Исследование ультраструктуры и биомеханических свойств

Известия ТРТУ
Тематический выпуск
Н. Гарнов, В. Грюндер
ИССЛЕДОВАНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ И БИОМЕХАНИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ СУСТАВНОГО ХРЯЩА С ПОМОЩЬЮ
ВЫСОКОРАЗРЕШАЮЩЕЙ ЯМР-ТОМОГРАФИИ
В настоящее время артрит является одним из самых распространенных заболеваний суставов среди людей пожилого возраста. Причиной его является в первую
очередь разрушение структуры гиалинового хряща (в дальнейшем будет идти речь
исключительно о хрящевом слое, покрывающим соприкасающиеся кости коленного сустава), – комплексной ткани организма с выдающимися амортизирующими
эластическими свойствами. Эти биомеханические свойства обоснованы сложной
организацией структурной матрицы хряща. В основе структуры лежат коллагеновые волокна (рис. 1), организованная ориентация которых отвечает за обеспечение
эластических свойств ткани [1,2].
Нарушение баланса в этой системе приводит к началу артрического заболевания, причиной которого является несоответствие нагрузки на хрящевую ткань и ее
фактической выносливости. Это ведет к «тихому» разрушению структуры хряща,
– как правило необратимый процесс, длящийся годами, который в итоге может
оказаться в серьезной стадии, причиняющей сильные боли, ограничения подвижности суставов до полной ее потери [2,3].
Средства диагностики, к сожалению, позволяют определить в большинстве
случаев уже прогрессирующую стадию этого заболевания, так как пациенты обращаются за врачебной помощью лишь при объективных жалобах (боль в суставах, отеки и т.п.). В связи с этим развитию новых диагностических методик для
определения артрита в ранней стадии уделяется в настоящее время большое внимание. Это связано также и с развитием новых диагностических средств, таких как
ядерно-магнитно-резонансная томография (ЯМРТ). Последнее является оптимальным средством тонкой неразрушающей визуализации суставов [4].
Для получения информации о ультраструктуре хряща и его эластических
свойств прибегают к помощи т.н. ЯМР-микроскопии. С ее помощью возможно
получение томографических изображений с разрешением до 10 мкм. При этом
накладываются ограничения на область обзора (FOV, Field Of View), которая однако при использовании подходящих высокочастотных антенн достаточна для исследований, например, коленных суставов. Данная методика использует представленную в биотканях воду. Считается, что особое значение при этом имеют молекулы Н2О в гидратных оболочках, связанных с группами протеоглюкана – наряду
с коллагеновыми волокнами важнейшая составляющая хрящевой ткани (рис. 1).
Их связанное состояние позволяет получить информацию об ориентации коллагеновых волокон [5].
Таким образом, было выявлено влияние расположения хряща в постоянном
магнитном поле на интенсивность ЯМР-сигнала. В основе этого эффекта лежит
диполь-диполь-взаимодействие между соседними протонами, а также поведение
протонов во внешнем стационарном магнитном поле. Было отмечено, что время
релаксации T2 зависит от направления внешнего поля B0 по отношению к диполям
связанных молекул воды и достигает максимального значения при условии «магического угла», равного 54.7°. Таким образом, появляется возможность получения
информации об ориентации коллагеновых волокон.
Так, на Т2-взвешенных ЯМР-изображениях изотропная структура представлена
более высокой интенсивностью (светлее), чем анизотропная. Когда же проба в
отдельных экспериментах была повернута так, что нормаль к поверхности хряща
находилась под углом 55° по отношению к B0, то и анизотропные структуры ста58
Раздел II
Аппаратные и программные средства медицинской диагностики и терапии
новились неотличимыми по интенсивности от изотропной среды. Различают три
вида ориентации коллагеновых волокон в хрящевой ткани: изотропная, радиальная
и тангенциальная. В процессе развития организма, структура хрящевой ткани претерпевает возрастные изменения: у новорожденных (postnatal) структура отсутствует, т.е. имеется в наличии лишь изотропная среда; у детей и подростков
(juvenile) формируется 5-слойная структура и в итоге это развитие оканчивается
формированием 3-слойной структурой у взрослых людей (adult), – большей частью радиальные волокна, переходящие через изотропную зону в тонкую тангенциальную зону. Такое развитие очевидно обосновано увеличением массы организма и, как следствие, возрастающей нагрузкой на суставы.
