P. Сhandra и соавт. с помощью планарного и суспензионного мультиплексного анализа создали панель из 6 кандидатных антигенов: histone 2B/e, виментин, фибриноген А, COMP, профилагрин, IgA настоящему времени, накопленная информация об особенностях белкового профиля при РА позволила создать IVDMIA для определения индекса РФ, специфичных для РА. ДЧ и ДС данной панели оказались сопоставимыми с показателями для АЦЦП и превышали таковые для IgM РФ [9]. К активности болезни, основанный на измерении концентрации 12 ключевых белков (молекулы адгезии сосудистого эндотелия первого типа, эпидермального 43 фактора роста, васкулоэндотелиального фактора роста, IL-6, ФНОP1, ММП1, -3, хрящевого гликопротеина-39, лептина, резистина, САА и Среактивного белка, ассоциирующихся с определенными компонентами DAS28 [229]. 1.6.3. Многопараметрический анализ биомареров в оценке эффективности терапии ревматоидного артрита генно-инженерными биологическими препаратами Появление в клинической практике ГИБП, обуславливает необходимость дальнейшего совершенствования существующих иммунологических методов мониторинга (табл. 7) и поиска предикторов эффективного ответа на проводимую биологическую терапию [5]. В большинстве исследований на фоне применения ингибиторов TNF-α в сыворотках больных РА отмечалось значительное (30-60%) снижение концентрации IgМ РФ и уменьшение содержания IgA и IgG РФ [230-234]. Кроме этого, ИНФ у примерно одинакового количества пациентов отмечена отрицательная (14%) и положительная (8%) IgM РФ-сероконверсия [235]. В отличие от IgМ РФ сывороточный уровень АЦЦП под действием ингибиторов TNF-α, как правило, не меняется [231-233, 235-242]. Существенное снижение данного показателя описано в единичных случаях, например при терапии адалимумабом, также отрицательная АЦЦПсероконверсия обнаруживается у незначительной части пациентов (4,5%) [235, 243]. На большом клиническом материале (642 больных РА) показано, что положительные результаты определения IgM РФ, IgA РФ и АЦЦП до начала лечения ассоциируются с неудовлетворительным клиническим ответом на ингибиторы TNF-α [230, 231, 245]. Практически все ингибиторы TNF-α индуцируют быстрое (в течение месяца, а иногда уже после первого введения препарата) снижение уровня маркеров острой фазы воспаления: СОЭ и СРБ [235]. По данным G. Wolbink и соавт., высокий исходный уровень СРБ у больных РА ассоциируется с 44 Таблица 6 Кандидатные протеомные маркеры РА Биологический материал Сыворотка крови Плазма крови Метод Протеомные маркеры SELDI-TOF TMS FT/MS САА* кальгранулин* А, В* и С* Актин, кальгранулин А*, В* и С*, талин 1, тимозин β4, виментин* коактозин подобный белок-1* 2D гельэлектрофорез, MALDI-TOF SELDI-TOF Синовиальная жидкость/ткань Цереброспинальная жидкость Слюна Аполипротеин A-1*, тромбоцитарный фактор 4* 2D гель- САА* электрофорез TMS кальгранулин А*, нейтрофильный галактиназа-ассоциированный липокалин*, триоз-фосфат-изомераза* MALDI-TOF нейтрофильный галактиназаассоциированный липокалин*, кальгранулин А*, B, α-энолаза*, аннексин*, супероксиддисмутазы*, катепсин D*, АТФаза эндоплазматического ретикулума, пероксиридоксин 2*, трансглутаминаза 2, гомолог Tubby-протеина, тиоредоксин доменсодержащий протеин 5* 2Dсератотрансферрин, транстиретин, электрофорез простангландин-D синтетаза MALDI-TOF 6-фосфоглюонат дегидрогеназа, белки семейства 14-3-3*, аполипротеин А*, кальгранулин А* и В, эпителиальный белок связывающий жирные кислоты*, GRP78/BiP-белки*, пероксиредоксин-2* РА – ревматоидный артрит, SELDI - усиленная поверхностью лазерная десорбция-ионизация, TMS – тандемная масс-спектрометрия, FT/MS квадрупольная масс-спектрометрия, MALDI-TOF – время пролетная матрица-ассоциированная лазерная десорбция-ионизация *- маркер описан в нескольких независимых исследованиях 45 Таблица 7 Лабораторный мониторинг при терапии ГИБП Биомаркеры Ингибиторы TNF-α РТМ* ТЦЗ** IgM РФ ▲ ▲ ▲ IgA РФ ▲ ▲ ▲ АЦЦП ▲ ▲ ▲ СОЭ ▲ ▲ ▲ СРБ ▲ ▲ ▲ SAA ▲ IL-6 ● sIL-6R ● ММП-3 ● мониторирование: ■-до начала терапии; ▲-в ходе терапии; ●- дополнительные исследования пониженным ответом на ИНФ через 14 недель после назначения препарата [245]. I. Sekigawa и соавт. впервые изучили влияние ИНФ на белково-пептидный профиль сыворотки/плазмы крови у 10 больных РА с использованием метода масс-спектрометрии. По данным авторов, через 24 ч после введения препарата возможно идентифицировать белки, участвующие в TNF-α-зависимых механизмах активации NF-kB (FAM62A/MBC2) и регенерации суставного хряща (ростовой фактор соединительной ткани (CTGF)) [246]. Сходные результаты были получены R.C. Dwivedi и соавт. в сыворотках 10 больных РА через 12 недель после начала терапии, обнаруживших у 3 пациентов с “хорошим” ответом на препарат 20% изменение концентрации 39 белков, регулируемых TNF-α или NF-kB [247]. При терапии ингибиторами TNF-α отмечено снижение уровней IL-6, васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF), сывороточного уровня хрящевого гликопротеина-39 (YKL-40) и MIF [248, 249] в периферической крови. По данным S. Fabre и соавт. среди 33 больных РА, получавших этанерцепт (ЭТА), положительный ответ на препарат ассоциировался с увеличением сывороточной концентрации MCP-1 и EGF-1 с 0-го по 90-й день лечения и повышенными базальными уровнями СРБ и EGF-1 [120]. При многоступенчатом протеомном исследовании сывороточных белков был 46 идентифицирован профиль из аутоантител и 12 цитокинов (TNF-α, IL-1α, 1β, -6, -15, -12p40, -12p70, GM-CSF, эотаксин, IP-10, FGF-2, МСР-1), позволяющий прогнозировать ответ на терапию ЭТА у больных РА [250]. Базальная экспрессия TNF-α в синовиальной ткани, может являться предиктором хорошего ответа на терапию ИНФ у больных РА [83]. При наличии ответа на терапию ЭТА, у пациентов с РА описано снижении уровня энзимов, являющихся главными звеньями в процессах деструкции матрикса (ММП-1, ММП-3) и олигомерного матриксного хрящевого белка (СOMP). Следует отметить, что уровень ММП-3 может коррелировать с активностью заболевания (DAS28) на фоне лечения ингибиторами TNF-α [83, 251, 252]. Кроме этого, в ходе терапии ИФК отмечено значимое повышения уровня маркера формирования костной ткани - остеокальцина к 14 неделе терапии по сравнению с базальным [253]. После курса РТМ в сыворотке крови больных РА наблюдается снижение титров IgM РФ на 30-70%, но через год их концентрация возвращается к исходному уровню [254, 255]. Результаты, отражающие влияния РТМ на уровень IgA РФ противоречивы. Показано, что препарат индуцирует снижение уровня IgA РФ, не связанное с уменьшением сывороточной содержания IgG и IgA, при этом существуют данные об отсутствии динамики концентрации данного показателя [256, 257]. В отличие от РФ, сывороточный уровень АЦЦП под действием РТМ практически не изменяется [255, 258]. При лечении РТМ у больных РА отмечены отрицательные сероконверсии по IgM РФ (28%) и АЦЦП (10,5%) [235]. В материалах многих исследований убедительно показано, что серопозитивность по РФ и/или АЦЦП и высокие уровни этих аутоантител в сыворотке крови до начала лечения служат предикторами хорошего ответа на терапию РТМ при РА [254, 259-261]. При этом исходная серопозитивность по IgM РФ и/или АЦЦП ассоциировалась с уменьшением скорости рентгенологического прогрессирования деструкции суставов у больных РА на 52-56 неделях терапии РТМ. В многоцентровом итальянском 47 исследовании (148 больных РА), серопозитивных хотя бы по одному из тестируемых антител (IgM РФ, IgA РФ и IgG РФ, АЦЦП и АМЦВ), “хороший” эффект (критерии EULAR) анти-В-клеточной терапии через 6 месяцев после ее начала регистрировался у пациентов, не получавших глюкокортикоиды и имевших высокий уровень IgG РФ [262]. Было установлено, что клиническая эффективность РТМ коррелирует также с высоким базальным уровнем IgA РФ (> 25 ЕД/мл) [263, 264]. По данным регистра CERRERA (2048 больных РА), установлена связь между эффективностью РТМ (динамика индекса DAS28) и серопозитивностью по АЦЦП и/или РФ через 6 месяцев после курса терапии, через 12 месяцев – “хороший” эффект препарата ассоциировался с АЦЦП-позитивностью [264]. Представляет интерес результаты крупного исследования SMART [265], в которое были включены резистентностью/непереносимостью 208 больных ингибиторов активным TNF-α РА (n=194) с или противопоказаниями для их назначения. Был исследован базальный уровень широкого спектра биомаркеров, включая РФ, АЦЦП, свободные легкие цепи иммуноглобулинов (κ и λ) сывороточный уровень IgG, IgA и IgM и их связь с эффективностью терапии (критерии EULAR) через 24 недели после одного курса РТМ. Отмечена достоверная связь между эффективностью РТМ и серопозитивностью по РФ/АЦЦП и увеличением концентрации IgG (> 12,7 г/л). Более того, у пациентов с высоким уровнем нескольких биомаркеров (РФ, АЦЦП, IgG) возможность развить эффективный ответ на терапию РТМ возрастала почти в 2 раза [235]. По данным многофакторного анализа материалов французского регистра AIR, АЦЦП-позитивность являлась предиктором для назначения повторных курсов РТМ в группе пациентов с рефрактерным РА [266]. Однако, в работе Y.K. Teng и соавт. низкая эффективность РТМ у больных РА была связана с исходной серопозитивностью по IgM и АЦЦП и выраженной инфильтрацией синовиальной ткани CD20+ и CD79a+ CD20- В-клетками. У пациентов негативных или низкопозитивных по АЦЦП чаще развивается 48 удовлетворительный ответ на терапию РТМ [244]. РТМ вызывает значительное снижение содержания СРБ и СОЭ, достигающее 40% к 28–й неделе терапии РА [233, 267]. Также показано, что эффективность препарата ассоциируется с низким базальным уровнем СРБ [263], а 50% повышение его концентрации непосредственно после введения препарата служит предиктором необходимости проведения повторного курса лечения данным препаратом [268]. Blom М. и соавт. [121] обнаружили в сыворотках больных РА (n=16) снижение концентрации IL-1β, -4, -7, -12, -13, -15, -17, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GMCSF), IFN-γ, TNF-α, а также повышение уровня MCP-1 в первые 24 недели лечения РТМ. Анализ кинетики цитокинового профиля с 0-го по 90-й день выявил достоверное снижение сывороточного уровня IL-6 в группе больных РА, “отвечающих” на проводимую терапию и концентраций IL-8 и EGF — в группе без клинического эффекта. Другая группа авторов [120] при изучении панели из 12 цитокинов (TNF-α, IL-1а, -1b, -2, -4, -6, -8, -10, IFN-γ, MCP-1, EGF, VEGF) у 46 больных РА показала, что на 90-й день после введения РТМ концентрация MCP-1 и EGF-1 в сыворотках “отвечающих” на терапию значительно превышает таковую у больных с отсутствием ответа. В настоящее время отсутствуют данные об идентификации базального цитокинового профиля, который мог бы служить предиктором эффективности терапии РТМ. Thurlings R.M. и соавт. обнаружили связь между снижением концентрации IL-6, -15, -22, -23, ИФН-, TNF-, MIP-2β, 5, -3β через 4 нед. после курса РТМ и клиническим эффектом через 24 недели [269]. Предполагается, что о развитии клинического “ответа” через 40 недель может свидетельствовать повышение уровней IL-17 и МIP-1β на 8 неделе после введения препарата. Терапия РТМ ассоциируется снижением в синовиальной ткани количества предшественников остеокластов, экспрессии RANKL, соотношения RANCL/остеопротегирин, что может свидетельствовать о способности препарата замедлять процессы суставной деструкции при РА [270]. В сыворотке крови поциентов с РА отмечено также 49 падение (к 6 неделе терапии РТМ) уровня такого продукта деградации коллагена 1 типа как βCTX, коррелирующее со сниженем активности заболевания. При этом возрастает концентрация N-терминального пропептида проколлагена I типа (PINP) - маркера формирования костной ткани. [271]. Раннее развитие клинического улучшения у больных РА на фоне терапии тоцилизумабом (ТЦЗ) сопровождается быстрым снижением концентрации аутоантител (IgM/IgA РФ, АМЦВ) в крови [272-274]. Nishimoto N. и соавт. отмечено снижение титра IgM РФ на 32% по сравнению с базальным уровнем к 12 неделе терапии, при этом у трех позитивных по РФ пациентов присутствовала отрицательная IgM РФ-сероконверсия [275]. В исследовании “OPTION” показано снижение титров IgM РФ на 24 неделе терапии ТЦЗ [276]. В работе S. Kavashiri и соавт. [277] высокопозитивные уровни IgM РФ, определявшиеся у больных РА до назначения препарата являлись эффективным серологическим маркером для прогнозирования достижения ремиссии болезни по индексу CDAI через 24-й недели после начала терапии ТЦЗ. Назначение ТЦЗ в дозировке 8 мг/кг в качестве монопрепарата или в сочетании с БПВП приводит к быстрому снижению уровня СРБ до нормальных значений через 2 нед. после первой инфузии препарата. Начиная с 6-й/10-й нед. и по 24 нед. терапии ТЦЗ концентрация СРБ остается в пределах нормы, не превышая 3 мг/л [276, 278-284]. В широкомасштабных клинических исследованиях “OPTION”, “TOWARD”, “RADIATE” и “AMBITION”, показано, что изменение концентрации СРБ и других сывороточных маркеров воспаления зависит от уровня и продолжительности циркуляции в крови ТЦЗ. Высокая экспозиция ТЦЗ сопровождается снижением уровня СРБ, СОЭ, SAA в крови на 2-й неделе лечения [280-282]. Концентрация свободного IL-6 при РА в течение всего времени лечения ТЦЗ четко отражает продукцию эндогенного IL-6 и положительно коррелирует с активностью заболевания. В большинстве исследований 50 прослеживалась четкая тенденция к снижению концентрации IL-6 на 24-й неделе терапии ТЦЗ ассоциированная с достижением клинической ремиссии (DAS 28) [281, 285]. Также выявлена положительная корреляция базальных уровней IL-6 с концентрацией аутоантител (IgA РФ, АЦЦП, АМЦВ). N. Nishimoto и соавт. продемонстрировали, что практически весь sIL-6R циркулирует в виде иммунных комплексов с ТЦЗ, а sIL-6R остается повышенным до тех пор, пока концентрация ТЦЗ в крови составляет >1 мкг/мл [286]. Было установлено увеличение концентрации sIL-6R в 10 раз на 6-й неделе, IL-6 – в 1, 5 раза на 2-й неделе терапии ТЦЗ. По мнению авторов, повышение сывороточного уровня IL-6 на фоне лечения ТЦЗ связано не с увеличением продукции данного цитокина, а с нарушением его клиренса в связи блокировкой IL-6R. J.Yamna и соавт. установили различия в изменениях цитокиновых профилей у пациентов с РА находившихся на терапии ТЦЗ и ингибиторами TNF-α. Так применение ТЦЗ значительно снижает концентрации IL-2, -7, -8, -12, GM-CSF, TNF-α, в отличие от терапии ингибиторами TNF-α, когда в основном подавляется гиперпродукция IL-6, MIP-1β, -3α. Aвторы предлагают использовать в качестве индикатора хорошего ответа на терапию снижение на 40% от базального уровня IL-2, -7, -10, -12, GM-CSF, IFN-γ при терапии ТЦЗ и IL-6, -12 и MCP-1 ингибиторами TNF-α [287]. Терапия ТЦЗ вызывает дозозависимое снижение содержания в сыворотке крови покзателей разрушения хрящя N-пропептида коллагена IIA типа (PIIANP), спирального пептида коллагена II типа (HELIX-II) и MMП-3. Также ТЦЗ вызывает падение концентраций маркеров костной деструкции CTX-I и карбокситерминального телопептида коллагена I типа (ICTP). Следует отметить, что снижение уровней ICTP, HELIX-II, MMП-3 было более выраженным у “ответчиков” чем у лиц с отсутствием ответа на терапию [287].Таким образом, к настоящему времени можно выделить ряд биологических маркеров, позволяющих осуществлять иммунологический мониторинг и прогнозирование эффективности терапии ГИБП при РА (табл.8). 51 Лабораторные показатели эффективности терапии ГИБП Биомаркеры IgM РФ IgA РФ IgG РФ АЦЦП АМЦВ СОЭ СРБ SAA TNF-α IFN-γ IL-1β IL-2 IL-4 IL-7 IL-8 IL-6 IL-12 IL-13 IL-15 IL-17 GM-CSF sIL-6R YKL-40 МИФ MCP-1 EGF-1 VEGF ММП-1 ММП-3 COMP βCTX PINP PIIANP HELIX-II CTX-I ICTP Определение % B-клеток (CD19+) BAFF IgM IgE Ингибиторы TNF-α ▼○ ▼○ РТМ ▼● ○ ● ▼ ▼○ ▼ ○ ▼ ▼□ ▼ ▼ ▼ ▼ ▲ ▲ ▼ ▼ ▼ ▼□ ▼□ □ ▼ ▼□ ▼□ ▼□ ▼□ ▼ ▼● ▼ ▼ ▼ ▼ АБЦ ▼ ● ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▲ ▲ □ ▼ ▼ ▼ ▼ □ ▼ ▼ ТЦЗ ▼● ▼ ▼ Таблица 8 ▼ ▼ ▼ ▼ ○ ▼-снижение на фоне терапии; ▲-повышение на фоне терапии, ●- высокий уровень является предиктором клинического ответа на терапию, ○- низкий уровень является предиктором клинического ответа на терапию, □ – возможный предиктор клинического ответа на терапию. 52 Таким образом, применение молекулярно-биологических современных методов иммунологических исследования и позволяет идентифицировать индивидуальные профили лабораторных биомаркеров и тем самым радикально улучшить раннюю диагностику РА (возможно, на доклинической стадии), оценку активности и тяжести заболевания, прогнозирование исходов патологического процесса и ответа на проводимое лечение. Перспективы иммунодиагностики РА связаны с поиском и валидацией новых высокочувствительных и специфичных молекулярных маркеров иммунного ответа и воспаления, включая МДИ на основе современных лабораторных технологий. 53 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Общая клиническая характеристика больных Обследовано 993 пациента с достоверным диагнозом РА, наблюдавшихся в ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой в период с 2010 по 2012 год. Проведение исследования одобрено этическим комитетом при ФГБНУ НИИР имени В.А. Насоновой". Возраст пациентов на момент обследования варьировал от 16 до 80 лет (Ме; 25-75 перцентиль: 51; 42-57). Длительность заболевания составляла от 0,5 месяца до 44 лет (7,5; 2,5-16). Активность РА (по DAS28) колебалась от 1 до 8 (5,2; 3,6-6,0) баллов (табл. 9). Для оценки эффективности терапии использовали критерии EULAR, основанные на динамике индекса DAS28 [288]. Изменения в суставах оценивались рентгенологически, методом Sharp в модификации van der Hejde [289, 290]. Рентгенологическая стадия заболевания определялась по методу Штейнброкера [291]. Анализ возрастного состава выявил преобладание пациентов в возрасте от 41 года и старше (73%). Соотношение женщин и мужчин в возрастных группах ≥ 41 ≤50 лет и ˃50 лет было 4,6:1 – 14:1, ≤ 20 лет – 1:0, ≥21 до≤ 30 лет: 1,7:1, ≥31 ≤ 40 лет - 2:1 (табл.10). Диагноз РА основывался на критериях заболевания Американской коллегии ревматологов (АCR) 1987 г. и ACR/ Европейской лиги по борьбе с ревматизмом (EULAR) 2010 г. [11, 292]. Группу сравнения составили (n=616): 27 пациентов - с системной красной волчанкой (СКВ), 15 - с синдромом Шегрена (СШ), 25 - с анкилозирующим спондилоартритом (АС), 33 - с остеоартритом (ОА), 20 - с перекрестным (OVERLAP) синдромом, 9 - с подагрическим артритом (ПА), 22 - с псориатическим артритом (ПCА), 168 с недифференцированным артритом (НА) и 297 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными (табл. 11). 54 Таблица 9 Клинико-иммунологическая характеристика больных РА Показатель n Пол (ж/м) Средний возраст (годы) Длительность РА (мес.) Рентг.стадия РА (Стейнброкер, модиф.) n(%) I II III IV Функциональный класс n(%) I II III IV Системные проявления Активность заболевания DAS 28,баллы Ремисcия (DAS28<2,6) n(%) Низкая (2,6<DAS28<3,2) n(%) Средняя (DAS28=3,2-5,1) n(%) Высокая (DAS28>5,1) n(%) ЧПС1 ЧБС2 СОЭ,(мм/ч), Ме (25-75%) СРБ, (мг/л), Ме (25-75%) IgM РФ (n) IgM РФ (МЕ/мл), Ме (25-75%) IgM РФ+ n(%) IgM РФ высокопозит. n(%) IgM РФ низкопозит. n(%) IgM РФ- n(%) Ранний РА(<6 мес.) 102 79/23 51(41-62) 4(2,5-6) Развернутый РА(>6 мес.) 891 733/158 51(43-56) 96(36-192) Группа сравнения 319 240/79 44(31-53) - Здоровые доноры 297 222/75 42(32-49) - 29(28) 73(72) 0 0 19(2,1) 306(34,3) 289(32,4) 277(31) - - 75(73,5) 27(26,5) 0 0 0 232(26) 578(65) 75(8,4) 6(0,6) 146(16) - - 5,1(4,1-5,9) 25(24,5) 77(75,5) 0 0 10(8-18) 15(10-28,5) 31(22-41) 9,5(3,4-32,9) 102 39 (5-137) 68(67) 54(53) 14(14) 34(33) 5,2(3,8-6) 53(6) 71(8) 306(34) 461(52) 7,5(3-14) 14(7-23) 30(16-45) 10(3,1-28,7) 891 49 (9,5-200) 588(66) 463(52) 125(14) 303(34) 2,8(0,8-10,3) 319 0,0(0,0-14,3) 77(24) 43(13,5) 34(10,5) 242(76) 0,6(0,2-1,9) 297 0,1(0,0-0,6) 10(3,5) 4(1,5) 6(2) 287(96,5) 55 Продолжение таблицы 9 Показатель Ранний Развернутый Группа Здоровые РА(<6 мес.) РА(>6 мес.) сравнения доноры IgA РФ (n) 21 105 85 35 IgA РФ (МЕ/мл), Ме (25-75%) 27 (19-80) 142 (25-388) 0,1 (0,1-0,1) 0,1 (0,1-0,1) IgA РФ+ n(%) 14(67) 87(83) 13(15) 0(0) IgA РФ высокопозит. n(%) 6(29) 65(62) 8(9) 0(0) IgA РФ низкопозит. n(%) 8(38) 22(21) 5(6) 0(0) IgA РФ- n(%) 7(33) 18(17) 72(85) 35(100) АЦЦП, n 102 891 319 297 АЦЦП (Ед/мл), Ме (25-75%) 36(0,5-100) 100(4-100) 0,8(0,4-1,5) 0,1(0,1-0,6) АЦЦП+ n(%) 58(57) 649(73) 51(16) 6(2) АЦЦП высокопозит. n(%) 53(52) 597(67) 42(13) 5(1,7) АЦЦП низкопозит. n(%) 5(5) 52(6) 9(3) 1(0,3) АЦЦП- n(%) 44(43) 242(27) 268(49) 291(98) АМЦВ, n 62 349 132 52 АМЦВ (Ед/мл), Ме (25-75%) 68,5(1-692) 273(40,7-973) 1,2(0,3-19,3) 0,3(0,2-11,2) АМЦВ+ n(%) 43(69) 297(85) 32(24) 3(6) АМЦВ высокопозит. n(%) 31(50) 245(70) 7(5) 0(0) АМЦВ низкопозит. n(%) 12(19) 52(15) 25(19) 3(6) АМЦВ- n(%) 19(31) 52(15) 100(76) 49(94) АКА, n 32 46 52 28 АКА+ n(%) 12(37,5) 13(41) 15(29) 7(25) АКА- n(%) 20(62,5) 33(59) 37(71) 21(75) 1 2 -число болезненных суставов, -число припухших суставов Таблица 10 Распределение больных по полу и возрасту Мужчины Женщины Всего ≤20 21-30 0(0) 10(1) 10(1) 29(3) 50(5) 79(8) Возраст (годы) 31-40 41-50 > 50 n(%) 60(6) 50(5) 30(3) 119(12) 228(23) 417(42) 179(18) 278(28) 447(45) Всего 239(24) 754(76) 993(100) 56 Таблица 11 Общая характеристика группы сравнения Заболевание СКВ СШ АС ОА OVERLAP ПА ПСА НА Здоровые доноры n 27 15 25 33 20 9 22 168 297 IgM РФ “+” n(%) 3(11) 2(13) 0(0) 4(12) 13(65) 0(0) 1(4,5) 52(31) 10 (3,5) АЦЦП “+” n(%) 0(0) 3(20) 0(0) 0(0) 4(20) 0(0) 0(0) 40(24) 6(2) ГИБП получали 93 пациента, из них: химерные мноклональные антитела к TNF-α (инфликсимаб, ИНФ), 27 человек, химерные моноклональные антитела к CD20 антигену В–лимфоцитов (ритуксимаб, РТМ) 34 человек, гуманизированные моноклональные антитела к рецептору IL-6 (тоцилизумаб, ТЦЗ) 42 человека (табл. 12) (табл. 12) [293-295 ]. ИНФ вводили внутривенно капельно из расчета 3 мг/кг массы тела, первые 2 инфузии с интервалом в 2 недели, следующие инфузии через 6 недель и далее каждые 8 недель. РТМ вводился по 1000 мг внутривенно, двукратно с интервалом в 2 недели. Инфузии ТЦЗ проводились в дозе 8 мг/кг внутривенно с интервалом в 4 недели. Клинические и лабораторные показатели анализировались непосредственно перед началом терапии (нулевая точка) и через 24 и 40 недель после инфузии. Терапевтический эффект при применении ГИБП оценивался согласно критериям EULAR [288]. 57 Таблица 12 Общая характеристика пациентов получавших терапию ГИБП ГИБП Женщины/мужчины Средний возраст, годы Длительность РА (мес.) DAS28 СОЭ мм/ч СРБ мг/л Позитивность по IgM РФ n(%) Позитивность по АЦЦП n(%) ИНФ (n=27) 25/2 46,5; 41,5-61,5 7; 4-11 6; 5-6 56; 36-76 24; 12-59 17 (62) 23(86) РТМ (n=34) ТЦЗ (n=42) 31/3 32/10 49; 42-64 51; 43-55 72; 36-132 56; 23-81 6; 5,5-6 6,5; 6-7 56; 37-62 54; 34-74 20; 14-46 34; 20-75 30(97) 38(88) 30(97) 40(93) 2.2. Методы исследования Всем больным проводилось полное клиническое, лабораторное и инструментальное обследование с использованием стандартных методов, применяемых в ФГБНУ НИИР им В.А. Насоновой. Рентгенографические исследования выполнялась в лаборатории лучевой диагностики (заведующий лабораторией - д.м.н., А. В. Смирнов). Исследование клинических, биохимических показателей крови осуществляли унифицированным методом в биохимической лаборатории (заведующая лабораторией – к.б.н. Л. Н. Кашникова). Иммунологическое исследование крови проводили в лаборатории иммунологии и молекулярной биологии ревматических заболеваний (заведующая лабораторией - д.м.н. Е.Н. Александрова). Для решения иммунологических поставленных исследований, задач который проводился включал комплекс определение в сыворотке крови уровня IgM и IgA ревматоидных факторов, АЦЦП, АМЦВ, АКА, СРБ, кальпротектина, 27 цитокинов, хемокинов и факторов роста, sRANKL, COMP и MMП-3. Кровь из локтевой вены в количестве 9 мл. собирали в вакуумную пробирку S-Monovette («Sarstedt», Германия) с активатором свертывания крови. Пробирку с кровью оставляли на 30 минут при комнатной 58 температуре в вертикальном положении для образования сгустка, затем центрифугировали 15 минут при 1100 – 1300 g с охлаждением до 40С. После центрифугирования СК собирали, перемешивали и аликвотировали по 0,3 мл в микропробирки типа “эппендорф”. Забор СЖ проводился путем введения стерильной пункционной иглы в полость коленного сустава. Полученные образцы аликвотировали по 0,3 мл в пробирки типа “эппендорф”. Все образцы исследуемого биологического материала хранили при -700С. Интервал между процедурой взятия крови и замораживанием образцов сывороток составлял не более 30 минут. 2.2.1. Методика определения IgM ревматоидного фактора Концентрацию IgM РФ в сыворотке крои и синовиальной жидкости измеряли иммунонефелометрическим методом с латексным усилением на анализаторе BN-ProSpec (“Siemens”, ФРГ) при использовании реагентов N Latex RF Kit (“Siemens”, ФРГ). Чувствительность определения IgМ РФ равнялась 9,5 Ме/мл (рис. 1). Верхняя граница нормы составляла 15 МЕ/мл, согласно рекомендации производителя. Рисунок 1 Калибровочная кривая для определения IgM РФ методом иммунонефелометрии. 59 2.2.2. Методика определения IgA ревматоидного фактора Количественное определение IgA РФ в сыворотке крови проводилось методом ИФА Rheumatoid с Factor использованием IgA коммерческого (“ORGENTEC набора Diagnostika”, ФРГ) реагентов согласно инструкции фирмы-изготовителя. Чувствительность определения IgA РФ равнялась 0,1 ЕД/мл (рис. 2). Верхняя граница нормы составляла 20 ЕД/мл, согласно рекомендации производителя. Рисунок 2 Калибровочная кривая для определения IgA РФ методом ИФА. 2.2.3. Методика определения антител к циклическому цитруллинипрванному пептиду Количественное определение АЦЦП в сыворотке крови и синовиальной жидкости проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Anti-CCP (“Axis-Shield”, Великобритания) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Чувствительность определения АЦЦП равнялась 0,1 ЕД/мл (рис.3). Верхняя граница нормы составляла 5 ЕД/мл, согласно рекомендации производителя. 60 Рисунок 3 Калибровочная кривая для определения АЦЦП методом ИФА. 2.2.4. Методика определения к циклическому модифицированному виментину Количественное определение АМЦВ в сыворотке крови и синовиальной жидкости проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Anti-MCV (“ORGENTEC Diagnostika”, ФРГ) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Чувствительность определения AМЦВ равнялась 0,1 ЕД/мл (рис. 4). Верхняя граница нормы составляла 20 ЕД/мл, согласно рекомендации производителя. Рисунок 4 Калибровочная кривая для определения АМЦВ методом ИФА. 61 2.2.5. Методика определения антител к кератину Качественное определение АКА в сыворотке крови проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции (НРИФ) с использованием коммерческого набора реагентов Immuno Glo, Anti-Keratin Antibody IFA (“IMMCO Diagnostics”, США) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Результаты считались положительными при наличии свечения АКА в титре 1:10, согласно рекомендации производителя (рис. 5). Рисунок 5 АКА при определении методом НРИФ 2.2.6. Методика определения С-реактивного белка Концентрацию вч-СРБ в сыворотке крови и синовиальной жидкости измеряли высокочувствительным иммунонефелометрическим методом с латексным усилением анализаторе BN-ProSpec (“Siemens”, ФРГ) при использовании реагентов CardioPhase hsCRP (“Siemens”, ФРГ). Чувствительность метода - 0,175 мг/л (рис. 6). Верхняя граница нормы составляла 5,0 Мг/л, согласно рекомендации производителя. 62 Рисунок 6 Калибровочная кривая иммунонефелометрии. для определения вч-СРБ методом 2.2.7. Методика определения кальпротектина Количественное определение КП в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Calprotectin ELISA (“Buhlmann Laboratories”, ФРГ) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Чувствительность определения кальпротектина <0,4 мкг/мл (рис.7). В качестве верхней границы нормы была принята концентрация, соответствующая значению 95 перцентиля данного показателя у доноров (n=33): 20 мкг/мл. Рисунок 7 Калибровочная кривая для определения кальпротектина методом ИФА. 63 2.2.8. Методика определения лиганда рецептора активатора транскрипционного фактора κB Количественное определение sRANCL в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов sRANKL (“Biomedica”, Aвстрия) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Чувствительность определения sRANKL равнялась 0,08 пмоль/л (рис. 9). В качестве верхней границы нормы была принята концентрация, соответствующая значению 95 перцентиля данного показателя у доноров (n=33): 0,6 пмоль/л. Рисунок 9 Калибровочная кривая для определения sRANCL методом ИФА. 2.2.9. Методика определения олигомерного матриксного белка хряща Количественное определение COMP в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Human Cartilage Oligomeric Matrix Protein ELISA (“BioVendor”, ФРГ) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Чувствительность определения COMP равнялась 4,0 нг/мл (рис. 10). В качестве верхней границы нормы была принята концентрация, соответствующая значению 95 перцентиля данного показателя у доноров (n=33): 1400 нг/мл. 64 Рисунок 10 Калибровочная кривая для определения COMP методом ИФА. 2.2.10. Методика определения матриксной металлопротеиназы-3 Количественное определение ММП-3 в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов (“Bender MedSystems”, Aвстрия) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Чувствительность определения ММП-3 равнялась 0,4 нг/мл (рис. 11). В качестве верхней границы нормы была принята концентрация, соответствующая значению 95 перцентиля данного показателя у доноров (n=24): 9,3 нг/мл. Рисунок 11 Калибровочная кривая для определения ММП-3 методом ИФА. 65 2.2.11. Методика очистки сыворотки крови от IgM ревматоидного фактора Удаление IgM РФ из исследуемых образцов сывороток крови производился с использованием набора реагентов “ВектоРФ- иммуносорбент” ( ЗАО “Вектор Бест”, Россия) согласно инструкции фирмы изготовителя. Основным компонентом набора является аффинный сорбент, в котором в качестве лиганда используется IgG человека, специфически связывающие IgM РФ. 2.2.12. Методика определения цитокинового профиля. Количественное определение 27 цитокинов (IL-1β, -1ra, -2, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -12, -13, -15, -17, FGF, эотаксина, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, PDGF-BB, RANTES, TNF-α, VEGF) в сыворотке крови и синовиальной жидкости проводилось методом мультиплексного анализа, технологией “xMAP”, на анализаторе Bio-Plex 200 (“Bio-Rad”, США) с использованием коммерческого набора реагентов Bio-Plex Pro Human Cytokine 27 plex assay (“Bio-Rad”, США) согласно инструкции Таблица 13 Аналитическая чувствительность и верхняя граница нормы при определении концентраций цитокинов методом xMAP Цитокин Аналитическая чувствительность (пг/мл) Верхняя граница нормы (пг/мл) IL-1β 0,1 7,6 IL-1ra 0,4 1082,8 IL-2 2,2 37,5 IL-4 0,1 8,9 IL-5 0,1 9,5 IL-6 0,0 33,47 IL-7 0,0 76,5 IL-8 0,1 28,15 IL-9 0,5 186,2 IL-10 0,1 411,3 66 Продолжение табл. 13 Цитокин Аналитическая чувствительность (пг/мл) Верхняя граница нормы (пг/мл) IL-12 0,1 27,6 IL-13 0,1 63,3 IL-15 0,1 40,8 IL-17 0,4 385,7 Эотаксин 1,7 1247,9 FGF 4,1 70,1 G-CSF 0,4 31,5 GM-CSF 5,4 182,1 IFN-γ 0,3 2342,6 IP-10 1,6 4064,0 MCP-1 0,2 248,5 MIP-1α 0,4 37,2 MIP-1β 0,1 153,3 PDGF-BB 1,4 93646,9 RANTES 0,4 6169,5 TNF-α 2,9 65,0 VEGF 0,1 313,0 фирмы-изготовителя (рис.8). Аналитическая чувствительность определения представлена в табл. 5. В качестве верхней границы нормы была приняты концентрации, соответствующие значению показателя у доноров (n=30) (табл. 13) 95 перцентиля данного 67 Рисунок 8 (а) 68 Рисунок 8 (б) Калибровочные кривые исследуемых цитокинов, хемокинов, факторов роста 2.2.13. Методы оценки диагностического значения биомаркеров при ревматоидном артрите Оценка диагностического значения биомаркеров РА осуществлялась путем расчета операционных характеристик теста: диагностической чувствительности (ДЧ), диагностической специфичности (ДС), отношения правдоподобия положительного и отрицательного результатов (ОППР и ОПОР) (табл. 14) [296]. 69 Таблица 14 Параметры оценки диагностической точности лабораторного теста Параметры Болезнь присутствует Болезнь отсутствует Результат a – истинно bположительный положительный ложноположительный Результат c– d – истинно отрицательный ложноотрицательный отрицательный ДЧ a/(a+c) ДС d/(b+d) ОППР a/(a+c)/b/(b+d) ОПОР c/(a+c)/d/(b+d) Согласно рекомендациям ACR наиболее полезными для диагностики РА считались лабораторные тесты с ОППР>5 и ОПОР<0,2; полезными – с ОППР>2 и ≤5, ОПОР>0,2 и ≤0,5; не имеющими пользы - с ОППР≤2 и ОПОР>0,5 [43]. Для анализа диагностической эффективности лабораторных тестов использовалась также характеристическая кривая (ROC-кривая), отражающая зависимость частоты истинно положительных результатов (чувствительность) от частоты ложноположительных результатов (1- специфичность). Для оценки ROC-кривых вычислялась площадь под кривой (ППК), варьирующая от 0,5 (отсутствие диагностической эффективности теста) до 1,0 (максимальная эффективность теста) [297]. 2.2.14. Методы статистической обработки результатов исследования Статистический анализ результатов проводили при участии зав. кафедры медицинской статистики Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова, д.м.н. Герасимова А.Н., с помощью программного комплекса EpiInfo 7.0, рекомендованного для использования в медико-биологических приложениях. Дистрибутив взят с сайта www.cdc.gov (центр слежения за заболеваемостью и смертностью, США, Атланта). Обработка результатов включала общепринятые методы параметрического и непараметрического анализа. Для описания распределения анализируемых показателей рассчитывали частоты встречаемости для дискретных переменных или 70 параметры для непрерывных, используя стандартное представление M±m, где M – среднее арифметическое, а m – статистическая погрешность его определения (среднеквадратичное отклонение среднего по группе) [298], а также другие параметры, включая перцентили. Для поверки корректности использования методов параметрической статистики анализировали формы распределения переменных. В случае их не компактности (с целью исключения погрешностей при расчете достоверности различий средних по группам) использовали аналогичные методы непараметрической статистики, т.е. проводили сравнение не исходных значений переменных, а их рангов. При сравнении параметров с нормальным распределением применялся парный t-тест для независимых выборок. Для параметров, распределение которых отличалось от нормального, при сравнении двух групп использовали критерий Манна-Уитни, а при сравнении трех и более групп – критерий Краскела-Уоллеса, результаты представлены в виде медианы (Ме) с интерквартильным размахом (25-й - 75-й перцентили). Корреляционный анализ проводился по методу Спирмена. Различия считались достоверными при p<0,05. Прогноз значений одной переменной по другим проводили при помощи метода многомерной линейной регрессии (многофакторного анализа), при котором прогноз показателя по показателям 1…n n осуществляется в виде прогноз с bk k . Коэффициенты bk в приведенных k 1 таблицах называются нестандартизованными коэффициентами. Для сравнительного анализа вклада факторов в прогностическую модель приведены также таблицы определяемых как k bk стандартизованных коэффициентов k, ( ) , а также статистическая достоверность p их (k ) отличия от нуля. Клиническую значимость полученного прогностического правила определяли при помощи построения ROC-кривой. 71 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Клиническое значение аутоантител при ревматоидном артрите 3.1.1. Ревматоидные факторы 3.2.1.1. IgM ревматоидный фактор Обследовано 993 пациента из них, 102 с ранним РА, (длительность <6 месяцев; 79 женщин и 23 мужчины; возраст: 51; 41-62 лет), 891 – с развернутым РА (длительность >6 месяцев; 733 женщины и 158 мужчин; возраст: 51; 43-56 лет). Статистически значимых различий по уровню IgМ РФ между группами больных ранним РА и развернутым РА не обнаружено (табл. 15). Таблица 15 Концентрация IgМ РФ (МЕ/мл) при РА и в группе сравнения Группы обследованных n IgМ РФ, Ме (25-75%) раннний РА (<6 мес.) 102 39 (5-137) *•† развернутый РА (>6 мес.) 891 49 (9,5-200) *•† Другие РЗ 319 0 (0-14,3) НА 168 0 (0-19) СКВ 27 0 (0-0) СШ 15 0 (0-0) АС 25 0 (0-0) ОА 33 0 (0-0) OVERLAP 20 36 (5,25-262,0) ПА 9 0 (0-0) ПСА 22 0 (0-0) Здоровые доноры 297 0 (0-0) Группа сравнения в целом 616 0,1 (0-17) * - р<0,05 относительно здоровых доноров, •-отностительно других РЗ, †- р<0,05 относительно группы сравнения в целом Концентрация IgM РФ (МЕ/мл) при раннем РА [39(5-137)] превышала таковую в группе сравнения [0,1(0,0-17), p=0,0001] и не зависела от пола и возраста пациентов. Увеличение сывороточной концентрации IgМ РФ (>15 МЕ/мл) отмечалось у 67% больных ранним РА, 54% пациентов имели 72 высокопозитивные результаты определения данного показателя, 13% низкопозитивные (табл. 16). Группа пациентов с ранним РА серопозитивных по IgM РФ достоверно отличалась от серонегативных больных, преобладанием пациентов с высокой активностью заболевания по DAS28 (52% vs 32%; p=0,04), II-ым функциональным классом заболевания (24,5% vs 0,0, p=0,0001), с II рентгенологической стадией по Стейнброкеру (79% vs 60%, p=0,02), более высокой концентрацией IgА РФ [54,5(23,0-200,1) vs 19,3(18,6-19,4) Ед/мл, p=0,01], АЦЦП [100,0(9,1-100,0) vs 0,9(0,3-7,6) Ед/мл, p=0,0001] и АМЦВ [133,6(26,5-823,0) vs 4,3(0,3-30,5) Ед/мл, p=0,0001]. В группе раннего РА с высокопозитивными значениями IgM РФ в отличие от низкопозитивных по данному показателю больных преобладали пациенты с II рентгенологической стадией заболевания (40% vs 12%, p=0,004). Среди больных ранним РА позитивных по IgM РФ, по сравнению с пациентами негативными по данному показателю чаще выявлялись IgA РФ (13/17, 76% vs 1/4, 25%, p=0,01), АМЦВ (33/42, 79% vs 10/20, 50%, p=0,001) и АЦЦП (52/68, 76% vs 9/34, 26%, p=0,0001), c преобладанием высокопозитивных значений АЦЦП (42/52, 90%, p=0,0001). АКА обнаруживались всего у 41% (9/22) больных ранним РА серопозитивных по IgM РФ и у 30% (3/10) - серонегативных. При раннем РА, отмечена корреляция сывороточного уровня IgM РФ с концентрацией СРБ (p=0,03) и ЧПС (p=0,03) (табл. 18). В целом, АЦБ обнаруживались одновременно c IgM РФ в 3,6 раза чаще (58/68, 85%) чем изолированно (8/34, 23,5%, p=0,001). Концентрация IgM РФ (МЕ/мл) при развернутом РА [49(9,5-200)] превышала таковую в группе сравнения [0,1(0,0-17), p=0,0001] и не зависела от пола и возраста пациентов. У больных развернутым РА увеличение сывороточной концентрации IgМ РФ (>15 МЕ/мл) отмечалось у 66% больных РА: 52% пациентов имели высокопозитивные результаты определения данного показателя, 14% - низкопозитивные (табл. 17). У позитивных по IgM РФ больных развернутым РА, по сранению с 73 негативными, выявлено более высокое содержание IgA РФ [263,3(100,7500,0)1 vs 20,9(15,0-29,4) Ед/мл, p=0,0001], АЦЦП [100,0(50,5-200,0) vs 13,8(0,6-100,0) Ед/мл., p=0,0001], АМЦВ [470,2(140,7-1000,0) vs 44,6(1,6566,8) Ед/мл., p=0,0001], а также большее количество больных с высокой активностью по DAS28 (45% vs 39%, p=0,04), III рентгенологической стадией (32% vs 25%, p=0,015), II функциональным классом заболевания (56% vs 50%, p=0,04). Высокопозитивные пациенты с развернутым РА отличались от низкопозитивных - увеличением СОЭ [31,5(20,0-50,0) vs 23(13-42) мм/ч, p=0,02], повышенным уровнем СРБ [15,2(5,1-35,4) vs 8,3(2,9-20,4) мг/л, p=0,0002], IgA РФ [276,7(113,9-500,0) vs 41,8(21,4-184,5) Ед/мл, p=0,04]; сниженным содержанием АЦЦП [13,8(0,6-100,0) vs 98(3,3-100,0) Eд/мл, p=0,0001], АМЦВ [44,6(1,6-566,8) vs 237(34,2-947,0) Ед/мл, p=0,0008] в сывортке крови, высокими значениями DAS28 [5,4(4,2-6.2) vs 4,6(3,8-5,7) p=0,04], большим количеством лиц с: I (17% vs 0%, p=0,0001) и III (34% vs 26%, p=0,03) рентгенологической стадией РА III, функциональным классом заболевания (19% vs 7%, p=0,0001), наличием системных проявлений (42% vs 20%, p=0,0001). В группе с низкопозитивными значениями сывороточной концентрации IgM РФ, по сравнению с больными с высокопозитивными значеними, чаще встречались пациенты с IV стадией РА (41% vs 27%, p=0,001) и I функциональным классом заболевания (37% vs 24%, p=0,002). Среди пациентов с развернутым РА позитивных по IgM РФ по сравнению с серонегативным по данному показателю больными наиболее часто выявлялись IgA РФ (72/80, 90% vs 15/25, 60% , p=0,0004), АМЦВ (223/230, 97% vs 70/119, 59%, p=0,0001) и АЦЦП (520/588, 88% vs 116/303, 38%, p=0,0001), c преобладанием высокопозитивные концентраций данных антител (62/72, 86%, p=0,0001; 202/223, 91%, p=0,0001 и 474/520, 91% p=0,0001, соответственно). 74 Таблица 16 Характеристика больных ранним РА (n=102) в зависимости от содержания IgM РФ в сыворотке крови Показатель Позитивные >15,0 (МЕ/мл) 68 (67) 106,2(34,1-290,7) 49(41-61) 53/15 4(3-5) 15(8-18) 19(10-27) n(%) Концентрация (МЕ/мл) Возраст (годы) Пол (ж/м) Длительность (мес.) ЧПС ЧБС Активность заболевания DAS 28,баллы 5,3(4,2-5,9) Степень активности, n(%) Ремисcия (DAS28<2,6) 4(4) Низкая (2,6<DAS28<3,2) 7(7) Средняя (DAS28=3,2-5,1) 22(21,5) Высокая (DAS28>5,1) 35(34)1 СОЭ, мм/ч 40(31-60) СРБ, мг/л 11,3(4,9-35,3) Рентг.