На правах рукописи Медведев Николай Ильич ТРЕХМЕРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СИНАПСОВ IN VIVO В ПОЛЕ СА1 ГИППОКАМПА ГИБЕРНИРУЮЩИХ СУСЛИКОВ И ГИПОТЕРМНЫХ КРЫС С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЕРИЙНЫХ УЛЬТРАТОНКИХ СРЕЗОВ Специальность “Биофизика” 03.00.02 Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пущино 2004 Работа выполнена в Филиале Института Биоорганической Химии РАН, Институте Биофизики Клетки РАН. Научные руководители: доктор биологических наук кандидат биологических наук Попов В.И. Садовников В.Б. Основные оппоненты: член-корреспондент РАМН, проф. доктор биологических наук, проф. Анохин К.В. Мошков Д.А. Ведущая организация: Кафедра Высшей Нервной Деятельности Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Защита состоится 11.02.2004 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д.002.093.01 при Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН по адресу: 142490, г. Пущино, ИТЭБ РАН. С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, Пущино. Автореферат разослан 10.01.2004 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук Ланина Н.Ф. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Традиционно, проблемы обучения, памяти и забывания связывают с нейронной пластичностью, в основе которой лежат изменения в синапсах. Согласно (Bailey and Kandel, 1993; Bailey et al., 2000) пластичность синапсов может быть разделена на 2 категории: 1) изменение уже существующих синапсов; и 2) изменение межнейронных связей, за счет образования новых синапсов или потери существующих. Считается, что 90% всех возбуждающих аксо-дендритных синапсов гиппокампа располагается на дендритных шипиках. Таким образом, предполагается, что синаптическая пластичность связана с пластичностью дендритных шипиков. К сожалению, размеры дендритных шипиков очень малы, что не позволяет адекватно оценить их светомикроскопическими методами, включая конфокальную микроскопию. Вместе с тем, результаты количественного анализа и моделирования различных субклеточных структур на основе одиночных ультратонких срезов дают слишком большую ошибку (Coggeshall and Lekan, 1996). Кроме того, иногда невозможно точно идентифицировать дендритный шипик на одиночном срезе. С появлением современных компьютеров, и специального программного обеспечения, а также с развитием технологий изготовления серийных ультратонких срезов, стало возможным получать точные количественные характеристики дендритных шипиков и других объектов. В последнее время появляется все больше работ посвященных трехмерным (3D) реконструкциям и стереологическому анализу дендритных шипиков и других компонентов синаптического аппарата. Подавляющее большинство этих работ связано с изучением пластичности синапсов in vitro, в то время как исследованиям in vivo уделяется намного меньше внимания. Данная работа посвящена исследованию синапсов в поле СА1 гиппокампа in vivo. Поле СА1 было выбрано не случайно, так как оно содержит в молекулярном слое наиболее характерные для центральной нервной системы (ц.н.с.) синапсы, которые интенсивно исследуются как in vitro, так и in vivo (Fiala et al., 1998; Sorra and Harris, 1998; Harris, 1999; Hering and Sheng, 2001; Segal and Andersen, 2000). В качестве животных моделей были выбраны гибернация якутского суслика (Citellus undulatus) и гипотермия крыс. Гибернация сусликов и гипотермия у крыс позволяет получить альтернативные функциональные состояния нервной ткани с низкой эффективностью синаптической передачи при гипотермии/гибернации и нормально функционирующими синапсами в нормотермии. У гибернирующих сусликов температура мозга падает до 0оС, а у крыс искусственно вызванная гипотермия понижает температуру мозга до 16-18оС (Калабухов, 1985; Игнатьев, 1992). При таких температурах эффективность синаптической передачи резко снижается, тогда как последующее восстановление животных до нормотермии индуцирует нормальную работу синапсов. Это позволяет провести сравнительные исследования синапсов в нормотермии и в условиях низкой функциональной активности – гипотермии/гибернации. Электронно-микроскопические (ЭМ) исследования таких синапсов с использованием серийных ультратонких срезов 3 позволяют осуществить поиск морфологических коррелятов синаптической передачи на субмикронном уровне. Цель работы Целью настоящей работы явилось сравнительное количественное и качественное исследование in vivo организации асимметричных аксодендритных синапсов в поле СА1 гиппокампа гибернирующих сусликов и гипотермных крыс с использованием серийных ультратонких срезов и трехмерных реконструкций дендритных шипиков и синаптических органелл. Основные задачи исследования 1. На основе серийных ультратонких срезов и 3D реконструкций провести количественный стереологический анализ in vivo 4 категорий синапсов в поле СА1 гиппокампа у гибернирующих сусликов и гипотермных крыс в альтернативных физиологических состояниях: гипотермия - нормотермия. 2. Провести количественный сравнительный анализ плотности синапсов в поле СА1 сусликов и крыс в альтернативных физиологических состояниях. 3. Выполнить 3D реконструкции дендритных шипиков, постсинаптических уплотнений и других синаптических структур в поле СА1 гиппокампа крысы и суслика. 4. Разработать программное обеспечение для анализа полученных трехмерных объектов. 4