Рис. 1. Схематическое изображение строения хрящевой ткани
Gründer et al. [5] было получено соотношение, отражающее зависимость интенсивности ЯМР-сигнала I от угла θ наклона нормали поверхности хряща ко внешнему постоянному магнитному полю B0 (в данном случае – для идеально радиальной ориентации коллагеновых волокон):
I ∝ e − (1− 3 cos
2
θ )2
(1)
.
Эта функция имеет максимум при θ = 54.7° и в высокой степени коррелирует с
полученными экспериментальными данными [5, 6]. В частности, были проведены
многочисленные экперименты по вращению проб, взятых из коленных суставов
животных (как правило, овец и свиней; имеются результаты, полученные при проведении экспериментов на человеческих пробах) различного возраста, в постоянном магнитом поле. На полученных изображениях выбирались отдельные участки
(ROI, Region Of Interest), внутри которых определелялась интенсивность сигнала.
Полученные данные представляли соотношения интенсивность/угол поворота,
которые в итоге были аппроксимированы с функцией (1).
Для клинического использования такая схема исследования к сожалению не
пригодна, так как невозможно вращение суставов пациентов внутри ЯМРтомографа. Однако Seidel et al. провели исследования, в которых использовался
натуральный изгиб мыщелка бедренной кости (femur) коленного сустава [7, 8]. В
этом случае также возможно наблюдение зависимости интенсивности сигнала от
ориентации структуры во внешнем магнитном поле, но с предположением об однородном распределении коллагеновых волокон на выбранном ROI.
Другим перспективным методом оценки состояния и биомеханических свойств
хрящевой ткани являются нагрузочные исследования. Основным достоинством
этой методики является возможность ее клинического использования. Имеется ряд
экспериментов с использованием специальных устройств, предназначенных для
симуляции нормальной нагрузки на коленные суставы пациентов, находящихся в
томографе [9, 10, 11].
59
Известия ТРТУ
Тематический выпуск
Основной целью нагрузочных исследований является оценка реакции структуры хрящевой ткани на оказываемое давление. Особо значимой задачей до последнего времени являлась оценка модуля продольной упругости (Юнга) – отношения
давления на поверхность хрящевого слоя к относительному изменению его толщины. Упругие свойства являются весомым показателем в оценке состояния хрящевой ткани, однако методика вычисления модуля Юнга имеет определенные ограничения, связанные в первую очередь с неточностью определения изменения
толщины хряща. Это обусловлено тем фактом, что в процессе возрастного развития наблюдается утончение хрящевого слоя – у взрослого человека его толщина
составляет около 1-2 мм.
Другим, более чувствительным, показателем является изменение интенсивности ЯМР-сигнала на томографических изображениях при нагрузочных исследованиях. Однако эта относительно новая методика требует более углубленного детального рассмотрения для ее возможного применения в клинической практике.
Многочисленные эксперименты показали, что изменение интенсивности ЯМРсигнала зависит от величины локальной нагрузки и от вида анизотропии (радиальная/тангенциальная) исследуемого хряща [9–14]. В частности, нагрузка обуславливает увеличение интенсивности радиально-ориентированных структур и снижение интенсивности тангенциально-ориентированных. Это объясняется снижением
анизотропии радиальных структур, вызванное давлением. В случае же тангенциальных структур анизотропия наоборот увеличивается (рис. 2).