стадия РА (Стейнброкер, модиф.), n(%) I 15(15) II 53(52) Высокопозитивные >45,0 (МЕ/мл) 54(54) 142,5(90,7-469,5) 51(40-61) 43/11 4,5(2,75-5,5) 16,5(12,5-19,5)1 26,5(18-31) Низкопозитивные >15,0≤45,0 (МЕ/мл) 14(13) 26,2(18,3-33,2) 49(42-59) 11/3 3(3-4) 8(5-15) 11(8-19) Негативные <15,0 (МЕ/мл) 34(33) 0(0-5) 53(44-67) 26/8 4(2-6) 8(8-10) 10(10-10) 5,5(3,9-6,1)1 4,9(4,3-5,6) 4,9(4,1-5,9) 4(4) 5(5) 17(16,5) 28(27,5)1 38(27-41) 13,8(4,5-35,3) 0 2(2) 5(5) 7(6,5) 40(31-60) 9,4(4,9-39,6) 2(2) 5(5) 16(15,5) 11(11) 22(10-33) 7,6(1,7-20,2) 13(13) 2(2) 14(13,5) 41(40) 12(12) 20(19,5) 75 Показатель Позитивные >15,0 (МЕ/мл) Функциональный класс n(%) I, n(%) 43(42) II, n(%) 25(24,5) Концентрации аутоантител IgA РФ (Ед/мл), n=21 54,5(23,0-200,1)1 АЦЦП, (Ед/мл) 100,0(9,1-100,0)1 АМЦВ (Ед/мл), n=62 133,6(26,5-823,0)1 Степени позитивности аутоантител, n(%) IgA РФ+ (n=14) 13(62) IgA РФ высокопозитивные (n=6) 6(29) IgA РФ низкопозитивные (n=8) 7(33) IgA РФ- (n=7) 4(19) АЦЦП+ 52(51) АЦЦП высокопозитивные 47(46) АЦЦП низкопозитивные 5(5) АЦЦП16(15,5) АМЦВ+ (n=43) 33(53) АМЦВ высокопозитивные (n=31) 24(39) АМЦВ низкопозитивные (n=12) 9(15) АМЦВ- (n=19) 9(15) АКА+ (n=12) 9(28) АКА- (n=20) 13(41) АЦБ+ 58(57) АЦБ10(10) 1 Высокопозитивные >45,0 (МЕ/мл) Продолжение таблицы 16 Низкопозитивные Негативные >15,0≤45,0 (МЕ/мл) <15,0 (МЕ/мл) 32(31) 22(21,5) 11(11) 3(3) 34(33,5) 0(0) 123,5(24,8-234,1)1 100,0(29,3-141,8)1 403,4(76,7-1000,0)1 26,8(20,0-45,5) 62,4(1,3-100,0)1 80,5(18,6-468,1)1 19,3(18,6-19,4) 0,9(0,3-7,6) 4,3(0,3-30,5) 10(48) 6(29) 4(19) 0(0) 42(41) 37(36) 5(5) 12(12) 27(44) 19(31) 8(13) 6(9) 6(19) 11(34) 46(45) 8(8) 3(14) 0(0) 2(14) 4(19) 10(10) 10(10) 0 4(4) 6(9) 5(8) 1(2) 3(6) 3(9) 3(9) 12(12) 2(2) 1(5) 0(0) 1(5) 3(14) 9(9) 7(7) 2(2) 25(24,5) 10(16) 7(11) 3(5) 10(16) 3(9) 7(22) 8(8) 26(25) -p<0,05 по сравнению с группой негативной по IgM РФ, n(%) – указаны от общего количества пациентов. 76 Таблица 17 Характеристика больных развернутым РА (n=891) в зависимости от содержания IgM РФ в сыворотке крови Показатель n(%) Концентрация (МЕ/мл) Возраст (годы) Пол (ж/м) Длительность (мес.) ЧПС ЧБС Активность заболевания DAS 28,баллы Степень активности, n(%) Ремисcия (DAS28<2,6) Низкая (2,6<DAS28<3,2) Средняя (DAS28=3,2-5,1) Высокая (DAS28>5,1) СОЭ, мм/ч СРБ, мг/л Стадия РА n(%) I II III IV Функциональный класс n(%) I II III IV Позитивные >15,0 (МЕ/мл) 588 (66) 118,4(49,2-324,2) 50(43-56) 493/95 96(36-192) 8(3-14) 15(7-24) Высокопозитивные >45,0 (МЕ/мл) 463(52) 190,2(81,6-407,5) 50(43-56) 387/76 492(36-180) 8(3-15) 15(7-24)1 Низкопозитивные >15,0≤45,0 (МЕ/мл) 125(14) 29,6(21,6-37,1) 50(43-55) 106/19 144(36-300) 7(3-12) 15(6-22) Негативные <15,0 (МЕ/мл) 303(34) 1,3(0-9,5) 51(40-57) 254/49 72(28-180) 7(3-11) 12(6-21) 5,2(4,0-6,1) 5,4(4,2-6,2)2 4,6(3,8-5,7) 5,2(3,6-6) 46(5) 87(10) 194(22) 261(29) 30(18-49) 13,4(4,4-32,3) 38(4) 68(8) 151(17) 206(23) 31,5(20-50)2 15,2(5,1-35,4)1,2 8(1) 19(2) 43(5) 55(6) 23(13-42) 8,3(2,9-20,4) 54(6) 42(5) 88(10) 119(13) 30(18-40) 6,2(1,7-21,1) 78(9) 143(16) 188(21) 179(20) 78(9) 102(11,5) 156(17,5) 127(14) 0 41(4,5) 32(3,5) 52(6) 61(7) 89(10) 75(8) 78(9) 158(18) 327(36) 96(11) 7(1) 112(12,5) 264(29,5) 87(10) 0 46(5) 63(7) 9(1) 7(1) 114(13) 151(17) 38(4) 0 77 Показатель Позитивные >15,0 (МЕ/мл) 16(5-37) 76(53-106 ) 100,5(58-123) 218(24,5) Высокопозитивные >45,0 (МЕ/мл) 17(5-37) 76(53-106) 103(65-123) 193(21,5) Продолжение таблицы 17 Низкопозитивные Негативные >15,0≤45,0 (МЕ/мл) <15,0 (МЕ/мл) 8(0-65) 3(0-6) 49(20-125) 65,5(40-76) 57(20-190) 68,5(40-82) 25(3) 54(6) Кол-во эрозий Кол-во сужений Счет Sharp-van der Heijde Системные проявления (есть) Концентрации аутоантител IgA РФ (Ед/мл), n=105 263,3(100,7-500,0)1 276,7(113,9-500,0)1,2 41,8(21,4-184,5) 20,9(15,0-29,4) 1 1,2 АЦЦП (Ед/мл) 100,0(50,5-200,0) 13,8(0,6-100,0) 98(3,3-100,0) 13,8(0,6-100,0) АМЦВ (Ед/мл) 470,2(140,7-1000,0)1 44,6(1,6-566,8)1,2 237(34,2-947,0) 44,6(1,6-566,8) Степени позитивности аутоантител, n(%) IgA РФ+ , n=87 72(69) 71(68) 1(1) 15(14) IgA РФ высокопозитивные, n=65 62(59) 62(52) 0(0) 3(3) IgA РФ низкопозитивные, n=22 10(10) 9(9) 1(1) 12(11) IgA РФ-, n=18 8(8) 5(5) 3(3) 10(9) АЦЦП+ 520(58) 422(47) 98(11) 116(13) АЦЦП высокопозитивные 474(53) 389(43,5) 85(9,5) 89(10) АЦЦП низкопозитивные 46(5) 33(3,5) 13(1,5) 27(3) АЦЦП68(8) 41(5) 27(3) 187(21) АМЦВ+ 223(64) 176(50,5) 47(13,5) 70(20) АМЦВ высокопозитивные 202(58) 171(49) 31(9) 39(11) АМЦВ низкопозитивные 21(6) 5(1,5) 16(4,5) 31(9) АМЦВ- n(%) 7(2) 5(1,5) 2(0,5) 49(14) АКА+ n(%) 10(22) 7(15) 3(6,5)1 2(4,5) 1 1,2 1 АКА20(43,5) 17(37) 3(6,5) 14(30) АЦБ+ 520(58)1 422(47)1,2 98(11) 116(13) АЦБ68(7,6)1 41(5)1,2 27(3) 187(21) 1 2 -p<0,05 по сравнению с группой негативной по IgM РФ, -p<0,05 по сравнению с группой низкопозитивных значений определения IgM РФ, n(%) – указаны от общего количества пациентов. 78 АКА обнаруживались всего у 33% (10/30) больных РА серопозитивных по IgM РФ и у 12,5% (2/16) - серонегативных. При РА отмечена слабая корреляция содержания IgM РФ с СОЭ (p=0,0001), концентрацией СРБ (p=0,0001) и наличием СП (p=0,0001)(табл. 18). В целом, АЦБ обнаруживались чаще - одновременно c IgM РФ (520/68, 88%), чем изолированно (116/187, 38%, p=0,001) (табл. 17). Таблица 18 Связь уровня IgM РФ с показателями активности и наличием системных проявлений при РА СОЭ СРБ ЧПС ЧБС DAS28 СП ранний РА (n=102) 0,2 0,2* 0,6* 0,3 0,1 0,1 развернутый РА (n=891) 0,2* 0,3* 0,1 0,1 0,1 0,3* ЧПС-число припухших суставов, ЧБС-число болезненных суставов, СПсистемные проявления; *-p<0,05 Уровни IgM РФ при 2-4 рентгенологических стадиях РА достоверно превышали таковой при 1 стадии в 9,6; 16; 15 раз, соответственно (табл. 19). Таблица 19 Уровни IgM РФ (МЕ/мл) в зависимости от ренгенологической стадии РА (n=53) Рентгенологическая стадия 1 2 3 4 IgM РФ, Ме (255 (5-18)2,3,4 48 (9,5-243)1 80 (39-199,5)1 74 (21-237)1 75%) 1,2,3,4 -p<0,01 по сравнению с соответствующей рентгенологической стадией Таблица 20 Диагностические характеристики IgM РФ при РА ранний РА (n=102) развернутый РА (n=891) ДЧ % 67 67 ДС % 79 79 ОППР 3,2 3,2 ОПОР 0,4 0,4 ППК (верхняя граница нормы: 15 МЕ/мл) 0,8 0,8 Согласно полученным данным (ОППР˃2 и ≤5; ОПОР˃0,2 и ≤0,5; интервал ППК 0,8-0,9), определение IgM РФ попадает в категорию “полезных” тестов, 79 обладающих “очень хорошей” эффективностью для диагностики РА на ранней и развернутой стадиях (табл 20, рис. 12). Рисунок 12 ROC-кривые для IgМ РФ при диагностики раннего РА (А) и развернутого РА (Б) А Б Таким образом, среди пациентов с ранним РА серопозитивных по IgM РФ в отличие от серонегативных, преобладают больные с высокой активностью заболевания по DAS28, II-ым функциональным классом заболевания, II рентгенологической стадией по Стейнброкеру, высокопозитивными значениями по IgА РФ, АЦЦП и АМЦВ. При раннем РА у высокопозитивных по IgM РФ пациентов II рентгенологическая стадия заболевания встречается в 3 раза чаще, чем у больных низкопозитивных по данному показателю. Среди пациентов с развернутым РА серопозитивных по IgM РФ в отличие от серонегативных, преобладают больные с высокой активностью по DAS28, III рентгенологической стадией, II функциональным классом заболевания, высокопозитивные по IgА РФ, АЦЦП и АМЦВ. Больные развернутым РА высокопозитивные по IgM РФ отличались от низкопозитивных: увеличением СОЭ, уровней СРБ и IgA РФ, а также более низкими уровнями АЦЦП, АМЦВ и более высокой активностью заболевания и встречаемостью системных проявлений. На ранней стадии РА уровень IgM РФ коррелирует с показателем распространенности воспалительного процесса - ЧПС, а у лиц с ранним и развернутым РА с рентгенологическими 80 показателями прогрессирования суставной деструкции. АЦБ обнаруживались одновременно c IgM РФ чаще, чем изолированно при раннем РА. У больных ранним и развернутым РА серонегативных по IgM РФ наиболее часто выявлялись АМЦВ (50%-59%). IgM РФ проявил одинаково удовлетворительные значения диагностической точности и эффективности теста независимо от клинической стадии РА. 3.2.1.2. IgА ревматоидный фактор Обследовано 126 пациентов, из них 21 с ранним РА (длительность <6 месяцев; 15 женщин и 6 мужчин; возраст: 53,5; 41-66 лет), 105 с РА (длительность >6 месяцев; 86 женщин и 19 мужчин; возраст: 48; 42-57 лет). Уровень IgA РФ при РА [142 (25-388) Ед/мл] в 2,5 раза превышал таковой при раннем РА [27 (19-80), p=0,02] (табл. 21). Таблица 21 Концентрация IgА РФ (Ед/мл) при РА и в группе сравнения Группа обследованных n IgА РФ, Ме (25-75%) Ранний РА 21 27 (19-80) *•†‡ РА 105 142 (25-388) *•† Другие РЗ 50 0,1(0,1-21) СКВ 7 21 (2-61) АС 11 0,1 (0,1-0,2) ОА 12 0,1 (0,1-0,1) OVERLAP 10 181,5 (6-500) ПСА 10 0,15 (0,1-0,2) Здоровые доноры 35 0,1 (0,1-0,1) Группа сравнения 85 0,1 (0,1-0,1) * - р<0,05 относительно здоровых доноров, •- отностительно других РЗ, †р<0,05 относительно группы сравнения, ‡- р<0,05 между ранней и развернутой стадиями РА Концентрация IgA РФ (Ед/мл) при раннем РА [27 (19-80)] превышала таковую в группе сравнения [0,1 (0,1-0,1); p=0,0001] и не зависела от пола и возраста пациентов. Увеличение сывороточной концентрации IgA РФ (>20 МЕ/мл) отмечалось у 67% больных ранним РА, 29% пациентов имели высокопозитивные результаты определения данного показателя, 38% - 81 низкопозитивные (табл. 22). Группа пациентов с ранним РА серопозитивных по IgA РФ достоверно отличалась от серонегативных больных более высоким уровнем IgM РФ [128,3(44,0-290,7) vs 0,1(0,0-34,1) Ед/мл, p=0,002]. В группе с высокопозитиными значениями IgA РФ, в отличие от низкопозитивных больных выявлен более высокий уровень IgM РФ [408,0(187,7-562,1) vs 54,4(33,65-128,3) Ед/мл, p=0,004]. Среди больных ранним РА позитивных по IgA РФ, по сравнению с негативными пациентами по данному показателю, чаще выявлялся IgM РФ (13/14, 93% vs 2/7, 29%, p=0,003). АКА обнаруживались у 50% (7/14) позитивных по IgA РФ пациентов и у 44% (3/7) негативных. Концентрация IgA РФ (Ед/мл) при развернутом РА [203,3(57,5-500,0)] превышала таковую в группе сравнения [0,1 (0,1-0,1); p=0,0001] и не зависела от пола и возраста пациентов. Увеличение сывороточной концентрации IgА РФ (>20 МЕ/мл) отмечалось у 83% больных развернутым РА: 62% пациентов имели высокопозитивные результаты определения данного показателя, 21% низкопозитивные (табл. 23). В группе позитивных по IgА РФ пациентов с развернутым РА, по сравнению с негативными по данному показателю болными, выявлено: более высокая СОЭ [50,0(32,0-72,0) vs 33,0(22,0-49,5) мм/ч, p=0,01], повышение концентраций IgM РФ [213,4(46,1-528,1) vs 9,5(0,152,3), p=0,0001], АЦЦП [100,0(50,5-323,5) vs 3,9(0,2-7,0), Ед/мл., p=0,0001], АМЦВ [470,2(97,6-1000,0) vs 7,3(2,6-54,6) Ед/мл., p=0,0001], а также большее количество больных с высокой активностью по DAS28 (62% vs 0%, p=0,0001). В группе с высокопозитиными значениями IgA РФ, в отличие от низкопозитивных больных с развернутым РА, выявлен более высокий уровень: IgM РФ [353,8(151,8-650,5) vs 9,5(9,5-46,1) Ме/мл, p=0,0001]; АЦЦП [100,0(77,8-412,9) vs 68,7(7,01-30,4) Ед/мл, p=0,006] и АМЦВ [628,6(206,91000,0) vs 7,3(2,6-54,6) Ед/мл, p=0,0001]. Среди пациентов с развернутым РА, позитивных по IgА РФ по сравнению с серонегативным по данному показателю больными, более часто выявлялись: IgM РФ (74/87, 85% vs 5/18, 28%, p=0,0001), АЦЦП (71/87, 82% vs 4/18, 22%, p=0,0001) и АМЦВ (81/87, 82 93% vs 8/18, 44%, p=0,0001). АКА обнаруживались у 36% (12/33) IgA РФпозитивных пациентов и у 10% (1/10) – негативных. В целом, АЦБ обнаруживались одновременно c IgА РФ в 2 раза чаще (87/87, 100%) чем изолированно (10/18, 55%, p=0,001). Отмечена корреляция уровня IgA РФ с СОЭ (r=0,3, p<0,05) (табл. 24). Согласно полученным данным (ОППР˃2 и ≤5; ОПОР˃0,2 и ≤0,5; интервал ППК 0,8-0,9), определение IgА РФ попадает в категорию “полезных” тестов, обладающих “очень эффективностью для диагностики РА (табл. 25, рис. 13). хорошей” 83 Таблица 22 Характеристика больных ранним РА (n=21) в зависимости от содержания IgA РФ в сыворотке крови Показатель Позитивные >20,0 (Ед/мл) 14(67) 55,1(26,8-200,1) 53,5(41,0-66,0) 11/4 4(3-5) 15(8-18) 19(10-27) n(%) Концентрация (Ед/мл) Возраст (годы) Пол (ж/м) Длительность (мес.) ЧПС ЧБС Активность заболевания DAS 28,баллы 5,6(3,9-6,1) СОЭ, мм/ч 40(31-60) СРБ, мг/л 14,3(3,8-28,1) Концентрации аутоантител IgM РФ (Ме/мл) 128,3(44,0-290,7)1 АЦЦП (Ед/мл) 56,6(2,1-100,0) АМЦВ (Ед/мл) 151,8(30,7-559,4) Степени позитивности аутоантител, n(%) IgM РФ+ 13(62) IgM РФ высокопозитивные 10(48) IgM РФ низкопозитивные 3(14) IgM РФ1(5) Высокопозитивные >60,0 (Ед/мл) 6(29) 217,1(167,1-500,0) 46,5(35,0-58,0) 5/1 4,5(2,75-5,5) 16,5(12,5-19,5)1 26,5(18-31) Низкопозитивные >20,0≤60,0 (Ед/мл) 8(38) 32,4(23,9-50,0) 45,0(40,0-54,0) 6/3 3(3-4) 8(5-15) 11(8-19) Негативные <20,0 (Ед/мл) 7(33) 18,6(4,3-19,4) 45,0(40,0-54,0) 4/3 4(2-6) 8(8-10) 10(10-10) 5,8(3,9-6,0) 38(27-41) 9,1(3,8-19,1) 5,6(3,9-6,2) 40(31-60) 23,9(3,3-47,5) 4,9(2,9-5,4) 22(10-33) 14,0(6,5-60,9) 408,0(187,7-562,1) 11,2(3,2-100,0) 82,8(32,5-198,0) 54,4(33,65-128,3) 100,0(0,90-100,0) 401,4(17,29-715,0) 0,1(0,0-34,1) 100,0(0,1-125,0) 127,8(0,1-1000,0) 6(29) 6(29) 0(0) 7(33) 4(19) 3(14) 2(9) 0(0) 2(9) 0(0) 1(5) 5(24) 84 Продолжение таблицы 22 Показатель Позитивные Высокопозитивные Низкопозитивные Негативные >20,0 (Ед/мл) >60,0 (Ед/мл) >20,0≤60,0 (Ед/мл) <20,0 (Ед/мл) АЦЦП+ 9(43) 4(19) 5(24) 5(24) АЦЦП высокопозитивные 7(33) 2(9) 5(24) 5(24) АЦЦП низкопозитивные 2(9) 2(9) 0(0) 0(0) АЦЦП5(24) 4(19) 3(14) 2(9) АМЦВ+ 12(57) 6(29) 6(29) 4(19) АМЦВ высокопозитивные 8(38) 3(14) 5(24) 4(19) АМЦВ низкопозитивные 4(19) 3(14) 1(5) 0(0) АМЦВ2(10) 0(0) 3(14) 3(14) АКА+ 7(33) 2(9) 3(14) 3(14) АКА7(33) 4(19) 5(24) 4(19) АЦБ+ 14(67) 6(29) 8(38) 7(33) АЦБ0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1 -p<0,05 по сравнению с группой негативной по IgА РФ, n(%) – указаны от общего количества пациентов. 85 Таблица 23 Характеристика больных развернутым РА (n=105) в зависимости от содержания IgA РФ в сыворотке крови Показатель n(%) Концентрация (Ед/мл) Возраст (годы) Пол (ж/м) Длительность (мес.) ЧПС ЧБС Активность заболевания DAS 28,баллы Степень активности, n(%) Ремисcия (DAS28<2,6) Низкая (2,6<DAS28<3,2) Средняя (DAS28=3,2-5,1) Высокая (DAS28>5,1) СОЭ, мм/ч СРБ, мг/л Рентг.стадия РА (Стейнброкер, модиф.), n(%) I II III IV Позитивные >20,0 (Ед/мл) 87(83) 203,3(57,5-500,0) 48,0(42,0-57,0) 70/17 65,0(36,0-105,0) 9,5 (4,0-13,0) 13,0 (7,0-18,5) Высокопозитивные >60,0 (Ед/мл) 65(62) 315,1(155,7-500,0) 53,0(43,0-58,0) 52/13 66,0(36,0-108,0) 9,5(3,5-13,5) 13,0(7,0-20,0) Низкопозитивные >20,0≤60,0 (Ед/мл) 22(21) 30,6 (2,7-41,8) 45,0(27,0-47,5) 18/4 50,5 (30,0-105,0) 8,5(4,5-12,5) 10,5(6,0-15,0) Негативные <20,0 (Ед/мл) 18(17) 9,2(1,9-16,2) 40,5(29,0-49,0) 16/2 48,0(28,0-60,0) 7,0(5,0-10,0) 9,5(6,0-16,0) 5,7(5,2-6,6) 6,3(5,2-6,8) 5,3(5,2-5,7) 5,6(3,9-6,0) 0(0) 2(2) 19(18) 62(59) 50,0(32,0-72,0)1 27,9 (15,8-47,2) 0(0) 0(0) 15(14) 50(48) 56,0(34,0-74,0) 30,4(16,9-47,8) 0(0) 2(2) 4(4) 16(15) 36,0(28,0-62,0) 24,0(9,6-41,1) 0(0) 0(0) 18(17) (0) 33,0(22,0-49,5) 26,2(15,6-49,7) 3(3) 33(31) 24(23) 0(0) 20(19) 21(20) 3(3) 13(3) 3(3) 0(0) 12(12) 3(3) 27(26) 24(23) 3(3) 3(3) 86 Показатель Позитивные >20,0 (Ед/мл) Высокопозитивные >60,0 (Ед/мл) Продолжение таблицы 23 Низкопозитивные Негативные >20,0≤60,0 (Ед/мл) <20,0 (Ед/мл) Функциональный класс n(%) I, n(%) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) II, n(%) 81(77) 70(67) 11(10) 18(17) III, n(%) 7(7) 3(3) 4(4) 0(0) IV, n(%) 0(0) (0) 0(0) 0(0) Концентрации аутоантител IgM РФ (Ме/мл) 213,4(46,1-528,1)1 353,8(151,8-650,5)2 9,5(9,5-46,1) 9,5(0,1-52,3) АЦЦП (Ед/мл) 100,0(50,5-323,5)1 100,0(77,8-412,9)2 68,7(7,0-30,4) 3,9(0,2-7,0) 1 2 АМЦВ (Ед/мл) 470,2(97,6-1000,0) 628,6(206,9-1000,0) 71,7(16,9-559,4) 7,3(2,6-54,6) Степени позитивности аутоантител, n(%) IgM РФ+ 74(70) 64(61) 10(9) 5(5) IgM РФ высокопозитивные 67(64) 61(58) 6(6) 4(4) IgM РФ низкопозитивные 7(6) 3(3) 4(4) 1(1) IgM РФ13(12) 1(1) 12(11) 13(12) АЦЦП+ 71(68) 61(58) 10(9) 4(4) АЦЦП высокопозитивные 63(60) 49(47) 5(5) 3(3) АЦЦП низкопозитивные 8(8) 8(8) 5(5) 1(1) АЦЦП16(15) 4(4) 12(11) 14(13) АМЦВ+ 81(77) 65(62) 16(15) 8(8) АМЦВ высокопозитивные 69(65) 58(55) 11(11) 3(3) АМЦВ низкопозитивные 12(11) 7(7) 5(5) 5(5) АМЦВ6(6) 0(0) 6(6) 10(10) АКА+ (n=13) 12(11) 10(10) 2(2) 1(1) АКА- (n=30) 21(20) 18(17) 6(6) 9(9) АЦБ+ 87(82) 65(61) 22(21) 10(9) АЦБ0(0) 0(0) 0(0) 8(8) p<0,05 по сравнению с группой негативной по IgА РФ, 2p<0,05 по сравнению с группой низкопозитивных значений IgA РФ, n(%) – указаны от общего количества пациентов. 87 Таблица 24 Связь уровня IgА РФ с показателями активности заболевания и наличием системных проявлений РА СОЭ СРБ ЧПС ЧБС DAS28 СП Ранний РА (n=21) 0,3 0,1 0,2 0,01 Развернутый РА (n=105) 0,3* 0,1 0,1 0,2 0,01 ЧПС-число припухших суставов, ЧБС-число болезненных суставов, СПсистемные проявления; *-p<0,05 Таблица 25 Диагностические характеристики IgА РФ при РА Ранний РА (n=21) Развернутый РА (n=105) ДЧ % 71 82 ДС % 83,5 83,5 ОППР 4,3 4,9 ОПОР 0,3 0,2 ППК (верхняя граница нормы: 20 ЕД/мл) 0,9 0,9 Рисунок 13 ROC-кривая IgА РФ для диагностики раннего РА(А) и развернутого РА (Б) А Б Таким образом, среди пациентов с ранним РА серопозитивных по IgA РФ в отличие от серонегативных, преобладают больные с повышенным уровнем IgM РФ. Среди пациентов с развернутым РА серопозитивных по IgА РФ в отличие от серонегативных, преобладают больные с высокой активностью по 88 DAS28, кроме этого в данной группе отмечено: более высокая СОЭ, повышение концентраций IgM РФ, АЦЦП, АМЦВ. Больные развернутым РА высокопозитивные по IgА РФ отличались от низкопозитивных: увеличением уровней IgM РФ, АЦЦП и АМЦВ. При развернутом РА уровень IgA РФ коррелирует с таким показателем активности воспаления при РА как СОЭ и ассоциируется с высокопозитивными значениями АЦЦП, АМЦВ, а также высокой активностью заболевания по DAS28. IgА РФ проявил одинаково удовлетворительные значения диагностической значимости и эффективности теста независимо от клинической стадии РА. 3.2.2. Антитела к цитруллинированным белкам. 3.2.2.1. Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду. Обследовано 993 пациента, из них 102 с ранним РА, (длительность <6 месяцев; 79 женщин и 23 мужчины; возраст: 51; 41-62 лет), 891 – с РА (длительность >6 месяцев; 733 женщины и 158 мужчин; возраст: 51; 43-56 лет). При развернутом РА сывороточный уровень АЦЦП [100 (4-100) Ед/мл] достоверно превышал таковой при раннем РА [36 (0,5-100)] в 2,8 раза (p=0,001) (табл. 26). Концентрация АЦЦП при раннем РА [36(0,5-100)] превышала таковую в группе сравнения [0,7(0,3-1,4), p=0,0001] и не зависела от пола и возраста пациентов. Увеличение содержания АЦЦП (>5 Ед/мл) отмечалось у 57% больных ранним РА, 52% пациентов имели высокопозитивные результаты определения данного показателя, 5% были низкопозитивными (табл. 27). Группа лиц серопозитивных по АЦЦП достоверно отличалась от серонегативных больных: преобладанием пациентов с высокой активностью по DAS28 (54% vs 15%; p=0,02), II-ого функционального класса заболевания (83% vs 20,5; p=0,0001), а также более высоким уронем СРБ [15,5(5,8-36,5) vs 6,6(1,4-17) мг/л; p=0,004], IgM РФ [91,8(31,1-338,8) vs 6,7(0,0-50,0) МЕ/мл, p=0,0001] и АМЦВ [355,6(105,7-1000,0) vs 0,9(0,3-22,1) Ед/мл, p=0,0001]. У высокопозитивных 89 Таблица 26 Концентрация АЦЦП (Ед/мл) при РА и в группе сравнения Группы обследованных n АЦЦП, Ме (25-75%) Ранний РА 102 36 (0,5-100) *•†‡ РА 891 100 (4-100) *•† Другие РЗ 319 0,8(0,4-1,5) НА 168 1 (0,2-24) СКВ 27 1 (0,2-27) СШ 15 2 (2-2) АС 25 8 (2-41) ОА 33 1 (0,3-3) OVERLAP 20 15 (0,4-26) ПА 9 0,3 (0,1-0,4) ПСА 22 0,3 (0,1-1) Здоровые доноры 297 0,4 (0,2-11) Группа сравнения 616 1,0 (0,3-1,4) * - р<0,05 относительно здоровых доноров, •-отностительно других РЗ, †р<0,05 относительно группы сравнения, ‡- р<0,05 между ранней и развернутой стадиями РА по АЦЦП пациентов в отличии от низкопозитивных чаще встречался II функциональный класс заболевания (92% vs 0%, p=0,0001), а также присутствовал более высокий уровень АМЦВ [629,6(190,1-1000,0) vs 59,8(26,7-77,2) Ед/мл, p=0,004]. При раннем РА совместно с АЦЦП наиболее часто выявлялись АМЦВ (35/37, 95%) и IgM РФ (51/58, 88%), при этом преобладали высокопозитивные значения концентраций данных антител (30/35, 86% и 36/51, 71% соответственно). АКА обнаруживались у 52% (10/19) больных серопозитивных по АЦЦП. У больных серонегативных по АЦЦП: IgM РФ, АМЦВ и АКА обнаруживались в 39% (17/44), 36% (9/25) и 18% (2/13) случаев. Также отмечена корреляция уровня АЦЦП с концентрацией СРБ (p=0,02) и ЧБС (p=0,02) (табл. 29). 90 Таблица 27 Характеристика больных ранним РА (n=102) в зависимости от содержания АЦЦП в сыворотке крови Показатель Позитивные >5,0 (Ед/мл) 58(57) 100(88,1-100) 49(40-61) 46/12 5,5(3,5-6) 12,5(8-18) 17,5(10-29) n(%) Концентрация (МЕ/мл) Возраст (годы) Пол (ж/м) Длительность (мес.) ЧПС ЧБС Активность заболевания DAS 28,баллы 5,3(4,3-5,9) Степень активности, n(%) Ремисcия (DAS28<2,6) 3(3) Низкая (2,6<DAS28<3,2) 4(4) Средняя (DAS28=3,2-5,1) 20(20,5) Высокая (DAS28>5,1) 31(31,5)1 СОЭ, мм/ч 31(27-61) СРБ, мг/л 15,5(5,8-36,5)1 Рентг.стадия РА (Стейнброкер, модиф.) n(%) I 19(19,5) II 39(40) Функциональный класс n(%) I 9(9)1 II 49(50)1 Высокопозитивные >15,0 (Ед/мл) 53(52) 100(100-100) 49(40-60) 42/11 6(4-6) 15(8-18) 24(10-31) Низкопозитивные >5,0≤15,0 (Ед/мл) 5(5) 9,1(9,1-11,6) 61(58-61) 4/1 2(2-2) 10(10-10) 10(10-10) Негативные <5,0 (Ед/мл) 44(43) 0,4(0,2-0,9) 53(45-67) 33/11 1,5(1-3) 10(4-15) 10(5-19) 5,3(4,3-5,9) 4,5(3,7-6,4) 4,7(3,9-5,9) 3(3) 4(4) 18(18) 28(29) 35,5(27-61) 15,5(5,8-36,5)1 0 0 2(2) 3(3) 8(8-8) 15,4(12,1-27,1) 3(3) 10(10) 16(16) 15(15) 32(10-39) 6,6(1,4-17) 18(18,5) 35(36) 1(1) 4(4) 12(12) 32(31) 4(4) 49(50) 5(5) 0 35(34) 9(9) 91 Показатель Позитивные >5,0 (Ед/мл) Концентрации аутоантител IgA РФ (Ед/мл), n=21 36,1(19,4-200,1) IgM РФ (МЕ/мл) 91,8(31,1-338,8)1 АМЦВ (Ед/мл), n=62 355,6(105,7-1000,0)1 Степени позитивности аутоантител, n(%) IgA РФ+ (n=14) 9(43) IgA РФ высокопозитивные (n=6) 6(29) IgA РФ низкопозитивные (n=8) 3(14) IgA РФ- (n=7) 5(24) IgM РФ+ 51(52)1 IgM РФ высокопозитивные 36(36,5)1 IgM РФ низкопозитивные 15(15,5)1 IgM РФ6(7)1 АМЦВ+ (n=44) 35(56,5)1 АМЦВ высокопозитивные (n=30) 30(48,5)1 АМЦВ низкопозитивные (n=14) 5(8) АМЦВ- (n=18) 2(3)1 АКА+ (n=12) 10(31)1 АКА- (n=20) 9(28) 1 Высокопозитивные >15,0 (Ед/мл) Продолжение таблицы 27 Низкопозитивные Негативные >5,0≤15,0 (Ед/мл) <5,0 (Ед/мл) 24,9(19,4-55,1) 217,1(200,1-234,1) 1 85,7(31,1-187,7) 525,4(51,4-562,1)1 629,6(190,1-1000,0)1,2 59,8(26,7-77,2)1 7(33) 2(9) 3(14) 5(24) 47(48) 32(32,5) 15(15,5) 6(6) 32(51,5) 29(47) 3(5) 2(3) 9(28) 8(25) 2(10) 4(20) 0(0) 0(0) 4(4) 4(4) 0 1(1) 3(5) 1(1,5) 2(3) 0 1(3) 1(3) 24,8(18,6-79,9) 6,7(0,0-50,0) 0,9(0,3-22,1) 5(24) 0(0) 5(24) 2(9) 17(17) 12(12) 5(5) 27(26,5) 9(14,5) 0 9(14,5) 16(26) 2(6) 11(35) -p<0,05 по сравнению с группой негативных значений определения АЦЦП, 2-p<0,05 по сравнению с группой низкопозитивных значений определения АЦЦП, n(%) – указаны от общего количества пациентов. 92 Концентрация АЦЦП (Ед/мл) при развернутом РА [100(4-100)] превышала таковую в группе сравнения [0,7(0,3-1,4) Ед/мл, p=0,0001] и не зависела от пола и возраста пациентов. Увеличение сывороточной концентрации АЦЦП (>5 Ед/мл) отмечалось у 73% больных развернутым РА: 67% пациентов имели высокопозитивные результаты определения данного показателя, 6% - низкопозитивные (табл. 28). Группа серопозитивных по АЦЦП больных, с развернутым РА, достоверно отличалась от серонегативных - преобладанием пациентов с III функциональным классом заболевания (22,5% vs 14%, p=0,004), наличием системных проявлений (20% vs 6%, p=0,0001) а также более высокими: СОЭ [36(22-55) vs 30(18,5-40) мм/ч, p=0,04], уровнями СРБ [13,4(4,2-33,6) vs 6,4(1,6-20,9) мг/л, p=0,0001], IgM РФ [93,0(30,1-288,3) vs 5,0(0,0-13,0) МЕ/мл, p=0,0001], АМЦВ [474,7(154,6-1000,0) vs 5,0(1,2-28,1) Ед/мл, p=0,0001] и меньшим количеством пациентов с II рентгенологической стадией РА (26% vs 33% p=0,02), I функциональным классом заболевания (26% vs 38%, p=0,0002). У высокопозитивных по АЦЦП пациентов с развернутым РА по сравнению с низкопозитивными были выше: значения DAS28 [5,5(4,4-6,3) vs 4,9(3,5-5,8), p=0,03], концентрации IgM РФ [104,6(36,1-322,1) vs 24,9(9,5-75,2) MЕ/мл, p=0,0001], IgA РФ [233,2(62,2-500,0) vs 16,2(9,2-22,8) Ед/мл, p=0,0001] АМЦВ [583,9(187,1-1000,0) vs 34,7(25,7-68,2) Ед/мл, p=0,0001], а также чаще встречались пациенты с высокой активностью (44% vs 27%, p=0,01), II функциональным классом (52% vs 35%, р=0,01) заболевания. При этом, в группе с низкопозитивными значениями концентрации АЦЦП, по сравнению с высокопозитивной по данному показателю группой чаще встречались пациенты со средней активностью РА по DAS28 (44% vs 28%, p=0,005), III функциональным классом заболевания (36% vs 21%, p=0,006). Среди пациентов позитивных по АЦЦП, наиболее часто выявлялись АМЦВ (247/254, 97%), IgA РФ (77/81, 95%) и IgM РФ (547/649, 84%). При этом преобладали высокопозитивные значения концентраций данных антител (225/247, 89%; 61/77, 79% и 441/547, 68% соответственно). АКА 93 обнаруживались всего у 33% (11/33) больных развернутым РА серопозитивных по АЦЦП. У больных серонегативных по АЦЦП: IgM РФ, IgA РФ, АМЦВ и АКА выявлялись в 22% (54/242), 42% (10/24), 52% (44/95) и 23% (3/13) случаев, с превалированием низкопозитивных значений, IgA РФ (6/10, 60%), АМЦВ (32/44, 73%) и высокопозитивных IgM РФ (32/54, 59%) (табл. 28). При развернутом РА отмечена корреляция уровня АЦЦП с концентрацией СРБ (r=0,2; p=0,0001), а также с ЧПС (r=0,2; p=0,007), ЧБС (r=0,3; p=0,0003) и DAS28 (r=0,1; p=0,02) (табл. 29). У пациентов с РА “высокопозитивных” по АЦЦП присутствовала, согласно рентгенологическим признакам, более выраженная степень суставной деструкции (большее кол-во сужений [76(58-105) vs 34(24-58)] и более высокие значения общего счета Sharp-van der Heijde [95,5(65-18) vs 43(30-34), p<0,01] по сравнению АЦЦП-негативными больными (табл. 30). Согласно полученным данным (ОППР˃5; ОПОР˃0,2 и ≤0,5; интервал ППК 0,8-0,9 при раннем РА; ОППР˃2 и ≤5; ОПОР˃0,2 и ≤0,5; интервал ППК 0,70,8 при РА), определение АЦЦП при РА попадает в категорию “полезных” тестов, обладающих “очень хорошей” эффективностью для диагностики РА, однако при раннем РА он проявляет несколько более низкую диагностическую эффктивность, соответствующую категории “хорошая” (табл. 31, рис. 14) . Таким образом, cывороточная концентрация АЦЦП при развернутом РА в 2,8 раза превышала таковую при раннем РА, при этом, в обоих случаях преобладали высокопозитивные значения данного показателя. Независимо от клинической стадии заболевания позитивность по АЦЦП, ассоциировалась с высоким уровнем СРБ. Концентрация АЦЦП при раннем РА коррелировала с ЧБС, при РА - с ЧПС, ЧБС и DAS28, а также ассоциировалась с выраженностью суставной деструкции. 94 Таблица 28 Характеристика больных развернутым РА (n=891) в зависимости от содержания АЦЦП в сыворотке крови Показатель n(%) Концентрация (МЕ/мл) Возраст (годы) Пол (ж/м) Длительность (мес.) ЧПС ЧБС Активность заболевания DAS 28,баллы Степень активности, n(%) Ремисcия (DAS28<2,6) Низкая (2,6<DAS28<3,2) Средняя (DAS28=3,2-5,1) Высокая (DAS28>5,1) СОЭ, мм/ч СРБ, мг/л Стадия РА n(%) I II III IV Позитивные >5,0 (Ед/мл) 649 (73) 100(70,7-187,9) 49(42-58) 530/119 87(36-168) 8(4-14)1 14(7-22)1 Высокопозитивные >15,0 (Ед/мл) 597 (67) 100(100-200) 49(42-58) 489/108 84(36-168) 9(4-14) 14(7-23) Низкопозитивные >5,0≤15,0 (Ед/мл) 52 (6) 11,1(7,6-12,7) 50(36-57,5) 41/11 105(36-228) 6(3-7) 9(3-14) Негативные <5,0 (Ед/мл) 242 (2) 0,5(0,2-1,8) 52(41,5-59,5) 213/29 48(17-156) 5(1-10) 8(3-19,5) 5,4(4,3-6,2) 5,5(4,4-6,3)1,2 4,9(3,5-5,8) 5,1(3,6-5,9) 88(10) 102(11,5) 183(20,5) 276(31) 36(22-55)1 13,4(4,2-33,6)1 80(9) 95(10,5) 160(18) 262(29,5) 36(22-55)1 13,7(4,3-33,8)1 8(1) 7(1) 23(2,5) 14(1,5) 40(20,5-60) 11,9(1,6-25,3) 35(4) 36(4) 76(8,5) 95(10,5) 30(18,5-40) 6,4(1,6-20,9) 120(13,5) 169(19) 187(21) 173(19,5) 111(12,5) 156(17,5) 170(19) 160(18) 9(1) 13(1,5) 17(2) 13(1,5) 45(5) 81(9) 62(7) 54(6) 95 Показатель Позитивные >5,0 (Ед/мл) Высокопозитивные >15,0 (Ед/мл) Продолжение таблицы 28 Низкопозитивные Негативные >5,0≤15,0 (Ед/мл) <5,0 (Ед/мл) Функциональный класс n(%) I 169(19) 154(17,5) 15(1,5) 91(10) II 329(37) 311(35) 18(2) 116(13) III 147(16,5) 128(14,5) 19(2) 35(4) IV 4(0,5) 4(0,5) 0 0 Кол-во эрозий 13,5(4-35) 12(5-33) 25(0-105) 3(0-12) Кол-во сужений 76(55,5-105,5)1 76(58-105)1 102(20-137) 34(24-58) Счет Sharp-van der Heijde 98(63-122,5)1 98(65-118)1 127(20-242) 43(30-64) Системные проявления (есть) n(%) 132(18,5) 118(16,5) 14(2) 15(2) Концентрации аутоантител IgA РФ (Ед/мл), n=105 233,2(62,2-500,0)1 255,8(68,3-500,0) 106,9(42,2-142,1) 16,2(9,2-22,8) 1 1,2 IgM РФ (МЕ/мл) 93,0(30,1-288,3) 104,6(36,1-322,1) 24,9(9,5-75,2) 5,0(0,0-13,0) АМЦВ (Ед/мл), n=349 474,7(154,6-1000,0)1 583,9(187,1-1000,0)1,2 34,7(25,7-68,2) 5,0(1,2-28,1) Степени позитивности аутоантител, n(%) IgA РФ+ (n=87) 77(73) 69(65) 8(8) 10(10) IgA РФ высокопозитивные (n=65) 61(58) 55(52) 6(6) 4(4) IgA РФ низкопозитивные (n=22) 16(15) 14(13) 2(2) 6(6) IgA РФ- (n=18) 4(4) 3(3) 1(1) 14(13) IgM РФ+ 547(61,5) 515(58) 32(3,5) 54(6) IgM РФ высокопозитивные 441(49,5) 422(47,5) 19(2) 32(3,5) IgM РФ низкопозитивные 106(12) 93(10,5) 13(1,5) 22(2,5) IgM РФ102(11,5) 82(9,5) 20(2) 188(21) АМЦВ+ (n=297) 247(71) 229(66) 18(5) 44(12,5) АМЦВ высокопозитивные (n=245) 225(64,5) 220(63) 5(1,5) 12(3,5) АМЦВ низкопозитивные (n=52) 22(6,5) 10(3) 12(3,5) 32(9) АМЦВ- (n=52) 7(2) 2(0,5) 5(1,5) 51(14,5) АКА+ (n=13) 11(24) 10(22) 1(2) 3(6,5) АКА- (n=33) 22(48) 19(41,5) 3(6,5) 10(21,5) 1 -p<0,05 по сравнению с группой негативных значений определения АЦЦП, 2-p<0,05 по сравнению с группой низкопозитивных значений определения АЦЦП, n(%) – указаны от общего количества пациентов. 96 Таблица 29 Связь уровня АЦЦП с показателями активности заболевания и наличием системных проявлений РА СОЭ СРБ ЧПС ЧБС DAS28 СП ранний РА (n=102) 0,1 0,2* 0,5 0,6* 0,2 0,2 развернутый РА (n=891) 0,1 0,2* 0,2* 0,3* 0,1* 0,1 ЧПС-число припухших суставов, ЧБС-число болезненных суставов, СП-системные проявления; *-p<0,05 Таблица 30 Связь уровня АЦЦП с рентгенологическими показателями суставной деструкции при РА(n=53) Уровни позитивности Все позитивные Негативные Низкий Высокий Кол-во эрозий 3(0-12) 25(0-105) 13(5-33) 14(5-33) Кол-во сужений 34(24-58) 102(20-137) 76(58-105)* 76(58-105)* Общий счет 43(30-34) 127(20-242) 95,5(65-18)* 98(68-122)* Sharp-van der Heijde *-p<0,01 по сравнению с группой негативных значений АЦЦП Таблица 31 Диагностические характеристики АЦЦП при РА ранний РА (n=102) развернутый РА (n=891) ДЧ % 59 75 ДС % 87 87 ОППР 4,5 5,8 ОПОР 0,4 0,3 ППК (верхняя граница нормы: 5 ЕД/мл) 0,7 0,8 Рисунок 14 ROC-кривые для АЦЦП при диагностике раннего РА (А) и развернутого РА (Б) А Б 97 Независимо от клинической стадии РА, совместно с АЦЦП наиболее часто выявлялись высокопозитивные значения концентрации АМЦВ (86-89%). Высокопозитивные по АЦЦП пациенты отличались от низкопозитивных более высокими уровенем IgM РФ и активностью заболевания при РА, а также повышенным уровнем АМЦВ заболевания. Изолированно от не зависимо от длительности АЦЦП с наибольшей частотой обнаруживались: при раннем РА - IgM РФ (39%), при развернутом РА АМЦВ (46%) Наилучшие показатели диагностической точности АЦЦП проявляют при развернутом РА. 3.2.2.2. Антитела к модифицированному цитруллинированному виментину. Обследовано 411 пациентов, из них 62 с ранним РА (44 женщин и 18 мужчины; возраст: 52; 40-61 лет), 349 с развернутым РА (286 женщин и 63 мужчин; возраст: 48,0; 42-55 лет). При развернутом РА сывороточный уровень АМЦВ [273 (40,7-973) Ед/мл] достоверно превышал таковой при раннем РА [68,5 (1-692)] в 4 раза (p=0,002) (табл. 32). Концентрация АМЦВ (Ед/мл) при раннем РА [68,5(1-692)] превышала таковую в группе сравнения [1,0(0,2-14,0), p=0,0001] и не зависела от пола и возраста пациентов. Увеличение содержания АМЦВ (>20 Ед/мл) отмечалось у 69% больных ранним РА, 50% пациентов имели высокопозитивные результаты определения данного показателя, 12% были низкопозитивными (табл. 33). Группа пациентов серопозитивных по АМЦВ достоверно отличалась от серонегативных больных: более высокими: СОЭ [38(27-70) vs 10(7,5-21,5) мм/ч, p=0,03], концентрацией IgM РФ [90,7(23,6-406,2) vs 15(0,1-64,7) МЕ/мл, p=0,0001], IgA РФ [50,0(21,5-183,6) vs 18,6(5,6-21,5) Ед/мл, p=0,024], АЦЦП [100,0(9,1-100,0) vs 0,0(0,1-0,5) Ед/мл, p=0,0001], а также преобладанием пациентов с высокой активностью заболевания по DAS28 (51% vs 21%, p=0,01) и I рентгенологической стадией (44% vs 21%, p=0,04) заболевания. 98 Таблица 32 Концентрация АМЦВ (Ед/мл) при РА и в группе сравнения Группа обследованных n АМЦВ, Ме (25-75%) ранний РА 62 68,5 (1-692) *•†‡ РА 349 273 (40,7-973) *•† Другие РЗ 319 1,2 (0,3-19) НА 168 1 (0,2-24) СКВ 27 1 (0,2-27) СШ 15 2 (2-2) АС 25 8 (2-41) ОА 33 1 (0,3-3) OVERLAP 20 15 (0,4-26) ПА 9 0,3 (0,1-0,4) ПСА 22 0,3 (0,1-1,2) Здоровые доноры 297 0,4 (0,2-11) Группа сравнения 616 (0,2-14) * - р<0,05 относительно здоровых доноров, •-отностительно других РЗ, †- р<0,05 относительно группы сравнения, ‡- р<0,05 между ранней и развернутой стадиями РА У высокопозитивных по АМЦВ больных выявлена болеее высокая концентрация АЦЦП по сравнению с низкопозитивными пациентами [100,0(100,0-100,0) vs 2,7(0,6-9,1) Ед/мл, p=0,0001]. При раннем РА IgM РФ, IgA РФ, АЦЦП и АКА обнаруживались совместно с АМЦВ - с частотой: 83% (36/43), 75% (12/16), 81% (35/43) и 44% (10/22). У больных серонегативных по АМЦВ: IgM РФ, IgA РФ, АЦЦП и АКА обнаруживались в 42% (8/19), 40% (2/5), 16% (3/19) и 21% (2/8) случаев, соответственно. Отмечена корреляция уровней АМЦВ и СРБ при раннем РА (r=0,3, p<0,05) (табл. 36). Концентрация АМЦВ (Ед/мл) при развернутом РА [273(40,7-973)] превышала таковую в группе сравнения [1,0(0,2-14), p=0,0001] и не зависела от пола и возраста пациентов. 99 Таблица 33 Характеристика больных ранним РА (n=62) в зависимости от содержания АМЦВ в сыворотке крови Показатель Позитивные Высокопозитивные Низкопозитивные Негативные >20,0 (Ед/мл) >60,0 (Ед/мл) >20,0≤60,0 (Ед/мл) <20,0 (Ед/мл) n(%) 43(69) 31(50) 12(19) 19(31) Концентрация (МЕ/мл) 301,2(46,9-932,3) 692,3(198-1000) 30,6(24,9-40,2) 0,5(0,2-0,9) Возраст (годы) 49(37-59) 49(40-60) 45,5(36-55,5) 59(53-70) Пол (ж/м) 30/13 23/8 7/5 14/5 Длительность (мес.) 3,5(1,7-6) 6(4-6) 1,5(1-2) 4(4-4) ЧПС 12,5(6,5-18) 15(8-18) 10(4-15) 10(10-10) ЧБС 15(9-26,5) 24(10-31) 10(5-19) 10(10-10) Активность заболевания DAS 28,баллы 5,3(3,9-6,2) 4,9(3,7-5,9) 5,9(4,5-6,4) 4,3(3,1-5,1) Ремисcия (DAS28<2,6) 1(1,5) 1(1,5) 0 2(3,5) Низкая (2,6<DAS28<3,2) 5(8) 4(6,5) 1(1,5) 4(6,5) Средняя (DAS28=3,2-5,1) 15(24) 13(21) 2(3) 9(14,5) Высокая (DAS28>5,1) 22(35,5) 13(21) 9(14,5) 4(6,5)1 СОЭ, мм/ч 38(27-60) 35,5(27-61) 38(31-40) 10(7,5-21,5) СРБ, мг/л 15,4(8,6-36,5) 19,7(8,6-39,6) 9,9(7,6-17,2) 8,4(0,7-28,1) Рентг. стадия РА (Стейнброкер, модиф.) n(%) I 19(30,5)1 15(24) 4(6,5) 4(6,5)1 II 24(39) 16(26) 8(13) 15(24) Функциональный класс n(%) I 35(56,5)1 26(42)2 9(14,5) 17(27,5) II 8(13) 5(8) 3(5) 2(3) 100 Показатель Позитивные >20,0 (Ед/мл) Высокопозитивные >60,0 (Ед/мл) Продолжение таблицы 27 Низкопозитивные Негативные >20,0≤60,0 (Ед/мл) <20,0 (Ед/мл) Концентрации аутоантител IgA РФ (Ед/мл), n=21 50,0(21,5-183,6)1 36,1(19,7-127,9) 123,5(52,4-200,6) 18,6(5,6-21,5) 1 1 1 IgM РФ (МЕ/мл) 90,7(23,6-406,2) 114,0(33,5-417,4) 71,0(14,5-216,6) 15(0,1-64,7) 1 1,2 1 АЦЦП (Ед/мл) 100,0(9,1-100,0) 100,0(100,0-100,0) 2,7(0,6-9,1) 0,0(0,1-0,5) Степени позитивности аутоантител, n(%) IgA РФ+ (n=14) 12(57) 8(38) 4(19) 2(10) IgA РФ высокопозитивные (n=6) 6(29) 3(14) 3(14) 0(0) IgA РФ низкопозитивные (n=8) 6(29) 5(24) 1(5) 2(10) IgA РФ- (n=7) 4(19) 4(19) 0(0) 3(14) IgM РФ+ 36(58) 27(43,5) 9(14,5) 8(13) IgM РФ высокопозитивные 27(43,5) 20(32,5) 7(11,5) 5(8) IgM РФ низкопозитивные 9(14,5) 7(11) 2(3) 3(4,5) IgM РФ7(11) 4(6,5) 3(4,5) 11(18) АЦЦП+ 35(56,5) 30(48,5) 5(8) 3(4,5) АЦЦП высокопозитивные 30(48,5) 29(47) 1(1,5) 2(3) АЦЦП низкопозитивные 5(8) 1(1,5) 4(6,5) 1(1,5) АЦЦП8(13) 1(1,5) 7(11,5) 16(26) 1 АКА+ (n=12) 10(31) 8(25) 2(6) 2(6) АКА- (n=20) 12(38) 9(28) 3(10) 8(25) 1 2 -p<0,05 по сравнению с группой негативных значений определения АМЦВ, -p<0,05 по сравнению с группой низкопозитивных значений определения АМЦВ, n(%) – указаны от общего количества пациентов. 101 Увеличение содержания АМЦВ (>20 Ед/мл) отмечалось у 85% больных развернутым РА, 70% пациентов имели высокопозитивные результаты определения данного показателя, 15% были низкопозитивными (табл. 34). Группа пациетов с развернутым РА серопозитивных по АМЦВ достоверно отличалась от серонегативных больных: большим ЧПС [8(4-14) vs 3(0-8,5), p=0,002], ЧБС [16(8-24) vs 4,5(2-14), p=0,0001], более высокой активностью заболевания по DAS28 [5,3(4,3-6,2) vs 3,9(3,3-5,3), p=0,002], преобладанием лиц с IV рентгенологической стадией (30% vs 13%, p=0,006), наличием системных проявлений (25% vs 8%, p=0,0001) и более высокими уровнями IgA РФ [182,9(50,9-500,0) vs 18,0(8,4-22,6), p=0,0001], IgM РФ [128,2(41,3376,8) vs 9,5(0,1-9,5) МЕ/мл, p=0,0001] и АЦЦП [130,2(54,6-200,0) vs 0,9(0,13,9) Ед/мл, p=0,0001], а также частотой обнаружений данных аутоантител: IgA РФ (80/88, 91% vs 7/17, 41%, p=0,0001), IgM РФ (254/297, 85% vs 13/52, 25%, p=0,0001), АЦЦП (270/297, 90% vs 6/52, 11%, p=0,0001). При развернутом РА высокопозитивные по АМЦВ пациенты отличались от низкопозитивных большим количеством суставных сужений [80(61,5-107) vs 44(21-53), p=0,01] и более высокими значениями счета Sharp-van der Heijde [100,5(67-122,5) vs 48(23-73), p=0,03], более высокими концентрациями IgA РФ [256,9(90,7-500,0) vs 46,0(18,5-113,9), p=0,008], IgM РФ [158,8(55,5-407,3) vs 39,2(9,5-120,8), p=0,0001] и АЦЦП [191,7(100,0-200,0) vs 10,1(2,3-64,2), p=0,0001] (табл. 34, 35). Отмечена корреляция данного показателя с СОЭ, уровнем СРБ, DAS28 и наличием системных проявлений при развернутом РА (табл. 36). Согласно полученным данным (ОППР˃2 и ≤5; ОПОР˃0,2 и ≤0,5; интервал ППК 0,8-0,9), определение АМЦВ попадает в категорию “полезных” тестов, обладающих “очень хорошей” эффективностью для диагностики РА независимо от его клинической стадии (табл. 37, рис. 15). 102 Таблица 34 Характеристика больных развернутым РА (n=349) в зависимости от содержания АМЦВ в сыворотке крови Показатель n(%) Концентрация (МЕ/мл) Возраст (годы) Пол (ж/м) Длительность (мес.) ЧПС ЧБС Активность заболевания DAS 28,баллы Ремисcия (DAS28<2,6) Низкая (2,6<DAS28<3,2) Средняя (DAS28=3,2-5,1) Высокая (DAS28>5,1) СОЭ, мм/ч СРБ, мг/л Стадия РА n(%) I II III IV Позитивные >20,0 (Ед/мл) 297(85) 412,7(122,6-1000) 49(43-54) 246/51 80,5(36-168) 8(4-14)1 16(8-24)1 Высокопозитивные >60,0 (Ед/мл) 245(70) 609,6(221,7-1000) 48,5(44-54,5) 202/43 81(36-168) 8(4-14)1 15,5(8-24)1 Низкопозитивные >20,0≤60,0 (Ед/мл) 52(15) 34,2(25,8-42,6) 49(36-54) 44/8 73(28-132) 8(5-15)1 18,5(7-24,5)1 Негативные <20,0 (Ед/мл) 52(15) 1,6(0,5-5,0) 46,5(37-55,5) 42/10 54(17-156) 3(0-8,5) 4,5(2-14) 5,3(4,3-6,2)1 38(11) 54(15,5) 86(24,5) 119(34) 32(20-51) 19,3(6,8-38,1) 5,3(4,3-6,2)1 31(9) 45(13) 71(20,5) 98(28) 32(20-52) 19,5(6,9-40,2) 5,4(4,3-6,2)1 7(2) 9(2,5) 15(4) 21(6) 31,5(17,5-50) 17,4(3,9-31,3) 3,9(3,3-5,3) 5(1,5) 10(3) 20(5,5) 17(5) 30,5(19-40) 10,9(3-33,3) 13(3,5) 94(27) 102(29,5) 8(2) 73(21) 85(24,5) 5(1,5) 21(6) 17(5) 5(1,5) 26(7,5) 14(4) 88(25) 79(22,5) 9(2,5) 7(2) 103 Показатель Функциональный класс n(%) I II III IV Кол-во эрозий Кол-во сужений Счет Sharp-van der Heijde Системные проявления (есть) Концентрации аутоантител IgA РФ (Ед/мл), n=105 IgM РФ (МЕ/мл) АЦЦП (Ед/мл) Степени позитивности аутоантител, n(%) IgA РФ+ (n=87) IgA РФ высокопозитивные (n=65) IgA РФ низкопозитивные (n=22) IgA РФ- (n=18) IgM РФ+ IgM РФ высокопозитивные IgM РФ низкопозитивные IgM РФАЦЦП+ АЦЦП высокопозитивные АЦЦП низкопозитивные АЦЦПАКА+ АКА1 Продолжение таблицы 34 Негативные <20,0 (Ед/мл) Позитивные >20,0 (Ед/мл) Высокопозитивные >60,0 (Ед/мл) Низкопозитивные >20,0≤60,0 (Ед/мл) 83(24) 194(55,5) 16(4,5) 4(1) 12(3-33) 76(53-105) 98(61-122) 75(21,5) 69(20) 159(45,5) 13(3,5) 4(1) 15(5-43) 82(61-108) 103(67-123) 56(16) 14(4) 35(10) 3 (1) 0 5(0-20) 44,5(21-53) 48,5(23-73) 19(5,5) 21(6) 29(8,5) 2(0,5) 0 6(0-18) 28(20-76) 46(20-82) 4(1) 182,9(50,9-500,0)1 128,2(41,3-376,8)1 130,2(54,6-200,0)1 256,9(90,7-500,0)1,2 158,8(55,5-407,3)1,2 191,7(100,0-200,0)1,2 46,0(18,5-113,9) 39,2(9,5-120,8)1 10,1(2,3-64,2)1 18,0(8,4-22,6) 9,5(0,1-9,5) 0,9(0,1-3,9) 80(76) 64(61) 16(15) 8(8) 254(73) 219(63) 35(10) 43(12) 270(77,5) 249(71,5) 21(6) 27(7,5) 12(26) 27(59) 68(65) 57(54) 11(10) 3(3) 221(63) 194(56) 27(7) 24(7) 238(68) 231(66) 7(2) 7(2) 11(24) 20(44) 12(11) 7(7) 5(5) 5(5) 33(9,5) 25(7) 8(2) 19(5,5) 32(9,5) 18(5,5) 14(4) 20(5,5) 1(2) 7(15) 7(7) 2(2) 6(6) 10(9) 13(4) 11(3) 2(1) 39(11) 6(2) 3(1) 3(1) 46(13) 1(2) 6(13) -p<0,05 по сравнению с группой негативных значений определения АМЦВ, 2-p<0,05 по сравнению с группой низкопозитивных значений определения АМЦВ, n(%) – указаны от общего количества пациентов. 