ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ БЕЛКОВ МИТОХОНДРИЙ
реклама
На правах рукописи Громова Екатерина Владимировна ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ БЕЛКОВ МИТОХОНДРИЙ СЕРДЦА BOS TAURUS С ПОМОЩЬЮ ПРОТЕОМНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ 03.01.04 – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва-2013 Работа выполнена на кафедре биоорганической химии биологического факультета Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» Научный руководитель кандидат химических наук, доцент Гринкевич Владимир Антонович Официальные оппоненты: Овчинникова Татьяна Владимировна доктор химических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук заведующая отделом «Учебно-научный центр» Шишкин Сергей Сергеевич доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук, заведующий лабораторией Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» Защита состоится «28» марта 2013 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2. С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1. Автореферат разослан « » февраля 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ1 Актуальность темы Протеомика – одна из современных молекулярнобиологических научных дисциплин, которая занимает особое место среди постгеномных наук, так как протеомика в основном занимается идентификацией белков (протеомов) – участников конечной стадии передачи информации в клетке. Доступные данные по аннотированным геномам организмов в настоящее время поставляют базовую информацию для изучения биологических систем с помощью протеомики. Но это только инвентаризация белков, так называемый «белковый конспект» (protein compendium) изучаемой клетки. Однако для понимания процессов, происходящих в клетке, необходим анализ экспрессии мРНК, количественного содержания и взаимодействия белков, их локализации. Протеомика в своем широком смысле предполагает изучение белкового состава, структуры, функции и взаимодействий белковых молекул. Поскольку эукариотическая клетка слишком сложна для прямого протеомного анализа, возрос интерес к расшифровке протеомов органелл. Митохондрии являются удобным объектом для протеомного исследования, в связи с большой важностью выполняемых функций и относительной простотой организации. Каждая митохондрия млекопитающих содержит от 2 до 10 кольцевых копий мтДНК, которые кодируют у человека 13 белков, 22 тРНК и 2 рРНК [Anderson et al.,1981]. Основное количество белков, которые находятся в митохондриях млекопитающих, кодируется ядерным геномом. Они синтезируются на рибосомах цитоплазмы в виде белков-предшественников, которые затем попадают в митохондрии, используя митохондриальный аппарат импорта. Состав этих белков специфичен для каждой ткани. [Johnson et al., 2007]. Митохондрии являются клеточными «силовыми станциями», синтезирующими основное количество АТФ, используемого эукариотическими клетками. Кроме того, они играют чрезвычайно важную роль в метаболизме аминокислот и липидов, биосинтезах гема и железо-серных кластеров, передаче Используемые сокращения и обозначения: MudPIT ̶ Multidimensional Protein Identification Technology, офВЭЖХ ̶ обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография, СМЧ ̶ субмитохондриальные частицы, ЖХМС/МС ̶ тандемная жидкостная хромато-масс-спектрометрия 1 сигналов в клетке и в апоптозе. Все эти функции в митохондриях осуществляются и контролируются митохондриальным протеомом, который является динамичным образованием. [Meisinger et al., 2008]. Для понимания этих механизмов на молекулярном уровне необходимо знать белковый состав этих органелл. Изменения в митохондриальном протеоме оказывают различное влияние на митохондриальный гомеостаз, что, в свою очередь, ведет к появлению различных патологий. Митохондриальные дисфункции играют значительную роль в патогенезе широкого круга болезней (более 50 у человека), которые связаны с нарушением состава или функций белков митохондрий [Calvo et al., 2010]. Протеом митохондрии состоит примерно из 1500 белков (по крайней мере, в митохондрии сердечной мышцы человека) [Meisinger et al., 2008]. Около 1/3 белков, закодированных в генах млекопитающих, геномы которых расшифрованы, являются гидрофобными мембранными белками, следовательно, не менее 1/3 митохондриальных белков также должны быть мембранными белками. Массспектрометрический анализ этих белков пока остается технически трудновыполнимым, поэтому можно предположить, что довольно значительное число мембранных белков, даже