Рис. 2. Схематическое представление воздействия нагрузки на радиальные и
тангенциальные структуры
Как правило, подобные исследования проводились на цилиндрических пробах
различных животных с использованием специальной аппаратуры для осуществления контролируемой нагрузки. При этом либо был взят фрагмент кость-хрящ одной кости, либо обоих соприкасающихся костей. В первом случае проба прилагалась хрящом к плоскому неэластичному предмету, производя таким образом локальное давление в зоне их соприкосновения [10, 12-14].
В 2004 году в нашем институте было произведено уникальное нагрузочное исследование, основным отличием которого от предыдущих было распределение
давления по всей поверхности пробы. Для эксперимента была взята цилиндрическая проба диаметром около 16 мм из бедренной кости (femur medial) коленного
сустава 6-летней здоровой овцы. Для создания давления на поверхность хряща
было использовано приспособление, состоящее из медицинского инъектора в виде
пистолета со встроенным датчиком давления [13]. Тонкий длинный неупругий
шланг был предназначен для передачи давления посредством дегазированной воды на образец, заключенный в полиэтиленовый шприц диаметром 16 мм, который
помещается в измерительное отверстие лабораторного ЯМР-спектрометра Bruker
60
Раздел II
Аппаратные и программные средства медицинской диагностики и терапии
AMX 300 (7.1 Тл) с приставкой для микротомографии. Для реализации равномерного распределения нагрузки по всей поверхности пробы была применена акриловая смола (Kallocryl CP-GM), которая изготавливалась посредством смешивания
метил-метакрилата с жидким затвердителем. Текучая смесь заливалась сверху на
пробу и в течение нескольких минут затвердевала, в результате чего образовывался неэластичный цилиндр, в точности покрывающий поверхность хряща (рис. 3).
Рис. 3. Схема устройства для осуществления равномерного давления на образец:
1 – давление, 2 – поршень, 3 – стеклянный шарик, 4 – смола, 5 – образец
Измерения производились с использованием импульсных последовательностей
мультиэхо MSME (TE = 20 ms, TR = 500 ms, flip = 90°). Область сканирования была выбрана 16×16 мм, размер матрицы 256×256 (пиксельное разрешение:
62,5 мкм), толщина слоя 1,5 мм. Давление было увеличено пошагово: 0 – 0,15 –
0,25 – 0,35 – 0,45 – 0,55 – 0,65 – 0,75 – 0,85 – 0,95 – 1,05 МПа. При каждом значении было произведено одно сканирование.
При рассмотрении полученной последовательности изображений (рис. 4,а) был
отмечен эффект «передвижения» зоны повышенной интенсивности (магический
угол), особо выраженный на левой половине образца, от края пробы к ее центру.
Данный эффект очевидно был вызван изменением ориентации коллагеновых волокон под воздействием давления. Таким образом, возможно наблюдение, а также
квантификация изменения исходной ориентации волокон.
Для оценки результатов ROI была выбрана в виде тонкой линии, толщиной в 3
пикселя, пролегающей в средине толщи хряща. Эту линию можно рассматривать
как сектор окружности с мнимым центром, лежащим в точке около 11 мм ниже
образца. Это позволяет выразить расположение каждой точки на ROI через угол ко
внешнему полю (переход в полярную систему координат) (рис. 4,б).
Принимая во внимание тот факт, что в зоне повышенной интенсивности волокна находятся под углом 55° к направлению B0, а также предполагая исходную, параллельную нормали к поверхности, ориентацию и равномерное распределение
структуры внутри хряща, была построена зависимость изменения угла наклона
волокон от давления (рис. 5,а). В данном случае наблюдалось увеличение угла α
(между нормалью к поверхности хряща и ориентацией коллагеновых волокон) от
22° без давления до 40° при давлении 1 МПа (∆α/∆p ≈ 17.5 град./МПа). Таким образом, можно ввести так называемый «модуль угла»
Eα = ∆p/∆α = 5.7·10-2 МПа/град.,
отражающий деформацию коллагеновой сети под нагрузкой.