104 Таблица 35 Связь уровня АМЦВ с рентгенологическими показателями суставной деструкции (n=50) Уровни позитивности Все позитивные Негативные Низкий Высокий Кол-во эрозий 6(0-18) 5(0-20) 14,5(5-40) 13(3-33) Кол-во сужений 28(20-76) 44(21-53) 80(61,5-107)* 76(53-105) Общий счет 46(20-82) 48(23-73) 100,5(67-122,5)* 96,5(61-122) Sharp-van der Heijde *-p<0,01 по сравнению с группой низкопозитивных значений АМЦВ Таблица 36 Связь уровня АМЦВ с показателями активности заболевания и наличием системных проявлений РА СОЭ СРБ ЧПС ЧБС DAS28 ранний РА (n=62) 0,3 0,3* 0,4 0,5 0,2 развернутый РА (n=349) 0,1* 0,2* 0,1 0,1 0,2* ЧПС-число припухших суставов, ЧБС-число болезненных суставов, СП-системные проявления; *-p<0,05 СП 0,1 0,2* Таблица 37 Диагностические характеристики АМЦВ при РА ранний РА (n=62) развернутый РА (n=349) ДЧ % 69 85 ДС % 81 81 ОППР 3,6 4,5 ОПОР 0,4 0,2 ППК (верхняя граница нормы: 20 ЕД/мл) 0,8 0,8 105 Рисунок 15 ROC-кривая АМЦВ для диагностики раннего РА(А) и РА (Б) А Б Таким образом, сывороточная концентрация АМЦВ при развернутом РА в 4 раза превышала таковую при раннем РА (p=0,002), при этом, при развернутом показателя. РА У преобладали высокопозитивные высокопозитивных низкопозитивными пациентами по при АМЦВ раннем РА значения по данного сравнению больных с выявлена повышенная концентрация АЦЦП, а при развернутом РА большее количество суставных сужений и более высокие значениями счета Sharp-van der Heijde. Независимо от длительности заболевания позитивность по АМЦВ ассоциировалась с высокой активностью заболевания по DAS28, серопозитивностью по IgM РФ и АЦЦП, уровень АМЦВ коррелировал с концентрацией СРБ. При раннем и развернутом РА обнаружена взаимосвязь между наличием АМЦВ, системных проявлений и выраженностью рентгенологических признаков суставной деструкции. При раннем РА совместно с АМЦВ - с наибольшей частотой обнаруживался IgM РФ, а при РА АЦЦП. У больных серонегативных по АМЦВ как при раннем РА так и при развернутом РА, наиболее часто выявлялся IgM РФ (42% и 25%). Наилучшиее сочетание показателей клинической информативности АМЦВ продемонстрировали при развернутом РА. 106 3.1.2.3. Антитела к кератину Обследовано 32 пациента с ранним РА (25 женщин и 7 мужчин; возраст: 41; 40-54 лет) и 46 с развернутым РА (43 женщины и 3 мужчин; возраст: 47; 42-58 лет). Группу сравнения (n=80) составили: 10 пациентов - с СКВ, 11 - с АС, 12 - с ОА, 9 - с OVERLAP синдромом, 10 - с ПCА, и 28 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными. Частота определения АКА у больных ранним РА (37,5%) была достоверно выше, чем в группе сравнения (25%, p=0,02) и не зависела от пола и возраста пациентов (табл. 38). Таблица 38 Частота выявления АКА при РА и в группе сравнения Группа обследованных n АКА, n(%) Ранний РА 32 12(37,5)*•† Развернутый РА 46 13(28) Другие РЗ 52 21(26) СКВ 10 1(10) АС 11 3(27) ОА 12 4(33) OVERLAP 9 3(33) ПСА 10 3(30) Здоровые доноры 28 7(25) Группа сравнения 80 22(27,5) * - р<0,05 относительно здоровых доноров, •-отностительно других РЗ, †- р<0,05 относительно группы сравнения в целом Больные ранним РА серопозитивные по АКА, отличалась от серонегативных больных более высоким уровнем АЦЦП [100,0(22,8-100,0 vs 8,3(0,4-100,0), p=0,04]. При раннем РА IgM РФ, АЦЦП и АМЦВ обнаруживались совместно с АКА - с частотой: 28,5%, 31% и 28,5%. У больных серонегативных по АКА: IgM РФ, АЦЦП и АМЦВ присутствовали в 43%, 38% и 28,5% (табл. 39). Частота определения АКА у больных развернутым РА (28%) не отличалась от группы сравнения (27,5%, p=0,45) и не зависела от пола и возраста больных. Группа лиц серопозитивных по АКА отличалась от серонегативных больных более высокой концетрацией АМЦВ в сыворотке крови [1000,0(356,6-1000,0) vs 236,7(48,6-658,3), p=0,003] и низкой частотой 107 выявления пациентов с высокой активностью заболевания (24% vs 68%, p=0,005), II рентгенологической стадией (9% vs 37%, p=0,001) и II функциональным классом РА (9% vs 35%, p=0,001). При РА IgM РФ, АЦЦП и АМЦВ обнаруживались совместно с АКА - с частотой: 24%. У больных серонегативных по АКА: IgM РФ, АЦЦП и АМЦВ присутствовали в 52%, 57% и 52% случаев, при этом АЦЦП обнаруживались в 2 раза чаще (p=0,02) чем у серопозитивных по АКА пациентов (табл. 40). Согласно полученным данным (ОППР≤2; ОПОР˃0,5; интервал ППК 0,5-0,6, при раннем РА и ОППР≤2; ОПОР≤0,5; интервал ППК 0,5-0,6 при РА), определение АКА попадает в категорию тестов “не имеющих пользы”, обладающих “неудовлетворительной” эффективностью для диагностики РА независимо от его клинической стадии (табл. 41, рис. 16). 108 Характеристика больных ранним РА (n=32) в зависимости от позитивности по АКА Показатель n(%) Возраст (годы) Пол (ж/м) Длительность (мес.) ЧПС ЧБС Активность заболевания DAS 28,баллы Ремисcия (DAS28<2,6) Низкая (2,6<DAS28<3,2) Средняя (DAS28=3,2-5,1) Высокая (DAS28>5,1) СОЭ, мм/ч СРБ, мг/л Рентг.стадия РА (Стейнброкер, модиф.) n(%) I II Функциональный класс n(%) I II Позитивные 12(37,5) 49(40-61) 7/5 5,5(3,5-6) 8(3-14) 10(10-10) Негативные 20(62,5) 53(45-67) 18/2 4,5(3-6) 6,5(5-8) 9,5(8-11) 5,1(3,7-6,2) 1(3) 2(6) 4(12,5) 5(15,5) 61(10-70) 9,2(3,9-44,7) 5,4(4,1-5,6) 0 3(9) 6(19) 11(35) 40(33-60) 17(8,6-28,4) 7(22) 5(16) 6(19) 14(43) 11(35) 1(3) 17(53) 3(9) Таблица 39 109 Показатель Концентрации аутоантител IgA РФ (Ед/мл), n=21 IgM РФ (МЕ/мл) АЦЦП (Ед/мл) АМЦВ (Ед/мл) Степени позитивности аутоантител, n(%) IgA РФ+ (n=14) IgA РФ высокопозитивные (n=6) IgA РФ низкопозитивные (n=8) IgA РФ- (n=7) IgM РФ+ IgM РФ высокопозитивные IgM РФ низкопозитивные IgM РФАЦЦП+ АЦЦП высокопозитивные АЦЦП низкопозитивные АЦЦПАМЦВ+ АМЦВ высокопозитивные АМЦВ низкопозитивные АМЦВ1 Позитивные Продолжение таблицы 39 Негативные 24,9(19,3-55,8) 109,0(31,3-348,4) 100,0(22,8-100,0)1 299,6(45,2-825,5) 46,2(19,4-200,1) 48,7(13,1-165,1) 8,3(0,4-100,0) 39,7(1,2-32,8) 6(29) 2(10) 4(19) 4(19) 9(28,5) 6(19) 3(9,5) 3(9,5) 9(28,5) 8(25) 1(3,5) 3(9,5) 10(31) 8(25) 2(6) 2(6) 8(38) 4(19) 4(19) 3(14) 14(43) 10(31) 4(12) 6(19) 9(28,5) 7(22) 2(6) 11(34) 12(38) 9(28,5) 3(9,5) 8(25) -p<0,05 по сравнению с группой негативных значений определения АКА 110 Таблица 40 Характеристика больных развернутым РА (n=46) в зависимости от позитивности по АКА Показатель n(%) Возраст (годы) Пол (ж/м) Длительность (мес.) ЧПС ЧБС СОЭ, мм/ч СРБ, мг/л Активность заболевания DAS 28,баллы Ремисcия (DAS28<2,6) Низкая (2,6<DAS28<3,2) Средняя (DAS28=3,2-5,1) Высокая (DAS28>5,1) Рентг. стадия РА (Стейнброкер, модиф.) n(%) I II III IV Функциональный класс n(%) I II III IV Позитивные 13(28) 47(42-58) 12/1 96(38-132) 9(4-12) 9(5-16) 57(37-74) 38,6(16,9-82,3) Негативные 33(72) 45(33-57) 31/2 60(36-120) 8(5-14) 14(7-22) 58(32-70) 22,7(13,8-41,8) 6,2(5,4-6,7) 0 0 2(4) 11(24) 6,1(5,6-6,9) 0 0 2(4) 31(68) 1(2) 4(9 2(4) 6(13) 0 17(37) 11(24) 5(11) 1(2) 4(9) 3(6,5) 5(11) 1 (2) 16(35) 9(19,5) 7(15) 111 Показатель Кол-во эрозий Кол-во сужений Счет Sharp-van der Heijde Системные проявления (есть) Концентрации аутоантител IgA РФ (Ед/мл) IgM РФ (МЕ/мл) АЦЦП (Ед/мл) АМЦВ (Ед/мл) Степени позитивности аутоантител, n(%) IgA РФ+ IgA РФ высокопозитивные IgA РФ низкопозитивные IgA РФРФ+ РФ высокопозитивные РФ низкопозитивные РФАЦЦП+ АЦЦП высокопозитивные АЦЦП низкопозитивные АЦЦПАМЦВ+ АМЦВ высокопозитивные АМЦВ низкопозитивные АМЦВ1 Позитивные 19(8-43) 76(71-110) 104(95-118) 13(28) Продолжение таблицы 39 Негативные 8(3-16) 82(52-102) 98(58-113) 21(45,5) 233,2(95,9-308,3) 185,5(72,8-642,5) 100,0(100,0-100,0) 1000,0(356,6-1000,0)1 64,9(18,5-276,7) 103,5(9,5-344,0) 70,9(7,1-100,0) 236,7(48,6-658,3) 12(26) 10(21,5) 2(4,5) 1(2) 11(24) 10(22) 1(2) 2(4,5) 11(24) 11(24) 0 2(4) 11(24) 9(19,5) 2(4) 2(4) 24(52,5) 18(39) 6(13) 9(19,5) 24(52) 23(50) 1(2) 9(19,5) 26(57) 22(48) 4(9) 7(15) 24(52) 16(35) 8(17) 9(19,5) -p<0,05 по сравнению с группой негативных значений определения АКА, n(%) – указаны от общего количества пациентов. 112 Таблица 41 ДЧ % ДС % ОППР ОПОР ППК Диагностические характеристики АКА при РА ранний РА (n=32) развернутый РА (n=46) 37,5 28 72,5 72,5 1,4 1 0,8 0,04 0,5 0,5 Рисунок 16 ROC-кривые для АКА при диагностики раннего РА (А) и развернутого РА(Б) А Б Таким образом, частота определения АКА у больных ранним РА не отличалась от таковой при развернутом РА (37,5% vs 28%, p=0,2). При раннем РА серопозитивность по АКА ассоциировалась с высоким уровнем АЦЦП, а при развернутом РА с повышенной концентрацией АМЦВ. Независимо от продолжительности у серопозитивных по АКА пациентов, IgM РФ, АЦЦП и АМЦВ обнаруживались с частотой ≈27%. У больных серонегативных по АКА: частота обнаружения IgM РФ, АЦЦП и АМЦВ достоверно не отличалась как при раннем РА, так и при развернутом РА и составляла ≈36,5% и ≈54%. При этом при развернутом РА у серонегативных по АКА пациентов АМЦВ обнаруживался в 2 раза чаще чем при раннем (p=0,02). Диагностическое значение определения АКА при РА является крайне низкой независимо от клинической стадии заболевания. 113 3.1.3. Многопараметрический анализ аутоантител при ревматоидном артрите С целью выбора оптимальной панели аутоантител для диагностики раннего РА и РА был проведен пошаговый линейный регрессионный анализ. В качестве возможных предикторов тестировали: IgM РФ, IgA РФ, АЦЦП, АМЦВ, АКА (табл. 42). На основании полученных данных вероятность наличия раннего РА расчитывается по формуле: 2,209-0,001[IgM РФ]0,002[IgА РФ]-0,001[АМЦВ]+0,001[АЦЦП]; развернутого РА: 2,0930,001[IgM РФ]-0,002[IgА РФ]+0,001[АМЦВ]+0,001[АЦЦП]. Таблица 42 Коэффициенты прогностической модели для диагностики РА. Нестандартизованные Стандартизованные коэффициенты коэффициенты Стандартная B ошибка β ранний РА РА ранний РА РА ранний РА РА Константа α 2,209 2,093 0,060 0,000 IgM РФ 0,000 0,000 0,000 0,001 -0,244 -0,292 IgА РФ -0,002 -0,002 0,001 0,000 -0,210 -0,312 АМЦВ -0,001 0,000 0,000 0,000 -0,257 -0,136 АЦЦП 0,000 0,000 0,000 0,000 -0,097 -0,102 В качестве верхних границ норм, для раннего РА выбрано значение прогноза 1,698, для РА 1,436 при которых данные модели обладают наилучшей диагностической точностью: ДЧ 90%, ДС 80%, ОППР 4,5, ОПОР 0,1, ППК 0,91 и ДЧ 92%, ДС 78%, ОППР 4,1, ОПОР 0,1, ППК 0,95 соответственно. Таким образом, повышение уровня аутоантител в сыворотках больных РА, ассоциируется с клинико-лабораторными показателями активности, системными проявлениями заболевания. Увеличение прогрессирование и рентгенологическим концентраций эрозивного АЦЦП поражения и прогрессированием АМЦВ суставов отражает при РА. Диагностическими маркерами РА служат IgM/IgA РФ, АЦЦП и АМЦВ. АМЦВ обладает наилучшей ДЧ (85%), а АЦЦП – ДС (87%) и ОППР (5,8). 114 При раннем РА IgA РФ, АЦЦП и АМЦВ демонстрируют меньшую ДЧ по сравнению с более поздними стадиями заболевания. Одновременная оценка концентраций IgM/IgA РФ, АЦЦП и АМЦВ повышает ДЧ исследования до 90-92%. 3.2. Клиническое значение белков острой фазы воспаления при ревматоидном артрите 3.2.1. С-реактивный белок Обследовано 993 пациента с РА из них 102 с ранним и 891 с развернутым РА. Группу сравнения составили (n=518): 33 - с остеоартритом (ОА), 20 - с OVERLAP синдромом, 168 - с недифференцированным артритом (НА) и 297 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными (табл. 43). Таблица 43 Концентрация СРБ (Мг/л) при РА и в группе сравнения n СРБ, Ме (25-75%) Ранний РА*•† 102 9,5(3-33) Развернутый РА *•† 891 10 (3-29) Другие РЗ 221 3 (1,0-10) НА 168 3 (1-15) ОА 33 2 (1-7) OVERLAP 20 5 (2-7) Здоровые доноры 297 1 (0,1-2) Группа сравнения 518 1 (0,5-5) * - р<0,05 относительно здоровых доноров, •- отностительно других РЗ, †р<0,05, относительно группы сравнения вцелом. Сывороточный уровень СРБ у больных ранним РА и развернутым РА был достоверно выше данного показателя в группе сравнения (табл. 44). Концентрация СРБ при раннем РА и развернутом РА не зависела от пола и возраста больных. Отмечена достоверная (p<0,05) корреляция данного показателя при раннем РА с СОЭ (r=0,7), при развернутом РА с СОЭ (r=0,6) , 115 ЧПС (r=0,2), DAS28 (0,3), наличием системных проявлений (r=0,2). (табл. 45) Связи уровня СРБ с деструктивным поражением суставов не обнаружено. Таблица 44 Клинико-лабораторная характеристика больных РА Ранний РА (n=102) 102 79/23 51(41-62) 4(2,5-6) 10(8-18) 15(10-28,5) 5,1(4,1-5,9) 31(22-41) 39 (5-137) 27 (19-80) 36(0,5-100) 68,5(1-692) n Муж/жен Возраст (лет) Длительность (мес.) ЧПС ЧБС DAS 28 (баллы) СОЭ (мм/ч) IgM РФ (МЕ/мл) IgA РФ (Ед/мл) АЦЦП (Ед/мл) АМЦВ (Ед/мл) Развернутый РА (n=891) 891 733/158 51(43-56) 96(36-192) 7,5(3-14) 14(7-23) 5,2(3,8-6) 30(16-45) 49 (9,5-200) 142 (25-388) 100(4-100) 273(40,7-973) Таблица 45 Связь уровня СРБ с показателями активности заболевания и наличием системных проявлений РА СОЭ ЧПС ЧБС DAS28 СП Ранний РА (n=102) 0,7* 0,1 Развернутый РА (n=891) 0,6* 0,2* 0,1 0,3* 0,2* ЧПС-число припухших суставов, ЧБС-число болезненных суставов, СПсистемные проявления; *-p<0,05 3.2.2. Кальпротектин Обследовано 78 пациентов с РА из них 32 с ранним РА и 46 с развернутым РА. Группу сравнения составили (n=84): 10 пациентов системной красной волчанкой (СКВ), 11 - с с анкилозирующим спондилоартритом (АС), 12 - с остеоартритом (ОА), 8 - с OVERLAP синдромом, 10 - с псориатическим артритом (ПCА) и 33 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными (табл. 46). 116 Концентрация кальпротектина при раннем РА и развернутом РА не зависела от пола и возраста больных и была достоверно выше, чем в группе сравнения (табл. 47). Таблица 46 Клинико-лабораторная характеристика больных РА при исследовании уровней кальпротектина, sRANCL и COMP. n Муж/жен Возраст (лет) Длительность (мес.) ЧПС ЧБС DAS 28 (баллы) СОЭ (мм/ч) СРБ (мг/л) IgM РФ (МЕ/мл) АЦЦП (Ед/мл) Ранний РА 32 24/8 54(41-66) 4,5(3,0-6,0) 6,5(5,0-8,0) 9,5(8,0-11,0) 5,4(4,1-5,8) 50,0(33,0-61,0) 14,5(7,5-34,2) 59,0(15,9-239,2) 50,3(0,7-100,0) РА 46 43/3 47(33-58) 60,0(30,0-132,0) 8,0(4,0-13,0) 13,0(7,0-20,0) 6,1(5,5-6,8) 56,0(32,0-70,0) 27,2(10,5-49,7) 153,4(26,5-454,3) 100,0(10,4-100,0) Отмечена корреляция данного показателя с СРБ (r=0,5; p<0,05) и DAS28 (r=0,4; p<0,05) при раннем РА, с СРБ (r=0,6; p<0,05) в развернутой стадии заболевания. Связи уровня кальпротектина с деструктивным поражением суставов не обнаружено. Таблица 47 Концентрация кальпротектина (мкг/мл) при РА и в группе сравнения n Кальпротектин, Ме (25-75%) Ранний РА*•† 32 24 (11-43) Развернутый РА *•† 46 29 (20-43) Другие РЗ 51 14 (5,0-29) СКВ 10 20 (8-38) АС 11 27(4-36) ОА 12 6(3-15) OVERLAP 8 22 (8-36) ПСА 10 14 (10,5-31,5) Здоровые доноры 33 7 (4-10) Группа сравнения 84 9 (4,5-22) * - р<0,05 относительно здоровых доноров, •- отностительно других РЗ, †- р<0,05,относительно группы сравнения в целом. 117 Таким образом, увеличение сывороточных концентраций белков острой фазы воспаления отражает активность РА. На ранней стадии заболевания уровень кальпротектина коррелирует с DAS28, а при РА длительностью более 6 месяцев с концентрацией СРБ. 3.3. Характеристика маркеров костного и хрящевого метаболизма при ревматоидном артрите 3.3.1. Лиганд рецептора активатора транскрипционного фактора κB Обследовано 78 пациентов с РА, из них 32 с ранним РА и 46 с развернутым РА. Группу сравнения составили (n=84): 10 пациентов с СКВ, 11 - с анкилозирующим спондилоартритом (АС), 12 - с остеоартритом (ОА), 8 - с OVERLAP синдромом, 10 - с псориатическим артритом (ПCА) и 33 здоровых донора, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными (табл. 46). Результаты определения концентрации растворимого (s) RANKL в сыворотках крови больных и лиц, составивших группу сравнения, представлены в табл. 48. Сывороточный уровень sRANKL у больных РА достоверно не отличался от такового в группе сравнения. Таблица 48 Концентрация sRANKL (пмоль/л) при РА и в группе сравнения n sRANKL, Ме (25-75%) Ранний РА 32 0,1 (0,1-1,3) Развернутый РА 46 0,1 (0,1-0,9) Другие РЗ 51 0,1 (0,1-0,1) СКВ 10 0,1 (0,1-0,2) АС 11 0,1 (0,1-0,8) ОА 12 0,1 (0,1-0,2) OVERLAP 8 0,1 (0,1-0,8) ПСА 10 0,1 (0,1-0,1) Здоровые доноры 33 0,1 (0,1-0,3) Группа сравнения 84 0,1 (0,1-0,6) 118 Концентрация sRANKL при раннем РА и развернутом РА не зависела от пола и возраста больных. Отмечена корреляция данного показателя с СРБ (r=0,5; p<0,05) и DAS28 (r=0,4; p<0,05) при раннем РА. Уровень sRANKL при 4-ой рентгенологической стадии РА достоверно превышал таковой при 3-ей стадии (p=0,03) (табл. 49). Таблица 49 Уровни sRANKL (пмоль/л) в зависимости от ренгенологической стадии РА (n=46) Рентгенологическая стадия 1 2 3 sRANKL, Ме(25-75%) 0,1 (0,1-0,1) 0,1 (0,1-6,2) 0,1 (0,1-0,1) *-p=0,03 по сравнению с 3 рентгенологической стадией 4 0,1 (0,1-0,8)* 3.3.2. Олигомерный матриксный белок хряща Обследовано 78 пациентов с РА из них 32 с ранним РА и 46 с развернутым РА. Группу сравнения составили (n=84): 10 пациентов с СКВ, 11 - с анкилозирующим спондилоартритом (АС), 12 - с остеоартритом (ОА), 8 - с OVERLAP синдромом, 10 - с псориатическим артритом (ПCА) и 33 здоровых донора, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными (табл. 50). Сывороточный уровень COMP у больных РА достоверно не отличался от такового в группе сравнения. Концентрация COMP при раннем РА и развернутом РА не зависела от пола и возраста больных. При раннем РА уровень данного биомаркера в 1, 4 раза превышал таковой при РА (p=0,005). Уровень COMP при 4-ой рентгенологической стадии РА достоверно превышал таковой при 2-ой (p=0,03) (табл. 51). 119 Таблица 50 Концентрация COMP (нг/мл) при РА и в группе сравнения n COMP, Ме (25-75%) Ранний РА‡ 32 650 (450-2100) Развернутый РА • 46 450 (400-1050) Другие РЗ 51 620(490-950) СКВ 10 500 (425-2900) АС 11 600 (500-1150) ОА 12 675 (550-1350) OVERLAP 8 1100 (850-4100) ПСА 10 650 (450-1400) Здоровые доноры 33 550 (450-1400) Группа сравнения 84 600 (450-1400) •- р<0,05 -отностительно других РЗ, †- р<0,05 относительно группы сравнения, ‡- р<0,05 между ранней и развернутой стадиями РА Таблица 51 Уровни COMP (нг/мл) в зависимости от ренгенологической стадии РА (т=46) Рентгенологическая стадия 1 2 3 4 COMP, Ме (25-75%) 550 (550-550) 450 (350-475) 550 (350-650) 550 (500-800)* * -p=0,03 по сравнению с 2 й рентгенологической стадией 3.3.3. Матриксная металлопротеиназа-3 Обследовано 114 пациентов с развернутым РА (93 женщины и 21 мужчина; возраст: 53,0 (42,0-60,0) лет и 24 здоровых донора, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными (табл. 52) Сывороточный уровень ММП-3 у больных развернутым РА достоверно превышал таковой в группе сравнения [35,0(12,5-66,5) vs 7,75(5,52-11,8), p=0,001]. Отмечена положительная корреляция уровня ММП-3 с СОЭ (r=0,4, p=0,01) и концентрацией СРБ (r=0,4, p=0,001) в сыворотке крови. 120 Таблица 52 Клинико-лабораторная характеристика больных развернутым РА при исследовании уровня ММП-3 (нг/мл). n Муж/жен Возраст (лет) Длительность (мес.) ЧПС ЧБС DAS 28 (баллы) СОЭ (мм/ч) СРБ (мг/л) IgM РФ (МЕ/мл) АЦЦП (Ед/мл) Развернутый РА 114 21/93 53,0 (42,0-60,0) 60,0 (28,0-108,0) 23,0(15,0-29,0) 19,0(11,0-23,0) 5,9 (5,2-6,7) 38,0 (29,0-60,0) 22,4 (12,7-47,2) 261,0(82,1-663,0) 354,8(67,9-500,0) Таким образом, при развернутом РА отмечено повышение сывороточной концентрации MMП-3. На ранней стадии заболевания отмечен более высокий уровень COMP по сравнению с развернутой, а также корреляция сывороточной концентрации sRANKL с показателями воспалительной (СРБ) и клинической (DAS28) активности заболевания. При РА выявлена корреляция уровней ММП-3 и СРБ. Также обнаружена взаимосвязь уровней sRANKL и COMP с рентгенологической прогрессией заболевания. 3.4. Мультиплексный анализ цитокинов при ревматоидном артрите 3.4.1. Оценка влияния IgM РФ на результаты измерения концентраций цитокинов Для оценки влияния неспецифического связывания содержащегося в сыворотках РФ на точность определения концентраций исследуемых цитокинов, были отобраны 20 пациентов с высоким уровнем IgM РФ (339,0;162,5-565,0, Ме/мл). С концентрацией IgM РФ до его удаления из исследуемых образцов коррелировало содержание только IL-9, после удаления – IL-2,-9,-15 и эотаксина. Удаление из исследуемых сывороток IgM 121 РФ привело к достоверному снижению уровней цитокинов, исключая GMCSF. В группах сывороток с неудаленным и удаленным IgM РФ коррелировали уровни следующих цитокинов: IL-2,-4,-6, эотаксина, IP-10, МСP-1, PDGF-ВВ, TNF-α, VEGF (r=0,5-0,7; p<0,05) (табл. 53). В синовиальной жидкости у пациентов (n=14) с высоким уровнем IgM РФ (197,85;120,8-324,7 Ме/мл) корреляций концентраций исследуемых цитокинов с данным показателем не обнаружено. Таким образом, удаление IgM РФ пациентов с РА перед проведением мультиплексного анализа по технологии X-map нецелесообразно. 3.4.2. Клиническое значение оценки цитокинового профиля при ревматоидном артрите Обследовано 118 пациентов с РА, из них 37 с ранним РА и 81 с развернутым РА (табл. 55). Группу сравнения (n=33) составили здоровые доноры, сопоставимые по полу и возрасту с обследованными больными. Концентрация исследуемых цитокинов при раннем РА и развернутом РА не зависела от пола и возраста больных. Результаты определения концентрации исследуемых цитокинов в сыворотках крови пациентов с РА и лиц составивших группу сравнения, представлены в табл. 56 и рис. 17. При раннем РА наблюдается повышение уровней провоспалительных (IL-1b,-6,15, TNF-α, MIP-1α), антивосполительных (IL-1ra,-10-13), Th1 (IL-2,-12, IFNγ), Th2 (IL-4,-5,-9, колониестимулирующих эотаксин), факторов (IL-7, Th17 (IL-17) GM-CSF), цитокинов, стромальных и ангиогенных факторов (FGF-2, VEGF), хемокинов (IP-10); при развернутом РА: провосполительных (IL-1b,-6,-12,-13-15, TNF-α), антивоспалительных (IL-1ra,-13), Th1 (IL-2,-12), Th2 (IL-9), колонистимулирующих факторов (GCSF, GM-CSF). 122 Таблица 53 Влияние IgM РФ на точность определения концентрация цитокинов методом “xMAP” IgM РФ присутствует IgM РФ удален Цитокины пг/мл Корреляция с уровнем IgM РФ пг/мл Корреляция с Корреляция с уровнем цитокинов уровнем в группе “IgM РФ IgM РФ присутствует” IL-1β 4,68 (2,75-29,21) 0,0 2,13(1,66-2,62)† -0,1 0,0 IL-1ra 113,80(89,22-135,12) 0,2 26,29(13,14-35,95) † 0,1 0,1 IL-2 48,14(17,05-77,13) 0,3 8,85(6,03-11,73) † 0,6* 0,5* IL-4 23,08(20,98-25,20) 0,0 1,05(1,05-1,48) † 0,1 0,5* IL-5 3,74(2,96-9,25) 0,1 1,74(1,56-2,09) † 0,3 0,1 IL-6 96,05(41,73-221,61) 0,2 17,27(11,33-29,82) † 0,4 0,7* IL-7 18,96(13,03-30,98) 0,1 6,39(5,04-7,14) † 0,1 0,2 IL-8 20,49(18,87-31,61) 0,0 4,20(3,77-5,34) † 0,1 0,3 IL-9 170,01(78,53-424,37) 0,7* 6,03(2,74-13,87)† 0,6* 0,3 IL-10 8,32(6,44-22,19) 0,1 5,25(4,89-5,79) † 0,2 0,2 IL-12 53,27(37,37-112,26) 0,0 15,96(11,46-18,38) † 0,0 0,2 IL-13 20,08(15,42-37,58) 0,0 8,89(5,82-14,56) † 0,3 0,0 IL-15 18,78(12,48-42,17) 0,1 7,71(2,01-10,40) † 0,5* 0,3 123 Продолжение таблицы 53 IgM РФ присутствует Цитокины IgM РФ удален пг/мл Корреляция с уровнем IgM РФ пг/мл 89,55(77,40-101,84) 0,2 19,97(14,72-38,25) † 0,0 0,0 369,50(233,44-508,92) 0,1 32,91(8,92-57,33) † 0,5* 0,5* FGF-2 59,08(47,38-91,44) 0,0 21,77(19,09-27,64) † 0,2 0,1 G-CSF 34,60(29,27-43,74) 0,1 15,52(11,11-16,51) † 0,4 0,5 153,30(94,58-616,68) 0,1 141,49(85,16-201,67) 0,0 0,2 IFN-γ 482,64(275,10-2380,65) 0,1 55,53(30,56-81,11) † 0,3 0,1 IP-10 1638,50(1334,05-2064,36) 0,4 64,90(54,71-96,70) 0,2 0,7* MCP-1 136,44(86,08-189,14) 0,0 11,14(5,34-21,59) † 0,0 0,7* MIP-1α 9,71(8,74-13,62) 0,1 6,48(6,19-6,57) † 0,3 0,6 MIP-1β 109,91(89,99-194,13) 0,1 16,74(13,52-20,63) † 0,1 0,4 PDGF-ВВ 8302,89(6689,74-9916,93) 0,1 157,53(63,58-256,81) † 0,1 0,6* RANTES 11951,66(8086,85-17976,52) 0,1 421,51(201,17-1018,97) † 0,3 0,1 173,10(50,34-511,90) 0,2 17,02(13,86-22,16) † 0,2 0,5* 0,0 0,5* IL-17 Эотаксин GM-CSF TNF-α VEGF 355,80(254,38-620,27) 0,4 163,90(111,01-211,76) † *-p<0.05; † -p<0,001 по сравнению с группой “IgM РФ+” Корреляция с Корреляция с уровнем цитокинов уровнем в группе “IgM РФ IgM РФ присутствует” 124 Таблица 55 Клинико-лабораторная характеристика больных РА при исследовании уровней цитокинов. Ранний РА РА 37 81 28/9 71/10 51(41-62) 46(35-58) 4(2,4-6) 9(36-192) ЧПС 6,5(5,0-8,0) 7,0(4,0-13,0) ЧБС 9,4(8,0-11,0) 12,0(6,0-20,0) DAS 28 (баллы) 5,0 (3,9-6,0) 4,6 (3,4-5,2) СОЭ (мм/ч) 61,0(33,0-70,0) 36,0(24,0-45,0) СРБ (мг/л) 14,0(6,5-28,7) 20,9(7,6-39,4) IgM РФ (МЕ/мл) 69,5(15,0-187,7) 42,7(0,1-259,1) АЦЦП (Ед/мл) 64,1(0,9-100,0) 18,8(0,6-100,0) n Жен/муж Возраст (лет) Длительность (мес.) При раннем РА обнаружен достоверно более высокий уровень Th1 (IFN-γ), Th17 цитокинов (IL-17), колониестимулирующих факторов (IL-7, GCSF) и хемокинов (IL-8, IP-10, MIP-1α) по сравнению с развернутой стадией заболевания (табл. 56). 125 Концентрация цитокинов (пг/мл) в сыворотках больных РА и здоровых доноров Цитокины ранний РA(n=37) Развернутый РА(n=81) Таблица 56 Доноры(n=33) Ме (25-75 перцентиль) Провоспалительные IL-1β 4,8(3,7-13,4)* 5,59(3,840-9,65)* 4,07(2,61-5,0) IL-6 47,0(28,1-240,1)* 62,44(21,68-186,49)* 7,78(4,5-13,1) IL-15 20,0(5,1-63,1)* 27,9(10,52-73,36)* 6,7 (3,92-17,4) TNF-α 82,0(50,4-162,4)* 67,68(36,26-135,49)* 39,0(17,2-65,0) MIP-1α 21,8(14,0-32,7)* ‡ 11,67(8,94-20,36) 10,82(8,84-18,1) IL-1ra 430,2(130,1-942,0)* 283,03(163,14-1907,19)* 150,64(111,19-253,8) IL-10 43,6(26,6-131,0)* 34,15(7,54-106,25) 13,22(5,83-34,5) IL-13 24,8(17,3-71,0)* 28,52(8,85-76,08)* 16,69(9,9-22,4) 2434,0(479,4-3376,0)* ‡ 235,45(137,69-1463,41) 285,35(112,2-1038,0) IL-2 50,0(12,0-296,6)* 24,96 (9,71-115,22)* 10,77(5,53-13,8) IL-12 16,0(7,3-97,3)* 10,88 (5,29-143,82)* 5,78(2,24-9,9) IL-4 6,0(2,5-12,9)* 4,05(0,43-7,93) 3,31(0,21-6,0) IL-5 5,1(3,9-10,2)* 4,49(0,37-16,38) 2,92 (0,2-5,2) Антивоспалительные Th1 IFN-γ Th2 126 Продолжение таблицы 56 Цитокины пг/мл ранний РA(n=37) Развернутый РА(n=81) Доноры(n=33) IL-9 116,3(53,0-811,0)* 134,8 (58,66-833,35)* 34,17(26,3-42,3) Эотаксин 397,3(99,0-1544,3)* 154,35(42,30-606,02) 102,41(19,39-585,7) 82,0(45,0-121,0)* ‡ 17,09(7,65-102,35) 22,87(5,23-90,3) 22,6(8,8-65,5)* ‡ 7,97(2,1-38,97) 8,15(0,5-21,5) 164,53(56,89-838,69) ‡ 24,23(9,90-82,20)* 10,86(2,37-56,5) 164,5(57,0-838,9)* 71,06(31,85-405,95)* 39,93(21,6-61,3) 36,2(25,7-69,8)* 37,01(17,14-53,06) 27,25(19,32-44,3) 29912,32(10329,17-4571,33) 11862,42(6020,06-54889,46) 26024,51(5854,75-56472,8) 509,3(153,3-518,4)* 285,17(83,72-656,31) 205,6(64,0-313,0) IL-8 14,92(10,14-17,62) ‡ 7,20(4,07-16,61) 12,47(4,76-9,0) IP-10 9454,0(1609,2-138,0)* ‡ 606,05(257,24-8313,56) 717,8(188,68-17831,0) MCP-1 84,63(21,38-254,75) 91,68(41,65-187,12) 48,59(22,26-6169,5) MIP-1β 81,92(43,98-132,45) 64,78(39,89-112,91) 66,05 (49,36-99,5) 1802,29(1802,29-6169,50) 6169,50(1802,29-6169,50) 1809,29(1802,29-6169,5) Th2 Th17 IL-17 Колониестимулирующие факторы IL-7 G-CSF GM-CSF Стромальные и ангиогенные факторы FGF-2 PDGF-ВВ VEGF Хемокины RANTES * - р<0,05 относительно здоровых доноров, ‡- р<0,05 между ранней и развернутой стадиями РА 127 Рисунок 17 Цитокиновый профиль при раннем РА, n=37 (А); развернутом РА, n=81 (Б); и у здоровых доноров, n= 33 (В) А Б 128 В Обозначения функциональных классов цитокинов: (П)-провоспалительные, (А)-антивоспалительные, (Th1)Th1, (Th2)-Th2, (Th17)-Th17, (T-рег)-Т-регуляторные, (К)-колониестимулирующие, (СА)-стромальные и ангиогенные, (Х)-хемокины. При развернутом РА отмечена корреляция уровней IL-1β,-5,-6,-9, FGF-2, GMCSF, TNF-α и СРБ; IL-1β,-6, G-CSF c DAS28 (табл. 57). При развернутом РА отмечена корреляция уровней IL-1ra,-2,-4,-6,-9,-12,-13,-15, FGF-2, GM-CSF, IFN-γ, MIP-1α c содержанием кальпротектина (табл. 57). Таблица 57 Связь уровня цитокинов (r) с клинико-лабораторными показателями воспалительной активности при развернутом РА (n=81) СОЭ СРБ Кальпротектин DAS28 81 81 36 81 IL-1β 0,17 0,40* 0,07 0,40 IL-6 0,37 0,46* 0,50* 0,44* IL-15 0,10 0,25 0,20* 0,33 TNF-α 0,02 0,44* 0,27 0,09 IL-1ra 0,09 0,26 0,25* 0,17 IL-10 0,11 0,31 0,19 0,12 IL-13 0,25 0,34 0,24* 0,16 0,04 0,20 0,20* 0,01 n Провоспалительные Антивоспалительные Th1 IFN-γ 129 Продолжение таблицы 57 СОЭ СРБ Кальпротектин DAS28 IL-2 0,09 0,21 0,3* 0,08 IL-12 0,05 0,42* 0,25* 0,05 IL-4 0,03 0,22 0,24* 0,03 IL-5 0,07 0,35* -0,03 0,05 IL-9 -0,03 0,63* 0,34* -0,06 Эотаксин 0,13 0,16 0,16 0,03 -0,09 0,14 0,10 -0,23 IL-7 0,01 0,24 0,18 -0,01 G-CSF 0,29 0,26 -0,02 0,47* GM-CSF -0,09 0,35* 0,38* -0,11 FGF-2 0,20 0,37* 0,24* 0,18 PDGF-ВВ 0,12 0,21 0,08 0,10 VEGF 0,18 0,12 0,17 -0,06 IL-8 0,19 0,08 0,19 -0,15 IP-10 -0,09 0,14 0,14 -0,13 MCP-1 0,06 -0,14 0,18 0,08 MIP-1α 0,06 0,23 0,30* -0,14 MIP-1β -0,08 -0,20 0,20 -0,13 RANTES -0,17 0,03 -0,09 -0,11 Th2 Th17 IL-17 Колонистимулирующие факторы Стромальные и ангиогенные факторы Хемокины *-p<0,05 130 Таблица 58 Связь уровней цитокинов (r) с аутоантителами при раннем РА (n=37) Цитокины IgM РФ IgA РФ АЦЦП АМЦВ IL-1β 0,38* 0,54* 0,23 0,34* IL-1ra 0,59* 0,69* 0,16 0,31 IL-2 0,56* 0,68* 0,09 0,38* IL-4 0,47* 0,51* -0,04 0,21 IL-5 0,46* 0,20 0,25 0,17 IL-6 0,48* 0,64* 0,23 0,42* IL-7 0,46* 0,45 0,07 0,19 IL-8 0,18 0,24 -0,06 0,14 IL-9 0,78* 0,88* 0,05 0,22 IL-10 0,52* 0,57* 0,05 0,26 IL-12 0,49* 0,43 0,15 0,35* IL-13 0,39* 0,47* 0,10 0,28 IL-15 0,43* 0,55* 0,29 0,36* IL-17 0,33* 0,30 -0,14 0,04 Эотаксин 0,51* 0,52* 0,15 0,34* FGF-2 0,28 0,36 0,14 0,16 G-CSF 0,31 0,37 0,30 0,45* GM-CSF 0,57* 0,67* 0,16 0,37* IFN-γ 0,53* 0,60* 0,05 0,29 IP-10 0,21 0,25 -0,14 0,01 MCP-1 0,24 0,10 0,09 0,17 MIP-1α 0,41* 0,44 -0,03 0,12 MIP-1β -0,09 -0,16 -0,01 -0,06 PDGF-ВВ -0,13 0,06 -0,21 -0,16 RANTES -0,14 -0,23 0,17 0,08 TNF-α 0,30 0,29 0,18 0,28 VEGF *-p<0,05 0,19 0,22 0,10 0,22 131 При раннем РА обнаружена корреляция IL-1β,-1ra,-2,-4,-5,-6-7,-9,-10,12,-13,15,-17, эотаксина, GM-CSF, IFN-γ, MIP-1α c IgM РФ; IL-1β,-1ra,-2,-4,-6,-9,-10,-13,15, эотаксина, GM-CSF, IFN-γ c IgA РФ; IL-1β,-2,-6,-12,-15, эотаксина, G-CSF, GM-CSF с АМЦВ (табл. 58). При развернутом РА обнаружена корреляция IL-1β,-1ra,-2-5,-6-9,-10,-12,-13,15, G-CSF, GM-CSF, MCP-1, TNF-α c IgM РФ; IL-1β,-1ra,-2,-9,-12,-15, эотаксина, G-CSF, GM-CSF с IgA РФ; IL-1β,-1ra,-9,-15, G-CSF, GM-CSF, TNF-α c АЦЦП; а также IL-1β,-1ra,-2,-9,-15, GM-CSF c АМЦВ (табл. 59). При раннем РА обнаружена обратная корреляция уровней TNF-α и FGF-2 с sRANKL, а также положительная корреляция концентраций с COMP и IP-10. При развернутом РА - положительная коррелция уровней IL-1ra, IL-4, IP-10 с MMП-3 (табл.60). Таким образом, уровни цитокинов в сыворотке крови изменяются в зависимости от длительности РА. Цитокиновый профиль при раннем РА, в отличие от РА длительностью более 6 мес., характеризуется более высокой концентрацией провоспалительных, колониестимулирующих провоспалительных, факторов и антивоспалительных, Th1, Th17 хемокинов. Th1, Th2, При Th17 цитокинов, РА уровни цитокинов, и колониестимулирующих факторов положительно коррелируют с концентрацией РФ и АЦБ в сыворотке крови. При развернутом РА обнаружена прямая взаимосвязь концентрации белков острой фазы воспаления (СРБ, кальпротектин) с провоспалительными, Th1, Th2 цитокинами; активности заболевания – с провоспалительными цитокинами, колонистимулирующими факторами; показателей костного и хрящевого метаболизма - с антивоспалительными, Th2 цитокинами и хемокинами. 132 Таблица 59 Связь уровня цитокинов (r) с аутоантителами при развернутом РА (n=81) IgM РФ IgA РФ АЦЦП АМЦВ IL-1β 0,64* 0,63* 0,44* 0,36* IL-1ra 0,63* 0,70* 0,43* 0,48* IL-2 0,57* 0,67* 0,39* 0,39* IL-4 0,27 0,30 0,13 0,14 IL-5 0,41* 0,32 0,23 0,16 IL-6 0,45* 0,36 0,32 0,17 IL-7 0,26 0,14 0,12 0,11 IL-8 -0,08 -0,08 -0,21 -0,06 IL-9 0,78* 0,67* 0,47* 0,69* IL-10 0,33* 0,25 0,21 0,13 IL-12 0,58* 0,61* 0,31 0,29 IL-13 0,37* 0,26 0,24 0,13 IL-15 0,63* 0,59* 0,42* 0,35* IL-17 -0,05 0,12 -0,11 -0,05 Эотаксин 0,33 0,44* 0,16 0,20 FGF-2 0,13 0,23 -0,01 0,13 G-CSF 0,46* 0,47* 0,40* 0,26 GM-CSF 0,66* 0,59* 0,44* 0,52* IFN-γ 0,23 0,27 0,10 0,08 IP-10 -0,02 -0,04 -0,26 -0,08 MCP-1 0,41* 0,71 0,28 0,34 MIP-1α 0,04 0,22 -0,02 0,13 MIP-1β 0,15 0,31 0,08 0,21 PDGF-ВВ -0,17 0,03 -0,17 -0,14 RANTES -0,05 0,04 -0,17 -0,02 TNF-α 0,56* 0,65 0,22* 0,28 VEGF *-p<0,05 -0,12 -0,17 -0,12 -0,13 133 Таблица 60 Связь уровня цитокинов (r) с маркерами костного и хрящевого метаболизма при РА Ранний РА (n=32) Цитокины Развернутый РА (n=34) sRANKL COMP MMП-3 IL-1β -0,21 0,11 -0,09 IL-1ra -0,14 0,13 0,45* IL-2 -0,12 0,14 -0,08 IL-4 -0,25 0,28 0,39* IL-5 -0,18 0,32 -0,01 IL-6 -0,15 0,11 -0,19 IL-7 -0,16 0,25 0,31 IL-8 -0,32 0,17 -0,17 IL-9 -0,21 0,13 -0,13 IL-10 -0,28 0,05 -0,08 IL-12 -0,26 0,05 -0,00 IL-13 -0,27 0,03 -0,10 IL-15 -0,09 0,15 0,33 IL-17 -0,33 0,35 0,27 Эотаксин -0,14 0,13 -0,09 FGF-2 -0,43* 0,08 0,03 G-CSF -0,02 0,01 0,29 GM-CSF -0,09 0,12 -0,04 IFN-γ 0,02 0,20 0,14 IP-10 -0,26 0,42* 0,35* MCP-1 -0,12 0,03 -0,1 MIP-1α -0,24 0,31 0,1 MIP-1β -0,05 0,19 0,33 PDGF-ВВ 0,00 0,24 0,01 RANTES 0,05 -0,32 0,01 TNF-α -0,47* -0,09 -0,08 VEGF *-p<0,05 -0,18 0,18 -0,05 134 3.5. Сравнение уровней биомаркеров ревматоидного артрита в крови и синовиальной жидкости. Обследовано 61 пациент с РА из них 10 с ранним РА и 53 с РА (табл. 61). Таблица 61 Клинико-лабораторная характеристика больных РА при исследовании уровней цитокинов в синовиальной жидкости. n Муж/жен Возраст (лет) Длительность (мес.) DAS 28 (баллы) СОЭ (мм/ч) СРБ (мг/л) IgM РФ (МЕ/мл) АЦЦП (Ед/мл) Ранний РА 10 8/2 52(42-55) 4,5(1,5-6) 5,9(4,9-6,2) 61,0(33,0-70,0) 33,9(19,3-46,2) 8,4(0,1-28,4) 100,0(0,3-100,0) Развернутый РА 53 38/15 51(43-61) 59(30-92) 4,6(3,6-5,4) 36,0(24,0-50,0) 27,0(9,1-43,4) 18,6(0,1-121,5) 11,0(0,5-100,0) Различий уровней исследованных биомаркеров в синовиальной жидкости в зависимости от стадии РА не обнаружено (табл. 63). В синовиальной жидкости больных с ранним РА по сравнению с сывороткой крови, были повышены уровни: СРБ, провоспалительных IL-6,-15, антивосполительных IL-10,-13 цитокинов, хемокинов- MCP-1, MIP-1α и снижено содержание Th1 и Th2 цитокинов (IFN-γ, IL-9 соответственно) колониестимулирующего фактора IL-7 (табл. 63, рис. 18). При развернутом РА отмечено повышение концентрации СРБ, провоспалительных: IL-1β,-6,-15, антивоспалительных: IL-1ra,-10,-13, Th17 – IL-17 цитокинов, ангиогенного фактора VEGF, хемокинов IL-8, IP-10, MCP-1; одновременно были понижены уровни Th2 цитокина IL-4, стромального фактора PDGF-BB, хемокина RANTES (табл. 62, рис.19). 135 Таблица 62 Концентрация лабораторных биомаркеров в синовиальной жидкости больных РА ранний РА (n=10) РА(n=53) 9,7(0,9-15,8) † 13,1(4,2-23,8) † 5,8(0,1-61,0) 48,6(0,1-146,9) АЦЦП (Ед/мл) 94,8(0,7-100,0) 38,3(1,0-100,0) АМЦВ (Ед/мл) 535,6(0,3-985,5) 35,7(0,1-201,5) IL-1β 2,45(1,47-89,30) 46,80(13,26-78,80)† IL-1ra 2303,51(98,48-28383,24) 3852,60(794,59-7158,46)† IL-2 0,78(0,02-24,36) 29,77(4,18-130,07) IL-4 0,01(0,01-1,16) 1,49(0,49-2,56)† IL-5 1,36(0,63-3,04) 1,41(0,76-9,10) IL-6 1123,80(828,45-2638,60)† 2521,85(1075,96-3144,14)† IL-7 0,01(0,01-0,15)† 0,01(0,01-1,38) IL-8 638,49(245,59-1248,80)† 1248,60(518,84-2117,51)† IL-9 38,80(13,11-260,91) 108,78(21,64-587,78) IL-10 70,08(17,86-83,83)† 84,39(55,26-195,41)† IL-12 21,06(6,90-37,04)† 28,43(13,35-455,69) IL-13 90,14(35,25-136,66)† 94,19(57,27-208,40)† IL-15 37,25(29,84-81,72) 85,34(54,48-142,52)† IL-17 11,62(6,17-73,49) 65,13(18,74-93,60)† Эотаксин 28,79(0,89-94,55) 68,97(32,06-236,23) FGF-2 36,46(19,11-50,00) 40,72(31,05-74,14) G-CSF 54,80(11,60-153,91) 98,83(56,17-136,85) GM-CSF 65,61(41,15-149,19) 92,88(970,79-240,81) IFN-γ 56,61(31,27-316,52) 357,85(184,04-593,54) СРБ (мг/л) IgM РФ (МЕ/мл) Цитокины (пг/мл) IP-10 13781,69(4261,18-3914,49)† 13781,69(4588,78-30706,04) † MCP-1 428,49(164,93-806,21)† 244,48(25,59-544,74)† MIP-1α 10,25(2,72-28,41) 16,41(9,270-22,31) MIP-1β 170,35(104,48-443,88) 187,74(92,86-351,20)† PDGF-ВВ 21,12(0,01-51,42)† 28,08(5,69-49,27)† RANTES 98,29(21,04-275,51)† 165,76(116,85-252,73)† TNF-α 49,25(36,36-147,53) 173,92(76,60-317,53) VEGF 2238,47(572,01-3200,56)† 1377,01(750,01-2084,19)† †-p<0,05 по сравнению с содержанием в сывортке крови 136 Рисунок 18 Различия концентраций цитокинов (пг/мл) в синовиальной жидкости и сыворотке крови при раннем РА (n=10, p<0,05 во всех случаях) Рисунок 19 Различия концентраций цитокинов (пг/мл) в синовиальной жидкости и сыворотке крови при РА (n=53, p<0,05 во всех случаях) 137 Обнаружены корреляции следующих биомаркеров в СК и СЖ - при раннем РА: АМЦВ, IL-6, GM-CSF; при развернутом РА: СРБ, IgM РФ, АЦЦП, АМЦВ, IL-1β, -1ra, -2, -4, -5, -7, -9, -10, -12, -15, эотаксина, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, MCP-1 (табл. 63). Таблица 63 Корреляция уровней биомаркеров в сыворотке крови и синовиальной жидкости Биомаркеры Ранний РА (n=10) Развернутый РА (n=53) СРБ 0,5 0,8* IgM РФ 0,5 0,9* АЦЦП 0,4 0,9* АМЦВ 0,9* 0,7* IL-1β 0,5 0,6* IL-1ra 0,6 0,75* IL-2 0,6 0,8* IL-4 0,4 0,6* IL-5 0,1 0,5* IL-6 0,95* 0,1 IL-7 0,3 0,5* IL-9 0,5 0,6* IL-10 0,5 0,9* IL-12 0,1 0,7* IL-15 0,4 0,7* Эотаксин 0,2 0,75* G-CSF 0,7 0,6* GM-CSF 0,92* 0,7* IFN-γ 0,4 0,5* MCP-1 0,1 0,7* * - р<0,05 При раннем РА установлены корреляции следующих биомаркеров в СЖ с показателями воспалительной активности заболевания: АЦЦП с СОЭ, АЦЦП, IL-1β, -10, -12, -13, G-CSF, IFN-γ, MCP-1, VEGF с СРБ в сыворотке крови; при развернутом РА: IgM РФ с СРБ в сыворотке крови (табл. 64). 138 Таблица 64 Связь уровня биомаркеров (r) в синовиальной жидкости с показателями активности РА Ранний РА (n=10) Развернутый РА (n=53) СОЭ СРБ (в сыв. крови) DAS28 СОЭ СРБ (в сыв. крови) DAS28 IgM РФ 0,3 0,4 0,3 0,1 0,4* -0,02 АЦЦП 0,9* 0,8* 0,6 0,1 0,3 0,2 IL-1β 0,1 0,7* 0,5 0,0 0,3 0,2 IL-1ra 0,4 0,6 0,4 0,0 0,3 0,1 IL-2 -0,5 0,2 -0,3 0,0 0,2 0,3 IL-4 -0,2 0,4 -0,1 0,1 0,1 0,2 IL-5 0,4 0,7 0,2 -0,3 0,1 -0,1 IL-6 0,2 0,4 0,3 0,0 0,1 0,0 IL-7 0,2 0,4 0,4 -0,1 0,0 0,1 IL-8 0,1 0,6 0,5 -0,1 -0,1 0,0 IL-9 0,4 0,6 0,3 -0,2 0,3 -0,2 IL-10 0,3 0,6* 0,1 -0,6 0,2 -0,2 IL-12 0,8 0,7* 0,5 -0,3 0,2 -0,2 IL-13 0,8 0,8* 0,7 -0,6 0,1 -0,1 IL-15 -0,3 0,6 0,02 -0,1 0,3 0,1 IL-17 -0,2 0,2 -0,2 0,3 0,3 0,2 Эотаксин 0,4 0,5 0,4 0,1 0,4 0,2 FGF-2 0,0 0,4 -2,5 -0,2 0,2 -0,4 G-CSF 0,4 0,7* 0,5 0,0 0,2 0,1 GM-CSF 0,4 0,6 0,25 -0,3 0,2 -0,1 IFN-γ 0,1 0,7* 0,5 0,0 0,1 0,2 IP-10 0,4 0,2 0,4 0,2 0,1 0,4 MCP-1 0,4 0,7* 0,4 -0,3 0,1 -0,1 MIP-1α 0,2 0,6 0,1 -0,1 0,4 -0,1 MIP-1β 0,4 0,5 0,1 0,0 0,2 0,0 PDGF-ВВ -0,4 0,3 -0,4 0,0 -0,1 0,2 RANTES 0,2 0,6 0,02 0,2 -0,1 0,0 TNF-α 0,2 0,6 0,3 -0,2 0,1 0,1 VEGF 0,4 0,8* 0,3 -0,5 0,1 -0,5 *-p<0,05 Таким образом, при РА концентрация аутоантител, маркеров воспаления, цитокинов, хемокинов, ростовых факторов в сыворотке крови способна отражать таковую в синовиальной жидкости. Кроме этого при РА уровень аутоантител, цитокинов, хемокинов и колониестимултрующих факторов способен отражать воспалительную активность заболевания. 139 3.6. Клинико-лабораторные особенности пациентов с ревматоидным артритом в зависимости от позитивности по антителам к цитруллинированным белкам Проанализированы клинико-лабораторные особенности 118 пациентов с РА из них 37 с ранним РА и 81 с развернутым РА в зависимости от их позитивности по АЦБ (табл. 66). Больные серопозитивные по АЦБ отличались от серонегативных, при раннем РА, более высоким уровнем IgM РФ (p=0,03), а при развернутом РА, как IgM РФ (p=0,0001), так и IgA РФ (p=0,0001). При раннем РА и развернутом РА различий клиниколабораторных характеристик в группах с изолированно повышенными уровнями IgM/IgA РФ и АЦБ не выявлено. Таблица 65 Клинико-лабораторная характеристика больных РА в зависимости от серопозитивности по АЦБ Ранний РА (n=37) Развернутый РА (n=81) АЦБ+ АЦБ- АЦБ+ АЦБ- 29(79%) 8(21%) 64(79%) 17(21%) 49,0(41,0-60,0) 55,0(45,0-69,0) 54,0(49,0-61,0) 45,0(36,0-55,0) 23/6 5/3 56/8 15/2 3,5(1,8-6,0) 4,0(4,0-4,0) 49,0(42,0-57,0) 75,0(17,0-168,0) ЧПС 12,5(6,5-18,0) 2,0(0,0-10,0) 8,0(4,0-14,0) 10,0(0,0-10,0) ЧБС 15,0(9,0-26,5) 10,0(0,0-10,0) 14,0(7,0-23,0) 10,0(0,0-22,0) 5,3(4,3-6,0) 4,4(3,5-5,6) 4,6(4,0-5,2) 3,9(3,3-5,4) СОЭ, мм/ч 34,5(27,0-59,5) 33,0(33,0-33,0) 34,0(21,0-55,0) 30,0(26,0-40,0) СРБ, мг/л 15,1(5,8-35,4) 20,5(5,6-59,2) 13,3(4,2-32,7) 10,6(5,4-33,6) IgM РФ (МЕ/мл) 85,7(25,3-290,7)* 16,0(2,0-88,1) 81,8(26,1-280,6)* 9,5(9,5-12,5) IgA РФ (Ед/мл) 36,1(19,4-167,1) 21,5(18,6-37,9) 164,8(41,8-500,0)* 16,1(1,9-18,9) n возраст Пол (жен/муж) длительность DAS28 140 АЦБ+ больные отличались от АЦБ-, при раннем РА, более высоким уровнем провоспалительного цитокина IL-15 (p=0,02) и колонистимулирующего фактора G-CSF (p=0,02), а при развернутом РА: провоспалительных цитокинов: TNF-α (p=0,02), IL-15 (p=0,03); антивоспалительных цитокинов IL-1rа,-2,-5,-9-10,-12, эотаксина (p=0,01, 0,003, 0,003, 0,005, 0,04, 0,01 соответственно); колонистимулирующего хемокина MCP-1 (p=0,01) (табл. 66, рис. 20). фактора GM-CSF (p=0,001), 141 Различия цитокиновых профилей между группами АЦБ позитивных и негативных пациентов с РА Ранний РА (n=37) РА (n=81) Таблица 66 АЦБ+ АЦБ- АЦБ+ АЦБ- 29(79%) 8(21%) 64(79%) 17(21%) IL-1β 5,4(4,1-14,3) 3,5(3,1-6,5) 6,3(3,9-39,8) 4,5(3,0-5,6) IL-1ra 668,7(165,3-4767,6) 183,4(74,9-71,4) 840,5(167,1-4387,7)* 180,4(148,3-235,7) IL-2 85,6(11,9-300,0) 14,9(11,3-75,8) 57,0(13,1-315,1)* 8,6(2,7-16,2) IL-4 6,0(2,3-13,8) 5,7(4,6-7,3) 6,1(0,5-9,4) 0,4(0,2-5,8) IL-5 5,8(3,8-11,0) 4,6(3,9-5,0) 5,4(0,4-22,1)* 0,6(0,2-1,2) IL-6 56,5(30,2-346,80) 33,2(16,8-90,0) 104,1(26,5-196,5) 25,4(11,8-79,0) IL-7 22,6(6,3-71,2) 23,9(15,8-44,1) 17,3(1,6-47,8) 2,9(1,6-11,5) IL-8 15,1(10,1-17,6) 14,8(12,4-17,3) 7,2(3,6-16,6) 6,3(3,5-10,2) IL-9 198,9(59,4-1663,3) 87,4(40,0-129,0) 307,1(77,9-939,7)* 67,8(27,0-111,8) IL-10 50,7(25,1-218,0) 36,0(27,0-76,4) 47,3(14,0-151,7)* 12,1(4,3-22,2) 9,2(7,6-16,7) 28,2(6,3-191,6)* 5,6(1,7-6,9) n IL-12 18,0(6,8 -136,5) IL-13 32,6(16,1-93,2) 18,7(17,7-32,1) 32,7(9,4 -125,3) IL-15 28,0(11,8-141,0)* 4,9(4,1-17,2) 44,4(10,6-135,6)* IL-17 70,3(39,8-128,3) 100,9(67,9-119,2) 20,2(8,3-98,5) 19,2(5,1-36,9) 18,3(10,5-27,0) 10,0(4,9 -21,9) 142 Продолжение таблицы 67 Ранний РА (n=37) РА (n=81) АЦБ+ АЦБ- АЦБ+ АЦБ- 499,9(99,3-2144,1) 166,1(98,7-504,1) 213,1(66,7-639,3)* 39,6(22,1-63,1) FGF-2 39,7(26,1-72,5) 33,7(16,1-48,4) 37,0(17,1-56,5) 39,8(31,3-49,4) G-CSF 18,7(2,8-35,0)* 2,5(1,3-3,0) 28,5(12,4-177,4) 22,1(18,3-36,0) 219,7(60,4-1004,0) 73,7(50,1-101,4) 136,1(60,7-528,8)* 31,9(20,6-56,8) IFN-γ 3600,9(365,7-15935,2) 1356,8(749,3-2468,2) 846,0(145,2-3267,1) 141,9(112,5-235,5) IP-10 7362,6(782,6-16721,7) 11438,7(7721,333388,0) 587,1(254,1-9881,9) 628,0(260,4-1410,4) MCP-1 100,1(32,0-254,7) 37,6(18,2-187,6) 104,3(58,4-227,7)* 36,4(11,8-125,5) MIP-1α 21,8(10,9-38,2) 22,2(20,2-24,0) 12,8(9,0-21,6) 10,2(8,5-12,9) MIP-1β 80,4(34,7-124,4) 100,2(60,5-175,9) 66,1(40,3-133,1) 60,6(34,3-106,8) Эотаксин GM-CSF PDGF-ВВ 26274,3(7793,4-0419,8) 53475,9(35427,967203,5) 11798,7(5672,9-40665,9) 9597,9(4361,5-47876,1) RANTES 1802,3(1802,3-6169,5) 1802,3(1802,3-1802,3) 3985,9(1802,3-6169,5) 6169,5(6169,5-6169,5) 99,8(53,4-181,8) 52,1(46,8-81,7) 76,0(48,1-347,7)* 38,1(24,9-63,8) 285,2(56,4-654,9) 151,9(79,3-439,5) TNF-α VEGF 577,6(116,4-2246,4) 478,5(277,5-936,8) *- относительно группы АЦБ негативных пациентов. 