для наиболее полно установленных митохондриальных протеомов млекопитающих, до сих пор не идентифицировано. Таким образом, исходя из вышеизложенного, актуальность работы определяется незаконченностью исследований протеома быка. Знания о протеоме необходимы для понимания белкового обеспечения биохимических процессов в митохондриях в норме и при патологии. Цели и задачи исследования Целью настоящей работы было исследование белков, составляющих протеом митохондрий из сердечной мышцы Bos taurus, с помощью различных методов, включающих идентификацию белков, определение их локализации и выполняемых функций, а также разработку новых подходов к анализу митохондриального протеома. Для достижения этой цели решались следующие задачи: 1. Получить белковые фракции из митохондрий сердца Bos taurus, пригодные для протеомных исследований. 2 2. Провести независимый анализ каждой полученной фракции, включающий расщепление идентификация белков на белкового пептиды, состава с разделение пептидного гидролизата, помощью технологии многомерной идентификации белков MudPIT (Multidimensional Protein Identification Technology). 3. Разработать протеомную методику для анализа гидрофобных фрагментов мембранных белков митохондрий. 4. Провести компьютерный анализ для идентификации белков и определения их внутриклеточной локализации и сублокализации, выполняемых функций и степени гидрофобности. Научная новизна работы Проведен независимый анализ двух белковых фракций, полученных из митохондрий сердца Bos taurus, позволивший расширить список идентифицированных белков. Впервые осуществлена идентификация 407 белков, в том числе были определены ферменты, обеспечивающие процессы β-окисления жирных кислот, белки цикла Кребса, белки, входящие в состав комплексов I-IV, которые обеспечивают тканевое окисление, белки теплового шока, АТФ-синтаза и др. Для 68 белков с ранее неустановленной локализацией были получены данные об их возможной локализации в митохондриях. Среди идентифицированных оказались гипотетические белки, о существовании которых ранее ничего не было известно, кроме информации о кодирующих их генах. Разработана схема анализа фракции «белков СМЧ», которая включает: 1) обработку фракции трипсином и разделение суммарных триптических пептидов на две подфракции: растворимые «экстрамембранные 1» фрагменты белков и так называемые «бритые СМЧ»; 2) выделение белковых фрагментов подфракции «бритые СМЧ», расщепление их бромцианом и последующая модификация этилендиамином; 3) трипсинолиз модифицированных фрагментов и получение фракции «экстрамембранные 2 + трансмембранные» пептиды; 4) независимый анализ фракций «экстрамембранные 1» и «экстрамембранные 2 + трансмембранные» триптических пептидов с помощью технологии MudPIT. Идентификация белков проводилась с учетом не только триптического, но и возможного неспецифического расщепления. 3 Научно-практическая значимость работы Разработан новый подход к протеомной идентификации трансмембранных фрагментов белков митохондрий. Для расширения возможности протеомной идентификации белков была предложена методика, предполагающая, помимо использования традиционного метода MudPIT, проведение разделения общего триптического гидролизата на две подфракции: пептиды, содержащие остатки цистеина, и пептиды, не содержащие цистеиновых остатков, независимый анализ каждой подфракции методом MudPIT и идентификация соответствующих белков. Среди идентифицированных белков могут присутствовать потенциальные биомаркеры различных заболеваний, например, белок ацетил-CoA ацетилтрансфераза (КФ 2.3.1.9). У человека мутации в гене, кодирующем данный белок, приводят к нарушению его функции, что вызывает наследственные заболевания. Полученные данные по исследованию белкового состава митохондрий могут быть использованы для изучения патогенеза различных заболеваний крупного рогатого скота и других млекопитающих. Апробация работы Результаты работ были представлены на XX и ХХI Зимней Международной молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008, 2009), XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2010» (Москва, 2010), V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011). Публикации По материалам диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, включая 2 статьи в рецензируемом журнале и 8 тезисов сообщений. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста и содержит 16 рисунков, 3 4 таблицы в основном тексте и 2 таблицы в приложениях. Список литературы включает 204 источника. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объект исследования В качестве объекта исследования были выбраны митохондрии сердечной мышцы домашнего скота Bos taurus в возрасте 18-24 месяцев. Этот выбор обусловлен тем, что Bos taurus является важнейшим источником питания и средств существования примерно 7 миллиардов людей на планете. Исследования генома, а также протеома этих животных необходимо не только для понимания эволюции млекопитающих, но и для генетического улучшения пород домашнего скота и увеличения его устойчивости к различным заболеваниям. Во введении обоснована актуальность темы, сформулирована цель и основные задачи исследования, охарактеризована научная новизна полученных результатов. Обзор литературы написан по теме данного исследования. В нем дано понятие протеомики как науки о белковом составе клетки или всего организма. Охарактеризованы методы протеомики, включая так называемые «гелевые» и «негелевые» методы разделения белковых смесей, а также методы идентификации белков с помощью протеомных технологий. Рассмотрены стратегии протеомики: «фингерпринт пептидных масс» и стратегия «shotgun». В последнем разделе обзора литературы кратко рассматривается данные по исследованию митохондриальных протеомов различных биологических объектов, а также данные по изучению посттрансляционных модификаций белков. Материалы и методы Митохондрии из сердца быка были выделены по методу [Crane F.L. et al., 1956] в модификации [Белогрудов Г.И и др., 1990]. Митохондрии подвергались ультрацентрифугированию в градиенте плотности сахарозы, разрушались ультразвуком и разделялись на белковые фракции с помощью центрифугирования. Было получено две фракции: «растворимые белки» митохондрий и «белки СМЧ». Протеомная идентификация белков проводилась методом MudPIT, включающая тандемную масс-спектрометрию. Кроме того, для анализа полученных фракций 5 были разработаны специальные методики, которые подробно рассматриваются в разделе «Результаты и обсуждение». Поиск белков по базам данных осуществляли следующим образом: данные тандемных экспериментов обрабатывали с помощью программы Data analysis 3.2 (Bruker Daltonics). Результаты направляли в программу идентификации пептидов Mascot 2.1.03 (Matrix Science). Поиск пептидов проводили по выборкам для таксона Bos taurus с помощью баз данных Swiss-Prot, NCBI, IPI (Bovine) и верифицировали впоследствии программами Scaffold 2_02_02 и X!Tandem (2008.08.08). При анализе фракции «белки СМЧ» поиск проводили с учетом как триптического, так и неспецифического расщепления. Дополнительно проводили анализ локализации белков с помощью алгоритмов: Psort, Predotar, Sublock и TargetP. Для определения индекса гидрофобности идентифицированных белков использовали алгоритмы анализа состава аминокислотной последовательности (www.bioinformatics.org/sms2, обновление 17.02.2009). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение белковых фракций митохондрий Митохондрии, предоставленные Н.Б. Поляковым и Л.Г. Зайцевой, подвергались центрифугированию в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (рис. 1). Рис. 1. Дополнительная очистка митохондрий методом ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (соответствующие значения концентрации сахарозы отмечены темным цветом) 6 Согласно полученным ранее в лаборатории данным полоса 2 содержала в основном не разрушенные митохондрии, пригодные для проведения протеомного исследования [Белогрудов Г.И и др., 1990]. На следующем этапе митохондрии из полосы 2 обрабатывали ультразвуком. Внешние и внутренние мембраны митохондрий при таком воздействии разрушаются. При этом внутренние мембраны образуют замкнутые везикулы, так называемые «субмитохондриальные частицы» (СМЧ). После центрифугирования (12000×gmax, 15 мин) неразрушенные митохондрии, митопласты и денатурированные белки выпадали в осадок, а основная часть содержимого межмембранного пространства и матрикса, а также некоторая часть примембранных и даже незначительные количества отдельных мембранных белков и СМЧ, подвергшиеся солюбилизации под действием ультразвука, оставались в растворе. После отделения осадка и в результате дальнейшего ультрацентрифугирования супернатанта (105000×gmax, 60 мин) осаждались СМЧ, загрязненные белками матрикса и внешних мембран. Супернатант, представляющий собой смесь белков в растворе, назвали «растворимые белки митохондрий». Анализ фракции «растворимые белки митохондрий» Фракцию «растворимые белки митохондрий» (около 100 мл) сконцентрировали