61
Известия ТРТУ
Тематический выпуск
а
б
Рис. 4. Результаты нагрузочного исследования с равномерным давлением на
образец: а – томографические изображения; б – профили интенсивности вдоль
тонкого профиля в средине толщины хряща
Следующим этапом была оценка изменения интенсивности сигнала в центральном регионе хряща (т.е. в пункте 0° по отношению к B0) в зависимости от
давления. Эта зависимость представлена на рис. 5,б. Предполагая большей частью
радиальную ориентацию волокон в данном образце (adult), и соответственно доминирующее влияние диполярного взаимодействия на трансверсальную релаксацию T2, мы ожидали в результате этой оценки получение зависимости, близкой к
описанной формулой (1), на участке от 22° до 40° (рис. 5,в). И правда, при линейной аппроксимации полученной зависимости изменения интенсивности от давления, мы могли наблюдать оптимальный результат лишь при относительно небольших величинах давления (до 0,8 МПа). Аппроксимация же с помощью нелинейной функции (1) дала наилучшие результаты (рис. 5б). Таким образом, зависимость интенсивность/давление можно интерпретировать как изменение ориентации коллагеновых волокон под нагрузкой. Используя информацию об ориентации
волокон в центральном регионе хряща до нагрузки (α ≈ 22°), мы можем в определенной степени судить по увеличению интенсивности сигнала об изменении ориентации структуры в результате давления.
Данные результаты демонстрируют возможность такими (бесхитростными)
способами получения достаточно важной информации об ультраструктуре суставного хряща (в принципе) неинвазивным путем. Для получения количественных
данных об изменении ЯМР-интенсивности требовалась информация об ориентации коллагеновых волокон, полученная из эксперимента (рис. 5,а). С другой стороны, используя знания о качественной связи между интенсивностью ЯМРсигнала и деформацией можно получить информацию о механических свойствах и
распределении нагрузки с помощью оценки изменения ЯМР-интенсивности под
давлением. Таким образом, возможно использование анизотропной коллагеновой
сети в качестве внутреннего сенсора давления.
62
Раздел II
Аппаратные и программные средства медицинской диагностики и терапии
а
б
в
Рис. 5: а – зависимость ориентации коллагеновых волокон от давления и ее линейная аппроксимация; б – зависимость интенсивности от давления в центральном
регионе пробы
Представленная публикация об исследовании ультраструктуры и биомеханических свойств суставного хряща с помощью высокоразрешающей ЯМР-томографии
раскрывает лишь малую часть научного потенциала, заключенного в этой области.
В качестве заключение нужно отметить, что особое внимание в дальнейшей работе
над данной проблематикой должно уделяться аспектам применения результатов
исследований в клинической практике.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Annefeld M. Der Chondrozyt, das lebende Element des Gelenkknorpels. In H.G.Fassbender,
Hrsg., Gelenkknorpel und Arthrose. Verlag Hans Huber, Stuttgart, 1983.
2. Glückert K. Veränderungen der Proteoglykane des Gelenkknorpels bei frühen arthrotischen
Prozessen: experimentelle und klinische Untersuchungen. Dissertation, Erlangen, 1985.
3. F. v. Müller, O. Seifert. Taschenbuch der medizinisch-klinischen Diagnostik. Verlag von
J.F.Bergmann, Wiesbaden, 1913.
4. P. A. Hardy, P. Nammalwar, S. Kuo. Measuring the thickness of articular cartilage from MR
images. J.Magn.Reson.Imaging, 13:120-126, 2001.
5. W. Gründer, M. Wagner, A. Werner. MR-microscopic visualization of anisotropic internal
cartilage structures using the magic angle technique. Magn.Reson.Med., 39:376-382, 1998.
6. Y. Xia, Heterogeneity of cartilage laminae in MR imaging. Osteoarthritis Cartilage, 9:393406, 2000.
7. P. Seidel, W. Gründer. Collagene order of articular cartilage by clinical magnetic resonance
images and its age dependency. Z.Med.Phys., 15:45-51, 2005.