143 Рисунок 20 Цитокиновый профиль АЦБ негативных (А) и позитивных (Б) пациентов с РА А Б Обозначения функциональных классов цитокинов: (П)-провоспалительные, (А)-антивоспалительные, (Th1)Th1, (Th2)-Th2, (Th17)-Th17, (T-рег)-Т-регуляторные, (К)-колониестимулирующие, (СА)-стромальные и ангиогенные, (Х)-хемокины. 144 Таким образом, серопозитивность по АЦБ ассоциируется с повышением уровня IgM/IgA РФ, провоспалительных, антивоспалительных (IL-1rа,-2,-5,9-10,-12, эотаксина; цитокинов, колонистимулирующего фактора GM-CSF и хемокина MCP-1. 3.7. Мультиплексный анализ биомаркеров в диагностике и оценке активности ревматоидного артрита. 3.7.1. Многопараметрический анализ биомаркеров в лабораторной диагностике раннего ревматоидного артрита Обследовано 102 пациента с ранним РА: 79 женщин и 23 мужчины; возраст: 51 (41-62) лет, длительность 4 (2,5-6,0) мес., DAS28 5,4 (4,1-5,9). Группу сравнения составили (n=616): 27 пациентов с СКВ), 15 - с СШ, 25 - с АС, 33 - с ОА, 20 - с OVERLAP синдромом, 9 - с ПА, 22 – с псориатическим ПCА и 168 - с НА, а также 297 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными. Концентрации 27 биомаркеров (IgM РФ, IgА РФ, АЦЦП, АМЦВ, СРБ, кальпротектин, IL-1β, IL-1ra, IL-2, -4, -5, -6, -7, -9, -10, -12, -13, -15, -17, эотаксин, FGF-2, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MIP-1α, TNF-α, VEGF) при раннем РА достоверно превышали таковые в группе сравнения (табл. 67). После проведения соответствующего статистического анализа полученных данных, стало возможным выделить наиболее “сильные” факторы прогнозирования наличия данного заболевания, а именно концентрации: IL-6, СРБ, GM-CSF, IFN-γ, IP-10 и АЦЦП (табл. 68, рис. 21) и создать многопараметрический диагностический индекс (МДИ) для раннего РА. Вероятность наличия раннего РА рассчитывается по формуле:-1050,002[IL-6]+0,001[СРБ]+0,002[GM-CSF]+0,001[ИФН]+0,05[IP10]+0,001[АЦЦП]. 145 Таблица 67 Конценцентрации биомаркеров и методы их определения у больных ранним РА (n=102) Биомаркеры Ранний РА Ме (25-75%) Аутоантитела IgM РФ 39(5-137)* IgА РФ 27 (19-80)* АЦЦП 36(0,5-100)* АМЦВ 68,5(1-692)* Острая фаза воспаления СРБ 9,5(3-33)* Кальпротектин 24(11-43)* Костный и хрящевой метаболизм sRANKL 0,1(0,1-1,3) CОМP 13(9-42) Цитокины IL-1β 4,8(3,7-13,4)* IL-1ra 430,2(130,1-942,0)* IL-2 50,0(12,0-296,6)* IL-4 6,0(2,5-12,9)* IL-5 5,1(3,9-10,2)* IL-6 47,0(28,1-240,1)* IL-7 22,6 (8,8-65,5)* IL-8 14,92(10,14-17,62) n Группа сравнения Ме (25-75%) 102 21 102 102 0 (0-17) 0,1(0,1-0,1) 0,1(0,1-0,1) 1,0(0,2-14) 102 32 1(0,5-5) 9(4,5-22) 32 32 0,1(0,1-0,6) 12(9-28) 36 36 36 36 36 36 36 36 4,07(2,61-5,0) 150,64(111,19-253,8) 10,77(5,53-13,8) 3,31(0,21-6,0) 2,92 (0,2-5,2) 7,78(4,5-13,1) 8,15(0,5-21,5) 12,47(4,76-9,0) n 616 85 616 616 метод ЕИ АЧ● ВГН ИНМ ИФА ИФА ИФА МЕ/мл ЕД/мл ЕД/мл ЕД/мл 9,5 0,1 0,1 0,1 15,0● 20,0● 5,0● 20,0● мг/л 0,175 мкг/мл <0,4 5,0● 20,0♦ 84 84 ИФА пмоль/л 0,08 ИФА нг/мл 0,4 0,6♦ 28,0♦ 30† 30† 30† 30† 30† 30† 30† 30† xMAP xMAP xMAP xMAP xMAP xMAP xMAP xMAP 518 ИНМ 84 ИФА пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл 0,1 0,4 2,2 0,1 0,1 0,0 0,0 0,1 7,6♦ 1082,8♦ 37,5♦ 8,9♦ 9,5♦ 33,47♦ 76,5♦ 28,15♦ 146 Биомаркеры Продолжение таблицы 68 метод ЕИ АЧ● ВГН Ранний РА Группа сравнения Ме (25-75%) n Ме (25-75%) n IL-9 116,3(53,0-811,0)* 36 34,17(26,3-42,3) 30† xMAP пг/мл 0,5 IL-10 43,6(26,6-131,0)* 36 13,22(5,83-34,5) 30† xMAP пг/мл 0,1 IL-12 16,0(7,3-97,3)* 36 5,78(2,24-9,9) 30† xMAP пг/мл 0,1 IL-13 24,8(17,3-71,0)* 36 16,69(9,9-22,4) 30† xMAP пг/мл 0,1 IL-15 20,0(5,1-63,1)* 36 6,7 (3,92-17,4) 30† xMAP пг/мл 0,1 IL-17 82,0(45,0-121,0)* 36 22,87(5,23-90,3) 30† xMAP пг/мл 0,4 Эотаксин 397,3(99,0-1544,3)* 36 102,41(19,39-585,7) 30† xMAP пг/мл 1,7 FGF-2 36,2(25,7-69,8)* 36 27,25(19,32-44,3) 30† xMAP пг/мл 4,1 G-CSF 164,53(56,89-838,69) 36 10,86(2,37-56,5) 30† xMAP пг/мл 0,4 GM-CSF 164,5(57,0-838,9)* 36 39,93(21,6-61,3) 30† xMAP пг/мл 5,4 IFN-γ 2434,0(479,4-3376,0)* 36 285,35(112,2-1038,0) 30† xMAP пг/мл 0,3 IP-10 9454,0(1609,2-138,0)* 36 717,8(188,68-17831,0) 30† xMAP пг/мл 1,6 MCP-1 84,63(21,38-254,75) 36 48,59(22,26-6169,5) 30† xMAP пг/мл 0,2 MIP-1α 21,8(14,0-32,7)* 36 10,82(8,84-18,1) 30† xMAP пг/мл 0,4 MIP-1β 81,92(43,98-132,45) 36 66,05 (49,36-99,5) 30† xMAP пг/мл 0,1 PDGF-ВВ 29912,32(10329,17-4571,33) 36 26024,51(5854,75-56472,8) 30† xMAP пг/мл 1,4 RANTES 1802,29(1802,29-6169,50) 36 1809,29(1802,29-6169,5) 30† xMAP пг/мл 0,4 TNF-α 82,0(50,4-162,4)* 36 39,0(17,2-65,0) 30† xMAP пг/мл 2,9 VEGF 509,3(153,3-518,4)* 36 205,6(64,0-313,0) 30† xMAP пг/мл 0,1 ЕИ – единицы измерения, АЧ – аналитическая чувствительность, ВГН – верхняя граница нормы; *– p<0,05; здоровые доноры; ●– определен изготовителем, ♦- рассчитан при исследовании сывороток здоровых доноров. 186,2♦ 411,3♦ 27,6♦ 63,3♦ 40,8♦ 385,7♦ 1247,9♦ 70,1♦ 31,5♦ 182,1♦ 2342,6♦ 4064,0♦ 248,5♦ 37,2♦ 153,3♦ 93646,9♦ 6169,5♦ 65,0♦ 313,0♦ †– условно 147 Таблица 68 Коэффициенты прогностической модели для диагностики раннего РА. Константа α IL-6 СРБ GM-CSF IFN-γ IP-10 АЦЦП Нестандартизованные коэффициенты Стандартная B ошибка -0,105 0,090 -0,002 0,003 0,000 0,000 0,002 0,003 0,001 0,003 0,005 0,002 0,000 0,000 Стандартизованные коэффициенты β -0,125 0,342 0,145 0,070 0,350 0,309 Рисунок 21 В качестве верхней границы нормы выбрано значение 0,5, при котором данная панель обладает наилучшими диагностическими характеристиками. В целом диагностическая точность превышает таковую каждого входящего в него биомаркера (табл. 69). 148 ДЧ % ДС % ОППР ОПОР ППК ДИ (95%) Таблица 69 Диагностические характеристики, входящих в МДИ при раннем РА IL-6 СРБ GM-CSF IFN-γ IP-10 АЦЦП МДИ 64 75 47 50 69 64 97 99 99 99 99 94 94 94 64 75 47 50 11,5 11 16,1 0,4 0,2 0,5 0,5 0,3 0,4 0,03 0,9 0,9 0,85 0,98 0,88 0,87 0,98 0,81-0,99 0,82-0,98 0,76-0,95 0,81-0,98 0,77-0,99 0,77-0,97 0,95-1,0 3.7.2. Многопараметрический анализ биомаркеров в лабораторной диагностике развернутого ревматоидного артрита Обследовано 891 пациент с РА: 733 женщин и 158 мужчины; возраст: 51(4356) лет, длительность заболевания 96(36-192) мес., DAS28 5,2(3,8-6). Группу сравнения составили (n=616): 27 пациентов с СКВ), 15 - с СШ, 25 - с АС, 33 - с ОА, 20 - с OVERLAP синдромом, 9 - с ПА, 22 – с псориатическим ПCА и 168 - с НА, а также 297 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными (табл. 70). Концентрации 16 биомаркеров (IgM РФ, IgА РФ, АЦЦП, АМЦВ, СРБ, кальпротектин, IL-1β, антогонист рецептора IL-1, IL-2, -6, -9, -12, -13, -15, G-CSF, GM-CSF, TNF-α) достоверно превышали таковые в группе сравнения (табл. 70) После проведения данных, стало соответствующего статистического анализа полученных возможным выделить наиболее “сильные” факторы прогнозирования наличия данного заболевания, а именно концентрации: АМЦВ, IL-6, IL-9, СРБ, АЦЦП, IgM РФ (табл. 71, рис. 22 ) и создать кандидатный МДИ для РА. Вероятность наличия РА рассчитывается по формуле: 0,161+0,001х[АМЦВ]+0,005х[IL-6]-0,005х[IL-9]+0,001х[СРБ]+0,001х[АЦЦП]0,001х[IgM РФ]. В качестве верхней границы нормы выбрано значение прогноза 1,15 при которой, данная диагностическая панель обладает наилучшими значениями диагностическими характеристиками: ДЧ 93%, ДС 93%, ОППР 13,3, ОПОР 0,1, ППК 0,99 (табл. 72). 149 Конценцентрации биомаркеров и методы их определения у больных развернутым РА (n=891) Биомаркеры Развернутый РА Ме (25-75%) Аутоантитела IgM РФ 49 (9,5-200)* IgА РФ 142 (25-388)* АЦЦП 100(4-100)* АМЦВ 273(40,7-973)* Острая фаза воспаления СРБ 10(3,1-28,7)* Кальпротектин 29 (20-43)* Костный и хрящевой метаболизм sRANKL 0,1 (0,1-0,9) 6 CОМP 450 (400-1050) Цитокины IL-1β 5,59(3,840-9,65)* IL-1ra 283,03(163,14-1907,19)* IL-2 24,96(9,71-115,22)* IL-4 4,05(0,43-7,93) IL-5 4,49(0,37-16,38) IL-6 62,44(21,68-186,49)* IL-7 7,97(2,1-38,97) IL-8 7,20(4,07-16,61) IL-9 134,8(58,66-833,35)* n Группа сравнения Ме (25-75%Р) n 616 85 616 616 Таблица 70 метод ЕИ АЧ● ВГН ИНМ ИФА ИФА ИФА МЕ/мл ЕД/мл ЕД/мл ЕД/мл 9,5 0,1 0,1 0,1 15,0● 20,0● 5,0● 20,0● 891 105 891 349 0 (0-17) 0,1(0,1-0,1) 0,1(0,1-0,1) 1,0(0,2-14) 891 46 1(0,5-5) 9(4,5-22) 46 46 0,1(0,1-0,6) 12(9-28) 84 84 ИФА пмоль/л ИФА нг/мл 0,08 0,4 0,6♦ 1400,0♦ 81 81 81 81 81 81 81 81 81 4,07(2,61-5,0) 150,64(111,19-253,8) 10,77(5,53-13,8) 3,31(0,21-6,0) 2,92 (0,2-5,2) 7,78(4,5-13,1) 8,15(0,5-21,5) 12,47(4,76-9,0) 34,17(26,3-42,3) 30† 30† 30† 30† 30† 30† 30† 30† 30† xMAP xMAP xMAP xMAP xMAP xMAP xMAP xMAP xMAP 0,1 0,4 2,2 0,1 0,1 0,0 0,0 0,1 0,5 7,6♦ 1082,8♦ 37,5♦ 8,9♦ 9,5♦ 33,47♦ 76,5♦ 28,15♦ 186,2♦ 518 ИНМ 84 ИФА мг/л 0,175 мкг/мл <0,4 пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл 5,0● 20,0♦ 150 Биомаркеры Продолжение таблицы 70 ЕИ АЧ● ВГН Развернутый РА Группа сравнения метод Ме (25-75%) n Ме (25-75%) n IL-10 34,15(7,54-106,25) 81 13,22(5,83-34,5) 30† xMAP пг/мл 0,1 IL-12 10,88(5,29-143,82)* 81 5,78(2,24-9,9) 30† xMAP пг/мл 0,1 IL-13 28,52(8,85-76,08)* 81 16,69(9,9-22,4) 30† xMAP пг/мл 0,1 IL-15 27,9(10,52-73,36)* 81 6,7 (3,92-17,4) 30† xMAP пг/мл 0,1 IL-17 17,09(7,65-102,35) 81 22,87(5,23-90,3) 30† xMAP пг/мл 0,4 Эотаксин 154,35(42,30-606,02) 81 102,41(19,39-585,7) 30† xMAP пг/мл 1,7 FGF-2 37,01(17,14-53,06) 81 27,25(19,32-44,3) 30† xMAP пг/мл 4,1 G-CSF 24,23(9,90-82,20)* 81 10,86(2,37-56,5) 30† xMAP пг/мл 0,4 GM-CSF 71,06(31,85-405,95)* 81 39,93(21,6-61,3) 30† xMAP пг/мл 5,4 IFN-γ 235,45(137,69-1463,41) 81 285,35(112,2-1038,0) 30† xMAP пг/мл 0,3 IP-10 606,05(257,24-8313,56) 81 717,8(188,68-17831,0) 30† xMAP пг/мл 1,6 MCP-1 91,68(41,65-187,12) 81 48,59(22,26-6169,5) 30† xMAP пг/мл 0,2 MIP-1α 11,67(8,94-20,36) 81 10,82(8,84-18,1) 30† xMAP пг/мл 0,4 MIP-1β 64,78(39,89-112,91) 81 66,05 (49,36-99,5) 30† xMAP пг/мл 0,1 PDGF-ВВ 11862,42(6020,06-54889,46) 81 26024,51(5854,75-56472,8) 30† xMAP пг/мл 1,4 RANTES 6169,50(1802,29-6169,50) 81 1809,29(1802,29-6169,5) 30† xMAP пг/мл 0,4 TNF-α 67,68(36,26-135,49)* 81 39,0(17,2-65,0) 30† xMAP пг/мл 2,9 VEGF 285,17(83,72-656,31) 81 205,6(64,0-313,0) 30† xMAP пг/мл 0,1 ЕИ – единицы измерения, АЧ – аналитическая чувствительность, ВГН – верхняя граница нормы; *– p<0,05; здоровые доноры; ●– определен изготовителем, ♦- рассчитан при исследовании сывороток здоровых доноров. 411,3♦ 27,6♦ 63,3♦ 40,8♦ 385,7♦ 1247,9♦ 70,1♦ 31,5♦ 182,1♦ 2342,6♦ 4064,0♦ 248,5♦ 37,2♦ 153,3♦ 93646,9♦ 6169,5♦ 65,0♦ 313,0♦ †– условно 151 Таблица 71 Коэффициенты прогностической модели для диагностики развернутого РА. Константа α АМЦВ IL-6 IL-9 СРБ АЦЦП IgM РФ Нестандартизованные коэффициенты Стандартная B ошибка 0,161 0,097 0,001 0,001 0,005 0,002 -0,005 0,003 0,001 0,000 0,000 0,000 -0,001 0,000 Стандартизованные коэффициенты β 0,433 0,299 -0,290 0,498 0,281 -0,335 Рисунок 22 Концентрации АМЦВ, IL-6, IL-9, СРБ, АЦЦП, IgM РФ при развернутом РА и у здоровых доноров 152 Таблица 72 Диагностические характеристики, входящих в МДИ для развернутогоРА IgM РФ АЦЦП АМЦВ СРБ IL-6 IL-9 МДИ ДЧ % 67 75 85 80 60 40 93 ДС % 79 87 81 97 99 99 93 ОППР 3,2 5,8 4,5 26,6 60,0 40,0 13,3 ОПОР 0,4 0,3 0,2 0,2 0,4 0,6 0,1 ППК 0,8 0,8 0,8 0,9 0,9 0,8 0,99 ДИ (95%) 0,66-0,92 0,82-0,1 0,91-1,0 0,84-0,1 0,84-0,1 0,66-0,92 0,91-1,0 Таким образом МДИ для диагностики раннего и развернутого РА значительно превосходит по своей клинической информативности рутинные биомаркеры входящие в классификационные критерии заболевания (IgM РФ, АЦЦП, СОЭ, СРБ). 3.7.3. Применение многопараметрического анализа лабораторных биомаркеров для оценки активности ревматоидного артрита. Обследовано 58 пациентов с РА: 46 женщина и 12 мужчин; возраст: 49 (47-58) лет, длительность 48 (28-120) мес., DAS28 4,8 (3,85-5,8), а также 30 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными. Больные РА были разделены на группы c высокой/умеренной и низкой активностью заболевания по DAS28. Измерялись концентрации 30 биомаркеров в сывортке крови СРБ, АЦЦП, АМЦВ, IL-1β,-1ra,-2,-4,-5,-6,-7,-8,-9,-10,-12,-13,-15,-17, FGF-2, эотаксин, G-CSF, GM-CS, IFN-γ, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, PDGF-BB, TNF-α, VEGF. В сыворотках больных РА концентрации большинства биомаркеров достоверно превышали таковые в группе здоровых доноров, исключение составили FGF, G-CSF, MIP-1β, PDGF-BB. Группа пациентов с высокой/умеренной активностью заболевания достоверно отличалась более высокими уровнями FGF, IL-1β,-6,-10,13,15, IP-10, TNF-α от больных с низкой активностью (табл. 73). 153 Таблица 73 Концентрации биомаркеров при РА в зависимости от степени активности заболевания и у здоровых доноров РА Активность РА Здоровые доноры все пациенты высокая /умеренная низкая (n=58) (n=48) (n=10) (n=30) Ме (25-75%) Ме (25-95%) DAS28 4,8(3,85-5,8) 5,1(4,5-5,9) 2,9(2,8-3,1) IgM РФ 36,5(1,3-142,5)* 34,7(0,1-194,9)* 36,5(12,9-127,5)* 0,1(0,1-0,1) АЦЦП 27,1(0,5-100,0)* 27,1(0,5-100,0)* 21,95(0,3-100,0)* 0,1(0,1-0,1) АМЦВ 39,6(3,2-243,5)* 36,2(2,5-219,9)* 98,0(38,6-243,5)* 0,2(0,2-0,2) СРБ 10,2(4,9-33,5)* 15,1(6,2-36,4)* 8,8(3,8-13,3)* 0,9(0,5-1,2) ▼ IL-1β 4,6(3,4-8,9)* 4,9(3,7-13,9)* 3,3(2,5-4,3) 4,07(2,61-7,57) IL-1ra 220,9(148,3-3761,6)* 244,7(152,4-4891,9)* 166,6(90,5-668,7) 150,6(111,2-1082,8) IL-2 25,1(10,3-221,9)* 36,7(11,3-521,1)* 14,75(10,05-49,3) 10,8 (5,5-37,5) IL-4 6,1(0,8-9,6)* 6,3(0,8-12,1)* 3,75(0,3-6,7) 3,3(0,2-8,9) IL-5 5,2(3,5-11,1)* 5,4(3,6-13,2)* 4,5(1,2-5,25) 2,9(0,2-9,5) ▼ IL-6 44,0 (21,7- 257,6)* 55,3(25,2-317,4)* 24,8(9,1-54,7)* 7,8(4,5-33,5) IL-7 22,0(4,4-52,5)* 25,5(6,3-60,3)* 17,4(1,6-21,5) 8,15(0,5-76,5) IL-8 14,8(6,7-19,1)* 15,3(7,1-19,1)* 10,6(2,4-15,6) 12,5 (4,8-28,15) IL-9 102,1(51,8-509,6)* 102,1(42,9-425,1)* 122,65(72,7-600,6)* 34,2(26,3-186,2) ▼ IL-10 48,2(14,0- 130,4)* 61,8(17,5-189,0)* 28,32(6,9-74,9) 13,2(5,8-411,3) IL-12 12,3(6,1-74,0)* 14,6(6,5-136,5)* 10,05(4,2-17,9) 5,8(2,2-27,6) ▼ IL-13 27,1(17,0-64,3)* 29,6(17,7- 82,5)* 17,5(8,7-28,5) 16,7(9,9-63,3) ▼ IL-15 19,3(5,8-57,8)* 24,7(8,7-86,8)* 7,06(3,9-19,4) 6,7(3,9-40,8) IL-17 83,3(21,9-120,5)* 88,0(22,5-126,9)* 74,3(10,5-103,8) 22,87 (5,23-385,67) Эотаксин 384,9(80,4 -1260,8)* 469,8(78,1-1590,2)* 163,5(118,1-192,5) 102,41 (19,39-1247,91) ▼ FGF-2 34,4(23,2-54,6) 37,0(28,3-62,6)* 15,8(7,3-21,6) 27,25 (19,3-70,1) ▼ G-CSF 12,4(2,7-31,9) 14,0(2,7-33,9) 2,5(0,3-16,3) 10,9 (2,4-31,5) 154 РА все пациенты (n=58) GM-CSF IFN-γ IP-10 MCP-1 MIP-1α MIP-1β PDGF-BB TNF-α VEGF Активность РА высокая /умеренная низкая (n=48) (n=10) Ме (25-75%) 94,3(48,6-920,1)* 14,0(2,7-33,9) 79,2(55,2-171,6)* 1369,3(197,8-10155,7)* 1521,9(197,8-10896,4)* 989,6(149,5-3563,7) ▼ 7733,1(754,2-13252,8)* 8302,6(770,0-16721,7)* 4922,6(364,9-10115,25) 84,6(28,4-249,2) 108,0(42,5-294,1)* 28,1(13,3-60,0) 20,2(10,4-24,2)* 20,9(10,2-28,1)* 17,5(11,3-20,5) 76,1(46.9-133.1) 80,4(52,9-135,0) 59,4(28,5-81,7) 31266,5(8029,9-65112,0) 31594,5(8974,0-65322,2) 26274,3(7207,7-44078,4) 76,5(47,4-144,7)* 80,7(48,9-211,5)*▼ 53,9(27,4-64,3) 494,6(131,8-1477,5)* 616,1(194,7-1914,8)* 318,6(30,8-524,0) Продолжение таблицы 73 Здоровые доноры (n=30) Ме (25-95%) 39,9(21,6-182,1) 285,35(112,2-2342,6) 717,8(188,7-17831,0) 48,6 (22,3-248,5) 10,8 (8,8-37,2) 66,0(49,4-153,3) 26024,5(5854,8-93646,9) 38,9 (17,2-98,0) 205,6 (63,85-2887,4) *-p<0,05 по отношению к здоровым донором, ●-по отношению к больным с умеренной активностью РА, ▼-по отношению к больным с низкой активностью РА 155 Проведение многофакторного анализа, позволило выделить факторы наиболее “связанные” с высокой/умеренной активностью РА по DAS28: FGF, MCP-1, IL1β,-6-15, TNF-α. Полученные данные позволили создать прогностическую модель оценки активности РА рассчитывающуюся по следующей формуле: - 0,0413+0,006(FGF)+0,006(IL-1β)+0,005(MCP-1)-0,004(TNF-α)+0,002(IL-6)0,007(IL-15). Концентрации цитокинов выражаются в значениях рангов их концентраций, результат расчета - в условных единицах. Коэффициент корреляции значений полученной прогностической модели и DAS28 составил 0,38 (p<0,05). По данным ROC-анализа данная модель обладает “отличной” диагностической эффективностью при дифференциации высокой/средней активности РА от низкой (ППК=0,94; 95% доверительный интервал (ДИ): 0,881,0). В качестве отсеченой точки (cut off) выбрано значение 0,652 (табл. 74). Таблица 74 Диагностическая точность МДИ для определения активности РА ППК (95% ДИ) ДЧ% ДС% ПЦПР ПЦОР æс DAS28 Прогностическая модель 0,93(0,87-1,00) 91,7 90,0 97,7 64,3 0,68 FGF-2 0,82(0,66-0,97) 87,5 80,0 97,7 64,3 0,20 MCP-1 0,75(0,60-0,89) 68,8 70,0 89,2 28,6 0,32 IL-1β 0,77(0,62-0,93) 77,1 70,0 92,3 36,8 0,33 IL-6 0,71(0,55-0,87) 60,0 60,0 88,2 25,0 0,14 IL-15 0,71(0,56-0,86) 72,9 70,0 92,1 35,0 0,31 TNF-α 0,73(0,58-0,88) 62,5 80,0 93,8 30,8 0,26 Таким образом, иммунологический индекс активности РА, включающий оценку провоспалительных цитокинов, хемокинов и ростовых факторов, проявляет “отличную” диагностическую эффективность при дифференциации высокой/средней и низкой степеней активности заболевания по DAS28. 156 3.8. Мультиплексный анализ биомаркеров для оценки эффективности применения генно-инженерных биологических препаратов при ревматоидном артрите. 3.8.1. Прогнозирование эффективности применения моноклональных антител к TNF-α (инфликсимаба). химерных Обследовано 27 пациентов с РА (25 женщин и 2 мужчин; возраст: 46,5; 41,561,5лет). На 6 неделе терапии инфликсимабом (ИНФ) у пациентов с РА наблюдалось снижение уровней IgM РФ, АЦЦП, на 14 - СОЭ, IgM РФ, на 24 – СОЭ, СРБ и IgM РФ (табл. 75). Таблица 75 Динамика показателей активности заббольных РА на фоне терапии ИНФ (n=27). недели 0 6 14 24 СОЭ (мм/ч) 56,00 40,00 34,00 34,00 (36,00-76,00) (22,00-66,00) (20,00-54,00)* (18,00-57,00)* СРБ (мг/л) 24,44 12,15 7,30 6,80 (12,40-59,10) (5,20-23,70) (3,70-43,70) (3,60-26,40)* IgM РФ 77,30 71,65 46,05 49,50 (МЕ/) (12,50-324,70) (9,50-96,50)* (9,50-75,30)* (9,50-114,20)* АЦЦП 96,15 73,85 100,00 43,60 (Ед/мл) (5,40-100,00) (0,90-100,00)* (22,80-100,00) (0,90-100,00) DAS28 6,12 5,10 4,46 4,10 (5,40-6,70) (4,63-5,50)* (3,82-5,10)* (2,78-4,60)* *-p<0,05 относительно базальных значений У пациентов с наличием клинического “ответа”: на терапии ИНФ на 6 неделе применения препарата наблюдалось снижение уровня IgM РФ, АЦЦП; на 14 – СОЭ, АЦЦП, на 24 – СОЭ, СРБ, IgM РФ, АЦЦП. При наличии “ответа” на 6 и 14 неделях был отмечен более высокий уровень АЦЦП, а на 24 – более низкие значения СОЭ и содержания IgM РФ, чем при отсутствии такового (табл. 76). На 24-й неделе у 14% положительных по IgM РФ и 4,5% по АЦЦП пациентов произошла сероконверсия в отрицательные результаты; у 8% отрицательных по IgM РФ и 33% по АЦЦП – в положительные. 157 Таблица 76 Динамика концентраций острофазовых показателей и аутоантител у больных РА при наличии “ответа” на терапию ИНФ (n=22) недели 0 6 14 24 СОЭ (мм/ч) 55.00 40.00 34.00 30.00 (36.00-62.00) (30.00-50.00) (20.00-46.00)* (12.00-40.00)*† СРБ (мг/л) 20.20 12.10 7.10 6.05 (12.40-41.50) (5.20-31.20) (3.70-15.30) (3.10-8.50)* † IgM РФ (МЕ/мл) 77.25 77.60 51.10 33.85 (26.50-324.70) (16.00-102.00)* (9.50-78.60)* (9.50-77.60)* АЦЦП (Ед/мл) 100.00 100.00 100.00 53.20 (24.80-100.00) (2.40-100.00)* † (63.40-100.00)† (0.90-100.00)* *-p<0,05 относительно базальных значений, †-по сравнения с лицами не “ответившими” на терапию У пациентов с отсутствием клинического “ответа”: на терапиию инфликсимабом на 24 неделе применения препарата можно отметить тенденцию к снижению СОЭ, уровней СРБ и возрастанию концентрации АЦЦП (табл. 77). Таблица 77 Динамика концентраций острофазовых показателей и аутоантител у больных РА при отсутствии “ответа” на терапию ИНФ (n=5) недели 0 6 14 24 СОЭ (мм/ч) 80.00 40.00 54.00 60.00 (70.00-82.00) (11.00-72.00) (16.00-78.00) (57.00-72.00) СРБ (мг/л) 66.80 21.20 63.90 27.10 (62.00-82.30) (3.73-23.70) (3.60-79.30) (26.40-63.20) IgM РФ (МЕ/) 77.30 9.50 9.50 76.40 (12.50-297.00) (9.50-84.60) (9.50-75.30) (9.50-116.90) АЦЦП (Ед/мл) 14.90 0.50 0.50 20.90 (0.75-44.60) (0.10-26.70) (0.40-22.80) (12.80-75.50) Обследовано 11 пациентов с РА (10 женщин и 1 мужчина; возраст: 40; 33-54 лет). На 6 неделе терапии ИНФ отмечено снижение уровней: IL-1rа,-7,-10,-12, FGF-2, MIP-1α; на 14-ой: IL-1β,- 1rа,-2,-4,-6,-10,-12,-13,-15,-17, эотоксина, GMCSF, IFN-γ, IP-10, MIP-1α, TNF-α. На 24 неделе терапии РА с использованием ИНФ, происходит снижение основных провоспалительных: TNF-α, IL-6,-12,-15; 158 антивоспалительных IL-1ra, -10; Th-1 цитокинов: IL-2, IFN-γ, колониестимулирующего фактора GM-CSF и хемокинов: IP-10, MCP-1 (табл. 78, 79). На 6 неделе у лиц “ответивших” на терапию ИНФ отмечено снижение уровней: IL-6,-12; на 14: IL-1rа,-2,-6,-10,-12,-15, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MIP-1α, TNF-α. На 24 неделе происходит снижение основных провоспалительных цитокинов: TNF-α, IL-6,-12,-15; IL-1ra,-10, обладающих антивоспалительной функцией; Th-1 цитокинов: IL-2, IFN-γ, колониестимулирующего фактора GMCSF, хемокинов: IP-10, MCP-1 и ангиогенного фактора VEGF. Кроме этого, у пациентов с наличием эффекта при терапии данным препаратом, выявлены более высокие базальные уровни IL-5,-6,-7,-8,-9,-13,-15, GM-CSF, и различия в концентрациях IL-9,-10 на 6 неделе терапии, IL-5,-9 на 14 неделе (табл. 80). У пациентов с отсутствием клинического “ответа”: на терапиию ИНФ на 24 неделе применения препарата можно отметить тенденцию концентраций: провоспалительных: IL-1β, -6, ,-15, к снижению TNF-α, антивоспалительных: IL-1ra,-10, -13, Th1: IL-2, -12, Th2 цитокинов: MIP-1α, IL-4,-5 эотаксина, колонистимулирующих факторов IL-7, GM-CSF, стромальных и ангиогенных факторов FGF-2, PDGF-bb, VEGF, хемокинов: IP-10, MCP-1, и повышению MIP-1β (табл. 81). С целью выбора оптимальной панели биомаркеров для оценки эффективности применения инфликсимаба для лечения РА был проведен пошаговый линейный регрессионный анализ базальных концентраций групп биомаркеров. В качестве возможных предикторов клинического “ответа” на препарат тестировали: аутоантитела: IgM РФ, АЦЦП, АМЦВ, лабораторные маркеры воспаления: СОЭ, СРБ, цитокины: IL-1β, -1ra, -2, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -12, -13, -15, -17, FGF-2, эотаксин, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, PDGF-ВВ, RANTES, TNF-α, VEGF. На основании полученных данных, наиболее “сильными” факторами для прогнозирования эффективности инфликсимаба являются: IL-12 (ППК 0,85), IL-17 (ППК 0,8), IL-9 (ППК 0,8) и СРБ (ППК 0,8) (табл. 82). Вероятность эффективности использования инфликсимаба при лечении 159 РА рассчитывается по формуле: 1,6-0,013[IL-12]-0,026[IL-17]-0,18[ранг IL-9]0,02[СРБ]. Полученная величина измеряется в условных единицах. При ее значении: <0,45 вероятность применение данного ГИБП для лечения РА неэффективно; 0,45-0,74 вероятность клинического “ответа” составляет 67%; >0,74 – 100%. При проверке точности построенного прогноза методом ROCанализа, значение ППК составило 0,96 (ДИ: 0,0-0,1) (рис. 23). 160 Таблица 78 Динамика концентраций цитокинов у больных РА на фоне терапии ИНФ (n=11). IL-1β IL-1rа IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-9 IL-10 IL-12 IL-13 0 2,42 (2,07-16,48) 1999,69 (1340,24-7792,50) 68,28 (38,77-140,52) 6,752 (5,98-12,93) 0,92 (0,72-1,03) 517,03 (265,58-1043,82) 20,48 (4,40-78,58) 3,39 (2,71-4,87) 53,70 (28,56-112,88) 59,49 (37,25-133,28) 11,28 (4,68-20,40) 44,94 (32,88-77,85) недели 6 14 2,25 1,99 (2,19-3,07) (1,55-2,19)* 1438,83 884,81 (485,97-1695,15)* (387,54-1316,04)* 35,86 27,74 (23,48-56,45) (9,11-50,58)* 6,59 5,21 (5,09-6,63) (3,11-6,24)* 0,80 0,69 (0,73-1,00) (0,61-0,90) 140,22 121,09 (106,41-297,24)* (99,95-221,96)* 6,69 2,05 (3,13-15,94) (1,18-11,99) 2,43 2,53 (1,98-11,64) (1,08-6,18) 46,25 32,42 (26,57-71,61) (22,03-61,13) 37,53 30,14 (14,70-65,61)* (8,51-32,97)* 3,97 2,37 (1,21-7,40)* (1,21-3,34)* 29,82 37,40 (23,70-35,74)* (33,36-39,84) 24 1,95 (1,25-2,69) 1095,88 (575,26-2621,27)* 34,89 (18,46-68,38)* 6,19 (4,85-6,98)* 0,73 (0,65-1,24) 210,44 (108,00-315,42)* 7,00 (1,18-22,41) 2,90 (1,48-11,27) 30,46 (22,82-113,95) 33,49 (14,90-52,09)* 4,91 (1,21-9,42)* 42,04 (26,77-47,52) 161 недели Продолжение таблицы 78 0 6 14 24 11,60 4,76 4,86 6,83 (6,04-41,69) (2,72-9,30) (0,88-8,91)* (2,16-14,21)* IL-17 10,53 1,51 1,51 11,64 (1,51-16,16) (1,51-2,69) (1,51-12,27)* (1,51-17,17) Эотаксин 212,96 199,09 176,21 214,75 (195,56-522,68) (173,36-231,10) (97,62-267,07)* (212,96-229,99) FGF-2 36,04 4,95 4,95 27,54 (4,95-56,39) (4,95-4,95)* (4,95-33,82) (4,95-52,03) GM-CSF 768,72 412,64 355,76 466,16 (435,79-1124,43) (360,01-689,62) (246,05-445,85)* (238,44-598,57)* IFN-γ 1314,17 1267,43 747,34 1038,03 (942,78-3122,18) (765,98-1399,12) (585,04-1228,44)* (741,67-1797,86)* IP-10 3443,75 2120,59 1954,39 2250,65 (2803,35-4040,66) (1997,20-2394,81) (1385,9-2722,10)* (1748,63-3576,16)* MCP-1 29,76 22,53 16,98 24,91 (19,97-79,65) (18,51-24,13) (11,88-22,01) (14,69-29,43)* MIP-1α 9,29 7,57 6,06 6,72 (8,61-12,64) (5,75-10,15)* (4,35-8,39)* (4,76-7,57) MIP-1β 109,70 102,04 114,31 101,35 (84,45-142,81) (76,30-134,50) (56,77-140,45) (67,64-161,72) PDGF-ВВ 5839,55 5839,56 11332,63 5839,56 (5839,56-23231,83) (5839,56-5839,56) (5839,5-21105,67) (5839,56-5839,56) TNF-α 304,96 44,05 86,36 141,64 (149,92-1836,59) (11,64-315,73) (11,64-277,03)* (72,12-215,56)* VEGF 197,030 137,81 111,06 126,18 (116,95-296,51) (127,19-167,43) (56,68-157,42) (88,37-220,77) Концентрация цитокинов представлена в пг/мл, МЕ (25-75 перцентиль); *-р<0,05 относительно базального уровня IL-15 162 Таблица 79 % изменения (∆) концентрации цитокинов на фоне применения ИНФ у пациентов с РА (24 недели) Функциональные классы цитокинов Цитокины (∆) Провоспалительные IL-6 -59 TNF-α -54 IL-15 -41 Антивоспалительные IL-1rа -45 IL-10 -44 Th1 цитокины IL-2 -49 IL-12 -56 IFN-γ -21 Th2 цитокины IL-4 -25 Колониестимулирующие факторы GM-CSF -39 Хемокины IP-10 -35 MCP-1 -16 р<0,05 относительно базального уровня во всех случаях Таблица 80 Динамика концентраций цитокинов у больных РА при наличии клинического “ответа” после введения ИНФ (n=8) Недели 0 6 14 24 IL-1β 2,15(1,95-3,30) 2,25(2,19-3,07) 884,81(481,40-1989,90) 1,95(1,55-2,67) IL-1rа 1813,15(1470,62-3958,98) 1438,83(485,97-2840,85) 27,74(6,92-48,48)* 960,65(529,22-1899,99)* IL-2 63,84(37,36-76,79) 35,86(22,84-66,07) 5,77(4,07-6,28)* 31,18(11,59-68,28)* IL-4 6,55(5,92-7,78) 6,59(5,09-6,63) 0,76(0,63-0,95) 5,80(2,80-6,84) IL-5 0,88(0,69-0,94) † 0,80(0,61-1,00) 118,82(75,59-221,96) † 0,88(0,65-1,21) IL-6 430,24(300,53-807,45) 126,95(101,53-338,34)* 2,05(1,18-7,51)* 188,99(106,80-266,40)* 163 Недели Продолжение таблицы 80 0 6 14 24 IL-7 12,14(4,26-23,50) † 4,31(1,18-15,94) 2,53(1,48-4,59) 4,09(1,18-20,50) IL-8 3,07(2,64-3,52) † 2,57(2,03-11,64) 25,90(20,16-48,54) 2,44(1,55-7,12) IL-9 38,50(28,06-60,03) † 46,04(19,34-70,80) † 31,30(12,24-35,70) † 29,27(22,43-60,51) IL-10 52,94(24,55-69,54) 33,49(5,05-45,70) † 2,37(1,21-3,47)* 33,10(16,47-52,65)* IL-12 7,26(4,45-12,43) † 3,73(1,21-7,40)* 31,90(24,78-37,48)* 4,38(1,21-7,71)* IL-13 40,68(27,72-50,22) † 36,02(26,99-39,84) 5,65(0,88-9,25) 37,85(25,83-44,91) IL-15 10,52(6,43-14,41) 4,76(2,72-14,37) 1,96(1,51-12,97)* 4,85(1,52-13,17)* IL-17 9,06(1,51-12,63) 1,51(1,51-2,69) 201,10(159,22-294,34) 9,22(1,51-16,97) Эотаксин 206,03(195,88-265,22) 204,59(173,36-354,03) 18,56(4,95-34,08) 213,86(165,86-229,85) FGF-2 20,50(4,95-51,37) 4,95(4,95-4,95) 308,30(244,79-439,84) 43,54(16,25-57,27) GM-CSF 555,17(383,72-805,84) † 412,64(225,29-689,62) 747,34(644,13-1150,64)* 1025,59(842,22-1426,04)* IFN-γ 1261,26(1024,63-2221,97) 1267,43(765,98-1943,35) 1707,67(1333,15-2305,46)* 1977,87(1739,52-2924,80)* IP-10 3178,06(2708,83-3871,70) 2120,59(1793,25-2461,30) 18,24(12,14-24,36)* 15,97(14,44-28,28)* MCP-1 26,24(20,27-40,31) 22,53(18,51-29,86) 6,18(5,11-7,95) 6,86(5,43-10,62)* MIP-1α 9,21(8,18-10,00) 7,57(5,75-10,15) 114,31(59,44-142,68)* 99,83(65,67-134,15) MIP-1β 105,65(88,13-141,06) 102,04(68,48-142,03) 12895,70(5839,56-21319,52) 5839,56(5839,56-11476,78) PDGF-ВВ 5839,56(5839,56-22083,34) 5839,56(5839,56-5839,56) 86,36(11,64-216,28) 130,61(41,88-218,51) TNF-α 285,18(182,74-807,68) 44,05(11,64-700,28) 127,62(82,23-158,08)* 137,67(89,98-202,61)* VEGF 157,32(97,28-246,77) 129,96(71,85-158,73) 2,61(1,65-2,81) 3,15(1,75-3,55)* Концентрация цитокинов представлена в пг/мл, МЕ (25-75 перцентиль); *-р<0,05 относительно группы сравнения, †-по сравнения с лицами не “ответившими” на терапию 164 Таблица 81 Динамика клинико-лабораторных показателей у больных РА при отсутствии клинического “ответа” после введения ИНФ (n=3) IL-1β L-1rа IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-9 IL-10 IL-12 IL-13 IL-15 IL-17 Эотаксин FGF-2 GM-CSF IFN-γ IP-10 MCP-1 MIP-1α MIP-1β PDGF-ВВ TNF-α VEGF 0 19,67(2,43-33,49) 12555,10(372,47-21069,06) 239,43(38,77-304,02) 26,67(6,19-26,86) 2,32(0,93-18,32) 1349,02(265,59-2656,56) 109,05(78,58-117,19) 5,02(4,87-5,48) 112,88(112,88-190,41) 133,28(92,01-145,49) 39,92(14,41-90,38) 77,85(59,86-170,90) 41,69(4,54-69,24) 16,16(10,84-46,27) 522,68(165,60-1635,72) 38,85(20,52-133,65) 2482,69(804,67-2718,55) 5979,96(942,78-7138,66) 5632,82(3023,54-7939,41) 101,07(17,16-122,49) 13,53(9,09-34,47) 139,25(78,74-216,52) 5839,56(5839,56-27587,92) 2840,42(133,07-3553,04) 265,32(198,14-412,25) недели 6 14 1,85(1,42-2,27) 708,81(101,57-1316,04) 708,81(101,57-1316,04) 30,71(10,83-50,58) 30,71(10,83-50,58) 1,87(0,52-3,23) 1,87(0,52-3,23) 0,57(0,57-0,57) 0,57(0,57-0,57) 216,06(121,09-311,04) 216,06(121,09-311,04) 41,13(1,18-81,09) 41,13(1,18-81,090 3,40(0,28-6,52) 3,40(0,28-6,52) 95,82(66,28-125,35) 95,82(66,28-125,35) 16,16(8,51-30,14) 16,16(8,51-30,14) 1,94(1,21-2,66) 1,94(1,21-2,66) 24,42(23,70-25,15) 24,42(23,70-25,15) 2,72(0,88-8,91) 2,72(0,88-8,91) 1,51(1,51-1,51) 1,51(1,51-1,51) 86,08(74,55-97,62) 86,08(74,55-97,62) 4,95(4,95-4,95) 4,95(4,95-4,95) 430,46(415,08-445,8500 430,46(415,08-445,85) 865,73(503,03-1228,44) 865,73(503,03-1228,44) 2812,30(2722,10-2902,49) 2812,30(2722,10-2902,49) 10,95(3,88-18,02) 10,95(3,88-18,02) 1,38(0,97-10,330 1,38(0,97-10,33) 70,98(9,41-132,55) 70,98(9,41-132,55) 11332,63(8904,22-13761,04) 11332,63(8904,22-13761,04) 144,33(11,64-277,03) 144,33(11,64-277,03) 62,13(55,72-68,53) 62,13(55,72-68,530 5,24(5,24-5,24) 24 1,99(1,08-4,01) 2835,33(575,26-4101,88) 40,47(27,98-83,300 6,63(4,85-6,98) 0,69(0,61-3,55) 288,22(151,67-324,56) 15,99(5,38-33,120 4,37(1,08-35,920 113,95(26,34-120,36) 40,68(14,90-52,09) 5,57(1,21-9,420 42,04(26,77-49,150 11,13(8,05-14,21) 15,19(1,51-38,43) 218,29(214,75-242,51) 4,95(4,95-4,95) 1194,73(661,97-2114,05) 4883,67(2250,65-5858,83) 24,91(24,91-30,74) 5,74(4,76-6,72) 145,44(85,73-165,72) 5839,56(5839,56-5839,560 157,95(83,95-215,56) 96,71(88,37-276,70) 6,10(4,60-6,95) Концентрация цитокинов представлена в пг/мл, МЕ (25-75 перцентиль); *-р<0,05 относительно группы сравнения 165 Таблица 82 Коэффициенты прогностической модели эффективности применения ИНФ при РА. Нестандартизованные Стандартизованные коэффициенты коэффициенты Стандартная B ошибка β Константа α 1.644 0,271 IL-12 -0,013 0,018 -0,184 IL-17 -0,026 0,015 -0,377 IL-9 -0,018 0,019 -0,229 СРБ -0,020 0,018 -0,278 Рисунок 23 ROC-кривая для прогностической модели для оценке эффективности ИНФ у пациентов с РА 3.8.2. Прогнозирование эффективности химерных моноклональных антител к мембранному CD20-антигену В-клеток (ритуксимаба). Обследовано 34 пациента с РА (31 женщина и 3 мужчин; возраст: 49,0; 42,064,0лет). На 8 неделе терапии ритуксимабом (РТМ) у пациентов с РА наблюдалось снижение уровней СРБ, IgM РФ, IgA РФ, АЦЦП АМЦВ, на 16 СОЭ, СРБ, IgM РФ, IgA РФ, АМЦВ, на 24 – всех исследуемых маркеров (табл. 83). 166 Таблица 83 Динамика концентраций острофазовых показателей и аутоантител у больных РА на фоне терапии РТМ (n=34). недели 0 8 56 42 СОЭ (мм/ч) (37-62) (30-64) 20,4 16,7 СРБ (мг/л) (13,8-46,2) (7,0-27,4)* 165,7 90,2 IgM РФ (МЕ/мл) (45,8-520,8) (37,5-150,1)* 150,5 31,0 IgА РФ (Ед/мл) (28,5-408,8) (1,7-164,5)* 100,0 100,0 АЦЦП (Ед/мл) (31,3-100,0) (26,7-100,0)* 572,6 256,7 АМЦВ (Ед/мл) (135,6-1000,0) (71,2-1000,0)* 6,1 5,1 DAS28 (5,5-6,8) (4,0-5,5)* *-p<0,05 относительно базальных значений 16 26 (20-48)* 7,5 (3,5-18,0)* 62,9 (14,9-145,4)* 22,6 (3,6-80,6)* 100,0 (26,1-100,0) 356,3 (75,9-962,7)* 3,9 (3,3-4,4)* 24 26 (14-36)* 6,9 (3,6-20,2)* 58,7 (11,3-123,2)* 24,9 (0,8-134,7)* 100,0 (20,9-100,0)* 216,8 (61,6-852,7)* 3,5 (2,6-4,0)* На 8 неделе в группе лиц “ответивших” на терапию РТМ отмечено достоверное снижение: СРБ, IgM/IgA РФ, АМЦВ, на 16: СОЭ, СРБ, IgA РФ, АМЦВ, на 24: CОЭ, СРБ, IgM/IgA РФ, АМЦВ. Также у 20% IgM РФ – позитивных и 7% АЦЦП позитивных больных РА произошла отрицательная сероконверсия (табл. 84). Таблица 84 Динамика концентраций острофазовых показателей и аутоантител у больных РА при наличии “ответа” на терапию РТМ (n=32) СОЭ (мм/ч) СРБ (мг/л) IgM РФ (МЕ/мл) IgА РФ (Ед/мл) АЦЦП (Ед/мл) АМЦВ (Ед/мл) 0 56 (37-62) 20,7 (14,2-46,2) 174,0 (47,6-519,8) 150,5 (28,5-408,8) 100,0 (31,3-100,0) 572,6 (135,6-1000,0) недели 8 42 (30-54) 16,7 (7,0-27,5)* 90,2 (37,5-150,1)* 31,0 (1,7-164,5)* 100,0 (32,6-100,0) 256,7 (71,2-1000,0)* 16 26 (20-46)* 12,1 (3,5-18,9)* 174,0 (47,6-519,8) 22,6 (3,6-80,6)* 100,0 (49,2-100,0) 356,3 (75,9-962,7)* 24 27 (14-35)* 6,9 (3,6-22,2)* 58,7 (11,3-123,2)* 24,9 (0,8-134,7)* 100,0 (27,2-100,0) 216,8 (61,6-852,7)* 167 У пациентов с отсутствием клинического “ответа” на терапиию РТМ на 24 неделе применения препарата можно отметить тенденцию к снижению уровней СРБ, IgA РФ, АЦЦП, АМЦВ, и возрастанию концентрации IgM РФ (табл. 85). Таблица 85 Динамика концентраций острофазовых показателей и аутоантител у больных РА при отсутствии “ответа” на терапию РТМ (n=2) недели 0 8 16 24 СОЭ (мм/ч) 55,0 71,0 50,0 56,0 (50,-60,0) (66,0-76,0) (46,0-54,0) (40,0-72,0) СРБ (мг/л) 13,72 14,93 4,80 8,30 (7,74-19,7) (8,67-21,20) (3,60-6,00) (8,1-8,50) IgM РФ 60,65 68,25 58,15 82,45 (МЕ/мл) (44,00-77,30) (51,90-84,60) (41,00-75,30) (20,90-144,00) IgА РФ 218,2 34,4 26,7 45,5 (Ед/мл) (54,5-500,0) (12,2-336,5) (16,1-210,9) (2,3-368,7) АЦЦП 80,25 63,35 61,40 60,45( (Ед/мл) (60,50-100,00) (26,70-100,00) (22,80-100,00) 20,90-100,00) АМЦВ 298,7 127,8 127,5 110,9 (Ед/мл) (132,0-658,3) (62,7-284,7) (58,3-418,5) (54,9-449,0) На 8 неделе терапии РТМ у всех пациентов отмечено снижение уровней: IL-2,6,-7,-9,-15, GM-CSF, IFN-γ,IP-10,MCP-1,MIP-1α,MIP-1β и повышение концентрации IL-1ra; на 16: IL-1β,-1rа,-2,-4,-5,-6,-7,-9,-10,-12,-13,-15, FGF-2, GMCSF, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, TNF-α. На 24 неделе терапии РА с использованием РТМ, происходит снижение основных провоспалительных цитокинов: IL-6,-12,-15; IL-1ra, IL-10 обладающих антивоспалительной функцией; Th-1 цитокинов: IL-2, IFN-γ; Th-2 цитокинов: IL-4,-5,9; стромального и ангиогенного фактора FGF-2, колониестимулирующих факторов: IL-7 GM-CSF; хемокинов: IP-10; повышение уровня Th-17 цитокина IL-17 и ангиогенного фактора VEGF (табл. 86, 87). На 8 неделе терапии РТМ у пациентов с наличием клинического “ответа” отмечено снижение уровней: IL-1β,-1ra,-2,-6,-9, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1; на 16: IL-1β,-1rа,-2,-4,-5,-6,-7,-9,-10,-12,-13,-15, FGF-2, GM-CSF, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, TNF-α; на 24: IL-1β,-1rа,-2,-4,-5,6,-7,-9,-10,-12,-13,-15,-17, эотаксина, FGF-2, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, TNF-α (табл. 88). 