с помощью ультрафильтрации, а затем лиофилизовали. Лиофилизат (~8 мг белка) растворили в 0,01М аммоний гидрокарбонатном буфере (рН 8,0) обессолили и разделили на 4 части (~2 мг белка в каждой), после чего каждую фракцию лиофилизовали и хранили при температуре – 40 °С. Для анализа белков этой фракции была выбрана так называемая стратегия «shotgun» [Yates et al., 1998; Wolters et al., 2001], предполагающая получение полного пептидного гидролизата исследуемой фракции с его последующим многомерным фракционированием и идентификацией отдельных пептидов методом тандемной масс-спектрометрии. Широкое распространение этот метод получил вследствие простоты проведения пробоподготовки и высокой степени автоматизации процесса. В некоторых источниках он обозначается также как MudPIT [Gonzales-Begne et al., 2009]. 7 Идентификацию белкового состава фракции «растворимые белки митохондрий» проводили двумя независимыми способами: с помощью MudPIT метода (по общей сумме всех триптических пептидов фракции) и разработанного в ходе выполнения работы (независимый MudPIT анализ двух подмножеств триптических пептидов: содержащих и не содержащих остатков цистеина). Разработанный подход позволяет экспериментально проверить, насколько полно в сложных многокомпонентных триптических гидролизатах могут быть определены пептиды, содержащие немодифицированные остатки цистеина. Полученные тандемные масс-спектры обрабатывали с помощью программы Data Analisys 3.2, которая учитывала интенсивность пиков на масс-спектре и исключала из массива для поиска низкокачественные и шумовые масс-спектры. Типичный тандемный масс-спектр пептида представлен на рис. 2. Рис. 2. Типичный тандемный масс-спектр пептида. По данному масс-спектру идентифицирован пептид (K)AGAGSATLSMAYAGAR(F), по которому в базе данных Swiss-Prot достоверно определен белок Malate dehydrogenase, mitochondrial precursor (EC 1.1.1.37) - Bos taurus (Bovine) Идентификацию пептидов и белков проводили с помощью программного комплекса MASCOT. На момент проведения данного анализа фракции «растворимых белков митохондрий» геном Bos taurus находился в процессе уточнения и аннотирования, и соответствующей полной геномной базы данных не существовало. Так как одной из целей работы было составление как можно более полного списка анализируемых белков, были выбраны три базы данных: SwissProt, NCBI и IPI (выборки по таксону Bos taurus). Результаты поиска белков дополнительно интегрированного верифицировали в программу с помощью Scaffold, 8 что алгоритма повышало X!Tandem, достоверность идентификации белков. Так как один и тот же белок может присутствовать в разных базах данных под разными названиями, то при переходе из одной базы данных в другую программа Scaffold выбирала только те масс-спектры, по которым ранее не удалось идентифицировать белки. Следует отметить, что в данном варианте анализа было определено только три цистеин-содержащих пептида. Во второй части эксперимента часть фракции «растворимых белков митохондрий» (~2 мг белка) растворяли в Трис-HCl буфере (pH 8.2), содержащем мочевину и β-меркаптоэтанол, и инкубировали 30 мин при комнатной температуре (для восстановления окисленных остатков цистеина). После этого фракцию обессоливали с помощью гель-фильтрации и добавляли трипсин. Все используемые буферы тщательно дегазировались и для более полного удаления растворенного кислорода дополнительно барботировались гелием, а трипсинолиз проводили в атмосфере аргона. Далее проводили ковалентную хроматографию пептидов триптического гидролизата на колонке с тиопропилсефарозой 4В. Эффективность ковалентного связывания цистеин-содержащих пептидов контролировали по поглощению образующегося 2-тиопиридона (343 нм). Схема реакции тиол-дисульфидного обмена, положенного в основу ковалентной хроматографии, представлена на рис. 3. Рис. 3. Схема тиол-дисульфидного обмена, лежащего в основе ковалентной хроматографии цистеин-содержащих пептидов Пептиды, не содержащие остатков цистеина и не связывающиеся с носителем, были собраны, лиофильно высушены и растворены в буфере для проведения хроматографии (0,1% муравьиная кислота). Цистеин-содержащие пептиды элюировали Трис-HCl-буфером (рН 8,2), содержащим 50 мМ β-меркаптоэтанола. 