8. W. Gründer, P. Seidel. Verfahren zur zonal aufgelösten Bestimmung des Ordnungsparameters
des kollagenen Netzwerkes von artikulärem Knorpel an einer MRT-Einzelaufnahme. Patent
DE 103 12 711.9, 2003.
63
Известия ТРТУ
Тематический выпуск
9. Nag D, Liney G, Gillespie P, Sherman K. Quantification of T2 relaxation changes in articular
cartilage with in situ mechanical loading of the knee. J.Magn.Reson.Imaging, 19:317-322,
2004.
10. P. Seidel, G. Hanke, W. Gründer. Load distribution of articular cartilage from MR-images by
neural nets. Z.Med.Phys., 15:101-106, 2005.
11. G. Gold, T. Besier, C. Draper, D. Asakawa, S. Delp, G. Beaupre. Weight-bearing of patellofemoral joint cartilage contact area. J.Magn.Reson.Imaging, 20:526-530, 2004.
12. G. Hanke, U. Reibetanz, W. Gründer. Determination of stress distribution in articular cartilage
by means of intensity shifts under load. Joint Annual Meeting ISMRM-ESMRMB, Glasgow,
21.-27. April 2001.
13. Gründer W, Kanowski M. Druckapparaturen für NMR-mikroskopische Untersuchungen zum
Belastungsverfahren von Gelenkknorpel. Biomed. Tech. 1998; 43: 287-292.
14. Gründer W, Kanowski M, Wagner M, Werner A. Visualization of pressure distribution within
loaded joint cartilage by application of angle sensitive NMR microscopy. Magn. Reson. Med.
2000; 43: 884-891.
N. Garnov, W. Gründer
STUDYING ULTRASTRUCTURE AND BIOMECHANICAL PROPERTIES OF
JOINT CARTILAGE BY MEANS OF HIGH-RESOLUTION MRI
Osteoarthrosis, which is mainly caused by joint cartilage degradation, is one of the
most common diseases in the old age. Non-invasive methods to point out cartilage degeneration could greatly improve the early diagnosis and therefore the possibilities of
intervention. In the last years Magnetic Resonance Imaging (MRI) turned out to be a
powerful tool to investigate joint cartilage. Additional to a direct visualization of cartilage thickness and surface properties, the cartilage ultrastructure (collageneous network
organization) non-invasively can be assess. Using load-influenced changes of the network structure biomechanical properties can be acquired.
By means of high-resolution MRI (MRI-microscopy, based on the properties of water molecules in the tissue) images with a resolution up to 10 µm can be taken. Contrast
determining is thereby the hydrate covers water connected with proteoglycan groups.
Because of a direct interaction between these water molecules and collagen fibers, we
have a potential non-invasive method to derive information about collageneous network
structure. This is based on the effect that water T2-relaxation is strongly influenced by
anisotropic dipolar coupling in zones of highly oriented matrix structures. Cartilage
zones of different network organization are visualized as zones of different MR intensity
resulting in a multilaminar appearance.
In case of ideal radial fiber orientation (adult cartilage) the dependency of the MR
signal intensity I on the orientation θ between the cartilage surface normal and the static
magnetic field B0 can be described as:
I ∝ e − (1− 3 cos
2
θ )2
(1)
.
This function reaches its maximum at a “magic-angle” θ of about 54.7°.
An adaptation of the common patient data to this function gives the information
about the cartilage matrix structure. Using the angle dependence of the MR signal (1)
three zones of collagen fiber orientation can be distinguished in articular cartilage: radial, tangential and isotropic. (Obviously) determined by load-influenced adaptation
processes, age-related changes of the collagen structure can be observed. In the aging
process cartilage shows an isotropic structure in knees of newborns, five-laminar structure in those of young people and a three-laminar structure in those of adults.
The complex organization of the cartilage matrix structure causes its special elastic
characteristics. If arthrotic changes in the cartilage occur, slightest infractions of the ma64