168 Динамика концентраций цитокинов у больных РА на фоне терапии РТМ (n=34). IL-1β IL-1rа IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-9 IL-10 IL-12 IL-13 IL-15 IL-17 Эотаксин FGF-2 G-CSF GM-CSF IFN-γ IP-10 MCP-1 MIP-1α MIP-1β PDGF-ВВ TNF-α VEGF 0 0,19(0,01-6,91) 1456,20 (210,5-12017,17) 101,23 (20,65-415,7) 17,70 (3,5-45,98) 0,81(0,01-4,11) 217,34 (82,37-553,41) 32,50 (5,32-118,72) 22,70 (7,35-50,82) 384,92 (131,48-1110,89) 81,30 (36,87-243,6) 15,97(3,18-107,28) 93,52(19,86-249,39) 25,73 (9,8-108,5) 47,82 (12,6-155,44) 790,94 (349,48-1265,46) 41,18 (9,91-71,56) 0,01 (0,01-3,27) 417,71(101,97-20038,91) 4461,59 (749,26-7847,71) 7013,12 (3494,97-13748,41) 149,52(46,61-514,44) 37,07 (23,27-88,11) 408,00 (201,17-844,24) 42491,11 (40514,10-60538,8) 78,25 (0,01-658,26) 510,54 (299,94-2421,50) недели 8 0,03(0,01-1,38) 1461,01 (224,36-5824,15)* 105,48 (25,21-195,53)* 21,28 (3,83-33,06) 0,42 (0,01-2,25) 117,53 (44,15-240,45)* 35,37 (2,13-78,35) 26,20 (9,23-86,49) 246,72 (95,88-524,46)* 104,53 (23,5-172,31) 15,23 (2,43-79,84) 78,78 (14,47-189,98) 19,32 (7,16-101,74)* 53,38 (16,08-116,05) 859,37 (382,34-1332,91) 38,31 (11,55-64,41) 0,00 (0,01-0,01) 274,20 (144,19-1306,14)* 3162,92 (856,86-7358,89)* 5850,55 (2343,21-9845,67)* 164,81 (45,67-252,24)* 28,56 (18,02-56,38) * 723,98 (207,8-925,53) 45591,39 (42491,00-64783,58) 115,61 (0,01-619,95) 800,63(244,62-2667,14) 16 0,02(0,01-1,2)* 739,6 (179,3-597,9)* 50,3 (28,3-153,9)* 15,3(3,6-27,3)* 0,5(0,01-1,9)* 54,7 (19,9-136,8)* 17,3 (3,6-53,0)* 34,3 (12,8-87,5) 182,5 (57,0-450,0)* 77,4 (37,9-122,5)* 11,5 (3,8-33,7)* 62,9 (24,6-135,7)* 11,1 (4,9-53,6)* 58,8(12,0-116,7) 680,9 (405,5-1034,9) 30,1 (7,7-55,7)* 0,01 (0,01-0,01) 210,4 (107,8-772,7)* 1880,8(1126,8-4218,0)* 5803,9(3149,2-10758,8) 83,8 (40,7-234,5)* 27,9 (20,1-44,3)* 533,7 (300,3-929,1)* 43653,1(42491,1-62644,3) 98,9 (0,01-336,2)* 656,9 (200,5-2047,4) Таблица 86 24 0,01(0,01-0,94) 676,02 (150,17-2200,46)* 38,15 (15,88-144,22)* 13,19 (2,39-26,47)* 0,38 (0,01-1,035)* 64,26 (15,89-145,7)* 7,67 (1,99-45,48)* 26,76(10,57-50,56) 173,11 (52,94-434,45)* 50,98 (23,98-107,89)* 8,07 (1,33-44,16)* 41,12 (11,36-138,18) 10,07 (3,92-44,54)* 33,53(10,38-106,43)* 584,06(298,34-1179,70) 22,84 (11,81-51,28)* 0,01 (0,01-0,01) 236,34 (87,60-535,01)* 1376,28 (498,19-4665,86)* 4800,42 (2313,70-9387,53)* 90,81 (40,39-221,24)* 28,02 (18,11-41,83)* 437,21 (255,50-908,37) 42491,11 (42491,11-57837,03) 48,99 (0,01-354,43)* 605,01(208,05-1564,65) Концентрация цитокинов представлена в пг/мл, МЕ (25-75 перцентиль); *-р<0,05 относительно базального уровня 169 % изменения (∆) концентрации цитокинов на фоне применения РТМ у пациентов с РА (24 недели) Функциональные классы цитокинов Цитокины (∆) Провоспалительные IL-1β -95 IL-6 -71 IL-15 -69 IL-12 -42 TNF-α -37 Антивоспалительные IL-1rа -56 IL-10 -37 Th1 цитокины IFN-γ -69 IL-2 -65 Th2 цитокины IL-9 -55 IL-5 -50 IL-4 -25 Th17 цитокины IL-17 +14 Колониестимулирующие факторы GM-CSF -46 IL-7 -74 Стромальные и ангиогенный факторы FGF -45 VEGF +26 Хемокины IP-10 -26 Таблица 87 170 Динамика концентраций цитокинов у больных РА при наличии “ответа” на терапию РТМ (n=32) IL-1β IL-1rа IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-9 IL-10 IL-12 IL-13 IL-15 IL-17 Эотаксин FGF-2 G-CSF GM-CSF IFN-γ IP-10 MCP-1 MIP-1α MIP-1β PDGF-ВВ TNF-α VEGF 0 0,19 (0,01-7,05) 1677,36(326,34-17879,40) 110,77(33,01-432,70) 19,98(3,61-47,82) 0,81(0,01-2,30) 217,34(82,27-553,41) 32,49(5,32-118,72) 22,70(7,35-45,98) 441,64(131,48-1672,56) 103,01(36,87-279,16) 15,97(3,18-141,76) 114,89(19,86-253,05) 31,16(10,23-140,06) 47,82(15,25-155,44) 838,40(367,42-1367,98) 42,16(9,91-72,95) 0,01(0,01-3,27) 528,41(142,23-2569,07) 5689,66(862,38-9638,29) 6585,69(2602,73-13748,41) 125,29(46,61-397,51) 38,96(23,27-88,11) 570,50(201,17-844,24) 42491,11(40514,10-58640,19) 168,15(0,01-1011,69) 571,38(302,21-2421,50) Недели 8 16 0,11(0,01-1,48)* 0,01(0,01-1,19)* 1533,82(356,95-5824,15)* 866,85(283,61-871,79)* 107,00(32,30-195,53)* 50,34(31,18-181,42)* 20,13(3,83-33,06) 19,49(3,88-27,32)* 0,45(0,01-2,25) 0,49(0,01-1,13)* 116,09(44,15-237,01)* 57,73(21,49-150,23)* 31,61(2,13-76,37) 17,31(3,59-50,92)* 22,47(8,42-86,49) 36,97(13,69-103,28) 272,75(113,10-524,46)* 182,47( 51,81-450,07)* 101,91(23,51-172,31) 82,12(41,85-122,52)* 14,86(2,43-79,84) 12,72(3,83-37,35)* 67,02(17,47-187,70) 73,34(26,59-135,75)* 21,02(8,47-101,740) 13,82(6,01-66,64)* 50,27(16,08-111,60) 73,98(12,82-116,69) 865,91(392,34-1332,91) 723,46(430,25-1091,45) 37,22(11,55-64,41) 30,81(12,89-55,69)* 0,01(0,01-0,01)* 0,01(0,01-0,01) 330,94(163,25-1306,14)* 236,01(107,83-780,20)* 3296,80(856,86-7358,89)* 2165,86(1248,43-4495,60)* 5959,72(2343,21-9845,67)* 5803,89(3438,61-10644,94) 130,36(45,67-252,24)* 75,52(40,50-234,50)* 28,52(18,02-56,38) 27,89(21,05-40,97)* 649,60(207,80-925,53) 645,76(300,32-954,23)* 44171,43(42491,11-58944,18) 45246,02(42491,11-62644,31) 114,80(0,01-619,95) 101,27(0,01-428,37)* 777,79(244,62-2630,22) 720,03(244,26-1894,55) Таблица 88 24 0,01(0,01-1,30)* 754,00(134,72-2561,30)* 46,88(14,72-147,99)* 16,28(2,52-28,01)* 0,36(0,01-0,94)* 73,12(18,73-147,54)* 8,60(1,80-47,05)* 26,77(10,87-55,27) 162,38(45,84-397,17)* 66,08(25,43-111,11)* 9,27(1,38-45,17)* 57,75(14,03-141,94)* 12,37(3,64-48,28)* 54,67(11,18-107,17)* 625,30(310,40-1229,29) 20,34(10,89-50,95)* 0,01(0,01-0,01) 236,34(79,03-466,55)* 1702,74(925,35-5901,50)* 4800,42(2305,10-10709,22)* 92,45(40,78-229,14)* 28,02(18,36-39,35)* 458,47(264,51-910,69)* 42491,11(42491,11-57235,93) 63,94(0,01-381,15)* 668,35(241,82-1664,56) Концентрация цитокинов представлена в пг/мл, МЕ (25-75 перцентиль); *-р<0,05 относительно базального уровня 171 Динамика концентраций цитокинов у больных РА при отсутствии “ответа” на терапию РТМ (n=2) IL-1β IL-1rа IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-9 IL-10 IL-12 IL-13 IL-15 IL-17 Эотаксин FGF-2 G-CSF GM-CSF IFN-γ IP-10 MCP-1 MIP-1α MIP-1β PDGF-ВВ TNF-α VEGF 0 0,20(0,0-0,40) 2272,10(84,55-4459,62) 100,32(8,63-192,01) 2,08(0,66-3,50) 38,62(0,44-76,80) 226,87(43,51-410,23) 22,79(1,08-44,49) 7,45(5,56-9,34) 275,39(178,67-372,12) 34,74(7,07-62,41) 41,86(0,29-83,43) 33,91(6,36-61,46) 31,20(4,09-58,32) 8,01(3,93-12,08) 275,94(45,93-505,95) 25,92(0,01-51,83) 0,01(0,01-0,01) 599,76(59,27-1140,24) 1112,63(97,14-2128,12) 5915,67(3494,97-8336,37) 101,05(29,20-172,90) 19,59(12,90-26,28) 226,97(138,70-315,24) 32889,49(23287,87-42491,11) 35,62(0,01-71,23) 78,27(56,17-100,36) Недели 8 16 0,10(0,00-0,20) 0,60(0,00-1,10) 1201,87(76,76-1498,56) 1201,90(68,98-2334,76) 100,32(12,83-60,22) 100,63(100,25-101,00) 1,96(0,90-2,32) 1,96(1,15-2,77) 3,57(0,42-4,54) 3,58(0,40-6,75) 38,05(7,11-40,945) 38,05(10,64-65,46) 4,64(1,09-5,30) 4,64(1,10-8,18) 7,45(5,24-7,52) 5,62(5,52-5,71) 275,395(104,57-289,05) 132,51(59,04-205,98) 22,35(10,85-26,08) 22,35(14,64-30,06) 5,6(0,59-5,87) 5,60(1,29-9,91) 11,53(7,29-11,795) 11,54(9,60-13,47) 12,41(3,28-14,84) 12,41(2,47-22,35) 7,72(4,06-8,33) 7,72(4,85-10,60) 222,11(63,39-324,39) 193,41(80,85-305,96) 25,92(0,94-41,00) 16,02(1,87-30,18) 0,01(0,01-0,01) 0,01(0,01-0,01) 413,53(51,22-693,67) 413,53(43,17-783,89) 629,86(86,78-726,06) 629,86(76,43-1183,29) 3825,495(2426,265-4205,6) 2806,37(2530,22-3082,52) 85(34,52-72,85) 85,00(67,55-102,45) 19,59(9,315-22,99) 14,84(9,98-19,70) 242,7(122,87-345,03) 310,46(135,16-485,76) 42491,11(32889,49-42491,11) 42491,11(42491,11-42491,11) 24,985(0,01-28,37) 91,00(37,915-127,13) Концентрация цитокинов представлена в пг/мл, МЕ (25-75 перцентиль) 24,98(0,01-49,96) 111,19(47,73-174,66) Таблица 89 24 0,00(0,00-0,00) 637,10(611,84-662,36) 18,24(17,04-19,44) 1,55(1,23-1,87) 1,59(0,84-2,33) 10,00(3,58-16,43) 2,31(2,19-2,43) 17,55(4,97-30,13) 1474,12(150,10-2798,14) 19,06(16,02-22,11) 1,36(0,89-1,83) 9,17(8,22-10,12) 6,43(5,52-7,33) 5,13(4,19-6,07) 222,11(101,40-342,82) 290,51(28,35-552,66) 0,01(0,01-0,01) 392,99(182,51-603,46) 239,35(209,87-268,83) 3825,49(2322,31-5328,68) 41,55(39,84-43,26) 281,76(8,65-554,86) 242,70(110,58-374,82) 100545,58(42491,1158600,04) 3,40(0,01-6,78) 91,00(28,10-153,90) 172 На основании полученных данных, наиболее “сильными” факторами для прогнозирования эффективности ритуксимаба являются: VEGF (ППК 0,99), IL-1ra (ППК 0,7), IL-10 (ППК 0,8), G-CSF (ППК 0,7) и IgM РФ (ППК 0,8) (табл. 90). Вероятность эффективности использования ритуксимаба при лечении РА рассчитывается по следующей формуле: 0.476548+0.019466[VEGF]+0.006344[IL-1ra]-0.014647[IL-10]-0.003740[GCSF]+0.004561[IgM РФ]. Полученная величина измеряется в условных единицах. При ее значении: <0,67 вероятность применение данного ГИБП для лечения РА не эффективно; >0,67 – вероятность клинического “ответа” на лечение теоретически составляет 97%. При проверке точности построенного прогноза методом ROC-анализа, значение ППК составило 0,99 (ДИ: 0,9-1,0 )(рис. 24). Таблица 90 Коэффициенты прогностической модели эффективности применения РТМ при РА. Нестандартизованные Стандартизованные коэффициенты коэффициенты Стандартная B ошибка β Константа α 0,019466 0,004 1,276 VEGF 0,006344 0,003 0,414 IL-1ra -0,014647 0,005 0,956 IL-10 -0,003740 0,003 0,296 G-CSF 0,004561 0,006 0,167 IgM РФ 0,019466 0,004 1,276 173 Рисунок 24 ROC-кривая для прогностической модели оценки эффективности РТМ у пациентов с РА 3.8.3 Прогнозирование эффективности гуманизированных моноклональных антител к рецепторам IL-6 (тоцилизумаба). Обследовано 43 пациента с РА (33 женщинs и 10 мужчин; возраст: 51,0; 43,055,0 лет). На 4 неделе терапии ТЦЗ у пациентов с РА наблюдалось снижение уровней CОЭ, СРБ, IgM РФ, АМЦВ, MMP-3; на 8 - СОЭ, СРБ, IgM РФ, IgA РФ, АЦЦП, АМЦВ, на 24 – всех исследуемых маркеров, исключая АЦЦП (табл. 91). На 4 неделе терапии тоцилизумабом у пациентов с “хорошим эффектом” применения препарата наблюдалось снижение уровней CОЭ, СРБ, IgM РФ, АМЦВ, MMP-3; на 8 - СОЭ, СРБ, IgM РФ, IgA РФ, АМЦВ, на 24 – всех исследуемых маркеров, исключая АЦЦП (табл. 92). На 4 неделе терапии ТЦЗ у пациентов с “умеренным эффектом” применения препарата наблюдалось снижение уровней CОЭ, СРБ, IgM РФ, IgM РФ; на 8 СОЭ, СРБ, IgM РФ, IgA РФ, АМЦВ, на 24 – всех исследуемых маркеров, исключая АЦЦП и ММP-3 (табл. 93). 174 Таблица 91 Динамика концентраций острофазовых показателей, аутоантител и MMP-3 у больных РА на фоне терапии ТЦЗ (n=42). Биомаркеры СОЭ (мм/ч) СРБ (мг/л) IgM РФ (МЕ/мл) IgА РФ (Ед/мл) АЦЦП (Ед/мл) АМЦВ (Ед/мл) MMP-3 (нг/мл) DAS28 0 41(30-70) 36,4 (19,2-62,7) 262,0 (95,3-663,0) 342,5 (106,9-89,9) 366,8 (76,9-500,0) 770,5(190,7-2393,1) 42,5(19,5-66) 6,4 (5,9-7,0) Недели 4 8 10 (6-16)* 6 (4-10)* 0,8 (0,4-2,4)* 0,5 (0,2-0,9)* 95,5 (28,2-233,0)* 177,5 (58,0-62,0)* 82,9 (42,5-343,1)* 183,0 (88,0-475,3) 500,0 (84,4-500,0)* 409,5 (101,7-00,0) 266,7(85,8-927,0)* 312,2(81,2-925,5)* 19,3(10,2-21,6)* 4,2 (3,7-4,9)* 3,2 (2,6-3,6)* *-p<0,05 относительно базальных значений 24 4 (3-8)* 0,4 (0,2-0,9)* 90,8 (20,0-336,0)* 64,1 (19,6-316,9)* 355,7 (39,8-500,0) 134,7 (27,0-62,1)* 12,4(7,8-17,9)* 2,1 (1,3-2,8)* Таблица 92 Динамика концентраций острофазовых показателей, аутоантител и MMP-3 у больных РА с “хорошим эффектом” на фоне терапии ТЦЗ (n=35) Биомаркеры СОЭ (мм/ч) СРБ (мг/л) IgM РФ (МЕ/мл) IgА РФ (Ед/мл) АЦЦП (Ед/мл) АМЦВ (Ед/мл) MMP-3 (нг/мл) 0 36 (30-70) 33,5 (17,8-56,6) 261,0 (68,9-663,0) 347,2 (74,3-749,0) 200,8 (51,5-500,0) 762,3(106,9-2393,1) 42,5 (16,0-66,0) Недели 4 8 10 (6-15)* 5 (4-6)* 0,5 (0,3-1,7)* 0,4 (0,2-0,7)* 166,0 (32,0-59,0)* 94,6 (20,0-233,0)* 200,5(49,1-450,5) 77,8 (40,2-312,6)* 303,2 (57,2-500,0) 252,6 (44,7-500,0) 219,7(75,2-960,3)* 233,3(57,3-853,3)* 19,3 (10,2-21,6)* - *-p<0,05 относительно базальных значений 24 4 (2-6)* 0,2 (0,2-0,8)* 84,1 (17,5-309,0)* 63,9 (18,6-329,1)* 240,6 (19,5-500,0) 130,8 (17,3-24,9)* 15,2 (9,4-19,4)* Таблица 93 Динамика концентраций острофазовых показателей, аутоантител и MMP-3 у больных РА с “умеренным эффектом” на фоне терапии ТЦЗ (n=7) СОЭ (мм/ч) СРБ (мг/л) IgM РФ (МЕ/мл) IgА РФ (Ед/мл) АЦЦП (Ед/мл) АМЦВ (Ед/мл) MMP-3 (нг/мл) 0 66 (50-86) 47,2 (31,5-112,0) 399,2 (177.0-744,0) 161,1(153,2-2261,0) 403,2 (295,7-500,0) 803,7(598,7-1233,4) 67,0 (57,5-107,0) Недели 4 8 24 16 (8-25) * 8 (5-10)* 12 (6-24)* 1,9 (1,3-31,0)* 0,7 (0,6-1,9)* 1,5 (0,9-12,4)* 217,0 (99,9-28,0)* 107,0 (46,0-398,0)* 317,0 (50,5-48,0)* 64,9 (37,7-233,4)* 142,7(126,8-36,2)* 88,1(62,7-461,2)* 500,0 (300,5-00,0) 500,0(500,0-00,0) 500,0 (297,0-00,0) 462,0(313,5-890,2) 300,0(191,6-65,4)* 464,4(42,1-1000,0)* 9,8 (5,9-12,9) 15,6 (9,7-21,5) *-p<0,05 относительно базальных значений 175 На 4, 8, 24 неделях терапии ТЦЗ у пациентов отмечено снижение уровней всех исследуемых цитокинов (исключая IL-6 -4 неделя, IL-1ra на 8 и 24 неделях) (табл. 94, 95). На 4, 8, 24 неделях терапии тоцилизумабом у пациентов с “хорошим эффектом” применения препарата наблюдалось снижение уровней всех исследуемых цитокинов, исключая IL-1rа и IL-6 на 4 неделе (табл. 96). На 4 неделе терапии ТЦЗ у пациентов с “умеренным эффектом” применения препарата наблюдалось снижение уровней IL-2,-5,-7,-13, FGF-2, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1, MIP-1α, VEGF; на 8 - IL-1β, IL-4,-5,-6,-7,-10,-13, эотаксина, FGF-2, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1, MIP-1α, VEGF, на 24 – IL-4,-5,-6,-7,-8,-9,-10,-13, FGF-2, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1,MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, VEGF (табл. 97). С целью выбора оптимальной панели биомаркеров для оценки эффективности применения ТЦЗ для лечения РА был проведен пошаговый линейный регрессионный анализ базальных концентрация группы биомаркеров. В качестве возможных предикторов клинического “ответа” на препарат тестировали: аутоантитела: IgM РФ, АЦЦП, АМЦВ, лабораторные маркеры воспаления: СОЭ, СРБ, цитокины: IL-1β, -1ra, -2, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -12, -13, -15, -17, FGF-2, эотаксин, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, PDGF-ВВ, RANTES, TNF-α, VEGF и протеолитического фермента, участвующего в деградации хряща: матриксной металлопротеиназы-3 (ММП-3). 176 Цитокины IL-1β IL-1rа IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-9 IL-10 IL-12 IL-13 IL-15 IL-17 Эотаксин FGF-2 G-CSF GM-CSF IFN-γ IP-10 MCP-1 MIP-1α MIP-1β TNF-α VEGF Динамика концентраций цитокинов у больных РА на фоне терапии ТЦЗ (n=34). 0 7,9 (2,9-29,4) 77,1 (45,4-118,9) 22,3 (9,1-70,1) 23,4 (21,3-29,1) 5,2(2,7-19,3) 176,8(106,1-462,3) 52,6(38,3-121,9) 43,0(29,7-86,8) 172,8(42,5-454,1) 10,7(6,2-29,0) 115,6 (57,7-178,6) 31,9 (23,7-69,4) 15,7 (3,6-68,6) 101,2(90,1-118,6) 234,2(146,7-455,4) 521,5 (42,-81,6) 0,01(0,01-9,2) 176,2(81,7-434,9) 1838,2 (961,1-7781,1) 24148,2(16915,3-2123,6) 168,2(91,7-316,5) 9,7(7,3-14,8) 194,6(159,0-245,8) 136,9(60,6-641,2) 2229,4(1272,9-4197,3) Недели 4 8 2,5(0,01-9,1)* 0,01(0,01-0,01)* 70,3 (55,1-94,7)* 73,6(55,0-109,3) 14,2(4,7-55,0)* 7,9(0,01-57,0)* 19,2(15,2-21,9)* 16,6 (15,1-18,7)* 2,4 (0,01-3,9)* 0,01(0,01-0,01)* 165,9(107,4-333,6) 97,4 (36,7-208,5)* 21,7(12,9-33,4)* 0,01(0,01-19,3)* 24,4(17,0-56,6)* 9,6 (4,7-17,4)* 111,3(47,3-292,1)* 69,7(46,1-201,4)* 3,4(0,01-6,8)* 0,01(0,01-6,5)* 47,9(24,7-112,3)* 43,1 (6,5-73,9)* 14,4(2,5-25,8)* 0,1(0,01-5,4)* 0,01(0,01-35,7)* 0,01 (0,01-0,01)* 81,8(59,5-97,1)* 61,9(56,0-71,2)* 178,4(104,7-270,0)* 116,5(73,4-185,4)* 40,7 (34,2-63,4)* 36,3 (26,9-52,4)* 0,01(0,01-0,01)* 0,01(0,01-0,01)* 78,6 (37,5-242,3)* 45,2(0,01-137,1)* 933,7(422,8-2703,8)* 386,6(197,7-768,6)* 10597,6(647,6-19884,2)* 532,8(349,3-987,3)* 149,6(79,3-227,2)* 112,6(74,3-203,8)* 6,9(2,8-8,3)* 0,01 (0,01-0,8)* 130,4 (102,2-170,4)* 111,1 (72,2-138,1)* 80,2 (29,8-273,4)* 45,4(5,2-213,2)* 332,1(220,3-772,9)* 159,5 (81,9-317,5)* Концентрация цитокинов представлена в пг/мл, МЕ (25-75 перцентиль); *-р<0,05 относительно базального уровня 24 1,4 (1,3-11,0)* 73,4(54,1-82,9) 12,7 (2,7-25,3)* 10,4 (9,9-11,2)* 1,8(1,6-2,4)* 33,5(21,5-91,6)* 10,0 (7,2-12,2)* 13,2(10,9-18,9)* 36,6(23,1-134,1)* 3,2(2,6-4,8)* 24,9(13,9-44,7)* 10,9(5,7-21,5)* 2,1(0,01-9,6)* 36,4(32,2-42,6)* 200,9(120,3-260,4)* 18,7(15,3-26,6)* 17,8(14,8-22,9)* 22,4(0,01-96,4)* 177,1(115,2-441,8)* 1238,3(865,8-1717,4)* 51,1 (36,7-116,7)* 3,8(3,5-4,6)* 81,6(59,5-116,6)* 29,1 (12,1-85,1)* 218,2(124,0-413,3)* Таблица 94 177 % снижения (∆) концентрации цитокинов на фоне применения ТЦЗ пациентов с РА (24 недели) Функциональные классы цитокинов Цитокины ∆ Провоспалительные IL-15 -87 IL-1b -82 IL-6 -81 TNF-α -79 IL-12 -78 Антивоспалительные IL-10 -70 IL-13 -66 Th1 цитокины IFN-γ -89 IL-2 -43 Th2 цитокины IL-9 -79 IL-5 -65 IL-4 -56 Эотаксин -14 Th17 цитокины IL-17 -64 Колониестимулирующие факторы GM-CSF -87 IL-7 -81 Стромальные и ангиогенный факторы FGF -96 VEGF -90 Хемокины IP-10 -95 MCP-1 -70 IL-8 -69 MIP-1а -61 МIP-1b -58 Таблица 95 178 Таблица 96 Динамика концентраций цитокинов у больных РА при наличии “хорошего ответа” на терапию ТЦЗ (n=29) Цитокины IL-1β IL-1rа IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-9 IL-10 IL-12 IL-13 IL-15 IL-17 Эотаксин FGF-2 G-CSF GM-CSF IFN-γ IP-10 MCP-1 MIP-1α MIP-1β TNF-α VEGF 0 7,9 (2,9-29,4) 77,1(45,4-101,9) 22,3(9,9-70,1) 23,3 (21,6-28,4) 5,2(2,7-19,3) 176,8(106,1-462,3) 52,6(35,3-121,9) 43,0(29,7-86,8) 148,0 (63,7-484,9) 9,2(6,2-29,0) 90,8(54,9-178,6) 31,9(23,5-69,4) 16,1 (6,4-68,6) 106,4 (93,5-115,1) 224,9 (147,9-55,4) 52,5(43,2-66,8) 0,01(0,01-9,2) 176,2(83,4-434,9) 1511,9(961,1-781,1) 24194,9 (18976,7-30963,1 185,6 (124,9-316,5) 9,7(7,6-14,8) 191,7 (166,9-245,8) 164,1(61,2-641,2) 1874,5(1272,9-3763,6) Недели 4 8 2,2 (0,01-7,8)* 0,01(0,01-0,01)* 69,0(53,2-94,7) 63,5 (55,0-102,0) 13,4 (1,9-65,9)* 5,9(0,01-52,4)* 18,6(14,9-21,6)* 16,5 (14,8-18,7)* 2,2(0,01-3,8)* 0,01 (0,01-0,01)* 163,6 (106,1-303,8) 103,4(39,1-208,5)* 19,3(6,3-31,9)* 0,01(0,01-12,6)* 24,3(14,9-51,3)* 8,9 (4,9-16,9)* 110,6 (46,4-255,8)* 63,2(46,1 -157,2)* 2,7(0,01-5,4)* 0,01(0,01-1,7)* 44,5(20,6-87,4)* 36,2 (2,1-73,9)* 10,6(1,8-25,4)* 0,1(0,01-5,4)* 0,01(0,01-39,6)* 0,01(0,01-0,01)* 75,8 (56,7-98,2)* 61,4(56,0-67,3)* 171,6 (109,1-239,7)* 114,7(73,4-85,4)* 41,5 (32,3-68,9)* 36,1(26,6-50,2)* 0,01(0,01-0,01)* 0,01(0,01-0,01)* 67,3 (32,7-240,8)* 36,4(0,01-147,1)* 813,8(390,0-3050,0)* 401,6(192,3-766,1)* 6591,4(496,1-18716,4)* 538,4(349,3-987,3)* 152,9 (80,5-197,7)* 124,7(74,3-203,8)* 6,7(1,9-7,9)* 0,01(0,01-0,8)* 128,4 (89,1-171,3)* 111,2(67,5-38,1)* 85,0 (27,9-292,1)* 51,5 (5,2-205,9)* 331,2(205,4-556,2)* 152,5(90,7-317,5)* 24 1,7(1,3-11,0)* 73,4(54,1-82,9) 13,5(2,2-25,3)* 10,3(9,9-10,9)* 1,8(1,6-2,4)* 33,9(21,5-91,6)* 9,9(7,2-11,9)* 12,9(10,9-18,9)* 32,5(23,2-102,9)* 2,9 (2,4-4,1)* 23,7(12,7-44,7)* 10,5(5,6-17,3)* 2,2(0,01-9,6)* 36,4(32,2-41,3)* 203,2(120,3-260,7)* 18,7(15,3-24,6)* 17,9 (14,8-22,9)* 21,7(0,01-96,3)* 177,1 (116,9-285,6)* 1237,8(939,1-717,4)* 56,9(38,4-116,7)* 3,8(3,5-4,2)* 81,1 (56,4-116,6)* 33,1 (12,1-85,1)* 208,8 (123,1-413,3)* Концентрация цитокинов представлена в пг/мл, МЕ (25-75 перцентиль); *-р<0,05 относительно базального уровня 179 Таблица 97 Динамика концентраций цитокинов у больных РА при наличии “удовлетворительного ответа” на терапию ТЦЗ (n=5) Цитокины IL-1β IL-1rа IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-9 IL-10 IL-12 IL-13 IL-15 IL-17 Эотаксин FGF-2 G-CSF GM-CSF IFN-γ IP-10 MCP-1 MIP-1α MIP-1β TNF-α VEGF 0 7,9 (3,9-11,3) 118,9 (77,1-348,5) 31,7 (21,1-47,9) 28,4 (22,0-29,4) 5,2 (4,9-8,3) 213,2 (201,7-278,5) 51,1(49,4-65,3) 45,6(34,9-61,2) 270,5(242,6-272,2) 10,7(10,6-13,9) 172,3 (124,6-172,8) 35,8(31,2-37,9) 6,0(0,01-27,6) 100,3(90,0-189,7) 257,9(235,9-289,3) 53,6 (42,6-82,6) 0,1 (0,01-8,4) 183,9 (81,7-307,8) 2669,6 (2538,8-2702,2) 21782,7(12633,5-8457,0) 134,6(80,9-272,1) 11,5 (9,5-11,9) 227,3 (204,8-234,1) 109,2(64,8-150,1) 4197,3(2296,6-8185,7) Недели 4 3,5(3,0-10,4) 77,1 (69,0-118,9) 25,5 (9,8-44,2)* 21,6 (20,9-26,6) 3,9(2,5-3,9)* 352,2 (119,7-476,8) 28,5(26,6-34,9)* 39,3(23,1-96,6) 177,7 (106,4-328,4) 7,6(6,1-7,9) 93,9(50,6-135,7) 24,4(20,9-27,5)* 0,01(0,01-31,7) 90,1(87,6-93,5) 185,3(90,9-300,3) 39,8(37,2-45,9)* 0,01(0,01-0,1) 95,0(53,7-243,8)* 2274,7(1354,7-2357,6) 13746,1(8233,3-25524,2) 84,4(62,4-338,4) 7,3 (6,1-10,9)* 158,6 (144,2-169,5) 72,2(35,5-120,4) 898,4(325,4-1564,4)* 8 0,01 (0,01-0,01)* 109,3(98,4-123,4) 29,9 (0,01-59,9) 17,9 (16,9-19,4)* 0,01(0,01-0,01)* 91,4 (29,6-180,4)* 4,7(0,9-47,9)* 16,3 (3,1-31,4) 136,8(105,4-333,0) 0,01(0,01-6,5)* 60,3 (55,6-68,8) 0,01(0,01-2,8)* 0,01(0,01-0,01) 69,9(59,4-79,0)* 117,2(115,7-176,3)* 44,1(29,1-52,4)* 0,01(0,01-0,01) 53,9(32,2-99,1)* 371,5(292,4-1173,8)* 527,2(392,9-968,3)* 83,1 (78,0-181,7)* 0,01(0,01-0,01)* 108,7 (100,9-120,2) 23,8 (8,0-213,2) 270,7(81,7-283,9)* Концентрация цитокинов представлена в пг/мл, МЕ (25-75 перцентиль); *-р<0,05 относительно базального уровня 24 1,8(1,3-3,5) 73,4 (73,4-102,0) 12,0 (7,3-25,3) 10,5(10,2-14,7)* 1,9 (1,5-2,1)* 27,6(27,3-57,9)* 12,2 (8,4-12,5)* 13,8(12,2-14,1)* 86,9(75,3-165,4)* 4,8 (3,3-4,9)* 27,3 (25,6-46,6) 11,3(8,7-21,5)* 1,0(0,8-3,6) 40,7(33.4-47,1)* 193,3 (135,0-211,5) 23,4(17,9-26,6)* 15,7(15,23-23,6) 23,1(9,0-74,6)* 173,9 (113,5-441,8)* 1318,9(865,8-1327,2)* 35,6(34,1-68,5)* 4(3,9-5,3)* 91,7(64,2-103,2)* 18,7(17,7-48,7)* 258,3(213,8-291,4)* 180 На основании полученных данных, наиболее “сильными” факторами для прогнозирования эффективности ТЦЗ являются: ММП-3 (ППК 0,7), АЦЦП (ППК 0,7) и VEGF (ППК 0,7) (табл. 98). Вероятность эффективности использования тоцилизумаба при лечении РА рассчитывается по следующей формуле: 0,36+0,011[ММП-3]+0,008[АЦЦП]+0,008[VEGF]. Полученная величина измеряется в условных единицах. При ее значении: <1,05 вероятность применение данного ГИБП для лечения РА неэффективно; 1,05-1,3 вероятность клинического “ответа” составляет 15%; >1,4 – 38%. При проверке точности построенного прогноза методом ROC-анализа, значение ППК составило 0,85 (ДИ: 0,7-1,0) (рис. 25). Таблица 98 Коэффициенты прогностической модели эффективности применения ТЦЗ при РА. Нестандартизованные Стандартизованные коэффициенты коэффициенты Стандартная B ошибка β Константа α 0,011 0,006 0,309 ММП-3 0,008 0,005 0,266 АЦЦП 0,008 0,006 0,214 VEGF 0,011 0,006 0,309 Рисунок 25 ROC-кривая для прогностической модели при оценке эффективности TЦЗ у пациентов с РА Таким образом, мультиплексный анализ базальных уровней лабораторных биомаркеров позволяет эффективно прогнозировать ответ на терапию ингибиторами TNF-α, моноклональными антителами мембранному CD20-антигену В-клеток и рецепторам интерлейкина-6. к 181 ОБСУЖДЕНИЕ В ходе развития современных протеомных технологий стало возможным модифицировать имеющиеся и создавать новые концепции поиска и валидации биомаркеров, что открывает широкие перспективы для диагностики, оценки активности, определения прогноза, выбора метода лечения болезни и мониторинга эффективности проводимой терапии при РА [42, 43]. Уже сейчас количество кандидатных биомаркеров РА значительно превышает число лабораторных показателей, вошедших в классификационные критерии данного заболевания [11]. Основными диагностическими лабораторными маркерами РА являются ревматоидные факторы (РФ) и антитела к цитруллинированным белкам (АЦБ). Кроме этого, существуют аутоантитела, обнаружение которых в силу ряда причин не получило широкого распространения в лабораторной практике (антитела к RA-33, иммуноглобулин-связывающему белку, кальпастатину, α-энолазе). Предполагается, что аутоантитела являются не только диагностическим маркером РА, но и принимают участие в патогенезе заболевания [47]. Нами обнаружены слабые корреляционные зависимости между наличием системный проявлений и высокими уровнями IgM РФ и АМЦВ при РА. Схожие данные получены Turesson С. и соавт. относительно IgM РФ и АЦЦП, в то время как, другие исследователи подобных закономерностей не обнаружили [299-301]. Выявление прогнозирования IgM РФ и АЦБ в высоких титрах служит для быстропрогрессирующего деструктивного поражения суставов [2, 73, 75, 86, 301-303]. Проностическая ценность АЦЦП превышает таковую для IgM РФ, СОЭ и СРБ[303, 304]. В настоящей работе отмечено достоверно более высокое количество суставных эрозий в группе пациентов с “высокопозитивными” значениями IgM РФ и АЦЦП по сравнению с “низкопозитивными” и “негативными” группами. Кроме этого, 182 сывороточный уровень IgM РФ возрастал в зависимости от рентгенологической стадии РА, а с рентгенологическими изменениями по Sharp-van der Heijde коррелировало содержание АЦЦП и АМЦВ. В исследованиях Shankar S. и cоавт. также показано, что пациенты одновременно серопозитивные по IgA-, IgM РФ, АЦЦП и АКА имеют большое количество суставных эрозий, нежели позитивные только по одному из этих аутоантител или серонегативные [305]. Сходные данные получены Mewar D. и соавт. показавших ассоциации уровней этих антител и рентгенологических нарушений при РА [306]. Другие авторы находили, что именно АКА лучше всего отражают степень рентгенологических изменений при РА [307]. Определение IgM РФ присутствует в диагностических критериях РА с 1987, а АЦБ (АЦЦП) с 2010 года. [11, 292]. Результаты данного исследования подтверждают высокую диагностическую точность определения этих аутоантител, выделяя АЦБ как наиболее диагностически значимые маркеры РА [16, 17, 51, 62, 65- 70, 84, 308-311]. По данным зарубежной литературы IgM РФ определяется у 60-90% пациентов с развернутой стадией РА и примерно у 50% - с ранним РА [312]. IgM РФ также обнаруживается у 3-5% здоровых лиц (по результатам данной работы в 3,5%) и у пациентов с другими РЗ. Полученные результаты полностью согласуются с данными литературы и свидетельствуют о недостаточно высокой ДС (87%) данного показателя. Несмотря на включение результатов определения IgM РФ в диагностические критерии РА, существуют рекомендации их использования в большей степени, для прогноза течения РА [313]. На сегодняшний день накоплено достаточное количество данных, позволяющих считать АЦЦП наиболее диагностически точным маркером РА. Так, при использовании АЦЦП первого поколения чувствительность метода являлась достаточно вариабельной – от 41% до 68%, однако разработка синтетического цитруллинированного пептида второго поколения 183 позволила повысить ДЧ до 49-91%, сохранив ДС на прежнем уровне – около 98% [61, 62]. По нашим данным ДЧ и ДС АЦЦП для диагностики РА составляет 75% и 87% соответственно. Диагностический потенциал АЦЦП подтверждается их выявлением у 34-69,3% серонегативных по IgM РФ пациентов с РА [61]. Обобщенный анализ результатов выявления АЦЦП при СКВ, СШ, гранулематозе Вегенера, АС, ПСА, ревматической полимиалгии (РП), палиндромном артрите показал более высокую специфичность данного маркера для диагностики РА по сравнению с IgM РФ [59, 61]. При ПР частота обнаружения АЦЦП (56%) приближалось к таковой при раннем РА (55%), а при сочетании палиндромного артрита с ревматоидным, АЦЦП обнаруживались в 38,1% случаев. При РП АЦЦП не выявлялись и этот факт позволяет расценивать данный маркер как важный фактор дифференциальной диагностики этого заболевания с РА у лиц пожилого возраста [314]. Отрицательные результаты определения АЦЦП могут играть существенную роль в дифференциальной диагностике РА и СКВ с наличием эрозивного полиартрита, часто сочетающегося с серопозитивностью по IgM РФ [315]. По результатам данной работы АЦЦП выявлялись у 20% пациентов с СШ и 20% с OVERLAP-синдромом. Следует отметить, что по нашим и зарубежным данным ДЧ определения АЦЦП при раннем РА несколько ниже, чем в среднем при РА (39-71%) [72, 316]. Полученные результаты подтверждают данные других авторов о диагностической значимости определения АМЦВ в сыворотках крови больных РА. Концентрация АМЦВ при РА является достоверно более высокой, чем у больных ОА, OVERLAP-синдромом, ПА, СКВ, ПСА. Сходные результаты о гиперпродукции АМЦВ при РА приводят C. Dejaco et al. [16]. Также. нами обнаружен достоверно более высокий уровень АМЦВ при развернутой стадии РА, по сравнению с ранней. Литературные источники указывают специфичность на высокую (89,8-98,7%) чувствительность (53,7-82,0%) и результатов определения АМЦВ для диагностики РА [16, 17, 317]. Согласно нашим исследованиям ДЧ АМЦВ при 184 РА составляет 85%, ДС 81%. Различия результатов определения ДЧ и ДС АМЦВ могут зависеть от подбора больных РА и контрольной группы и выбранного уровня позитивности. Более низкий, по сравнению с материалами других авторов уровень специфичности АМЦВ, также связан с наличием в контрольной группе больных АС, OVERLAP-синдромом и НА у которых АМЦВ выявлялись, соответственно в 57%, 65%, 50% случаев, в то время как у здоровых доноров эти аутоантитела не определялись. Вместе с тем, учитывая данные о прогностическом значении данных аутоантител, нельзя исключить, что у ряда больных НДА с положительными результатами определения АМЦВ в дальнейшем может быть поставлен диагноз «достоверный» РА [16, 17, 317, 318]. Возможно, выявленный нами сравнительно невысокий уровень ДС определения АМЦВ также связан с наличием у Sa-антигена/МЦВ большего количества эпитопов, способных связываться с антителами, по сравнению с синтетическим ЦЦП [64, 318, 319]. Большинство исследователей, в связи с более низкой ДС по сравнению с АЦЦП, рекомендуют рассматривать АМЦВ как дополнительный тест для верификации диагноза РА [84, 85, 310, 311, 320- 325]. Данные о недостаточно высокой ДЧ (32%) АКА при РА полученные в данном исследовании, совпали с результатами зарубежных исследователей. В ряде работ описана связь данных антител с тяжестью заболевания, однако нами подобных закономерностей не обнаружено [326]. В целом, для раннего РА наиболее клинически информативным маркером являются АЦЦП, а для развернутой стадии РА – АЦЦП, АМЦВ и IgA РФ. Более того, рядом авторов показано, что совместное определение IgM/IgA РФ и АЦБ имеет более высокую ДЧ, чем каждый показатель по отдельности [327-329]. Например, по данным M.Rodriguez-Mahou и соавт. одновременный учет результатов тестирования АМЦВ, АЦЦП и IgМ РФ сопровождается ДЧ до 100% [318]. При этом, Zhao J. и соавт. продемонстрировали, что совместное определение АЦЦП и АКА не ведет к повышению диагностической точности при РА [330]. При применении метода линейного 185 регрессионного анализа в нашей работе показано, что оценка диагностического индекса для панели аутоантител сосотоящей из IgM и IgA РФ, АЦЦП, АМЦВ позволяет повысить ДЧ до 90% при раннем и до 92% при развернутом РА (табл.99). Таблица 99 Диагностическое значение IgM РФ, АЦЦП и АМЦВ при РА IgA РФ ДЧ % ДС % ОППР ОПОР ППК IgM РФ 67 79 3,2 0,4 0,8 ДЧ % ДС % ОППР ОПОР ППК 67 79 3,2 0,4 0,8 82 83,5 4,9 0,2 0,9 71 83,5 4,3 0,3 0,9 Ранний РА (n=102) АЦЦП АМЦВ 59 87 4,5 0,4 0,7 РА (n=891) 75 87 5,8 0,3 0,8 69 81 3,6 0,4 0,8 Прогностическая модель 90 80 4,5 0,1 0,9 85 81 4,5 0,2 0,8 92 78 4,1 0,1 0,95 Сейчас, принято рассматривать РФ и АЦБ как различные системы аутоантител и соответственно, выделять два клинико-лабораторных субтипа РА (АЦБ-позитивный и АЦБ-негативный), отличающихся по молекулярным механизмам патогенеза, тяжести течения и подходам к терапии [67, 77, 79, 82, 331, 332]. При раннем РА, больные серопозитивные по АЦБ, отличались от серонегативных только более высоким уровнем IgM РФ, а при РА, как IgM, так и IgA РФ. В целом при РА нами обнаружены достоверно большее количество ЧПС, ЧБС, более высокие значения DAS28, СОЭ и концентраций IgM/IgA РФ в группе АЦБ-позитивных пациентов по сравнению с АЦБнегативными. В данной работе у пациентов с РА изолированно обнаруживались только АМЦВ и АКА в 33% и 40% случаев, соответственно. Следует отметить, что в “отрицательной” по IgM РФ группе АЦЦП, АМЦВ и 186 АКА встречались в 34%, 48%, и 21% случаев, что подтверждает большую ДЧ АЦБ по сравнению с IgM РФ. Также, необходимот учитывать существование серонегативных по РФ вариантов данного заболевания, при которых по нашим и зарубежным данным АЦЦП выявляется в 34%-38% случаев. [10, 75, 64, 65, 316, 333]. Данные о способности РФ и АЦБ отражать воспалительную активность РА носят противоречивый характер. Аmri M. и совт. обнаружили достоверную взаимосвязь повышенного сывороточного содержания IgM-, IgA РФ, АЦЦП, АКА с ЧПС и ЧБС, а IgM РФ с СОЭ [301]. Нами получены сходные данные о корреляции IgM РФ с ЧПС и АЦЦП с ЧБС при раннем РА. Кроме этого отмечена слабая взаимосвязь уровня СРБ с концентрациями IgM РФ, АЦЦП, АМЦВ при раннем РА и развернутом РА. Как в данном исследовании, так и в работах Аmri M. и совт. и Greiner A. и соавт. не удалось найти взаимосвязи концентраций аутоантител с значениями DAS28 [334]. Bas S. и соавт., напротив, обнаружили корреляцию данного индекса активности РА с уровнями IgA-, IgM РФ и АЦЦП [70], a Alexiou I. и соавт. только с IgM РФ [335]. СРБ - классический острофазовый белок плазмы крови, рассматривающийся как наиболее чувствительный лабораторный маркер инфекции, воспаления и тканевого повреждения [90, 91]. Определение СРБ является более стабильным, валидированным и воспроизводимым маркером воспаления, чем СОЭ [110]. Так, степень корреляции уровня СРБ с данным показателем по нашим данным находилась в границах умеренных значений: (r=0,7-0,6) в зависимости от стадии РА. Определение СРБ может использоваться для оценки активности патологического процесса (является компонентом DAS28, SDAI), прогноза и тяжести деструктивного поражения суставов [108, 109]. Использование СРБ, а не СОЭ, при подсчете DAS28 позволяет более достоверно оценить активность заболевания [94]. Связь с активностью заболевания подтверждается полученными данными о корреляции уровня СРБ с DAS28 и ЧПС при РА. Однако нами не было 187 обнаружено взаимосвязи между уровнем СРБ и такими показателями деструктивного поражения суставов как рентгенологическая стадия и общий счет Sharp-van der Heijde. Отмечена корреляция слабая корреляция СРБ с наличием системных проявлений в развернутой стадии заболевания, что подтверждается наблюдениями Nyhäll-Wåhlin B.M. и соавт. [336]. Участвуя в внеклеточного патогенезе матрикса РА, и кальпротектин аутоиммунные усиливает нарушения, протеолиз индуцируя псевдоопухолевый фенотип синовиоцитов [95]. В синовиальной жидкости больных РА отмечается гиперпродукция данного белка [337]. Достоверная корреляция между кальпротектином, СОЭ и уровнем СРБ, обнаружена не только в данном исследовании (r=0,3 и 0,6 соответственно), но и в работах Hammer H.B., Berntzen H.B. и Brun J.G. [338-340]. Показано, что кальпротектин может являеться независимым прогностическим маркером клинического и рентгенологического прогрессирования РА [338, 341]. Нами, как и в исследовании Hammer H.B. и соавт. обнаружена взаимосвязь уровня кальпротектина с DAS28, но не с показателями рентгенологической деструкции суставов [338]. Таким образом, изменения концентраций СРБ и кальпротектина в сыворотке крови могут отражать воспалительную и клиническую активность РА, при этом данных о взаимосвязи этих белков с показателями рентгенологической деструкции суставов не получено. RANKL играет важную роль в ремоделировании костной ткани, принимая участие в процессах остеокластогенеза, миграции остеокластов и регуляции апоптоза [342]. Проостеокластогенная функция RANKL регулируется его рецептором - остеопротегерином (ОПГ), конкуренто подавляющим способность первого связываться с RANK [343]. Степень развития костной деструкции при РА зависит от баланса анти- и проостеокластогенных факторов в регуляции соотношения которых важную роль играет RANKL. Так RANKL, связанный с мембраной остеобластов и секретируемый синовиоцитами активно вовлечен в процессы костной деструкции при РА [344-346]. В нашим исследовании отмечена “средняя” 188 степень корреляции уровней sRANKL и СРБ при раннем РА, что согласуется с работами Hein G. и соавт. и Geusens P. и соавт. [347, 348]. Степень описанной González-Alvaro I. и соавт. взаимосвязи между активностью заболевания и уровнем sRANKL (r=0,3) при РА, полностью соотносится с нашими данными [115]. Однако, в недавнем исследовании группы египетских авторов подобных взаимосвязей не обнаружено [349]. Согласно данным Geusens P. и соавт. существует “слабая” корреляционная зависимость между уровнем RANKL и степенью ренгенологической прогрессии, в частности с общим счетом Sharp-van der Heijde [348]. Однако более позднее исследование Syversen S. и соавт. опровергают эти результаты [24] . В данной работе обнаружен только достоверно более высокий уровень RANKL при 4 рентгенологической стадии РА по сравнению с 3-ей. Уровень COMP может служить специфическим маркером деградации хряща при РА [114]. Попытки использовать его в качестве лабораторного маркера РА продемонстрировали неприемлемые для клинической практики значения ДЧ (15%–48%) и ДС (66%–69%) [350]. Существуют данные о возможности применения данного биомаркера в качестве предиктора поражения крупных суставов, так как его уровень достоверно возрастает при агрессивных формах течения РА [351-353]. Кроме этого, показано, что высокий уровень CОМP, коррелирует с рентгенологическими признаками суставной деструкции, что подтверждается и результатами данной работы [354]. Сывороточное содержание СOMP позволяет прогнозировать 5 летний риск развития тяжелого деструктивного поражения суставов [355, 356]. Данные о связи уровня COMP c воспалительной активностью РА, носят противоречивый характер. В исследованиях Saxne T. и соавт. и P. Roux‐Lombard и соавт. не обнаружено взаимосвязи данного показателя с уровнем СРБ и СОЭ, тогда как, результаты других авторов свидетельствуют об обратном [357-360]. Данные о способности COMP отражать клиническую активность заболевания, также носят неоднозначный характер. Ряд публикаций свидетельствует о наличие связи его уровня с DAS28, в то тоже 189 время исследование Marti C. и соавт. согласуясь с полученными в данной работе результатами, не подтверждают данную закономерность [359, 361363]. В нашей работе отмечена корреляция уровня ММП-3 с воспалительной активностью РА - уровнями СОЭ и СРБ в сыворотке крови, и не обнаружено взаимосвязи с развитием костной деструкции, согласуясь с результатами полученными японскими исследователями [364]. При РА в синовиальной мембране происходит резкое увеличение количества активированных B- и Т-лимфоцитов, тучных клеток, макрофагов, участвующих в неоваскуляризации и лимфоангиогенезе. Хронизация воспаления достигается за счет нарастания количества активированных в процессе хрящевой и костной деструкции тканевых фибробластов, хондроцитов и остеокластов. Цитокины играют основную роль в рекрутинге, активации и осуществлении эффекторных функций клеток, участвующих в развитии аутоиммунного воспалительного процесса при РА [119]. В настоящее время существует несколько методов мультиплексного анализа цитокинов в сыворотке/плазме крови [365, 366]. В данной работе использовалась технология xMAP основанная на “сэндвич” методе ИФА, главным элементом которой является суспензия кодируемых микросфер содержащих молекулярные зонды, специфичные к одной из множества исследуемых биологических молекул [367-371]. Данная технология обладает высоким аналитическими харакеристиками при определении концентрации цитокинов в сыворотке крови [366]. При исследовании уровней цитокинов в сыворотке крови одной из причин искажения результатов исследований является присутствие в исследуемом материале гетерофильных антител, в частности IgM РФ, представляющего собой антитела к Fc-фрагменту IgG [372-374]. Влияние IgM РФ описано при применении планарных микрочипов, “in house” реагентов и использовании неразведенных образцов биологических жидкостей [375-378]. Существует ряд реагентов, позволяющих исключить 190 влияние высокого содержания IgM РФ на результаты исследования, блокируя: HeteroBlock, heterophilic blocking reagent (HBR); immunoglobulininhibiting reagent (IIR) или удаляя IgM РФ: протеин-L, PEG6000, “ВектоРФиммуносорбент” [372, 374, 376, 379]. Представляется интересным, что даже при использовании PEG6000 эффективность удаления IgM РФ составляет ≈50% для плазмы/сыворотки и ≈30% для синовиальной жидкости [379]. В нашем исследовании использовались наборы реагентов “Bio-Plex Pro Human Cytokine Standard Group I 27-Plex” (Bio-Rad, США), где твердой фазой служили магнитные микросферы, а процедуры “отмывки” осуществлялись с применением промывочной станции Bio-Plex Pro II Wash Station, что приводит к существенной редукции неспецифического связывания исследуемых аналитов с гетерофильным антителами [380, 381]. Это подтверждается тем, что при использовании аналогичных реагентов фирмы LINCO, где твердой фазой служат обычные полистироловые микросферы, содержащих специальный буфер для устранения влияния IgM РФ и наборов Bio-Rad, были получены сходные результаты концентраций цитокинов [382]. При изучении степени влияния высоких концентраций IgM РФ на точность определения содержания цитокинов в сыворотке крови и синовиальной жидкости (при разведении 1:4) методом xMAP нами отмечена достоверная корреляция уровня IgM РФ только c IL-9 (r=0,7) в сыворотке, при этом она сохранялась (r=0,6) и при удалении данных аутоантител с использованием реагентов “ВектоРФ-иммуносорбент”. Подобные результаты получены (разведения сыворотки крови 1/2, 1/20, 1/1000) и при использовании планарных микрочипов, для создания иммунологического индекса активности РА, где, либо не отмечено интерференции с гетерофильными антителами и в частности с IgM РФ, либо ей можно пренебречь [383]. Следует отметить, что удаление/блокировка гетерофильных антител во всех выше перечисленных исследованиях приводили к значительному снижению определяемых уровней всех исследуемых биомаркеров. Кроме этого в нашей работе показано, что после удаления IgM РФ, корреляции с прежними 191 уровнями, сохранились лишь у части цитокинов. Kokkonen H. и соавт. проводили удаление/блокировку IgM РФ из плазмы крови используя HeteroBlock и протеин-L, согласно рекомендациям Raza K. и соавт. В результате показано, что данные, полученные после использования этих реагентов, не поддаются сопоставлению [212, 384]. В этой работе, методом “mismatch simplex sandwich” убедительно показано отсутствие влияние IgM РФ на результаты исследований при использовании оригинальных реагентов “Bio-Plex Pro Human Cytokine Standard Group I 27-Plex”. Таким образом, при определении цитокинов в биологических жидкостях пациентов с РА технологией xMAP, использование магнитных микросфер, автоматизированной отмывки и большая степень разведения сыворотки приводят к кардинальному снижению влияния IgM РФ на результаты исследования. В нашей работе показано наличие корреляционной зависимости между уровнями большинства исследуемых биомаркеров в синовиальной жидкости и сыворотке крови. K. Raza и соавт. [212] провели измерение уровня 23 цитокинов в синовиальной жидкости у 36 больных с ранним РА (< 6 мес.), 9 больных с РА (> 6 мес.), 12 больных подагрическим артритом и 4 больных ОА. Авторами показано транзиторное увеличение концентрации IL-2, -4, -13, -17, -15, основного FGF и эпидермального фактора роста (ЭФР) у 8 больных ранним РА в течение первых 3 мес. после появления клинических симптомов заболевания и повышение уровня IFN-γ у 14 больных с недифференцированным, псориатическим (ПСА) и другими вариантами неревматоидного персистирующего артрита на ранней стадии болезни. При РА в СЖ происходит увеличение продукции IL-17 CD4 T-клетками. Th17 клетки при этом в большей степени продуцируют TNF-α [385]. В синовиальной жидкости при РА значительно повышаются уровни провоспалительных IL-1β, TNF-α; антивоспалительных: IL-1ra, -10; Th1: IL-2, IFN-γ; Th2: IL-4; Th17: IL-17 цитокинов, стромальных и ангиогенных факторов: G-CSF, GM-CSF и хемокинов IL-8, IP-10, MCP-1. [386, 387]. 192 Уровни цитокинов, секретируемых Т-клетками, макрофагами и стромальными клетками (IL-2,-4,-13,-17,-15, основного фактора роста фибробластов (FGF-2), эпидермального ростового фактора (EGF) и GM-CSF значимо повышаются в течении трех месяцев после начала заболевания. В ходе прогрессирования РА в периферической крови происходит изменение уровней цитокинов принадлежащих ко всем основным функциональным классам (табл. 100) [388-391]. Признаки дисбаланса цитокинового профиля могут отмечаться за 3-6 лет до первой манифестации заболевания [384]. Отмечено повышения провоспалительных цитокинов (IL-1α,-1β,-6, TNFα), Th1 (IL-12), Th2 (эотаксин), Th17 (IL-17), T-регуляторных (IL-10,-15) цитокинов и стромальных/ангиогенных факторов (FGF-2, GM-CSF) [384, 392]. После развития первых симптомов РА происходит повышение и уровня антивоспалительных цитокинов [384, 393]. W. Hueber и соавт. [226], проанализировавшие панель из 22 цитокинов в сыворотках 56 больных ранним РА, 21 больного ПСА/АС и 19 здоровых лиц, выявили при РА достоверное увеличение концентрации провоспалительных цитокинов: IL-1α, -12, -13, TNF-α и хемокинов: - IP-10, MCP-1, эотаксина, а при ПСА и АС только IL-8. Нами обнаружено повышение противовоспалительных цитокинов IL-1b,-6,15, антивоспалительного IL-1ra, Th1 IL-2 и IFN-γ, Th2 IL-4,-5,-9, колонистимулирующего IL-7, хемокина MIP-1α, IL-8, MCP-1 и GM-CSF. Следует отметить, что изменения концентраций цитокинов в крови при раннем РА, не обязательно напрямую связано с воспалительными процессами в синовиальной ткани, а в большей степени отражает комплексное взаимоотношение многочисленных медиаторов врожденного и приобретенного иммунитета [388]. При раннем РА обнаружен достоверно более высокий уровень Th1 (IFN-γ), Th17 цитокинов (IL-17), колониестимулирующих факторов (IL-7, G-CSF), хемокинов (IL-8, IP-10, MIP-1α), по сравнению с развернутой стадией заболевания. Для более 193 Таблица 100 Изменения концентраций цитокинов в сыворотке крови и синовиальной жидкости больных РА по данным различных авторов Функциональный класс цитокинов Провоспалительные Сыворотка крови Синовиальная жидкость Ранний РА РА Ранний РА РА ▲∆ ▲∆ ▲ ▲ IL-6 ▼▲∆ ▲∆ ▲ ▲ IL-12 ▲∆ ▲∆ ? ▲ IL-15 ▲∆ ▲∆ ▲ ▲ TNF-α ▲∆ ▲∆ ? ? MIP-1α ∆ ▲○ ? ▲ IL-1ra ▲∆ ▲∆ ? ▲ IL-10 ▲∆ ▲▼ ? ▲ IL-13 ▲∆ ∆ ? ? ▼▲∆ ○ ? ▼ IL-2 ▲∆ ∆ ▲ ? IL-12 ▲∆ ▲∆ ? ▲ IL-4 ▼∆ ○ ▲ ? IL-5 ○ ○ ? ? IL-9 ▲∆ ∆ ? ? Эотаксин ▲∆ ○ ? ? ▼▲∆ ○ ▲ ▲ ▲∆ ▲▼○ ? ▲ IL-7 ∆ ▲▼○ ? ▲ G-CSF ∆ ▲∆ ? ▲ IL-1/1β Антивоспалительные Th1 IFN-γ Th2 Th17 IL-17 T-регуляторные IL-10 Колониестимулирующие факторы GM-CSF ▼∆ ∆ ? ▲ 194 Продолжение таблицы 100 Сыворотка крови Провоспалительные Синовиальная жидкость Ранний РА РА Ранний РА РА FGF-2 ∆ ○ ▲ ▲ PDGF-ВВ ▲○ ○ ? ? VEGF ▲∆ ▲○ ? ▲ IL-8 ▲∆ ○ ? ▲ IP-10 ▲∆ ○ ? ? MCP-1 ▲○ ▲○ ? ▲ MIP-1α ∆ ▲ ? ▲ MIP-1β ▲○ ○ ? ? ○ ○ ? ▲ Стромальные и ангиогенные факторы Хемокины RANTES ▲-повышение концентрации данные литературы, ∆-повышение концентрации собственные данные, ▼-понижение концентрации, концентрация не меняется данные литературы, ○- концентрация не меняется собственные данные, ?