9 Так как свободные сульфогидрильные группы легко окисляются, цистеинсодержащие триптические пептиды модифицировали йодацетамидом. Схема реакции модификации представлена на Рис.4. S-карбамидометилцистеиновые пептиды обессоливали с помощью гель-фильтрации, лиофилизовали и перерастворяли в буфере для офВЭЖХ (0,1 % трифторуксусная кислота). Для анализа пептидов, содержащих модифицированные остатки цистеина, использовали метод ЖХ-МС/МС в варианте «офф-лайн», предполагающий разделение пептидов на фракции с помощью офВЭЖХ и последующий анализ на тандемном масс-спектрометре, используя прямой ввод образца в источник ионизации. Полученные масс-спектры цистеин-содержащих пептидов объединяли с полученными масс-спектрами пептидов, не содержащих остатков цистеина, и использовали для поиска белков с помощью программного обеспечения MASCOT как описано выше. Рис. 4. Реакция модификации остатков цистеина йодацетамидом в цистеинсодержащих пептидах В итоге во фракции «растворимые белки митохондрий» было достоверно идентифицировано 213 уникальных белков. Достоверной считали идентификацию белка по 2 и более уникальным пептидам. Для аннотации (локализация в клетке или сублокализация в митохондриях, определение функций белков) использовали базу данных Swiss-Prot, а также результаты предсказания локализации белков по алгоритмам TargetP, Psort, Predotar, Subloc. На рис.5 представлена диаграмма распределения идентифицированных белков по компартментам клетки. Из немитохондриальных найдены, в основном, цитозольные белки и в незначительном количестве белки крови, ядерные белки и белки межмембранного пространства. Для 24 белков не удалось однозначно определить локализацию в клетке. 10 11,2 % 24 белка Локализация в клетке не определено внеклеточные 1,0 % 2 белка плазма крови 1,4 % 3 белка ядерные 1,4 % 3 белка 11,2 % 24 белка цитоплазматические 73,8 % 157 белков митохондриальные 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 Белки, % Рис. 5. Диаграмма распределения идентифицированных «растворимых белков» по компартментам клетки На рис. 6 представлена диаграмма распределения митохондриальных белков, определенных по базе данных Swiss-Prot, по субкомпартментам митохондрий. Большая часть идентифицированных белков, согласно данным этой базы, относится к внутренней мембране митохондрий. Этот результат объясняется тем, что база данных Swiss-Prot не содержит полного набора белков митохондрий, а среди присутствующих в базе митохондриальных белков большинство относится к белкам внутренней мембраны, так как последние являются наиболее популярными объектами исследования. Крупные комплексы дыхательной цепи состоят из большого числа субъединиц, не все из которых являются интегральными мембранными белками, и при разрушении мембран митохондрий ультразвуком часть таких белков может диссоциировать от мембраны. Кроме того, большинство белков внутренней мембраны митохондрий кодируется ядерным геномом и импортируется в митохондрии из цитоплазмы. В процессе переноса от транслоказы внешней мембраны (TOM – Translocase of Outer Membrane) к транслоказе внутренней мембраны (TIM22 – Translocase of Inner Membrane) они пересекают межмембранное пространство, будучи в это время связанными с переносящим комплексом TIM9–TIM10. Следовательно, на момент анализа часть белков внутренней мембраны митохондрий могла находиться в состоянии 11 транспорта и таким образом попасть во фракцию «растворимых белков митохондрий». Не определено 25% (20 белков) Внутренняя мембрана 43% (37 белков) Внешняя мембрана 4% (3 белка) Межмембранное пространство 2% (2 белка) Матрикс 24% (19 белков) Рис. 6. Диаграмма распределения идентифицированных «растворимых белков», определенных по базе данных Swiss-Prot, по субкомпартментам митохондрий Одним из параметров определения белков было минимальное число пептидов, по которому производилась идентификация белка. Достоверным считали определение белка по двум и более пептидам. Достаточно важным параметром определения белков является процент покрытия аминокислотной последовательности белка идентифицированными пептидами. На рис. 7 приведена диаграмма распределения «растворимых белков митохондрий» по данной величине. Большинство белков имеет процент покрытия аминокислотной последовательности менее 20 %. С целью объяснения данного результата дополнительно приведено распределение белков в соответствии с их молекулярной массой. Подавляющее большинство белков с процентом покрытия больше 20%, имеют массу не более 50 кДа, в то время как аминокислотные последовательности самых крупных белков (массой свыше 90 кДа) покрываются не более чем на 10% (и только в случае одного белка не более чем на 20%). Таким 12 образом, прослеживается зависимость величины процента покрытия аминокислотной последовательности