-нет данных. полного понимания роли различных классов цитокинов в патогенезе раннего РА, необходимы исследования больших когорт пациентов с ранним РА, а также “преклинических” образцов соответствующего биоматериала [226]. Последние работы подтверждают важную роль хемокинов в патогенезе РА [394-397]. Существует предположение, что повышение не только Th1, но и в большей степени Th2 цитокинов в доклиничекий период может провоцировать появление АЦБ у больных РА. В нескольких исследованиях показана взаимосвязь гиперпродукции данных классов цитокинов с наличием АЦБ, что позволяет предположить существования субтипов РА, различающихся на молекулярном уровне [250, 384, 393]. Эти данные согласуются с результатами нашей работы, согласно которым, у АЦБположительных пациентов, по сравнению с АЦБ-негативными, достоверно 195 повышены уровни: провоспалительных (IL-6,-12,-15, TNF-α), антивоспалительных цитокинов (IL-1ra,-13,-10), Th1 (IL-2, IFN-γ), Th2 цитокинов (IL-4,-9, эотаксина); колониестимулирующих факторов: IL-7, GMCSF. В зарубежной литературе также описаны корреляционные зависимости между содержанием в периферической крови IgM РФ, АМЦВ и концентрациями различных цитокинов (IL-1β -1ra,-2,-4,-6,-7,-8,-10,-12,-17, TNF-α, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, VEGF, MCP-1 и MIP-1β), что в целом совпадает с результатами настоящей работы [389, 398]. Кроме этого, нами обнаружена взаимосвязь уровней IL-1β,-1ra,-2,-4,-6,-9,-10,-13,-15, эотаксина, GM-CSF, IFN-γ и IgA РФ при раннем РА. В литературе, приводятся противоречивые данные о взаимосвязи между активностью РА и уровнями отдельных цитокинов [389, 390, 399, 400]. Так, Hitchon C.A. и соавт. выделили группу с “мягким” течением РА, характеризующуюся повышенными уровнями MIP-1beta, IL-8, -2, -12, -17, 5, -10 и пониженным содержанием IL-6,-4, IFN-γ, GM-CSF и группу с “тяжелым” течением РА, где были повышены уровни IL-13, IL-12, TNF-a и IL-4. Однако, неросредственной корреляции концентраций исследуемых биомаркеров со значениями DAS28, авторами обнаружено не было [391]. По нашим данным, при РА лишь уровень IL-6 достоверно коррелировал с значениями DAS28, и СРБ. Однако, по данным Chung S.J. и соавт. сывороточная концентрация цитокинов семейства IL-6 (IL-6,-11, фактор ингибирующий лейкозные клетки), коррелирует только с уровнем СРБ. [401]. Результаты тестирования 25 цитокинов (эотаксина, TNF-α, IFN-γ, ИФНα, MIP1-α/β, IP-10, монокин индуцированный ИФН (МIG), MCP-1, GM-CSF, IL-1β,-ra,-2,-2R,-4,-5,-6,-8,-10,-12,-13,-15,-17, RANTES) больных ранним РА позволили S.W. Syversen и соавт. сделать вывод об ассоциации только уровня эотаксина в сыворотке крови и показателями рентгенологической прогрессии [185]. При этом, авторами не обнаружено ассоциации других цитокинов с развитием радиологичемкой прогрессии подобных корреляций не выявлено. [185]. В нашем исследовании 196 Как показано ранее, в сыворотке крови больных РА выявляют широкий спектр биомаркеров, включающий аутоантитела, белки острой фазы воспаления, показатели костного и хрящевого метаболизма, цитокины (табл. 101). При этом не удалось обнаружить биомаркер, характерный только для РА. Поэтому с целью повышение диагностической точности, в лабораторной практике начинают применяться МДИ [36-39]. Появление аутоантител и признаков дисбаланса цитокинового профиля отмечаются за 3-6 лет до первой манифестации заболевания [384, 392, 393]. После развития первых симптомов РА, наряду с высоким содержанием аутоантител, провоспалительных и Th1 цитокинов, происходит повышение уровня провоспалительных белков, антивоспалительных цитокинов, колонистимулирующих факторов и хемокинов (табл. 4) [212, 250, 384]. Так изменение содержания биомаркеров использованных при создании МДИ, способно отражать воспалительную активность РА (СРБ, IL-6), гиперпродукцию АЦБ (АЦЦП), развитие иммунного ответа по Th1 типу (IFN-γ), активацию процессов гемопоэза (GM-CSF) и хемотаксиса (IP-10) [131, 191, 168, 195]. При диагностике раннего РА МИРРА обладает высокой ДЧ и ДС (97%, 94% соответственно), превосходя IgM РФ (59%, 79%) по обоим параметрам, а АЦЦП (71%, 97%) по ДЧ [10]. В 2011 году группа под руководством W.H. Robinson с помощью мультиплексного анализа создала, аналогичную диагностическую панель из 6 биомаркеров: гистон 2B/e, виментин, фибриноген А, олигомерный матриксный протеин хряща (COMP), профилагрин, IgA РФ. При диагностике раннего РА данная панель, проявляет более высокую ДС (96%) чем IgM РФ, однако не превосходит по таковой АЦЦП и МДИ [42-45]. Таким образом, после тщательной валидации МИРРА сможет рассматриваться как высокоточный серологический тест для ранней диагностики РА. Кроме этого, в данной работе создан МДИ для диагностики развернутого РА, включающий в себя IgM РФ, АЦЦП, АМЦВ, СРБ, IL-6 и 197 Таблица 101 Повышение уровней биомаркеров в доклинический период и при раннем РА Биомаркеры доклинический период (3-6 лет до начала заболевания) литературные данные Маркеры воспаления Аутоантитела СРБ РФ, АЦЦП Цитокины Провоспалительные IL-1α,-1β,-6,-15, TNF-α Антивоспалительные Th1 IL-1ra IL-2,-12, IFN-γ Th2 IL-4[33,34], эотаксин Th17 Т-регуляторные Колонистимулирующие факторы Стромальные ангиогенные факторы Хемокины IL-17 IL-10 IL-7,FGF-2, GM-CSF и MCP-1 ранний РА (<6 мес.) собственные данные литературные данные СРБ СРБ, КП РФ, АЦЦП, РФ, АЦЦП, АМЦВ АМЦВ IL-1α/1β,-6,IL-1/1β,-6,-12,-15,TNF-α, MIP-1α 12, -15,TNF-α IL-1ra,-13] IL-1ra,-10,-13 IFN-γ, IL-2, - IFN-γ, IL-2, -12 12 IL-9, IL-4,-9, эотаксин эотаксин IL-17 IL-10 IL-10 IL-7, G-CSF, GM-CSF PDGF-ВВ, FGF-2, VEGF VEGF IL-8,MCPIL-8, IP-10, MCP-1 1,MIP-1β, IP10 198 IL-9 и обладающий больше диагностической точностью, нежели рутинно используемые IgM РФ и АЦЦП. В этот МДИ не вошли такие показатели, ответсвенные за развитие иммунного ответа по Th1 типу (IFN-γ), активацию процессов гемопоэза (GM-CSF) и хемотаксиса (IP-10), но был включен IL-9 главным биологическим эффектом которого является активация цитотоксических и тучных клеток, кроме этого, он служит синергистом IL-1,2,-4,-5[184]. Этот факт служит еще одним подтверждением того, что прогрессирование РА является динамически развивающимся процессом, как с точки зрения патогенетических механизмов, так и лабораторных проявлений [2]. В зарубежной литературе описано два МДИ, созданных для оценки активности РА и способных определить наличие высокой/умеренной и низкой активности РА. Первый основан на связи изменения плазменных концентраций IL-6, макрофагального белка воспаления (MIP)-3, трансформирующего ростового фактора (TGF)-α, хемокина CXCL13, макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) и 4-1BB лиганда со степенями активности РА (ППК:0,89) [402]. При создании второго (Vectra DA), молекулы учитывалась адгезии ассоциация сосудистого сывороточных эндотелия первого концентраций: типа (VCAM-1), эпидермального фактора роста (EGF), VEGF, IL-6, рецептора фактора некроза опухоли первого типа (TNF-RI), ММP-1,-3, YKL-40, лептина, резистина, SAA и СРБ с компонентами DAS28 (ППК: 0,71) [403]. Величина коэффициента корреляционной связи с DAS28 ни у одного из МДИ, включая описанный в настоящей работе, не поднималась выше средней [383]. Однако все МДИ обладают диагностической точностью лежащей в границах “хорошая-отличная” и она превышает таковую для каждого маркера, включенного в соответствующий индекс, что свидетельствует в пользу эффективности применения для оценки многопараметрических прогностических моделей. активности РА 199 Вошедшие в наш МДИ биомаркеры отражают основные звенья иммунопатогенеза РА. Среди провоспалительных цитокинов центральное место в развитии синовиального воспаления, прогрессирующей костной деструкции и системных проявлений при РА занимают TNF-α, IL-6 и IL-1β [122]. TNF-α продуцируется макрофагами синовиальной ткани и его максимальная концентрация достигается в активную стадию заболевания. Основными патогенетическими эффектами TNF-α являются увеличение продукции фактора дифференцировки остеокластов –RANKL отвечающего за резорбцию костной ткани, а также индукция гиперэкспрессии молекул адгезии, металлопротеиназ, коллагеназ, хемокинов и простагландинов [122]. IL-1β - один из важнейших медиаторов воспаления при РА. Отмечается значительное увеличение его продукции синовиальной ткани, с последующим ростом концентрации в синовиальной жидкости и сыворотке крови, коррелирующей с активностью заболевания [125, 126]. IL-1β стимулирует выход нейтрофилов из костного мозга, рост и дифференцировку лимфоцитов, участвует в запуске ассоциированного с синовитом неоангиогенеза, активирует макрофаги. IL-1β способен индуцировать синтез многих других цитокинов, хемокинов, матриксных металлопротеиназ и ферментов способствующих разрушению хряща и костной ткани. Участие IL-1β в патогенезе РА подтверждено его способностью усиливать тяжесть коллаген-индуцированного артрита и при введении интраартикулярно вызывать артритоподобные изменения [405]. Патологическое действие IL-6 при РА состоит в стимуляции пролиферации B-клеток, секреции иммуноглобулинов, синтеза СРБ, дифференцировке плазматических клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов. Повышение уровня IL-6 коррелирует с активностью РА, титрами РФ, лейкоцитарной инфильтрацией синовиальной ткани и тяжестью деструктивного поражения суставов [406]. IL-6 принимает участие в развитии околосуставного остеопороза и суставной деструкции через влияние на дифференцировку остеокластов, увеличение активности протеолитического фермента аггреканазы и ускорения деградации 200 протеогликана [131]. IL-15 при РА способен напрямую стимулировать продукцию TNF-α синовиальными Т-клетками и опосредованно участвовать в усилении синтеза TNF-α макрофагами [136]. FGF-2 является членом семейства гепарин-связывающих ростовых факторов. При РА наблюдается значительное увеличение его концентрации в синовиальной жидкости, ассоциирующееся с тяжестью течения заболевания [186]. FGF-2 усиливает пролиферацию синовиальных фибробластов и, обладая способностью увеличивать синтез VEGF, стимулирует ангиогенез. Кроме этого, связываясь с рецептором (FGFR-1) на синовиальных фибробластах и активируя ERKкиназу, он ускоряет RANКL и ICAM-1 опосредованное созревание остеокластов, приводящее к развитию костной резорбции [187]. MCP-1 синтезируется макрофагами, фибробластами, эндотелиальными и опухолевыми клетками в ответ на стимуляцию IL-6, TNF-α и IL-1β. MCP-1 участвует в патогенезе заболеваний характеризующихся, инфильтрацией мононуклеарных клеток, в том числе и РА [195]. Кроме этого, существуют данные позволяющие считать MCP-1 одним из основных провоспалительных медиаторов при РА [192]. Следует отметить, что во всех МДИ используется оценка содержания в периферической крови провоспалительных цитокинов, хемокинов и ростовых факторов, отражающего процессы рекрутинга, активации и реализации клетками эффекторных функций, без которых невозможно развитие аутоиммунного воспалительного процесса при РА. Эти данные позволяют предположить, что измерение концентраций представителей именно этих функциональные классов цитокинов способно наиболее точно отражать активность заболевания. Таким образом, создание независимого от субъективной оценки иммунологического МДИ, обладающего более высокой диагностической точностью, по сравнению с рутинно используемыми в клинической практике индексами, может являться качественно новым этапом в оценке и контроле активности РА. 201 Значительный прогресс в лечении РА связан с разработкой нового класса лекарственных средств - ГИБП, к которым относят моноклональные антитела против определенных детерминант иммунокомпетентных клеток или провоспалительных цитокинов и рекомбинантные белки, селективно блокирующие ведущие звенья иммунопатогенеза РА [407]. Создание ГИБП позволило сформулировать новую стратегическую цель фармакотерапии РА – достижение ремиссии заболевания, а не только клинического улучшения и замедления темпов костной деструкции [408]. В большинстве исследований на фоне применения ингибиторов TNF-α в сыворотках больных РА отмечалось значительное (30-60%) снижение концентрации IgМ РФ и уменьшение содержания IgA и IgG РФ, что совпадает с полученными в нашей работе результатами [230-234]. Кроме этого, на фоне терапии ИНФ, нами выявлена отрицательная (14%) и положительная (8%) IgM РФ-сероконверсия. В отличие от IgМ РФ сывороточный уровень АЦЦП под действием ингибиторов TNF-α, как правило, не меняется [231-233, 236-242]. Существенное снижение данного показателя описано в единичных случаях, например при терапии адалимумабом, также отрицательная АЦЦП-сероконверсия обнаруживается у незначительной части пациентов (4,5%) [243]. По нашим данным к 24 неделе терапии ИНФ, уровень АЦЦП также не изменяется, при этом у 4,5% пациентов отмечена отрицательная, а у 33% - положительная сероконверсия. Практически все ингибиторы TNF-α индуцируют быстрое (в течение месяца, а иногда уже после первого введения препарата) снижение уровня маркеров острой фазы воспаления: СОЭ и СРБ [98, 114, 118-120]. В нашем исследовании, показано, что при применении ИНФ достоверное снижение СОЭ происходит к 14-ой, а СРБ к 24-ой неделе терапии. I. Sekigawa и соавт. [246] впервые изучили влияние ИНФ на белковопептидный профиль сыворотки/плазмы крови у 10 больных РА с использованием метода масс-спектрометрии. По данным авторов, через 24 ч после введения препарата возможно идентифицировать белки, участвующие 202 в TNF-α-зависимых механизмах активации NF-kB (FAM62A/MBC2) и регенерации суставного хряща (ростовой фактор соединительной ткани (CTGF)). Сходные результаты были получены R.C. Dwivedi и соавт. [247] в сыворотках 10 больных РА через 12 недель после начала терапии, обнаруживших у 3 пациентов с “хорошим” ответом на препарат 20% изменение концентрации 39 белков, регулируемых TNF-α или NF-kB. В целом, при терапии ингибиторами TNF-α, отмечено снижение уровней IL-6, VEGF, сывороточного уровня хрящевого гликопротеина-39 (YKL-40) и миграцию ингибирующего фактора (MIF) [248, 249] в перифеической крови. Согласно полученным нами данным, на 24 неделе терапии РА с использованием ИНФ, происходит снижение основных провоспалительных цитокинов: TNF-α, IL-6,-12,-15; обладающих антивоспалительной функцией IL-1ra, -10; Th-1 цитокинов: IL-2, IFN-γ, колониестимулирующего фактора GM-CSF и хемокинов: IP-10, MCP-1. Кроме этого, на фоне применения РТМ отмечены особенности в динамике цитокинового профиля в зависимости от “ответа” на терапию. Так, у пациентов с наличием эффекта при терапии данным препаратом выявлены различия в концентрациях IL-9,-10 на 6 неделе терапии, IL-5,-9 на 14 неделе. На большом клиническом материале показано, что положительные результаты определения IgM/IgA РФ и АЦЦП до начала лечения ассоциируются с неудовлетворительным клиническим ответом на ингибиторы TNF-α [230, 231, 244]. G. Wolbink и соавт., установили, что высокий исходный уровень СРБ у больных РА ассоциируется с пониженным ответом на ИНФ через 14 недель после назначения препарата [245]. При многоступенчатом протеомном исследовании сывороточных белков был идентифицирован профиль из аутоантител и 12 цитокинов (TNF-α, IL-1α, 1β, -6, -15, -12p40, -12p70, GM-CSF, эотаксин, IP-10, FGF-2, МСР-1), позволяющий прогнозировать ответ на терапию ЭТА у больных РА [450]. Согласно нашим результатм, наиболее “сильно” связаны с наличием клинического ответа на ИНФ: IL-12, -17 -9 и СРБ. Эти данные позволили 203 создать МДИ, для прогнозирования эффективности данного препарата. Эти биомаркеры представляют провоспалительные, Th17, Th2 цитокины и белок острой фазы воспаления, что в целом (исключая аутоантитела и хемокины), согласуется с результатами более ранних исследований. В материалах многих исследований убедительно показано, что серопозитивность по РФ и/или АЦЦП и высокие уровни этих аутоантител в сыворотке крови до начала лечения служат предикторами хорошего ответа на терапию РТМ при РА [254, 259-261]. В многоцентровом итальянском исследовании (148 больных РА), серопозитивных хотя бы по одному из тестируемых антител (IgM РФ, IgA РФ и IgG РФ, АЦЦП и АМЦВ), “хороший” эффект (критерии EULAR) анти-В-клеточной терапии через 6 месяцев после ее начала регистрировался у пациентов, не получавших глюкокортикоиды и имевших высокий уровень IgG РФ, что совпадает с полученными нами данными о достоверном снижении на 8 неделе IgM РФ, IgA РФ, АМЦВ в группе лиц “ответивших” на терапию [262]. По данным регистра CERRERA (2048 больных РА), установлена связь между эффективностью РТМ и серопозитивностью по АЦЦП и/или РФ через 6 месяцев после курса терапии [264]. Нами данной закономерности для АЦЦП не обнаружено, но показана подобная тенденция для IgM/IgA РФ и АМЦВ. Как по нашим, так и по данным других исследователей, РТМ вызывает значительное снижение содержания СРБ и СОЭ, достигающее ≈40% к 24–й неделе терапии РА [233, 267]. Данные, касающиеся влияния РТМ на уровень цитокинов у пациентов с РА немногочисленны. При оценке динамики изменения цитокинового профиля Blom М. и соавт. [121] с помощью мультиплексной суспензионной технологии обнаружили в сыворотках больных (n=16) снижение концентрации IL-1β,-4,-7,-15,-12,-13,-17 GM-CSF, IFN-γ, TNF-α, а также повышение уровня MCP-1 в первые 24 недели лечения РТМ, что совпадает с нашими результатами, за исключением возросшего уровня MCP-1. Дополнительно к этому в нашем исследовании отмечено снижение содержания IL-1ra, IL-2, IL-9, IL-10 и FGF-2. Fabre S. и соавт., 204 используя технологию протеомных биочипов, при изучении панели цитокинов у 46 больных РА на фоне терапии РТМ, показали, что на 12 неделю, после введения препарата, концентрация MCP-1 и эпидермального ростового фактора (EGF) в сыворотках ответчиков (n=29) значительно превышает таковую у больных с отсутствием эффекта терапии (n=17) [120]. Кроме этого, выявлено достоверное снижение сывороточного уровня IL-6 в группе “ответчиков”, и IL-8 – в группе больных РА, не «отвечающих» на проводимую терапию РТМ. В нашем исследовании, на 8 неделе после инфузии РТМ, в группе с наличием клинического эффекта, показано снижение IL-6, MCP-1; на 24 неделе при сохранении низких значений IL-6 также отмечен повышенный уровень MCP-1. Blom М. и соавт. рассматривают кратковременное повышение концентрации MIP-1β через 2 часа и снижение уровня IL-6 через 6 часов после первой инфузии препарата в качестве возможных предикторов “хорошего” ответа на терапию РТМ [121]. Thurling R.M. и соавт. обнаружили достоверную связь между снижением концентрации IL-6, IL-15, ИФН-, TNF-, IL-22, IL-23, хемокинов: CXCL3, CCL12, CCL19 через 4 нед. после курса РТМ и клиническим эффектом через 24 недели. По нашим данным о возможном развитии клинического “ответа” через 40 недель может свидетельствовать повышение уровней IL-17 и MIP-1β на 8 неделе после введения препарата [269]. Было установлено, что клиническая эффективность РТМ коррелирует также с высоким базальным уровнем IgA РФ (> 25 ЕД/мл) [263, 264]. Более того, у пациентов с высоким уровнем РФ и АЦЦП возможность развить эффективный ответ на терапию РТМ возрастала почти в 2 раза [235]. Однако, в работе Y.K. Teng и соавт. низкая эффективность РТМ у больных РА была связана с исходной серопозитивностью по IgM и АЦЦП и выраженной инфильтрацией синовиальной ткани CD20+ и CD79a+ CD20- В-клетками. У пациентов негативных или низкопозитивных по АЦЦП чаще развивается удовлетворительный ответ на терапию РТМ [244]. Также показано, что 205 эффективность препарата ассоциируется с низким базальным уровнем СРБ [263] а 50% повышение его концентрации, непосредственно после введения препарата, служит предиктором необходимости проведения повторного курса лечения данным препаратом [268]. В настоящее время отсутствуют данные об идентификации базального цитокинового профиля, который мог бы служить предиктором эффективности терапии РТМ. Согласно нашим результатам, наиболее “сильно” связаны с наличием клинического регуляторные, ответа на данный препарат колонистимулирующие, провоспалительные, ангиогенные цитокины, Tи аутоантитела ( IL-1ra, -10, G-КСФ, VEGF, IgM РФ). Эти данные позволили создать МДИ, для прогнозирования с высокой долей вероятности, эффективность применения РТМ. После начала терапии ТЦЗ у больных РА, наблюдается значительное быстрое снижение уровней лабораторных показателей, на 4 неделе терапии: CОЭ, СРБ, IgM РФ, АМЦВ, MMП-3; на 8 СОЭ, СРБ, IgM РФ, IgA РФ, АЦЦП, АМЦВ, на 24 – всех исследуемых биомаркеровмаркеров исключая АЦЦП. Нами впервые получены данные о том, что терапия ТЦЗ приводит к уменьшению на 60-70% от исходного уровня концентрации IgM/IgA РФ и АМЦВ у больных РА, но не сказывается на титрах АЦЦП. Снижение титра IgM РФ на 32% по сравнению с базальным уровнем к 12 неделе терапии отмечено Nishimoto N. и соавт, при этом у трех позитивных по РФ пациентов присутствовала отрицательная IgM РФ- сероконверсия [275]. В исследовании “OPTION” показано снижение титров IgM РФ на 24 неделе терапии ТЦЗ [276]. Наиболее существенное влияние ТЦЗ оказывал на уровень СРБ, что совпадает с данными других авторов, согласно которым его уровень снижается до нормальных значений через 2 недели после первой инфузии препарата, а начиная с 6-й/10-й недели и по 24ую полностью нормализуется [276, 278-284, 409]. В широкомасштабных клинических исследованиях “OPTION”, “TOWARD”, “RADIATE” и “AMBITION”, показано, что изменение концентрации СРБ и других 206 сывороточных маркеров воспаления зависит от уровня и продолжительности циркуляции в крови ТЦЗ [280-282]. В нашем исследовании, при терапии ТЦЗ отмечена тенденция к снижение содержания в сыворотке крови энзима являющегося одним из главных звеньев в процессах деструкции матрикса MMП-3, что подтверждается данными P.Garnero и соавт., предполагающими, что данный эффект носит дозозависимый характер [287]. J.Yamаna и соавт. установили особенности цитокинового профиля пациентов с РА находившихся на терапии ТЦЗ. Применение ТЦЗ значительно снижает концентрации IL-2, -7, -8, -12, TNF-α и GM-CSF [410]. В нашем исследовании к 24 неделе снижается содержание всех исследуемых цитокинов. Наибольшее внимание, при исследовании влияния ТЦЗ на цитокиновый профиль больных РА уделяется изменению уровня IL-6. Повышение сывороточного уровня IL-6, в начале терапии ТЦЗ, связано не с увеличением продукции данного цитокина, а с нарушением его клиренса вызванного блокадой IL-6R. Однако, как и в большинстве исследований, на 24-й неделе терапии ТЦЗ, в нашей работе прослеживалась четкая тенденция к снижению концентрации IL-6, причем у ≈15% больных ее значения приближались к условной норме [281, 285]. J.Yamna и соавт. предлагают использовать в качестве индикатора хорошего ответа на терапию снижение на 40% от базального уровня IL-2, -7, -10, -12, GM-CSF, IFN-γ при терапии ТЦЗ и IL-6, -12 и MCP-1 ингибиторами TNF-α [410]. В работе S. Kavashiri и соавт. высокопозитивные уровни IgM РФ, определявшиеся у больных РА до назначения препарата являлись эффективным серологическим маркером для прогнозирования достижения ремиссии болезни по индексу CDAI через 24 недели после начала терапии ТЦЗ [277]. Согласно результатам регрессионного анализа, из 33 биомаркеров отобраны наиболее “сильно” связанные с наличием клинического ответа на данный препарат: протеолитический фермент, участвующего в деградации хряща ММП-3, основной фактор неоангиогенеза VEGF и АЦЦП. Эти данные позволили создать МДИ, позволяющий с достаточной долей 207 вероятности прогнозировать клинический ответ, у пациентов с РА при терапии ТЦЗ. Таким образом, многопараметрический анализ протеомных биомаркеров является не только важным инструментом для изучения иммунопатогенетических механизмов заболевания, но и для идентификации индивидуальных профилей аутоантител, белков острой фазы воспаления, показателей костного и хрящевого метаболизма, цитокинов, хемокинов, ростовых факторов, что позволяет на качественно новом уровне проводить раннюю диагностику, оценку активности патологического процесса и прогноза заболевания, а также предсказывать эффективность применения ГИБП при РА. 208 ВЫВОДЫ 1. Диагностическими маркерами РА служат IgM/IgA РФ, АЦЦП и АМЦВ. АМЦВ обладает наилучшей ДЧ (85%), а АЦЦП – ДС (87%) и ОППР (5,8). При раннем РА IgA РФ, АЦЦП и АМЦВ демонстрируют меньшую ДЧ по сравнению с более поздними стадиями заболевания. Одновременная оценка концентраций IgM/IgA РФ, АЦЦП и АМЦВ повышает ДЧ исследования до 90-92%. 2. Повышение уровня аутоантител в сыворотках больных РА, ассоциируется с клинико-лабораторными показателями активности и рентгенологическим прогрессированием заболевания. При раннем РА уровень IgM РФ коррелирует с ЧПС (r=0,6, p=0,03); АЦЦП - с ЧБС (r=0,6, p=0,02); АМЦВ - с СРБ (r=0,3, p=0,001). При РА длительностью более 6 месяцев уровень IgM РФ коррелирует с СРБ (p=0,3, r=0,0001); IgA РФ - с СОЭ (p=0,3, r=0,005); АЦЦП - с ЧБС (r=0,3, p=0,003). Уровень IgM РФ на II-IV рентгенологических стадиях РА достоверно превышает таковой на I стадии (p=0,01; 0,002; 0,006). Увеличение концентраций АЦЦП и АМЦВ ассоциируется с развитием эрозивного поражения суставов (по Sharp-van der Heijde) (p=0,03) при РА. 3. Увеличение сывороточных концентраций белков острой фазы воспаления отражает активность РА. На ранней стадии заболевания обнаружена корреляция DAS28 с уровнем кальпротектина (r=0,4, p=0,02), а при РА длительностью более 6 месяцев с уровнем СРБ (r=0,4, p=0,04). 4. Прогрессирование РА сопровождается повышением сывороточных уровней маркеров костного и хрящевого метаболизма sRANKL, COMP и ММП-3. На ранней стадии РА с показателями клинико-лабораторной активности заболевания (СРБ, DAS28) положительно коррелирует концентрация sRANKL (r=0,5, p=0,05; r=0,4, p=0,05), при заболевании длительностью более 6 месяцев с СОЭ и СРБ коррелирует 209 концентрация ММП-3(r=0,4, p=0,01; r=0,4, p=0,001). Обнаружено повышение уровней sRANKL (p=0,03) и СОМP (p=0,03) на IV рентгенологической стадии РА. 5. Уровни цитокинов в сыворотке крови изменяются в зависимости от длительности РА. Цитокиновый профиль при раннем РА, в отличие от РА длительностью более 6 мес., характеризуется более высокой концентрацией провоспалительных (MIP-1α, p=0,02), Th1 (IFN-γ, p=0,005), Th17 (IL-17, p=0,003) цитокинов, колониестимулирующих факторов (IL-7, p=0,01; G-CSF, p=0,02) и хемокинов (IL-8, p=0,05; IP10, p=0,0003). 6. При РА уровни провоспалительных, антивоспалительных, Th1, Th2, Th17 цитокинов, и колониестимулирующих факторов положительно коррелируют с концентрацией РФ и АЦБ в сыворотке крови. При РА длительностью более 6 мес. обнаружена прямая взаимосвязь концентрации белков острой фазы воспаления (СРБ, кальпротектин) с провоспалительными, Th1, Th2 цитокинами; активности заболевания (DAS28) – с колонистимулирующими провоспалительными цитокинами, факторами; костного показателей и хрящевого метаболизма - с антивоспалительными, Th2 цитокинами и хемокинами. 7. Серопозитивность по АЦБ при РА ассоциируется с повышением уровня IgM/IgA РФ (p=0,0001), провоспалительных (TNF-α, IL-15; p=0,02, 0,03), антивоспалительных (IL-1rа,-2,-5,-9-10,-12, эотаксина; p=0,01, 0,003, 0,003, 0,005, 0,04, 0,01) цитокинов, колонистимулирующего фактора GM-CSF (p=0,001) и хемокина MCP-1 (p=0,01). 8. На фоне терапии ИНФ, РТМ, ТЦЗ у пациентов с РА отмечается достоверное снижение СОЭ и СРБ. При применении ТЦЗ стойкая нормализация уровня данных маркеров воспаления регистрируется уже 210 через 2 недели после первой инфузии. Терапия РТМ и ТЦЗ сопровождается концентрации снижением АМЦВ и уровня не IgM/IgA влияет на РФ, уменьшением концентрацию АЦЦП, Использование ИНФ вызывает снижение уровня только IgM РФ. Применение ТЦЗ и РТМ индуцирует уменьшение концентраций всех функциональных классов цитокинов. Терапия ИНФ не влияет на уровни Th17 цитокинов, стромальных и ангиогенных факторов. 9. При РА сывороточные уровни СРБ, IgM РФ, АЦБ, провоспалительных, антивоспалительных, Th1, Th2 цитокинов и колонистимулирующих факторов достоверно отражают концентрацию данных биомаркеров в синовиальной жидкости. В синовиальной жидкости, как и в сыворотке крови, обнаружена положительная корреляция уровней провоспалительных цитокинов с СРБ, IgM РФ, АЦБ; Th1 цитокинов с IgM РФ, Th2 цитокинов, клонистимулирующих факторов с IgM РФ АЦБ. 10. Многопараметрический индекс для диагностики раннего РА основанный на определении уровней СРБ, АЦЦП, IL-6, IFN-γ, IP-10, GM-CSF значительно превосходит по своей клинической информативности (ДЧ - 97%; ДС - 94%; ОППР - 16,1, ОПОР - 0,03; ППК – 0,98) рутинные биомаркеры входящие в классификационные критерии заболевания (IgM РФ, АЦЦП, СОЭ, СРБ). 11. Иммунологический индекс активности РА, включающий оценку провоспалительных цитокинов, хемокинов и ростовых факторов (IL1β,-6-15, TNF-α диагностическую MCP-1, FGF-2), эффективность проявляет при “отличную” дифференциации высокой/средней и низкой степеней активности заболевания по DAS28 (ППК 0,94; 95% ДИ 0,88-1,0). 12. Мультиплексный анализ базальных уровней лабораторных биомаркеров позволяет эффективно прогнозировать ответ на терапию 211 ингибиторами TNF-α (СРБ, IL-12, -9, -17; ППК 0,96; ДИ 0,0-0,1), моноклональными антителами к мембранному CD20-антигену Вклеток (IgM РФ, IL-1ra,-10, G-CSF, VEGF; ППК 0,99, ДИ 0,9-1,0) и рецепторам интерлейкина-6 (АЦЦП, ММП-3, VEGF; ППК: 0,85, ДИ: 0,7-1,0). Практические рекомендации 1. Обнаружение в сыворотках больных повышенных уровней IgM/IgA РФ и/или АЦЦП, рекомендуется использовать в качестве лабораторных критериев диагностики РА. Определение АМЦВ является полезным дополнительным серологическим тестом у IgM/IgA РФ- и/или АЦЦПнегативных пациентов. Для диагностики раннего РА наиболее полезным является применение МДИ на основе измерения концентраций СРБ, АЦЦП, IL-6, IFN-γ, IP-10 и GM-CSF. 2. МДИ включающий определения уровней IL-1β,-6-15, TNF-α MCP-1и FGF-2 рекомендуется применять в качестве дополнительного иммунологического теста при оценке активности РА. 3. Повышение уровней АЦЦП, АМЦВ, sRANKL, СОМP в сывороке крови при РА следует рассматривать как лабораторный маркер развития тяжелого деструктивного поражения суставов. 4. Для прогнозирования эффективности терапии РА - ИНФ, РТМ и ТЦЗ целесообразно использовать МДИ созданные на основе измерения базальных уровней: СРБ, IL-12, -9, -17; IgM РФ, IL-1ra,-10, G-CSF, VEGF и АЦЦП, ММП-3, VEGF соответственно. 212 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Harris E.D. Rheumatoid Arthritis: pathophysiology and implication for therapy // N. Engl. J. Med.-1990. - Vol. 322. - P. 1277-1289. 2. Ревматология. Национальное руководство. / Под ред. Е.Л. Насонова, В.А. Насоновой, М.: ГЭОТАР-Медиа - 2008. – 737 с. 3. McInnes I.B., Schett G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis // N. Engl. J. Med. - 2011. - Vol. 365. - P. 2205-2219. 4. Samuels J., Ng Y.S., Coupillaud C. et al. Impaired early B cell tolerance in patients with rheumatoid arthritis // J. Exp. Med. – 2005. - Vol. 201. - P. 1659-1667. 5. Brennan F.M., McInnes I.B. Evidence that cytokines play a role in rheumatoid arthritis // J. Clin. Invest. – 2008. - Vol. 118. - P. 3537-3545. 6. Kim J.M., Weisman M. H. When does rheumatoid arthritis begin and why do we need to know? // Arthritis Rheum. – 2000. – Vol. 43 (3). P. 473-484. 7. Carrasco R., Barton A. Biomarkers of outcome in rheumatoid arthritis // Rheumatology Reports. – 2010. – Vol. 2 (1). P. 26-38. 8. Mease P.J. The potential roles for novel biomarkers in rheumatoid arthritis assessment // Clin. Exp. Rheumatol. – 2011. - Vol. 29. – P. 567-574. 9. Chandra P.E., Sokolove J., Hipp B.G. et al. Novel multiplex technology for diagnostic characterization of rheumatoid arthritis [Электронный ресурс] // Arthritis Research&Therapy. – 2011. – Vol.13 (3). - Режим доступа: http://arthritis-research.com/content/13/3/r102. 10. Taylor P., Gartemann J., Hsieh J. et al. A systematic review of serum biomarkers anti-cyclic citrullinated peptide and rheumatoid factor as tests for rheumatoid arthritis [Электронный ресурс] // Autoimmune Dis. – 2011. Vol. – 2011. - Режим доступа: http://dx.doi.org/10.4061/2011/815038. 11. Aletaha D., Neogi T., Silman A. et al. 2010 rheumatoid arthritis classification criteria // Arthritis Rheum. – 2010. - Vol. 62. - P. 2569–2581. 12. Shmerling R.H., Delbanco T.L. The rheumatoid factor: an analysis of clinical utility // Am. J. Мed. – 1991. Vol. 91: P. - 528-534. 213 13. Houssien D.A., Jonsson T., Davies E. et all. Clinical significanse of IgA rheumatoid factor subclasses in rheumatoid arthritis // J. Rheumatol. – 1997. – Vol. 24. – P. 2119-2122. 14. Vencovsky J., Machacek S., Sedova L., et al. Autoantibodies can be prognostic markers of an erosive disease in early rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2003. – Vol. 62. - P. 427-430. 15. Nishimura K., Sugiyama D., Kogata Y. et al. Meta-analysis: diagnostic accuracy of anti-cyclic citrullinated peptide antibody and rheumatoid factor for rheumatoid arthritis // Ann. Intern. Med. – 2007. – Vol. 146. – P. 797808. 16. Dejaco C., Klotz V., Larcher H. et al. Diagnostic value of antibodies against a modified citrullinated vimentin in rheumatoid arthritis // Arthritis Res. Ther. - 2006. – Vol. 8 (6). - P. 119-125. 17. Ursum J., Schaardenburg D., Nielen M. The value of antibodies to mutated citrullinated vimentin in early arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2007. – Vol. 66 (11). - P. 339. 18. Matsson L., Mullazehi M., Wick M. et al. Antibodies against citrullinated vimentin in rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. – Vol. 58. - 2008. - P. 36-45. 19. Young B.J., Mallya R.K., Leslie R.D. et al. Anti-keratin antibodies in rheumatoid arthritis // Br. Med. J. – 1979. – Vol. 2. - P. 97-99. 20. Genevay S., Hauem G., Verpillat P et al. An eight year prospective study of outcome prediction by antiperinuclear factor and antikeratin antibodies at onset of rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2002. Vol. 6. – P. 734736. 21. Dayer E., Dayer J., Roux-Lombard P. Primer: the practical use of biological markers of rheumatic and systemic inflammatory diseases // Nat. Clin. Pract. Rheumatol. – 2007. Vol. 3 (9). – P. 512-520. 214 22. de Seny D., Fillet M., Ribbens C. et al. Monomeric calgranulins measured by SELDI-TOF mass spectrometry and calprotectin measured by ELISA as biomarkers in arthritis // Clin Chem. – 2008. Vol. – 54 (6). - P. 1066-1075. 23. Garnero P., Landewé R., Boers M. et al. Association of baseline levels of markers of bone and cartilage degradation with long-term progression of joint damage in patients with early rheumatoid arthritis: the COBRA study // Arthritis Rheum. – 2002. – Vol. 46. - P. 2847-2856. 24. Syversen S.W., Goll G.L., van der Heijde D. et al. Cartilage and bone biomarkers in rheumatoid arthritis: prediction of 10-year radiographic progression // J. Rheumatol. - 2009. - Vol. - 36: P. 266-272. 25. Ally M.M., Hodkinson B., Meyer P.W. et al. Serum matrix metalloproteinase-3 in comparison with acute phase proteins as a marker of disease activity and radiographic damage in early rheumatoid arthritis [Электронный ресурс] // Mediators Inflamm. – 2013. - Vol. 2013. – Режим доступа: http://dx.doi.org/10.1155/2013/183653. 26. Romano M., Polentarutti N., Fruscella P. et al. Role of IL-6 and its soluble receptor in induction of chemokines and leukocyte recruitment // Immunity. – 1997. – Vol. 6. - P. 315-325. 27. Lally F., Smith E., Filer A. et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium // Arthritis Rheum. – 2005. – Vol. 52. – P. 3460-3499. 28. Smolen J.S., Aletaha D., Koeller M. et al. New therapies for treatment of rheumatoid arthritis // Lancet. – 2007. – Vol. 370. P. 1861-1874. 29. Paleolog E.M. Angiogenesis in rheumatoid arthritis // Arthritis Res. – 2002. – Vol. 4 (3). – P. 81-90. 30. Naka T., Nishimoto N., Kishimoto T. The paradigm of IL-6: from basic science to medicine // Arthritis Res. – 2002. - Vol. 4 (3). – P. 233-242. 31. Andrews N.C. Anemia of inflammation: the cytokine-hepcidin link // J. Clin. Invest. – 2004. – Vol. 113. – P. 1251-1253. 215 32. Chrousos G.P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immunemediated inflammation // N. Engl. J.Med. – 1995. – Vol. 332. P. 1351-1362. 33. Firestein G.S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis // J. Clin. Rheumatol. – 2005. – Vol. 11(3). – P. 39-44. 34. Astry B., Venkatesha S.H., Moudgil K.D. Temporal cytokine expression and the target organ attributes unravel novel aspects of autoimmune arthritis // Indian. J. Med. Res. – 2013. – Vol. 138(5). - P. 717-731. 35. Burska A., Boissinot M., Ponchel F. Cytokines as biomarkers in rheumatoid arthritis [Электронный ресурс] // Mediators Inflamm. 2014. – Vol. 2014. – Режим доступа: http://dx.doi.org/10.1155/2014/545493. 36. Wener M. Multiplex, megaplex, index, and complex: the present and future of laboratory diagnostics in rheumatology [Электронный ресурс] // Arthritis Research & Therapy. - 2011. – Vol. 13 (6). – Режим доступа: http://arthritis-research.com/content/13/6/134. 37. Zhou X., Fragala M.S., McElhaney J. et al. Conceptual and methodological issues relevant to cytokine and infl ammatory marker measurements in clinical research // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. – 2010. – Vol. 13(5). – P. 541-547. 38. Bossuyt P.M. The thin line between hope and hype in biomarker research // JAMA. – 2011. – Vol. 305. – P. 2229-2230. 39. Katz M.H. Multivariable analysis: a primer for readers of medical research //Ann. Intern. Med. – 2003. - Vol. 138. P. 644-650. 40. Kingsmore S.F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays // Nat. Rev. Drug. Discov. – 2006. – Vol. 5(4). - P. 310-320. 41. Bansard C., Lequerré T., Daveau M. Et al. Can rheumatoid arthritis responsiveness to methotrexate and biologics be predicted? // Rheumatology (Oxford). – 2009. – Vol. 48(9). – P. 1021-1028. 216 42. Насонов Е.Л. Современные направления иммунологических исследований при хронических воспалительных и аутоиммунных заболеваниях человека // Тер. Архив. – 2001. - № 8. – С. 43-46. 43. Kavanaugh A.F., Solomon H.D., Schur P. et al. Guidelines for immunologic laboratory testing in the rheumatic diseases: an introduction // Arthritis Rheum. – 2002. – Vol. 47. - P. 429-433. 44. Wilk A.S., Gordon T.P., Kavanaugh A.F. et al. IUIS/WHO/AF/CDC committee for the standardization of autoantibodies in rheumatic and related diseases. Cutting edge diagnostics in rheumatology: the role of patients, clinicians, and laboratory scientists in optimizing the use of autoimmune serology // Arthritis Rheum. – 2004. – Vol. 51. – P. 291-298. 45. Кишкун А.А., Арсенин С.Л., Кольченко О.Л. Доказательная лабораторная медицина // Клин. лаб. Диагностика. - 2005. - № 5. – С. 24-32. 46. Мошкин А.В., Долгов В.В. Обеспечение качества в клинической лабораторной диагностике / М.: Медиздат. – 2004. - 216 c. 47. Новиков А.А., Современные Александрова методы Е.Н., лабораторной Черкасова диагностики М.В. и соавт. ревматоидного артрита // Научно-практическая ревматология. – 2010. - № 1. С. 31-45. 48. Swedler W., Wallman J., Froelich C.J., Teodorescu M. Routine measurement of IgM, IgG, and IgA rheumatoid factors: high sensitivity, specificity, and predictive value for rheumatoid arthritis // J. Rheumatol. 1997. – Vol. 24. – P. 1037-1044. 49. Shmerling R.H., Delbanco T.L. How useful is the rheumatoid factor? An analysis of sensitivity, specificity, and predictive value // Arch. Intern. Med. – 1992. – Vol. 152 (18). – P. 2417-2420. 50. Goldbach-Mansky R., Lee J., McCoy A. et al. Rheumatoid arthritis associated autoantibodies in patients with synovitis of recent onset // Arthritis Res. – 2000. – Vol. 2. – P. 236-243. 217 51. Nell V.P., Machold K.P., Stamm T.A. et al. Autoantibody profiling as early diagnostic and prognostic tool for rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. 2005. – Vol. 64. – P. 1731-1736. 52. van Boekel M.A., Vossenaar E.R., van den Hoogen F.H., et al. Autoantibody systems in rheumatoid arthritis: specificity, sensitivity and diagnostic value // Arthritis Res. – 2002. – Vol. 4. – P. 87-93. 53. van Leeuwen M.A., Westra J., van Riel P.L. et al. IgM, IgA, and IgG rheumatoid factors in early rheumatoid arthritis predictive of radiological progression? // Scand. J. Rheumatol. – 1995. Vol. 24. – P. 146-153. 54. Kanmert D., Kastbom A., Almroth G., et al. IgG rheumatoid factors against the four human Fc-gamma subclasses in early rheumatoid arthritis (the Swedish TIRA project) // Scand. J. Immunol. – 2012. – Vol. 75(1). – P. 115119. 55. Nienhius R.L.F., Maudema E.A. A new serum factor in patients with rheumatoid arthritis. The antiperinuclear factor // Ann. Rheum. Dis. – 1964. – Vol. 23. – P. 302-305. 56. Насонов Е.Л., Штутман В.З., Сперанский А.И. Антиперинуклеарный фактор и антитела к кератину: новые серологические маркеры ревматоидного артрита // Клинич. ревматол. – 1993. - № 2. – С. 20-24. 57. Alnigenis M.N., Warikoo S., Barland P. Amtiperinuclear factor and antikeratin antibody: diagnostic use in a clinical laboratory setting // J. Rheumatol. – 2000. – Vol. 27(8). - 2056-2057. 58. Menard H., Lapointe E., Rochdi M., et al. Insights into rheumatoid arthritis derived from the Sa immune system // Arthritis Res. – 2000. – Vol. 2. P. 429-432. 59. Vincent C., Simon M., Sebbag M. et al. Immunoblotting detection of autoantibodies to human epidermis filaggrin: a new dizgnostic test for rheumatoid arthritis // J. Rheumatol. – 1998. – Vol. 25(5). – P. 838-846. 218 60. Pamela L., Palosio T., Aho K. et al. Association of autoantibodies to filaggrin with an active disease in early rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2001. – Vol. 60. – P. 32-35. 61. Avouac J., Gossec L., Dougados M. Diagnostic and predictive value of anticyclic citrullinated protein antibodies in rheumatoid arthritis: a systematic literature review // Ann. Rheum. Dis. – 2006. – Vol. 65. – P. 845- 851. 62. López-Longo F., Rodríguez-Mahou M., Sánchez-Ramon S. et al. Anticyclic citrullinated peptide versus anti-Sa antibodies in diagnosis of rheumatoid arthritis in an outpatient clinic for connective tissue disease and spondyloarthritis // J. Rheumatol. – 2006. – Vol. 33. – P. 1476–1481. 63. Schellekens G.A., de Jong B.A., van den Hoogen F.H. et al. Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies // J. Clin. Invest. – 1998. – Vol. 101(1). – P. 273-281. 64. Schellekens G., Visser H., de Jong B. et al. The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide // Arthritis Rheum. – 2000. – Vol. 43. – P. 155–163. 65. Lee D.M., Schur P.H. Clinical utility of the anti-CCP assay in patients with rheumatic diseases //Ann. Rheum. Dis. – 2003. Vol. 62. - P.870-874. 66. Suzuki K., Sawada T., Murakami A. et al. High diagnostic performance of ELISA detection of antibodies to citrullinated antigens in rheumatoid arthritis // Scand. J. Rheumatol. – 2003. –Vol. 32. – P. 197-204. 67. Aggarwal R., Liao K., Nair R. et al. Anti-citrullinated peptide antibody assays and their role in the diagnosis of rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. - 2009. – Vol. 61. - P. 1472-1483. 68. Nijenhuis S., Zendman A.J, Vossenaar E.R. et al. Autoantibodies to citrullinated proteins in rheumatoid arthritis: clinical performance and biochemical aspects of an RA-specific marker // Clin. Chim. Acta. – 2004. – Vol. 350. – P. 17-34. 219 69. Bizzaro N., Mazzanti G., Tonutti E. et al. Diagnostic accuracy of the anticitrulline antibody assay for rheumatoid arthritis // Clin. Chem. – 2001. – Vol. 47. – P. 1089-1093. 70. Bas S., Genevay S., Meyer O., Gabay C. Anti-cyclic citrullinated peptide antibodies, IgM and IgA rheumatoid factors in the diagnosis and prognosis of rheumatoid arthritis // Rheumatology (Oxford). – 2003. – Vol. 42. – P. 677-680. 71. Александрова Е.Н., Чемерис Н.А., Каратеев Д.Е. и др. Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду при ревматоидном артрите // Тер. Архив. – 2004. - № 12. – С. 64-8. 72. Niewold T., Harrison M., Paget S. et al. Anti-CCP antibody testing as a diagnostic and prognostic tool in rheumatoid arthritis // Q. J. Med. – 2007. – Vol. 100. – P. 193–201. 73. Ronnelid J., Wick M.C., Lampa J. et al. Longitudinal analysis of citrullinated protein/peptide antibodies (anti-CP) during 5 year follow up in early rheumatoid arthritis: anti-CP status predicts worse disease activity and greater radiological progression // Ann. Rheum. Dis. - 2005. – Vol. 64. – C. 1744-1749. 74. Combe B., Dougados M., Goupille P. et al. Prognostic factors for radiographic damage in early rheumatoid arthritis: a multiparameter prospective study // Arthritis Rheum. – 2001. – Vol. 44. – P. 1736-1743. 75. Kroot E.J., de Jong B.A., van Leeuwen M.A. et al. The prognostic value of anti-cyclic citrullinated peptide antibody in patients with recent-onset rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. – 2000. – Vol. 43. – P. 1831-1835. 76. Jansen L.M., van Schaardenburg D., van der Horst-Bruinsma I. et al. The predictive value of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in early arthritis // J. Rheumatol. – 2003. – Vol. 30. – P. 1691-1695. 77. Valesini G., Alessandri C. Anticitrullinate antibodies and rheumatoid factors: two distinct autoantibody systems // Arthritis Res. Ther. – 2009. Vol. 11. – P. 125. 220 78.van Beers J.J.B.C., van Venrooij W.J., Pruijn G.J.M. Two major classes of rheumatoid arthritis: CCP distinguishes between ACPA-positive and ACPAnegative RA // From pathogenesis to therapy of autoimmune diseases. 2009. - Vol.6. – P. 265-277. 79. Klareskog L., Catrina A.I., Paget S. Rheumatoid arthritis // Lancet. – 2009. – Vol. 373(9664). – P. 659-672. 80. van Gaalen F.A., Linn-Rasker S.P., van Venrooij W.J. et al. Autoantibodies to cyclic citrullinated peptides predict progression to rheumatoid arthritis in patients with undifferentiated arthritis:a prospective cohort study // Arthritis Rheum. - 2004. – Vol.50. – P. 709–715. 81. van der Helm-van Mil A.H., le Cessie S., van Dongen H..et al. A prediction rule for disease outcome in patients with recent-onset undifferentiated arthritis: how to guide individual treatment decisions // Arthritis Rheum. 2007. – Vol. 56. – P. 433-440. 82. Ursum J., Bos W.H., van de Stadt R.J. et al. Different properties of ACPA and IgM-RF derived from a large dataset: further evidence of two distinct autoantibody systems [Электронный ресурс] // Arthritis Res. Ther. - 2009. – Vol. 11. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2714121/. 83. Gibbons L.J., Hyrich K.L. Biologic therapy for rheumatoid arthritis. Clinical efficacy and predictors of response // Biodrugs. - 2009. – Vol. 23. – P. 111-124. 84. van der Linden M.P., van der Woude D., Ioan-Facsinay A. et al. Value of anti-modified citrullinated vimentin and third-generation anti-cyclic citrullinated peptide compared with second-generation anti-cyclic citrullinated peptide and rheumatoid factor in predicting disease outcome in undifferentiated arthritis and rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. – 2009. – Vol. 60. – P. 2232-2241. 221 85. Qin X., Deng Y., Xu J. et al. Meta-analysis: diagnostic value of serum antimutated citrullinated vimentin antibodies in patients with rheumatoid arthritis // Rheumatol. Int. – 2011. - Vol. 31. – P. 785-794. 86. Luime J.J., Colin E.M., Hazes J.M., Lubberts E. Does anti-mutated citrullinated vimentin have additional value as a serological marker in the diagnostic and prognostic investigation of patients with rheumatoid arthritis? // Ann. Rheum. Dis - 2010. – Vol. 69. – P. 337-344. 87. Sox H.C., Liang M.H. The erythrocyte sedimentation rate. Guidelines for rational use // Ann. Intern. Med. – 1986. – Vol. 104. P. 515-523. 88. Brigden M. The erythrocyte sedimentation rate. Still a helpful test when used judiciously // Postgrad. Med. – 1998. – Vol. 103. – P. 257-274. 89. Gonzalez-Gay M., Rodriguez-Valverde V., Blanco R. et al. Polymyalgia rheumatica without significantly increased erythrocyte sedimentation rate. A more benign syndrome // Arch. Intern. Med. – 1997. – Vol. 157. – P. 317320. 90. Pepys M.B., Baltz M.L. Acute phase proteins with special reference to Creactive protein and related proteins (pentaxins) and serum amyloid A protein // Adv.Immunol. – 1983. – Vol. 34. – P. 141-212. 91. Vigushin D.M., Pepys M.B., Hawkins P.N. Metabolic and scintigraphic studies of radioiodinated human C-reactive protein in health and disease // J. Clin. Invest. 1993, 91, 1351-1357. 92. Pepys M.B., Hirschfield G.M. C-reactive protein: a critical update // J. Clin. Invest. – 2003. – Vol. 111. – P. 1805-1812. 93. Scott D.L. Radiological progression in established rheumatoid arthritis // J. Rheumatol. Suppl. - 2004. – Vol. 69. - P. 55-65. 94. Wells G., Becker J., Teng J. et al. Validation of the Disease Activity Score 28 (DAS28) disease progression in patients with rheumatoid and EULAR response criteria based on CRP against arthritis, and comparison with the DAS28 based on ESR // Ann. Rheum. Dis. – 2009. – Vol. 68(6). – P. 954960. 222 95. Baillet A., Trocmé C., Berthier S. et al. Synovial fluid proteomic fingerprint: S100A8, S100A9 and S100A12 proteins discriminate rheumatoid arthritis from other inflammatory joint diseases // Rheumatology (Oxford). – 2010. - Vol. 49(4). - P. 671-682. 96. Hessian P.A., Edgeworth J., Hogg N. et al. MRP-8 and MRP-14, two abundant Ca(2+)-binding proteins of neutrophils and monocytes // J. Leukoc. Biol. – 1993. – Vol. 53(2). – P. 197-204. 97. Hammer H.B., Haavardsholm E.A., Kvien T.K. Calprotectin (a major leucocyte protein) is associated with the levels of anti-CCP and rheumatoid factor in a longitudinal study of patients with very early rheumatoid arthritis // Scand. J. Rheumatol. – 2008. - Vol. 37(3). – P. 179-182. 98. Chen Y.S., Yan W., Geczy C.L. et al. Serum levels of soluble receptor for advanced glycation end products and of S100 proteins are associated with inflammatory, autoantibody, and classical risk markers of joint and vascular damagein rheumatoid arthritis [Электронный ресурс] // Arthritis. Res. Ther. – 2009. – Vol. 11(2). – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2688185/. 99. Brun J.G., Haga H.J., Bøe E. et al. Calprotectin in patients with rheumatoid arthritis: relation to clinical and laboratory variables of disease activity // Rheumatol. – 1992. – Vol. 19(6). – P. 859-862. 100. Madland T.M., Hordvik M., Haga H.J. et al. Leukocyte protein calprotectin and outcome in rheumatoid arthritis. A longitudinal study // Scand. J. Rheumatol. – 2002. – Vol. 31(6). – P. 351-354. 101. Grevers L.C., de Vries T.J., Vogl T. et al. S100A8 enhances osteoclastic bone resorption in vitro through activation of Toll-like receptor 4: implications for bone destruction in murine antigen-induced arthritis // Arthritis Rheum. – 2011. – Vol. 63(5). - P. 1365-1375. 102. Geusens P. The role of RANK ligand/osteoprotegerin in rheumatoid arthritis // Ther. Adv. Musculoskelet. Dis. – 2012. – Vol. 4(4). – P. 225-233. 223 103. Lacativa P., Farias M. Osteoporosis and inflammation // Arq. Bras. Endocrinol. Metab. – 2010. Vol. 54(2). - P.123-132. 104. Romas E., Gillespie M.T., Martin T. Involvement of receptor activator of NFkappaB ligand and tumor necrosis factor-alpha in bone destruction in rheumatoid arthritis // Bone. – 2002. – Vol. 30. – P. 340-346. 105. Teitelbaum S.L. Osteoclasts: what do they do and how do they do it? // Am. J. Pathol. - 2007. – Vol. 170(2). – P. 427-435. 106. Gillespie M.T. Impact of cytokines and T lymphocytes upon osteoclast differentiation and function [Электронный ресурс] // Arthritis. Res. Ther. – 2007. – Vol. 9(103). – Режим доступа: http://arthritisresearch.com/content/9/2/103. 107. Tanaka Y., Nakayamada S., Okada Y. Osteoblasts and osteoclasts in bone remodeling and inflammation // Curr. Drug. Targets. Inflamm. Allergy. – 2005. Vol. 4(3). – P. 325-328. 108. Viswanathan A., Sylvester F.A. Chronic pediatric inflammatory diseases: effects on bone // Rev. Endocr. Metab. Disord. - 2008. – Vol. 9(2). – P. 107-122. 109. Hedbom E., Antonsson P., Hjerpe A., et al. Cartilage matrix proteins. An acidic oligomeric protein (COMP) detected only in cartilage // J. Biol. Chem. – 1992. Vol. 267. - P. 6132–6136. 110. Chen F.H., Herndon M.E., Patel N. et al. Interaction of cartilage oligomeric matrix protein/thrombospondin 5 with aggrecan // J. Biol. Chem. – 2007. – Vol. 282. – P. 24591–24598. 111. Mann H.H., Ozbek S., Engel J., Paulsson M. et al. Interactions between the cartilage oligomeric matrix protein and matrilins. Implications for matrix assembly and the pathogenesis of chondrodysplasias // J. Biol. Chem. – 2004. – Vol. 279. - P. 25294–25298. 112. Johnson A., Smith R., Saxne T. et al. Fibronectin fragments cause release and degradation of collagen-binding molecules from equine explant cultures // Osteoarthritis Cartilage. – 2004. - Vol. 12. – P. 149–159. 224 113. Tseng S., Reddi A.H., Di Cesare P.E. Cartilage Oligomeric Matrix Protein (COMP): A Biomarker of Arthritis // Biomark. Insights. – 2009. Vol. 17(4). – P. 33-44. 114. Skoumal M., Haberhauer G., Feyertag J. et al. Serum levels of cartilage oligomeric matrix protein are elevated in rheumatoid arthritis, but not in inflammatory rheumatic diseases such as psoriatic arthritis, reactive arthritis, Raynaud’s syndrome, scleroderma, systemic lupus erythematosus, vasculitis and Sjogren’s syndrome // Arthritis. Res. Ther. – 2004. – Vol. 6. P.73–74. 115. Gonza´lez-Alvaro I., Ortiz A., Tomero E. et al. Baseline serum RANKL levels may serve to predict remission in rheumatoid arthritis patients treated with TNF antagonists // Ann. Rheum. Dis. – 2007. - Vol. 66. – P. 1675–1678. 116. Соловьева Н.И. Матриксные металлопротеиназы и их биологические функции // Биоорганическая химия. – 1989. № 4. – С. 245-255. 117. Bhupinder S.S. Matrix metalloproteinases – an overview // Research and Reports in Biology. – 2010. Vol. 1. – P. 1–20. 118. Ouchi E, Iwata K, Yamanaka H. Serum MMP-3 in rheumatoid arthritis // Inflamm. Regen. – 2004. - Vol. 24. – P. 154–160. 119. McInnes I., Schett G. Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis // Nat. Rev. Immunol. - 2007. – Vol. 7(6). – P. 429-442. 120. Fabre S., Guisset C., Tatem L. et al. Protein biochip array technology to monitor rituximab in rheumatoid arthritis // Clin. Exp. Immunol. – 2009. – Vol. 155(3). – P. 395-402. 121. Blom M., Wenink M., Huijbens R. et al. Altered Circulating Cytokine Pattern after Administration of Rituximab is Correlated with Response to Therapy in Rheumatoid Arthritis // Arthritis Rheum. – 2008. – Vol. 58(19). – P. 450. 225 122. Dayer J., Beutler B., Cerami A. Cachectin/tumor necrosis factor stimulates collagenase and prostaglandin E2 production by human synovial cells and dermal fibroblasts // J. Exp. Med. – 1985. – Vol. 162(6). – P. 21632168. 123. Koch A.E., Kunkel S.L., Strieter R.M. Cytokines in rheumatoid arthritis // J. Investig. Med. – 1995. - Vol. 43(1). – P. 28-38. 124. Moss M., Sklair-Tavron L., Nudelman R. Drug insight: tumor necrosis factor-converting enzyme as a pharmaceutical target for rheumatoid arthritis // Nat. Clin. Pract. Rheumatol. – 2008. – Vol. 4(6). – P. 300-309. 125. Dinarello C.A. Interleukin-1 beta, interleukin-18, and the interleukin-1 beta converting enzyme // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1998. – Vol. 29(856). – P. 1-11. 126. Hom J.T., Bendele A.M., Carlson D.G. In vivo administration with IL-1 accelerates the development of collagen-induced arthritis in mice // J. Immunol. – 1988. – Vol. 141(3). – P. 834-41. 127. Brozik. M., Rosztóczy. I., Merétey. K. et al. Interleukin 6 levels in synovial fluids of patients with different arthritides: correlation with local IgM rheumatoid factor and systemic acute phase protein production // J. Rheumatol. – 1992. - Vol. 19(1). - P. 63-68. 128. Flannery C.R., Little C.B., Hughes C.E. et al. IL-6 and its soluble receptor augment aggrecanase-mediated proteoglycan catabolism in articular cartilage // Matrix Biol. – 2000. – Vol. 19(6). – P. 549-553. 129. Kishimoto T., Tanaka T., Yoshida K. et al. Cytokine signal transduction through a homo- or heterodimer of gp130 // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1995. – Vol. 766. – P. 224-234. 130. Bravo J., Heath J. Receptor recognition by gp130 cytokines // EMBO J. – 2000. – Vol. 19(11). – P. 2399-23411. 131. Dasgupta B., Corkill M., Kirkham B. et al. Serial estimation of interleukin 6 as a measure of systemic disease in rheumatoid arthritis // J Rheumatol. – 1992. – Vol. 19(1). – P. 22-25. 226 132. Grabstein K., Eisenman J., Shanebeck K. et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the beta chain of the interleukin-2 receptor // Science. - 1994. – Vol. 264(5161). – P. 965-968. 133. Fehniger T.A., Caligiuri M.A. Interleukin 15: biology and relevance to human disease // Blood. – 2001. – Vol. 97(1). – P. 14-32. 134. Gonzalez-Alvaro I., Ortiz A., Garcia-Vicuña R. et al. Increased serum levels of interleukin-15 in rheumatoid arthritis with long- term disease // Clin. Exp. Rheumatol. – 2003. – Vol. 21(5). – P. 639-642. 135. Hessian P., Highton J., Kean A. et al. Cytokine profile of the rheumatoid nodule suggests that it is a Th1 granuloma // Arthritis Rheum. 2003. – Vol. 48(2). – P. 334-338. 136. McInnes I.B., Leung B.P., Sturrock R.D. et al. Interleukin-15 mediates T cell-dependent regulation of tumor necrosis factor-alpha production in rheumatoid arthritis // Nat. Med. – 1997. – Vol. 3(2). – P. 189-195. 137. Liew F.Y., McInnes I.B. Role of interleukin 15 and interleukin 18 in inflammatory response // Ann. Rheum. Dis. – 2002. – Vol. 61(2). – P. 100102. 138. McInnes I., al-Mughales J, Field M. et al. The role of interleukin-15 in T-cell migration and activation in rheumatoid arthritis // Nat. Med. – 1996. – Vol. 2(2). – P. 175-182. 139. McInnes I.B., Leung B.P., Liew F.Y. Cell-cell interactions in synovitis. Interactions between T lymphocytes and synovial cells // Arthritis Res. - 2000. – Vol. 2(5). – P. 374-378. 140. Gracie J.A., Robertson S.E., McInnes I.B. Interleukin-18 // J. Leukoc. Biol. – 2003. –Vol. 73(2). – P. 213-224. 141. Göbel T., Schneider K., Schaerer B. et al. IL-18 stimulates the proliferation and IFN-gamma release of CD4+ T cells in the chicken: conservation of a Th1-like system in a nonmammalian species // J. Immunol. – 2003. – Vol. 171(4). – P. 1809-1815. 227 142. Dai S., Matsuno H., Nakamura H. et al. Interleukin-18 enhances monocyte tumor necrosis factor alpha and interleukin-1beta production induced by direct contact with T lymphocytes: implications in rheumatoid arthritis // Arthritis. Rheum. – 2004. – Vol. 50(2). – P. 432-443. 143. Kawashima M., Novick D., Rubinstein M. et al. Regulation of interleukin-18 binding protein production by blood and synovial cells from patients with rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. – 2004. – Vol. 50(6). – P. 1800-1805. 144. Moller B., Kessler U., Rehart S. et al. Expression of interleukin-18 receptor in fibroblast-like synoviocites // Arthritis Res. – 2002. – Vol. 4. – P. 139-144. 145. Miossec P. An update on the cytokine network in rheumatoid arthritis // Curr. Opin. Rheumatol. – 2004. – Vol. 16(3). P. 218-222. 146. Trinchieri G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity // Nat. Rev. Immunol. – 2003. – Vol. 3(2). – P.133-146. 147. Trinchieri G. Interleukin-12 and interferon-gamma. Do they always go together? // Am. J. Pathol. – 1995. – Vol. 147(6). – P. 1534-1538. 148. Trinchieri G. Interleukin-12: a proinflammatory cytokine with immunoregulatory functions that bridge innate resistance and antigenspecific adaptive immunity // Ann. Rev. Immunol. – 1995. – Vol. 13. – P. 251-276. 149. Trinchieri G. nterleukin-12: a proinflammatory cytokine with immunoregulatory functions that bridge innate resistance and antigenspecific adaptive immunity. // Annu. Rev. Immunol. – 1995. – Vol. 13. – P. 251-276. 150. Desai B.B., Quinn P.M., Wolitzky A.G. et al. IL-12 receptor. II. Distribution and regulation of receptor expression // J. Immunol. – 1992. – Vol. 148(10). – P. 3125-3132. 151. Sakkas L.I., Johanson N.A., Scanzello C.R. et al. Interleukin-12 is expressed by infiltrating macrophages and synovial lining cells in 228 rheumatoid arthritis and osteoarthritis // Cell Immunol. – 1998. – Vol. 188(2), - P. 105-110. 152. Kitagawa M., Mitsui H., Nakamura H. et al. Differential regulation of rheumatoid synovial cell interleukin-12 production by tumor necrosis factor alpha and CD40 signals // Arthritis Rheum. – 1999. – Vol. 42(9). - P. 19171926. 153. Kim T.S., Kang B.Y., Lee M.H. et al. Inhibition of interleukin-12 production by auranofin, an anti-rheumatic gold compound, deviates CD4(+) T cells from the Th1 to the Th2 pathway // Br. J. Pharmacol. – 2001. - Vol. 134(3). – P. 571-578. 154. Fossiez F., Djossou O., Chomarat P. et al. T cell interleukin-17 induces stromal cells to produce proinflammatory and hematopoietic cytokines // J. Exp. Med. – 1996. – Vol. 183(6). – P. 2593-2603. 155. Aggarwal S., Ghilardi N., Xie M. et al. Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17 // J. Biol. Chem. - 2003. – Vol. 278(3). – P. 1910-1914. 156. Bush K.A., Walker J.S., Lee C.S. et al. Cytokine expression and synovial pathology in the initiation and spontaneous resolution phases of adjuvant arthritis: interleukin-17 expression is upregulated in early disease. Clin. Exp. Immunol. – 2001. Vol. 123(3). – P. 487-495. 157. Kotake S., Udagawa N., Takahashi N. et al. IL-17 in synovial fluids from patients with rheumatoid arthritis is a potent stimulator of osteoclastogenesis // J. Clin. Invest. – 1999. – Vol. 103(9). – P. 1345-1352. 158. Attur M.G., Patel R.N., Abramson S.B. et al. Interleukin-17 up- regulation of nitric oxide production in human osteoarthritis cartilage // Arthritis Rheum. – 1997. – Vol. 40(6). – P. 1050-1053. 159. Lubberts E., van den Bersselaar L., Oppers-Walgreen B. Et al. IL-17 promotes bone erosion in murine collagen-induced arthritis through loss of the receptor activator of NF-kappa B ligand/osteoprotegerin balance // J. Immunol. – 2003. – Vol. 170(5). – P. 2655-2662. 229 160. Miossec P. Interleukin-17 in rheumatoid arthritis: if T cells were to contribute to inflammation and destruction through synergy // Arthritis Rheum. – 2003. –Vol. 48(3). – P. 594-601. 161. Nakae S., Nambu A., Sudo K. et al. Suppression of immune induction of collagen-induced arthritis in IL-17-deficient mice // J. Immunol. – 2003. – Vol. 171(11). – P. 6173-6177. 162. Nakae S., Saijo S., Horai R. et al. IL-17 production from activated T cells is required for the spontaneous development of destructive arthritis in mice deficient in IL-1 receptor antagonist // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2003. – Vol. 100(10). – P. 5986-5990. 163. Burchill M.A., Nardelli D.T., England D.M. et al. Inhibition of interleukin-17 prevents the development of arthritis in vaccinated mice challenged with Borrelia burgdorferi // Infect. Immun. – 2003. – Vol. 71(6). – P. 3437-3442. 164. Lubberts E., Koenders M., Oppers-Walgreen B. et al. Treatment with a neutralizing anti-murine interleukin-17 antibody after the onset of collagen-induced arthritis reduces joint inflammation, cartilage destruction, and bone erosion // Arthritis Rheum. - 2004. Vol. 50(2). – P. 650-659. 165. van Roon J., Wijngaarden S., Lafeber F. et al. Interleukin 10 treatment of patients with rheumatoid arthritis enhances Fc gamma receptor expression on monocytes and responsiveness to immune complex stimulation // J. Rheumatol. – 2003. – Vol. 30(4). – P. 648-651. 166. Hong K., Cho M., Min S. Effect of interleukin-4 on vascular endothelial growth factor production in rheumatoid synovial fibroblasts // Clin. Exper. Immunology. - 2006. – Vol. 147. – P. 573-579. 167. Koch A.E., Kunkel S.L., Harlow L.A. et al. Enhanced production of monocyte chemoattractant protein-1 in rheumatoid arthritis // J. Clin. Invest. – 1992. – Vol. 90(3). – P. 772-779. 230 168. Möller B., Paulukat J., Nold M. et al. Interferon-gamma induces expression of interleukin-18 binding protein in fibroblast-like synoviocytes // Rheumatology (Oxford). - 2003. – Vol. 42(3). – P. 442-445. 169. Smith K.A. T-cell growth factor // Immunol. Rev. – 1980. – Vol. 51. – P. 337-357. 170. Blanchard D.K., Kavanagh J.J., Sinkovics J.G. et al. Infiltration of interleukin-2-inducible killer cells in ascitic fluid and pleural effusions of advanced cancer patients // Cancer Res. – 1988. – Vol. 48(22). – P. 63216327. 171. Yokoyama A., Evavold B., Dunn D. et al. Production of IL-2 and IFN by TH2 clones // Immunol. Lett. – 1989. – Vol. 21(2). – P. 119-125. 172. Hamblin AS. Lymphokines and interleukins // Immunol. – 1988. Vol. 64(1). – P. 39-41. 173. Бережная Н.М., Горецкий Б.А. Биологические эффекты интерлейкина-2 и перспективы его использования в иммунотерапии злокачественных новообразований // Эксперим. онкология. – 1989. - № 11(6). – С. 38-44. 174. Fry T.J., Mackall C.L. Interleukin-7: from bench to clinic // Blood. - 2002. – Vol. 99(11). – P. 3892-3904. 175. De Benedetti F., Massa M., Pignatti P. et al. Elevated circulating interleukin-7 levels in patients with systemic juvenile rheumatoid arthritis // J. Rheumatol. – 1995. – Vol. 22(8). – P. 1581-1585. 176. van Roon J.A., Glaudemans K.A., Bijlsma J.W. et al. Interleukin 7 stimulates tumour necrosis factor alpha and Th1 cytokine production in joints of patients with rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2003. Vol. 62(2). – P. 113-119. 177. Alderson M.R., Tough T.W., Ziegler S.F. et al. Interleukin 7 induces cytokine secretion and tumoricidal activity by human peripheral blood monocytes // J. Exp. Med. – 1991. – Vol. 173(4). – P. 923-930. 231 178. Taha A., Grant V., Kelly R. Urinalysis for interleukin-8 in the non- invasive diagnosis of acute and chronic inflammatory diseases // Postgrad. Med. J. – 2003. – Vol. 79(929). – P. 159-163. 179. Rothe L., Collin-Osdoby P., Chen Y. et al. Human osteoclasts and osteoclast-like cells synthesize and release high basal and inflammatory stimulated levels of the potent chemokine interleukin-8 // Endocrinology. 1998. – Vol. 139(10). – P. 4353-4363. 180. Kraan M., Patel D., Haringman J. et al. The development of clinical signs of rheumatoid synovial inflammation is associated witch increased synthesis of the chemokine CXCL8 (interleukin 8) // Arthritis Res. – 2001. Vol 3. - P. 65-71. 181. Кадагидзе З.Г. Цитокины // Практич. Онкология. - 2003. – Vol. 4(3). – C. 131-139. 182. Lejeune D., Demoulin J., Renauld J. Interleukin 9 induces expression of three cytokine signal inhibitors: cytokine-inducible SH2-containing protein, suppressor of cytokine signalling (SOCS)-2 and SOCS-3, but only SOCS-3 overexpression suppresses interleukin 9 signalling // Biochem. J. – 2001. – Vol. 353(1). – P. 109-116. 183. Hart P.H., Ahern M.J., Smith M.D. et al. Regulatory effects of IL-13 on synovial fluid macrophages and blood monocytes from patients with inflammatory arthritis // Clin. Exp. Immunol. – 1995. – Vol. 99(3). – P. 331337. 184. Haas C.S., Amin M.A., Ruth J.H. et al. In vivo inhibition of angiogenesis by interleukin-13 gene therapy in a rat model of rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. – 2007. – Vol. 56(8). – P. 2535-2548. 185. Syversen S.W., Goll G.L., Haavardsholm E.A. et al. A high serum level of eotaxin (CCL 11) is associated with less radiographic progression in early rheumatoid arthritis patients [Электронный ресурс] // Arthritis. Res. Ther. – 2008. – Vol. 10(2). – Pежим доступа: e http://arthritisresearch.com/content/10/2/R28. 232 186. Yamashita A., Yonemitsu Y., Okano S. et al. Fibroblast growth factor- 2 determines severity of joint disease in adjuvant-induced arthritis in rats // J. Immunol. – 2002. – Vol. 168(1). – P. 450-457. 187. Nakano K, Okada Y, Saito K. et al. Induction of RANKL expression and osteoclast maturation by the binding of fibroblast growth factor 2 to heparan sulfate proteoglycan on rheumatoid synovial fibroblasts // Arthritis Rheum. – 2004. – Vol. 50(8). – P. 2450-2458. 188. Lawlor K., Campbell I., Metcalf D. et al. Critical role for granulocyte colony-stimulating factor in inflammatory arthritis // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2004. – Vol. 101(31). – P. 11398-11403. 189. Campbell I.K., Rich M.J., Bischof R.J. et al. The colony-stimulating factors and collagen-induced arthritis: exacerbation of disease by M-CSF and G-CSF and requirement for endogenous M-CSF // J. Leukoc. Biol. 2000. – Vol. 68(1). – P. 144-150. 190. Cook A.D., Braine E.L., Campbell I.K. et al. Blockade of collagen- induced arthritis post-onset by antibody to granulocyte-macrophage colonystimulating factor (GM-CSF): requirement for GM-CSF in the effector phase of disease // Arthritis Res. - 2001. – Vol. 3(5). – P. 293-298. 191. Hanaoka R., Kasama T., Muramatsu M. et al. A novel mechanism for the regulation of IFN-gamma inducible protein-10 expression in rheumatoid arthritis // Arthritis Res. Ther. - 2003. – Vol. 5(2). – P. 74-81. 192. Cho M.L., Yoon B.Y., Ju J.H. et al. Expression of CCR2A, an isoform of MCP-1 receptor, is increased by MCP-1, CD40 ligand and TGF-beta in fibroblast like synoviocytes of patients with RA // Exp. Mol. Med. - 2007. – Vol. 39(4). – P. 499-507. 193. Hatano Y., Kasama T., Iwabuchi H. et al. Macrophage inflammatory protein 1 alpha expression by synovial fluid neutrophils in rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 1999. – Vol. 58(5). – P. 297-302. 194. Hanyuda M., Kasama T., Isozaki T. et al. Activated leucocytes express and secrete macrophage inflammatory protein-1alpha upon 233 interaction with synovial fibroblasts of rheumatoid arthritis via a beta2integrin/ICAM-1 mechanism // Rheumatology (Oxford). – 2003. – Vol. 42(11). – P. 1390-1397. 195. Koch A.E., Kunkel S.L., Harlow L.A. et al. Macrophage inflammatory protein-1 alpha. A novel chemotactic cytokine for macrophages in rheumatoid arthritis // J. Clin. Invest. – 1994. – Vol. 93(3). – P. 921-928. 196. Toh K., Kukita T., Wu Z. et al. Possible involvement of MIP-1alpha in the recruitment of osteoclast progenitors to the distal tibia in rats with adjuvant-induced arthritis // Lab. Invest. – 2004. – Vol. 84(9). – P. 10921102. 197. Wang C.R, Liu M.F. Regulation of CCR5 expression and MIP-1alpha production in CD4+ T cells from patients with rheumatoid arthritis // Clin. Exp. Immunol. – 2003. – Vol. 132(2). – P. 371-378. 198. Beckmann M.P., Betsholtz C., Heldin C. et al. Comparison of biological properties and transforming potential of human PDGF-A and PDGF-B chains // Science. – 1988. – Vol. 241(4871). – P. 1346-1349. 199. Nistér M., Libermann T., Betsholtz C. et al. Expression of messenger RNAs for platelet-derived growth factor and transforming growth factoralpha and their receptors in human malignant glioma cell lines // Cancer Res. – 1988. – Vol. 48(14). – P. 3910-3918. 200. Nistér M., Hammacher A., Mellström K. et al. A glioma-derived PDGF A chain homodimer has different functional activities from a PDGF AB heterodimer purified from human platelets // Cell. – 1988. – Vol. 52(6). – P. 791-799. 201. Hart C., Forstrom J., Kelly J. et al. Two classes of PDGF receptor recognize different isoforms of PDGF // Science. - 1988. – Vol. 240(4858). – P. 1529-1531. 202. Heldin C., Bäckström G., Ostman A. et al. Binding of different dimeric forms of PDGF to human fibroblasts: evidence for two separate receptor types // EMBO J. – 1988. – Vol. 7(5). – P. 1387-1393. 234 203. Thornton S.C., Por S.B., Penny R. et al. Identification of the major fibroblast growth factors released spontaneously in inflammatory arthritis as platelet derived growth factor and tumour necrosis factor-alpha // Clin. Exp. Immunol. – 1991. – Vol. 86(1). – P. 79-86. 204. Kameda H., Ishigami H., Suzuki M. et al. Imatinib mesylate inhibits proliferation of rheumatoid synovial fibroblast-like cells and phosphorylation of Gab adapter proteins activated by platelet-derived growth factor // Clin. Exp. Immunol. – 2006. – Vol. 144(2). – P. 335-341. 205. Stanczyk J., Kowalski M., Grzegorczyk J. et al. RANTES and chemotactic activity in synovial fluids from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis // Mediators Inflamm. – 2005. – Vol. 6. – P. 343348. 206. Brenchley P.E. Antagonising angiogenesis in rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2001. – Vol. 60(3). – P. 71-74. 207. Murakami M., Iwai S., Hiratsuka S. et al. Signaling of vascular endothelial growth factor receptor-1 tyrosine kinase promotes rheumatoid arthritis through activation of monocytes/macrophages // Blood. – 2006. – Vol. 108(6). – P. 1849-1856. 208. Klimiuk P., Sierakowski S., Latosiewicz R. et al. Soluble adhesion molecules (ICAM-1, VCAM-1, and E-selectin) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in patients with distinct variants of rheumatoid synovitis // Ann. Rheum. Dis. – 2002. – Vol. 61(9). – P. 804-809. 209. Марченко Ж.С., Лукина Г.В. Роль сосудистого эндотелиального фактора роста в патогенезе ревматоидного артрита // Научно-практич. ревматол. – 2005. - № 1. – C. 57-61. 210. Kowanetz M., Ferrara N. Vascular endothelial growth factor signaling pathways: therapeutic perspective // Clin. Cancer. Res. – 2006. – Vol. 12(17). – P. 5018-5022. 235 211. Kanik K., Hagiwara E., Yarboro C. et al. Distinct patterns of cytokine secretion characterize new onset synovitis versus chronic rheumatoid arthritis // J. Rheumatol. – 1998. – Vol. 25(1). – P. 16-22. 212. Raza K., Falciani F., Curnow S. et al. Early rheumatoid arthritis is characterized by a distinct and transient synovial fluid cytokine profile of T cell and stromal cell origin // Arthritis Res. Ther. – 2005. – Vol. 7. – P. 784795. 213. Firestein G.S. Pathogenesis of rheumatoid arthritis: how early is early? // Arthritis Res.Ther. – 2005. – Vol. 7(4). – P. 157-159. 214. Miossec P., Verweij C.L., Klareskog L. et al. Biomarkers and personalized medicine in rheumatoid arthritis: a proposal for interactions between academia, industry and regulatory bodies // Ann. Rheum. Dis. – 2011. – Vol. 70(10). – P. 1713-1718. 215. Gibson D.S., Rooney M.E., Finnegan S. et al. Biomarkers in rheumatology, now and in the future // Rheumatology (Oxford). – 2012. – Vol. 51(3). – P. 423-433. 216. Atkinson A.J., Colburn W.A., Degruttola V.G. Biomarkers and surrogate endpoints: preferred definitions and conceptual framework // Clin. Pharmacol. Ther. – 2001. – Vol. 69. – P. 89-95. 217. Zhang H., Liu A.Y., Loriaux P. et al. Mass spectrometric detection of tissue proteins in plasma // Mol. Cell. Proteomics. – 2007. - Vol 6. – P. 6471. 218. Etzioni R., Urban N., Ramsey S. et al. The case for early detection // Nat. Rev. Cancer. – 2003. – Vol. 3. – P. 243-252. 219. Rifai N., Gillette M.A., Carr S.A. Protein biomarker discovery and validation: the long and uncertain path to clinical utility // Nat. Biotechnol. – 2006. – Vol. 24. – P. 971-983. 220. Guo Y., Fu Z., Van Eyk J.E. A proteomic primer for the clinician // Proc. Am. Thorac. Soc. – 2007. – Vol. 4. – P. 9-17. 236 221. Anderson L. Candidate-based proteomics in the search for biomarkers of cardiovascular disease // J. Physiol. Lond. – 2005. – Vol. 563. – P. 23-60. 222. Scott L.J., Evans E.L., Dawes P.T. et al: Comparison of IgA-alpha1- antitrypsin levels in rheumatoid arthritis and seronegative oligoarthritis: complex formation is not associated with inflammation per se // Br. J. Rheumatol. – 1998. – Vol. 37. – P. 398-404. 223. Tilleman K., Van Beneden K., Dhondt A. et al. Chronically inflamed synovium from spondyloarthropathy and rheumatoid arthritis investigated by protein expression profiling followed by tandem mass spectrometry // Proteomics. – 2005. – Vol. 5. – P. 2247-2257. 224. Sinz, A., Bantscheff M., Mikkat, S. et al., Mass spectrometric proteome analyses of synovial fluids and plasmas from patients suffering from rheumatoid arthritis and comparison to reactive arthritis or osteoarthritis // Electrophoresis. – 2002. – Vol. 23. – P. 3445–3456. 225. Drynda, S., Ringel, B., Kekow, M., et al., Proteome analysis reveals disease-associated marker proteins to differentiate RA patients from other inflammatory joint diseases with the potential to monitor anti-TNFalpha therapy // Pathol. Res. Pract. - 2004. – Vol. 200. – P. 165–171. 226. Hueber W., Tomooka B.H., Zhao X. et al. Proteomic analysis of secreted proteins in early rheumatoid arthritis: anti-citrulline autoreactivity is associated with up regulation of proinflammatory cytokines // Ann. Rheum. Dis. – 2007. – Vol. 66. – P. 712-719. 227. Jager W., Hoppireijs E.P.A.H., Wulffraat N.M. et al. Blood and synovial fluid cytokines signatures in patients with juvenile idiopatic arthritis a cross-sectional study // Ann. Rheum. Dis. – Vol. 66. – P. 589-598. 228. US Department of Health and Human Services. Draft Guidance for Industry, Clinical Laboratories, and Staff: In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assays [Электронный ресурс]. – 2012. – Режим доступа: http://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuida nce/GuidanceDocuments/ucm071455.pdf. 237 229. Cavet G., Centola M., Shen Y. et al. Development of a Multi- Biomarker Test for Rheumatoid Arthritis (RA) Disease Activity [Электронный ресурс] // Ann. Rheum. Dis. – 2010. - Vol 69(3). – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3621826/. 230. Bobbio-Pallavicini F, Caporali R, Alpini C et al. High IgA rheumatoid factor levels are associated with poor clinical response to tumour necrosis factor alpha inhibitors in rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2007. – Vol. 66(3). – P. 302-307. 231. Bobbio-Pallavicini F, Caporali R, Bugatti S. et al. What can we learn from treatment-induced changes in rheumatoid factor and anti-citrullinated Peptide antibodies? // J. Rheumatol. – 2008. – Vol. 35(10). – P. 1903-1905. 232. Grosjean C., de Chaisemartin L., Nicaise-Roland P. et al. Prospective cohort study of rituximab effects on rheumatoid factor, anti-cyclic citrullinated peptide antibodies and antinuclear antibodies in patients with long-standing rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2008. – Vol. 67(2). – P. 196. 233. Higashida J, Wun T, Schmidt S, Naguwa SM et al. Safety and efficacy of rituximab in patients with rheumatoid arthritis refractory to disease modifying antirheumatic drugs and anti-tumor necrosis factor-alpha treatment // J. Rheumatol. – 2005. – Vol. 32(11). – P. 2109-2115. 234. Bruns A, Nicaise-Roland P, Hayem G. et al. Prospective cohort study of effects of infliximab on rheumatoid factor, anti-cyclic citrullinated peptide antibodies and antinuclear antibodies in patients with long-standing rheumatoid arthritis // Joint Bone spine. – 2009. – Vol. 76(3). – P. 248-253. 235. Александрова Е.Н., Новиков А.А., Диатроптов М.Е., Насонов Е.Л. Подходы к прогнозированию терапии генно-инженерными биологическими препаратами при ревматоидном артрите. // Приложение к журналу Научно-практическая ревматология. - № 3. – 2009. – С. 3-17. 238 236. De Rycke L., Peene I., Hoffman I.E., Kruithof E. et al. Rheumatoid factor and anticitrullinated protein antibodies in rheumatoid arthritis: diagnostic value, associations with radiological progression rate, and extraarticular manifestations // Ann. Rheum. Dis. – 2004. – Vol. 63(12). – P. 1587-1593. 237. Caramaschi P., Biasi D., Tonolli E. et al. Antibodies against cyclic citrullinated peptides in patients affected by rheumatoid arthritis before and after infliximab treatment // Rheumatol. Int. – 2005. – Vol. 26(1). – P. 5862. 238. Braun-Moscovici Y., Markovits D., Zinder O. et al. Anti-cyclic citrullinated protein antibodies as a predictor of response to anti-tumor necrosis factor-alpha therapy in patients with rheumatoid arthritis // J. Rheumatol. – 2006. – Vol. 33(3). – P. 497-500. 239. Chen H.A., Lin K.C., Chen C.H. et al. The effect of etanercept on anti-cyclic citrullinated peptide antibodies and rheumatoid factor in patients with rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2006. – Vol. 65(1). – P. 3539. 240. Alessandri C., Bombardieri M., Papa N. et al. Decrease of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies and rheumatoid factor following antiTNFalpha therapy (infliximab) in rheumatoid arthritis is associated with clinical improvement // Ann. Rheum. Dis. – 2004. – Vol. 63(10). – P. 12181221. 241. Atzeni F, Sarzi-Puttini P, Dell'Acqua D. et al. Adalimumab clinical efficacy is associated with rheumatoid factor and anti-cyclic citrullinated peptide antibody titer reduction: a one-year prospective study [Электронный ресурс] // Arthritis Res. Ther. - 2006. – Vol. 8(1). – Режим доступа: e http://arthritis-research.com/content/8/1/R3. 242. Vis M., Bos W.H., Wolbink G. et al. IgM-rheumatoid factor, anti- cyclic citrullinated peptide, and anti-citrullinated human fibrinogen antibodies decrease during treatment with the tumor necrosis factor blocker 239 infliximab in patients with rheumatoid arthritis // J. Rheumatol. – 2008. – Vol. 35(3). – P. 425-428. 243. Cuchacovich M., Catalan D., Wainstein E. et al. Basal anti-cyclic citrullinated peptide (anti-CCP) antibody levels and a decrease in anti-CCP titres are associated with clinical response to adalimumab in rheumatoid arthritis // Clin. Exp. Rheumatol. – 2008. – Vol. 26(6). – P. 1067-1073. 244. Potter C., Hyrich K. L., Tracey A. et al. Association of rheumatoid factor and anticyclic citrullinated peptide positivity, but not carriage of shared epitope or PTPN22 susceptibility variants, with anti-tumour necrosis factor response in rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2009. – Vol. 68. – P. 69–74. 245. Wolbink G.J., Voskuyl A.E., Lems W.F. et al. Relationship between serum trough infliximab levels, pretreatment C reactive protein levels, and clinical response to infliximab treatment in patients with rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2005. – Vol. 64. – P. 704–707. 246. Sekigawa I., Yanagida M., Iwabuchi K. et al. Protein biomarker analysis by mass spectrometry in patients with rheumatoid arthritis receiving anti-tumor necrosis factor-alpha antibody therapy // Clin. Exp. Rheumatol. - 2008. – Vol. 26. – P. 261—267. 247. Dwivedi R.C., Dhindsa N., Krokhin O.V. et al. The effects of infliximab therapy on the serum proteome of rheumatoid arthritis patients [Электронный ресурс] // Arthr. Res. Ther. - 2009. – Vol. 11. – Режим доступа: e http://arthritis-research.com/content/11/2/R32. 248. Knudsen L., Hetland М., Johansen J. et al. Changes in plasma IL-6, plasma VEGF and serum YKL-40 during Treatment with Etanercept and Methotrexate or Etanercept alone in Patients with Active Rheumatoid Arthritis Despite Methotrexate Therapy // Biomarker Insights. - 2009. – Vol. 4. – P. 91–95. 249. Wijbrandts C.A., van Leuven S.I., Boom H.D. et al. Sustained changes in lipid profile and macrophage migration inhibitory factor levels 240 after anti-tumour necrosis factor therapy in rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2009. – Vol. 68. – P. 1316–1321. 250. Hueber W., Tomooka B.H., Batliwalla F. et al. Blood autoantibody and cytokine profiles predict response to anti-tumor necrosis factor therapy in rheumatoid arthritis [Электронный ресурс] // Arthr. Res. Ther. – 2009. – Vol. 11. – Режим доступа: http://arthritis-research.com/content/11/3/R76. 251. Catrina A.I., Lampa J., Ernestam S. et al. Anti-tumour necrosis factor (TNF)-a therapy (etanercept) down-regulates serum matrix metalloproteinase (MMP)-3 and MMP-1 in rheumatoid arthritis // Rheumatology. – 2002. – Vol. 41. – P. 484–489. 252. Crnkic M, Månsson B., Larsson L. et al. Serum cartilage oligomeric matrix protein (COMP) decreases in rheumatoid arthritis patients treated with infliximab or etanercept [Электронный ресурс] // Arthritis. Res. Ther. – 2003. – Vol. 5. – Режим доступа: http://arthritis- research.com/content/5/4/R181. 253. Vis M., Havaardsholm E.A., Haugeberg G., et al. Evaluation of bone mineral density, bone metabolism, osteoprotegerin and receptor activator of the NFkappaB ligand serum levels during treatment with infliximab in patients with rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. - 2006. – Vol. 65. – P. 1495-1499. 254. Cohen S.B., Emery P., Greenwald M.W, et al. Rituximab for rheumatoid arthritis refractory to anti-tumor necrosis factor therapy. Results of multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, phase III trial evaluating primary efficacy and safety at twenty-four weeks // Arthritis Rheum. – 2006. –Vol. 54. – P. 2793-2806. 255. Cambridge G., Stohl W., Leandro M.J. et al. Circulating levels of B lymphocyte stimulator in patients with rheumatoid arthritis following Rituximab treatment: relationship with B cell depletion, circulating antibodies, and clinical relapse // Arthritis Rheum. – 2006. – Vol. 54. – P. 723-732. 241 256. Cambridge G., Leandro M.J., Edwards J.C.W. et al. Serologic changes following B lymphocyte depletion therapy for rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. – 2003. – Vol. 48. – P. 2146-2154. 257. Bokareva M., Lindholm C., Zendjanchi K. et al. Efficacy of Anti- CD20 treatment in patients with rheumatoid arthritis resistant to a combination of methotrexate/anti-TNF therapy // Scand. J. Immunol. – 2007. – Vol. 66. – P. 467-483. 258. Thurlings R.M., Vos K., Wijbrandts C.A. et al. Synovial tissue response to Rituximab: mechanism of action and identification of biomarkers of response // Ann. Rheum. Dis. – 2008. – Vol. 67. – P. 917-925. 259. Isaacs J.D., Olech E., Tak P.P. et al. Autoantibody-positive rheumatoid arthritis (RA) patients (pts) have enhanced clinical response to rituximab (RTX) when compared with seronegative patients // Ann. Rheum. Dis. - 2009. – Vol. 68(13). – P. 442. 260. Khan A., Mahmud T., Hammond T., et al. Rituximab (RTX) is more effective in active sero-positive RA than sero-negative RA // Arthritis Rheum. – 2010. – Vol. 62 (10). – P. 1830. 261. Narvaez J., Torne C., Ruiz J. Predictors of response to rituximab in patients with active rheumatoid arthritis and inadequate response to antiTNF agents or traditional DMARD // Arthritis Rheum. 2010. Vol. 62 (10). – P. 1118. 262. Ferraccioli G., Tolusso B., Pallavicini B., et al. Biomarkers predictors of good EULAR response to B cell depletion therapy (BCDT) in seropositive rheumatoid arthritis patients // Arthritis Rheum. – 2010. – Vol. 62 (10). – P. 1098. 263. Peluso G., Fuustin F., Gremese E. et al. B-cell depletion in rheumatoid arthritis: seaching for serologic and clinical baseline factors that could predict long-term efficacy // Ann. Rheum. Dis. – 2010. – Vol. 69(3). – P. 683. 242 264. Chatzidionysiou K., van Vollenhoven R.F., Nasonov EL. et al. Efficacy of Rituximab retreatment in clinical practice: data from the CERRERA collaboration // Ann. Rheum. Dis. – 2010. – Vol. 69(3). – P. 380. 265. Sellam J., Rouanet S., Taoufic Y. et al. Predictive factors of response to rituximab in rheumatoid arthritis with inadequate response or intolerance to anti-TNF: data from SMART trial // Ann. Rheum. Dis. – 2010. – Vol. 69 (3). – P. 68. 266. Gottenberg J.E., Ravaud P., Bardin T. et al. Risk factors of severe infections in patients with rheumatoid arthritis treated with Rituximab in the Autoimmunity and Rituximab (AIR) registry // Arthritis Rheum. – 2010. – Vol. 62(9). – P. 2625-2632. 267. Popa C., Leandro M.J., Cambridge G. et al. Repeated B lymphocyte depletion with rituximab in rheumatoid arthritis over 7 yrs // Rheumatology. – 2007. – Vol. 46(4). – P. 626-30. 268. Edwards C.W., Szczepanski L., Szechinski J. et al. Efficacy of B-cell- Targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis // New Engl. J. Med. – 2005. – Vol. 350. – P. 2572-2581. 269. Thurlings R.M., Boumans M.J.H., Vos K. et al. Early changes in serum levels of cytokines and chemokines are predictive of the response to Rituximab treatment in rheumatoid arthritis // Arthr. Rheum. – 2009. – Vol. 60 (10). – P. 1686. 270. Boumans M.J., Thurlings R.M., Yeo L. et al. Rituximab abrogates joint destruction in rheumatoid arthritis by inhibiting osteoclastogenesis // Ann. Rheum. Dis. – 2012. – Vol. 71(1). - P. 108-113. 271. Wheater G., Hogan V.E., Teng Y.K. et al. Suppression of bone turnover by B-cell depletion in patients with rheumatoid arthritis. Osteoporos. Int. – 2011. – Vol. 22(12). – P. 3067-3072. 272. и Насонов Е.Л., Панасюк Е.Ю., Булдаков С.Г. и др. Эффективность безопасность тоцилизумаба при ревматоидном артрите 243 (промежуточные результаты российского многоцентрового исследования) // Научно-практич. ревматология. – 2009. - №. 2. – С. 2129. 273. Александрова Е.Н., Панасюк Е.Ю., Авдеева А.С. и др. Динамика лабораторных биомаркеров у больных ревматоидным артритом на фоне терапии тоцилизумабом // Науч-практич. ревматология. - 2011. № 3. – С. 14-19. 274. Панасюк Е.Ю., Амирджанова В.Н., Александрова Е.Н. и др. Быстрый эффект тоцилизумаба при ревматоидном артрите. Научпрактич. ревматология. - 2011. - № 4. – С. 11-16. 275. Nishimoto N., Yoshizaki K., Miyasaka N. et al. Treatment of rheumatoid arthritis with humanized anti-interleukin-6 receptor antibody: a multicenter, double-blind, placebo-controlled trial // Arthritis Rheum. – 2004. – Vol. 50(6). – P. 1761-1769. 276. Smolen J.S., Beaulieu A., Rubbert-Roth A. et al. Effect of interleukin- 6 receptor inhibition with tocilizumab in patients with rheumatoid arthritis (OPTION study): a double-blind, placebo-controlled, randomised trial // Lancet. – 2008. – Vol. 371. – P. 987-997. 277. Kawashiri S., Kawakami A., Iwamoto N. et. al. In rheumatoid arthritis patients treated with tocilizumab, the rate of clinical disease activity index (CDAI) remission at 24 weeks is superior in those with higher titers of IgMrheumatoid factor at baseline // Mod. Rheumatol. 2011. – Vol. 4. – P. 370374. 278. Frey N., Grange S., Woodworth T. Relationship between serum concentration of the interleukin-6 receptor inhibitor tocilizumab and Creactive protein reduction in RA patients: 6 months data from a phase 3 study // Arthritis Rheum. – 2007. – Vol. 56(9). – P. 148-149. 279. Choy E.H., Isenberg D.A., Garrood T. et al. Therapeutic benefit of blocking interleukin-6 activity with an anti-interleukin-6 receptor monoclonal antibody in rheumatoid arthritis: a randomized, double-blind, 244 placebo-controlled, dose-escalation trial // Arthritis Rheum. – 2002. – Vol. 46. – P. 3143-3150. 280. Jones G., Gu J.R., Lowenstein M. et al. Tocilizumab monotherapy is superior to methotrexate monotherapy in reducing disease activity in patients with rheumatoid arthritis: the ambition study // Ann. Rheum. Dis. – 2008. – Vol. 67(2). – P. 89. 281. Levi M., Frey N., Grange S. et al. Reduction in inflammatory biomarkers with increasing exposure to the IL-6 inhibitor, tocilizumab, in patients with rheumatoid arthritis: graphical analysis of pooled data // Ann. Rheum. Dis. – 2008. – Vol. 67(2). – P. 192. 282. Beaulieu A., McKay J., Pavelka K. et al. Treatment with the humanized anti-interleukin-6 receptor antibody tocilizumab results in rapid improvements in the signs and symptoms of rheumatoid arthritis: results from a pooled analysis of clinical trial data from option and toward // Ann. Rheum. Dis. – 2008. – Vol. 67(2). – P. 195. 283. Genovese M.C., McKay J.D., Nasonov E.L. et al. Interleukin-6 receptor inhibition with tocilizumab reduces disease activity in rheumatoid arthritis with inadequate response to disease-modifying antirheumatic drugs: the tocilizumab in combination with traditional disease-modifying antirheumatic drug therapy study // Arthritis Rheum. – 2008. – Vol. 58. – P. 2968-2980. 284. Emery P., Keystone E., Tony H.P. et al. IL-6 receptor inhibition with tocilizumab improves treatment outcomes in patients with rheumatoid arthritis refractory to anti-tumour necrosis factor biologicals: results from a 24-week multicentre randomised placebo-controlled trial // Ann. Rheum. Dis. - 2008. – Vol. 67. – P. 1516-1523. 285. Nishimoto N., Miyasaka N., Yamamoto K. et al. Relationship between serum IL-6 levels after tocilizumab treatment an clinical remission in active rheumaroid arthritis patients // Ann. Rheum. Dis. – 2008. – Vol. 67(2). – P. 90. 245 286. Nishimoto N., Terao K., Mima T. et al. et al. Mechanisms and pathologic significances in increase in serum interleukin-6 (IL-6) and soluble IL-6 receptor after administration of an anti-IL-6 receptor antibody, tocilizumab, in patients with rheumatoid arthritis and Castleman disease // Blood. - 2008. – Vol. 112. – P. 3959-3964. 287. Garnero P., Thompson E., Woodworth T. et al. Rapid and sustained improvement in bone and cartilage turnover markers with the antiinterleukin-6 receptor inhibitor tocilizumab plus methotrexate in rheumatoid arthritis patients with an inadequate response to methotrexate: results from a substudy of the multicenter double-blind, placebo-controlled trial of tocilizumab in inadequate responders to methotrexate alone // Arthritis Rheum. – 2010. – Vol. 62(1). – P. 33-43. 288. Олюнин Ю. А. Оценка статуса больных ревматоидным артритом // Науч-практич. ревматология. – 2012. - № 50(1). – С. 9-13. 289. О.А. Кричевская, Д.В. Горячев, А.В. Смирнов, Ш.Ф. Эрдес. Некоторые методы оценки прогрессирования рентгенологических проявлений ревматоидного артрит // Научн-практич. ревматология. – 2007. - № 2. – С. 56-63. 290. van der Heijde D.M. How to read radiographs according to the Sharp/van der Heijde method // J. Rheumatol. – 1999. – Vol. 26(3). – P. 743-745. 291. Смирнов диагностика А.В. поражения Дифференциальная суставов кисти рентгенологическая при ревматических заболеваниях // Consilium medicum. - 2005. - № 2. - 76-83. 292. Arnett F.C., Edworthy S.M., Bloch D.A. et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis // Arthr. Rheum. – 1988. – Vol. 31. – P. 315-324. 293. Насонов Е.Л. Применение инфликсимаба (моноклональные антитела к фактору некроза опухоли) в ревматологии: новые данные // РМЖ. – 2004. - № 20. – С. 1123–1127. 246 294. Reff M.E., Carner K., Chambers K.S. et al. Depletion of B cells in vivo by a chimeric mouse human antibody to CD20 // Blood. – 1994. – Vol. 83. – P. 435–445. 295. Sato K., Tsuchiya M., Saldanha J. et al.Reshaping a human antibody to inhibit the inerieukin-6-dependent tumor cell growth // Cancer Res. 1993. – Vol. 53. – P. 851–856. 296. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. – М.: МедиаСфера, 2003. – 312 с. 297. Zweig М., Campbell G. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine // Clinical Chemistry. – 1993. – Vol. 39(8). – P. 561–577. 298. Герасимов А.Н. Медицинская статистика. Учебное пособие. – М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2007. – 480 с. 299. Turesson C., Jacobsson L.T., Sturfelt G. er al. Rheumatoid factor and antibodies to cyclic citrullinated peptides are associated with severe extraarticular manifestations in rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2007. – Vol. 66. – P. 59-64. 300. Bas S., Perneger T.V., Seitz M. et al. Diagnostic tests for rheumatoid arthritis: comparison of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies, antikeratin antibodies and IgM rheumatoid factors // Rheumotology. – 2002. – Vol. 41. – P. 809-814. 301. Amri M., Sfar I., Ounallah H.S., Dhaouadi T. et al. Anti-CCP antibodies, rheumatoid factors and anti-keratin antibodies: clinical value in established rheumatoid arthritis // Tunis Med. – 2011. – Vol. 89(3). – P. 231235. 302. Mathsson L., Mullazehi M., Wick M.C. et al. Antibodies against citrullinated vimentin in rheumatoid arthritis higher sensitivity and extended prognostic value concerning future radiographic progression as compared 247 with antibodies against cyclic citrullinated peptides // Arthritis Rheum. – 2008. – Vol. 58(1). – P. 36-45. 303. Forslind K., Ahlmén M., Eberhardt K. et. al. Prediction of radiological outcome in early rheumatoid arthritis in clinical practice: role of antibodies to citrullinated peptides (anti-CCP) // Ann. Rheum. Dis. – 2004. – Vol. 63. – P. 1090–1095. 304. Kastbom A., Strandberg G., Lindroos A. et al. Anti-CCP antibody test predicts the disease course during three years in early rheumatoid arthritis (the TIRA project) // Ann. Rheum. Dis. – 2004. – Vol. 63. – P. 1085–1089. 305. Shankar S., Grover R., Handa R. Role of anti- cyclic citrullinated peptide antibodies in erosive disease in patients with rheumatoid arthritis // Indian J. Med. Res. – 2006. – Vol. 124. – P. 689-696. 306. Mewar D., Coote A., Moore D.J. et al. Independent associations of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies and rheumatoid factor with radiographic severity of rheumatoid arthritis [Электронный ресурс] // Arthritis Res. Ther. – 2006. – Vol. 8. - Режим доступа: http://arthritisresearch.com/content/8/4/R128. 307. Agrawal S., Misra R., Aggarwal A. Autoantibodies in rheumatoid arthritis: association with severity of disease in established RA // Clin. Rheumatol. – 2007. – Vol. 26. – P. 201–204. 308. Mutlu N., Bicakcigil M., Tasan D. A. et al. Comparative erformance analysis of 4 different anti-citrullinated protein assays in the diagnosis of rheumatoid arthritis // Journal of Rheumatology. – 2009. - Vol. 36. – Vol. 3. – P. 491–500. 309. Coenen D., Verschueren P., Westhovens R. et al. Technical and diagnostic performance of 6 assays for themeasurement of citrullinated protetn/peptide antibodies in the diagnosis of rheumatoid arthritis // Clinical Chemistry. – 2007. - Vol. 53(3). - P. 498–504. 310. Novikov A., Alexandrova E., Karateev D. et al. Diagnostic value of antibodies against a modified citrullinated vimentin, cyclic citrullinated 248 peptide and IgM rheumatoid factor in early rheumatoid arthritis // Annals of the Rheumatic Diseases. – 2007. - Vol. 66(2). – P. 333. 311. Sghiri R., Bouajina E., Bargaoui D. et al. Value of antimutated citrullinated vimentin antibodies in diagnosing rheumatoid arthritis // Rheumatology International. – 2008. - Vol. 29(1). - P. 59–62. 312. Rantapaa-Dahlqvist S. “Diagnostic and prognostic significance of autoantibodies in early rheumatoid arthritis // Scandinavian Journal of Rheumatology. – 2005. - Vol. 34(2). – P. 83–96. 313. Combe B., Landewe R., Lukas C. et al. “EULAR recommendations for themanagement of early arthritis: report of a task force of the European Standing Committee for International Clinical Studies Including Therapeutics (ESCISIT) // Annals of the Rheumatic Diseases. – 2007. - Vol. 66(1). - P. 34–45. 314. Salvador G., Gomez A., Vinas O. et al. Prevalence and clinical significance of anti-cyclic citrullinated peptide and antikeratin antibodies in palindromic rheumatism. An abortive form of rheumatoid arthritis? // Rheumatology. – 2003. – Vol. 42. – P. 972–975. 315. Mediwake R., Isenberg D.A., Schellekens G.A., et al. Use of anticitrullinated peptide and anti-RA33 antibodies in distinguishing erosive arthritis in patients with systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2001. – Vol. 60. – P. 67–68. 316. Zeng X., Ai M., Tian X. et al. Diagnostic value of anticyclic citrullinated peptide antibody in patients with rheumatoid arthritis // J. Rheumatol. – 2003. – Vol. 30. – P. 1451-1455. 317. Bang H., Luthke K., Gauliard A. et al. Mutadet citrullinated vimentin (MCV) as a candidate autoantigen for diagnosis and monitoring of disease activity in rheumatoid arthritis. Annals of Rheumatic disease. – 2006. - Vol. 65(11). – P. 144. 318. Rodrigues-Mahou M., Lopez-Longo F., Sanchez-Ramon S. et al. Association of Anti–Cyclic Citrullinated Peptide and Anti-Sa/Citrullinated 249 Vimentin Autoantibodies in Rheumatoid Arthritis // Arthritis & Rheumatism (Arthritis Care & Research). – 2006. - Vol. 55. – P. 657–661. 319. Vossenaar E.R., Despres N., Lapointe E. et al. Rheumatoid arthritis specific anti-Sa antibodies target citrullinated vimentin // Arthritis Res. Ther. – 2004. – Vol. 6. – P. 142-150. 320. Wagner E., Skoumal M., Bayer P. M. et al. Antibody against mutated citrullinated vimentin: a new sensitive marker in the diagnosis of rheumatoid arthritis // Rheumatology International. – 2009. - Vol. 29(11). - P. 1315– 1321. 321. Liu X., Jia R., Zhao J. et al. The role of anti-mutated citrullinated vimentin antibodies in the diagnosis of earlyrheumatoid arthritis // Journal of Rheumatology. – 2009. - Vol. 36(6). – P. 1136–1142. 322. van der Woude D., Ioan-Facsinay A., Schwarte C. et al. Fine specificity of the anti-citrullinated protein antibody response in relationship to the disease course of rheumatoid arthritis // Annals of the Rheumatic Diseases. – 2008. - Vol. 67(2). – P. 75. 323. Ursum J., Nielen M., van Schaardenburg D. et al. Antibodies to mutated citrullinated vimentin and diseaseactivity score in early arthritis: a cohort study [Электронный ресурс] // Arthritis Research and Therapy. – 2008. - Vol. 10(1). – Режим доступа: http://arthritis- research.com/content/10/1/R12. 324. A. Kinloch, V. Tatzer, R. Wait et al. Identification of citrullinated alpha-enolase as a candidate autoantigen in rheumatoid arthritis // Arthritis Research & Therapy. – 2005. - Vol. 7(6). - P. 1421–1429. 325. Zablocki R.W., van der Helm-van Mil A., Huizinga T., Rao S. A Novel Diagnostic Marker for RA, Anti-MCV // Arthritis Rheum. – 2010. – Vol. 62(10). – P. 660. 326. Vasiliauskiene L., Wiik A., Hoier-Madsen M. Prevalence and clinical significance of anti-keratin antibodies and other serological markers in 250 Lithuanian patients with rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2001. – Vol. 60. – P. 459-466. 327. Quinn M.A., Gough A.K.S., Green M. J. et al. Anti-CCP antibodies measured at disease onset help identify seronegative rheumatoid arthritis and predict radiological and functional outcome // Rheumatology. -2006. - Vol. 45(4). – P. 478–480. 328. Dubucquoi S., Solau-Gervais E., Lefranc D. et al. Evaluation of anti- ctrullinated filaggrin antibodies as hallmarks for the diagnosis of rheumaticdiseases // Ann. Rheum. Dis. – 2004. – Vol. 63. – P. 415–419. 329. Girelli F., Foschi F.G., Bedeschi E. et al. Is Anti Cyclic citrullinated peptide a useful laboratory test for the diagnosis of rheumatoid arthritis? // Eur. Ann. Allergy. Clin. Immunol. – 2004. – Vol. 36(4). – P. 127-130. 330. Zhao J., Liu X., Wang Z. et al. Is it necessary to combine detection of anticitrullinated protein antibodies in the diagnosis of rheumatoid arthritis? // J. Rheumatol. – 2010. – Vol. 37(12). – P. 2462-2465. 331. Song Y.W., Kang E.H. Autoantibodies in rheumatoid arthritis: rheumatoid factors and anticitrullinated protein antibodies // Q.J.M. – 2010. – Vol. 103. – P. 139-146. 332. Meyer O., Labarre C., Dougados M. et al. Anticitrullinated protein/peptide antibody assays in early rheumatoid arthritis for predicting five year radiographic damage // Ann. Rheum. Dis. – 2003. – Vol. 62. – P. 120-126. 333. Vallbracht I., Rieber J., Oppermann M. et al. Diagnostic and clinical value of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies compared with rheumatoid factor isotypes in rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2004. – Vol. 63(9). – P. 1079–1084. 334. Greiner A., Plischke H., Kellner H. et al. Association of anticyclic citrullinated peptide antibodies, anti-citrullin antibodies, and IgM and IgA rheumatoid factors with serological parameters of disease activity in 251 rheumatoid arthritis // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2005. – Vol. 1050. – P. 295303. 335. Alexiou I., Germenis A., Ziogas A. et. al. Diagnostic value of anti- cyclic citrullinated peptide antibodies in Greek patients with rheumatoid arthritis [Электронный ресурс] // BMC Musculoskelet. Disord. – 2007. – Vol. 8. – Режим доступа: http://www.biomedcentral.com/1471-2474/8/37. 336. Nyhäll-Wåhlin B.M., Petersson I.F., Nilsson J.A. Et al. High disease activity disability burden and smoking predict severe extra-articular manifestations in early rheumatoid arthritis // Rheumatology (Oxford) – 2009. - Vol. 48(4). – P. 416-420. 337. Liao H., Wu J., Kuhn E. et al. Use of mass spectrometry to identify protein biomarkers of disease severity in the synovial fluid and serum of patients with rheumatoid arthritis // Arthr. Rheum. - 2004. – Vol. 50. – P. 3792–3803. 338. Hammer H.B., Odegard S., Fagerhol M.K. Calprotectin (a major leucocyte protein) is strongly and independently correlated with joint inflammation and damage in rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. – 2007. – Vol. 66. – P. 1093–1097. 339. Berntzen H.B., Munthe E., Fagerhol M.K. A longitudinal study of the leukocyte protein L1 as an indicator of disease activity in patients with rheumatoid arthritis. J. Rheumatol. – 1989. – Vol. 16. – P. 1416–1420. 340. Brun J.G., Jonsson R., Haga H.J. Measurement of plasma calprotectin as an indicator of arthritis and disease activity in patients with inflammatory rheumatic diseases. J. Rheumatol. – 1994. – Vol. 21. – P. 733–737. 341. Hammer H.B., Odegard S., Syversen S.W. et al. Calprotectin (a majorS100 leucocyte protein) predicts 10-year radiographic progression in patients with rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2010. – Vol. 69. – P. 150–154. 252 342. Dougall W.C., Glaccum M., Charrier K. et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development // Genes. Dev. – 1999. – Vol. 13. – P. 2412-2424. 343. Shalhoub V., Faust J., Boyle W.J. et al. Osteoprotegerin and osteoprotegerin ligand effects on osteoclast formation from human peripheral blood mononuclear cell precursors // J. Cell. Biochem. – 1999. – Vol. 72. – P. 251-261. 344. Kong Y.Y., Feige U., Sarosi I. et al. Activated T cells regulate bone loss and joint destruction in adjuvant arthritis through osteoprotegerin ligand // Nature. – 1999. – Vol. 402. – P. 304-309. 345. Romas E., Bakharevski O., Hards D.K. et al. Expression of osteoclast differentiation factor at sites of bone erosion in collagen-induced arthritis // Arthritis Rheum. – 2000. – Vol. 43. – P. 821-826. 346. Suda T., Takahashi N., Udagawa N. et al. Modulation of osteoclast differentiation and function by the new members of the tumor necrosis factor receptor and ligand families // Endocr. Rev. – 1999. – Vol. 20. – P. 345-357. 347. Hein G.E., Meister M., Oelzner P. sRANKL and OPG in serum and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis in comparison to nondestructive chronic arthritis // Rheumatol. Int. - 2008. – Vol. 28(8). P. - 765769. 348. Geusens P.P., Landewe R.B.M., Garnero P. et al. The ratio of circulating osteoprotegerin to RANKL in early rheumatoid arthritis predicts later joint destruction. Arthrititis Rheum. – 2006. - Vol. 54(6). - P. 1772– 1777. 349. Ellabban A.S., Kamel S.R., Ahmed S.S. Receptor activator of nuclear factor kappa B ligand serum and synovial fluid level. A comparative study between rheumatoid arthritis and osteoarthritis // Rheumatol. Int. – 2012. Vol. 32(6). – P. 1589-1596. 253 350. Nikolaisen C., Rekvig O.P., Nossent H.C. Diagnostic impact of contemporary biomarker assays for rheumatoid arthritis // Scand. J. Rheumatol. – 2007. – Vol. 36. – P. 97–100. 351. Forslind K., Eberhardt K., Jonsson A. et al. Increased serum concentrations of cartilage oligomeric matrix protein. A prognostic marker in early rheumatoid arthritis // Br. J. Rheumatol. – 1992. – Vol. 31. – P. 593– 598. 352. Mansson B., Carey D., Alini M. et al. Cartilage and bone metabolism in rheumatoid arthritis. Differences between rapid and slow progression of disease identified by serum markers of cartilage metabolism // J. Clin. Invest. – 1995. – Vol. 95. – P. 1071–1077. 353. Wollheim F.A., Eberhardt K.B., Johnson U. Et al. HLA DRB1* typing and cartilage oligomeric matrix protein (COMP) as predictors of joint destruction in recent-onset rheumatoid arthritis // Br. J. Rheumatol. – 1997. – Vol. 36. – P. 847–849. 354. Andersson M.L., Svensson B., Petersson I.F. et al. Early increase in serum-COMP is associated with joint damage progression over the first five years in patientswith rheumatoid arthritis [Электронный ресурс] // BMC Musculoskelet. Disord. 2013. Vol. 2(14). – Режим доступа: http://www.biomedcentral.com/1471-2474/14/229. 355. Young-Min S., Cawston T., Marshall N. Biomarkers predict radiographic progression in early rheumatoid arthritis and perform well compared with traditional markers // Arthritis Rheum. – 2007. - Vol. 56(10). - P. 3236–3247. 356. Fex E., Eberhardt K., Saxne T. Tissue-derived acromolecules and markers of inflammation in serum in early rheumatoid arthritis: relationship to development of joint destruction in hands and feet // British Journal of Rheumatology. – 1997. – Vol. 36. P. 1161-1165. 254 357. Saxne T., Heinegard D. Cartilage oligomeric matrix protein: a novel marker of cartilage turnover detectable in synovial fl uid and blood // Br. J. Rheumatol. – 1992. – Vol. 31. – P. 583–591. 358. Roux‐Lombard P., Eberhardt K., Saxne T. Cytokines, metalloproteinases, their inhibitors and cartilage oligomeric matrix protein: relationship to radiological progression and inflammation in early rheumatoid arthritis. A prospective 5‐year study // Rheumatology. – 2001. – Vol. 40(5). – P. 544-551. 359. Fujikawa K., Kawakami A., Tamai M. High serum cartilage oligomeric matrix protein determines the subset of patients with early-stage rheumatoid arthritis with high serum C-reactive protein, matrix metalloproteinase-3, and MRI-proven bone erosion // J. Rheumatol. – 2009. – Vol. 36(6). – P. 1126-1129. 360. Soderlin M.K., Kastbom A., Kautiainen H. Antibodies against cyclic citrullinated peptide (CCP) and levels of cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in very early arthritis: relation to diagnosis and disease activity // Scand. J. Rheumatol. – 2004. – Vol.33(3). – P. 185-188. 361. Kawashiri S.Y., Kawakami A., Ueki Y. Decrement of serum cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in rheumatoid arthritis (RA) patients achieving remission after 6 months of etanercept treatment: comparison with CRP, IgM-RF, MMP-3 and anti-CCPAb // Joint Bone Spine. – 2010. – Vol. 77(5). – P. 418-420. 362. Wisłowska M, Jabłońska B. Serum cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in rheumatoid arthritis and knee osteoarthritis // Clin. Rheumatol. – 2005. – Vol. 24(3). – P. 278-284. 363. Marti C., Neidhart M., Gerber T. Cartilage oligomeric matrix protein (COMP): the role of a non-collagen cartilage matrix protein as a marker of disease activity and joint destruction in patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. // Z. Rheumatol. - 1999. – Vol. 58(2). – P. 79-87. 255 364. Hashimoto J. Garnero P. Heijde D. et al. A combination of biochemical markers of cartilage and bone turnover,radiographic damage and body mass index to predict the progression of joint destruction in patients with rheumatoid arthritis treated with disease-modifying antirheumatic drugs // Mod. Rheumatol. - 2009. – Vol. 19. – P. 273-282. 365. Lash G.E., Scaife P.J., Innes B.A. Comparison of three multiplex cytokine analysis systems: Luminex, SearchLight and FAST Quant // J. Immunol. Methods. – 2006. – Vol. 309(1-2). – P. 205-208. 366. Fu Q., Zhu J., Van Eyk J. Comparison of Multiplex Immunoassay Platforms. // Clin. Chem. – 2010. – Vol. 56(2). – P. 314–318. 367. Чечеткин Д. В., Прокопенко Д. В., Макаров А. А. и соавт. Биочипы для медицинской диагностики // Российские нанотехнологии. – 2006. - № 1(1, 2). – С. 13-27. 368. Finkel N.H., Lou X., Wang C. et al. Barcoding the microworld. Anal Chem. 2004. - Vol. 76(19). - P. 352-359. 369. Braeckmans K., De Smedt S.C., Leblans M. et al. Encoding microcarriers: present and future technologies // Nat. Rev. Drug Discov. – 2002. – Vol. 1(6). – P. 447-456. 370. Fortina P., Kricka L.J., Surrey S. et al. Nanobiotechnology: the promise and reality of new approaches to molecular recognition // Trends Biotechnol. – 2005. – Vol. 23(4). – P. 168-173. 371. Fan J.B., Chee M.S., Gunderson K.L. Highly parallel genomic assays // Nat. Rev. Genet. – 2006. – Vol. 7(8). – P. 632-644. 372. Martins T.B., Pasi B.M., Litwin C.М. Heterophile Antibody Interference in a Multiplexed Fluorescent Microsphere Immunoassay for Quantitation of Cytokines in Human Serum // Clinical and diagnostic laboratory immunology. – 2004. – Vol. 11(2). - P. 325–329. 373. Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство: в 2 т. – T.II. / Под ред. В.В. Долгова, В.В. Меньшикова. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. — 808 с. 256 374. Churchman S.M., Geiler J., Parmar R. Multiplexing immunoassays for cytokine detection in the serum of patients with rheumatoid arthritis: lack of sensitivity and interference by rheumatoid factor // Clinical and Experimental Rheumatology. - 2012. – Vol. 30(4). – P. 534-542. 375. de Jager W., Prakken B.J., Bijlsma J.W. et al. Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heteropholic antibodies // J. Immunol. Methods. – 2005. – Vol. 300. – P. 124-135. 376. de Jager W., Bourcier K., Rijkers G. et al. Prerequisites for cytokine measurements in clinical trials with multiplex immunoassays [Электронный ресурс] // BMC Immunology. - 2009. – Vol. 10(52). – Режим доступа: http://www.biomedcentral.com/1471-2172/10/52. 377. Todd D., Knowlton N., Amato M. et al. Erroneous augmentation of multiplex assay measurements in patients with rheumatoid arthritis due to heterophilic binding by serum rheumatoid factor // Arthritis Rheum. – 2011. - Vol. 63(4). – P. 894–903. 378. Toedter G., Hayden K., Wagner C. Simultaneous detection of eight analytes in human serum by two commercially available platforms for multiplex cytokine analysis // Clinical and vaccine immunology. – 2008. – Vol. 15(8). - P. 42–48. 379. Bartels E.M., Watjen I.F., Andersen E.L. et al. Rheumatoid factor and its interference with cytokine measurements: problems and solutions [Электронный ресурс] // Arthritis. – 2011. – Vol. 2011. - Режим доступа: http://dx.doi.org/10.1155/2011/741071. 380. Tan W., Eldering J., Ma L. Development and validation of a high- precision, high-sensitivity human cytokine assay on magnetic microspheres // BioRadiations. -2008. –Vol. 125. – P. 25. 381. Carson R.T., Vignali D.A. Simultaneous quantitation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay // J. Immunol. Methods. - 1999 Vol. 227(1-2). – P. 41-52. 257 382. Khan I.H., Krishnan V.V., Ziman M. et al. Comparison of Multiplex Suspension Array Large-Panel Kits for Profiling Cytokines and Chemokines in Rheumatoid Arthritis Patients // Cytometry Part B (Clinical Cytometry). – 2009. – Vol. 76(3). – P. 159–168. 383. Eastman P.S., Manning W.C., Qureshi F. et al. Characterization of a multiplex, 12-biomarker test for rheumatoid arthritis // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. – 2012. – Vol. 70 (2012). – P. 415– 424. 384. Kokkonen H., Söderström I., Rocklöv J. et al. Up-Regulation of Cytokines and Chemokines Predates the Onset of Rheumatoid Arthritis // Arthritis Rheum. – 2010. - Vol. 62(2). – P. 383–391. 385. Church L.D., Filer A.D., Hidalgo E. et al. Rheumatoid synovial fluid interleukin-17-producing CD4 T cells have abundant tumor necrosis factoralpha co-expression, but little interleukin-22 and interleukin-23R expression [Электронный ресурс] // Arthritis Research Therapy. - 2010, Vol. 12(5). – Режим доступа: http://arthritis-research.com/content/12/5/R184. 386. Wright H.L., Bucknall R.C., Moots R.J. et al. Analysis of SF and plasma cytokines provides insights into the mechanisms of inflammatory arthritis and may predict response to therapy // Rheumatology (Oxford). – 2012. – Vol. 51(3). – P. 451-459. 387. Endres M., Andreas K., Kalwitz G. Chemokine profile of synovial fluid from normal, osteoarthritis and rheumatoid arthritis patients: CCL25, CXCL10 and XCL1 recruit human subchondral mesenchymal progenitor cells // Osteoarthritis Cartilage. – 2010. - Vol. 18(11). – P. 1458-1466. 388. Alex P., Szodoray P., Knowlton N. et al. Multiplex serum cytokine monitoring as a prognostic tool in rheumatoid arthritis // Clinical and Experimental Rheumatology. – 2007. – Vol. 25. – P. 584-592. 389. Meyer P.W., Hodkinson B., Ally M. et al. Circulating Cytokine Profiles and Their Relationships with Autoantibodies, Acute Phase Reactants, and Disease Activity in Patients with Rheumatoid Arthritis 258 [Электронный ресурс] // Mediators of Inflammation. – 2010. – Vol. 2010. – Режим доступа: http://dx.doi.org/10.1155/2010/158514. 390. Sivalingam S.P., Thumboo J., Vasoo S. et al. In vivo Pro- and Anti- inflammatory Cytokines in Normal and Patients with Rheumatoid Arthritis // Ann. Acad. Med. Singapore. – 2007. – Vol. 36. – P. 96-99. 391. Hitchon C.A., Alex P., Erdile L.B. et al. A distinct multicytokine profile is associated with anti-cyclical citrullinated peptide antibodies in patients with early untreated inflammatory arthritis // J. Rheumatol. – 2004. – Vol. 31(12). – P. 2336-2346. 392. Deane K.D., O'Donnell C.I., Hueber W. et al. The Number of Elevated Cytokines and Chemokines in Preclinical Seropositive Rheumatoid Arthritis Predicts Time to Diagnosis in an Age-Dependent Manner. Arthritis Rheum. – 2010. - Vol. 62(11). – P. 3161–3172. 393. Jorgensen K.T., Wiik A., Pedersen M. et al. Cytokines, autoantibodies and viral antibodies in premorbid and postdiagnostic sera from patients with rheumatoid arthritis: case-control study nested in a cohort of Norwegian blood donors // Ann. Rheum. Dis. – 2008. – Vol. 67. – P. 860–866. 394. Charo I.F., Ransohoff R.M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation // N. Engl. J. Med. – 2006. Vol. 354. – P. 610–621. 395. Garcia-Vicuna R., Gomez-Gaviro M.V., Dominguez-Luis M.J. et al. CC and CXC chemokinereceptors mediate migration proliferation, and matrix metalloproteinase production by fibroblast-like synoviocytes from rheumatoid arthritis patients // Arthritis Rheum. – 2004. – Vol. 50. – P. 3866–3877. 396. Johnson Z., Schwarz M., Power C.A. et al. Multi-faceted strategies to combat disease by interference with the chemokine system // Trends Immunol. – 2005. – Vol. 26. P. 268–274. 397. Smolen J.S., Steiner G. Therapeutic strategies for rheumatoid arthritis // Nat. Rev. Drug. Discov. – 2003. – Vol. 2. – P. 473–488. 259 398. Hughes-Austin J.M., Deane K.D., Derber L.A. et al. Multiple cytokines and chemokines are associated with rheumatoid arthritis-related autoimmunity in first-degree relatives without rheumatoid arthritis: Studies of the Aetiology of Rheumatoid Arthritis (SERA) // Ann Rheum. Dis. – 2013. – Vol. 72(6). – P. 901–907. 399. Milman N., Karsh J., Booth R.A. Correlation of a multi-cytokine panel with clinical disease activity in patients with rheumatoid arthritis // Clin. Biochem. – 2010. – Vol. 43(16-17). – P. 1309-1314. 400. Kobayashi T., Murasawa A., Komatsu Y. et al. Serum cytokine and periodontal profiles in relation to disease activity of rheumatoid arthritis in Japanese adults // J. Periodontol. – 2010. – Vol. 81(5). – P. 650-657. 401. Chung S., Kwon Y., Park M. The Correlation between Increased Serum Concentrations of Interleukin-6 Family Cytokines and Disease Activity in Rheumatoid Arthritis Patients // Yonsei Med. J. – 2011. – Vol. 52(1). – P. 113-120. 402. Rioja I., Hughes F.J., Sharp C.H., et al. Potential novel biomarkers of disease activity in rheumatoid arthritis patients: CXCL13, CCL23, transforming growth factor alpha, tumor necrosis factor receptor superfamily member 9, and macrophage colony-stimulating factor // Arthritis Rheum. – 2008. – Vol. 58(8). – P. 2257-2267. 403. Centola M., Cavet G., Shen Y., Ramanujan S., Knowlton N., Swan K.A. et al. Development of a multi-biomarker disease activity test for rheumatoid arthritis [Электронный ресурс] // PLoS One. – 2013. – Vol. 8(4). – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3621826/. 404. Choy E.H. Selective modulation of T-cell co-stimulation: a novel mode of action for the treatment of rheumatoid arthritis // Clin. Exp. Rheumatol. – 2009. Vol. 27. – P. 510-518. 260 405. Vinuesa C.G., Cook M.C. The molecular basis of lymphoid architecture and B cell responses: implications for immunodeficiency and immunopathology // Curr. Mol. Med. – 2001. Vol. 1. – P. 689-725. 406. Kotake S., Sato K., Kim K.J. et al. Interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptors in the synovial fluids from rheumatoid arthritis patients are responsible for osteoclast-like cell formation. – 1996. - J. Bone Miner. Res. – Vol. 11. – P. 88-95. 407. Насонов Е.Л. Фармакотерапия ревматоидного артрита – взгляд в 21 век // Клин. Медицина. - 2005. - № 6. – С. 8-12. 408. Smolen J.S., Aletaha D., Bijsma J.W.J. et al. For the T2T Expert Committee. Treating rheumatoid arthritis to target: recommendations of an international task force // Ann. Rheum. Dis. – 2010. – Vol. 69. – P. 631-637. 409. Myers G.L., Rifai N., Tracy R.P. et al. CDC/AHA Workshop on Markers of Inflammation and Cardiovascular Disease: Application to Clinical and Public Health Practice: report from the laboratory science discussion group // Circulation. – 2004. – Vol. 110. – P. 545-549. 410. Yamana J., Iwahashi M., Kim M. et al. T-Cell-Related Cytokines Are Inhibited in Response to Tocilizumab in Patients with Rheumatoid Arthritis in Contrast with TNF-Inhibitor // Arthritis Rheum. – 2011. – Vol. 63(10). – P. 51.