белков от их молекулярной массы: с увеличением молекулярной массы величина процента покрытия аминокислотной последовательности уменьшается. В связи с этим можно сделать вывод, что параметр покрытия не является абсолютным критерием достоверности определения белка, так как более крупные белки при масс-спектрометрическом анализе имеют более низкий процент покрытия аминокислотной последовательности. Mr 50 - 90 кДа; 14 белков Процент покрытия аминокислотной последовательности, % Mr менее 50 кДа; 65 белков Более 20% Mr менее 50 кДа; 46 белков Mr 50 - 90 кДа; 12 белков Mr 90 - 285,5 кДа; 1 белок 10 - 20% Mr 50 - 90 кДа; 36 белков Mr менее 50 кДа; 27 белков Mr 90 - 285,5 кДа; 12 белков Менее 10% 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Количество белков Рис.7. Диаграмма распределения «растворимых белков» по процентному покрытию аминокислотной последовательности идентифицированными пептидами и их молекулярным массам С помощью разработанного метода выделения и анализ цистеин-содержащих пептидов, было определено 75 триптических пептидов, содержащих остаток S-карбамидометилцистеина, в то время как с помощью MudPIT-анализа общего триптического гидролизата фракции «растворимые белки митохондрий», было идентифицировано только 3 пептида, содержащих остатки цистеин. Данные пептиды не привели к значительному 13 увеличению общего количества идентифицированных «растворимых белков митохондрий» (только для 17 белков пептид, содержащий модифицированный остаток цистеина, стал вторым уникальным пептидом). Однако эти пептиды существенно повлияли на процентное покрытие аминокислотной последовательности у других белков, заметно повысив достоверность идентификации белков исследуемой фракции. Протеом фракции «субмитохондриальных частиц» (СМЧ) Для получения пептидов фракции белков внутренней мембраны митохондрий (фракция СМЧ) была разработана и применена новая методика, а для идентификации белков данной фракции выбрана стратегия «shotgun». Так как белки внутренней мембраны митохондрий располагаются как в липидном бислое, так и вне его, была разработана методика трехстадийного получения пептидных фрагментов этих белков: гидролиз экстрамембранных частей белков трипсином, расщепление трансмембранных и оставшихся экстрамембранных фрагментов мембранных белков бромцианом с последующим расщеплением трипсином образовавшихся бромциановых фрагментов. Такой поэтапный подход позволил получить несколько независимых выборок и увеличить число повторений данных о структуре белков за счет многоступенчатого гидролиза. Сочетание нескольких методов расщепления белков повышает достоверность их идентификации при поиске по базам данных. Благодаря тому, что все части белков были подвергнуты гидролизу, можно было ожидать хорошее покрытие первичной последовательности белков идентифицированными пептидами. СМЧ вначале были обработаны экстрамембранных пептидов (рис.8). 14 трипсином с целью получения «правильно ориентированные» СМЧ «вывернутые» СМЧ трипсинолиз, центрифугирование Э1-пептиды Э1-пептиды «бритые» СМЧ «бритые» СМЧ 75% HCOOH, гель-фильтрация расщепление BrCN модификация, трипсинолиз Э2Т-пептиды Рис. 8. Схема получения фракции «экстрамембранных 2 + трансмембранных пептидов» (Э2Т-пептиды). 15 Поскольку трипсинолизу была подвергнута смесь из «правильно ориентированных» и «вывернутых» СМЧ, то в результате такой обработки получали смесь пептидов, относящиеся как к наружным, так и к внутренним экстрамембранным фрагментам белков. Пептиды полученной фракции назвали «экстрамембарнными 1» (Э1-пептиды), а СМЧ после такой обработки ̶ «бритыми». Э1-пептиды были отделены от «бритых» СМЧ центрифугированием (18000 об/мин) и подготовлены для анализа методом MudPIT. «Бритые» СМЧ растворяли в 75% муравьиной кислоте, и белковую фракцию отделяли от липидов с помощью гель-фильтрации. Полученные белковые фрагменты сначала расщепляли бромцианом по остаткам метионина. Полученные бромциановые фрагменты на С-конце имели остаток гомосеринлактона. взаимодействия этого Для остатка предотвращения со свободными неконтролируемого аминогруппами его модифицировали избытком 1 М этилендиамина. Такая модификация, во-первых, дезактивировала С-концевой остаток гомосеринлактона и, следовательно, препятствовала кросс-сшивке бромциановых фрагментов друг с другом. Вовторых, увеличивала растворимость бромциановых пептидов в буфере для трипсинолиза. В-третьих, увеличивала вероятность сорбции протонов на пептиде, содержащем такой модифицированный остаток, при масс-спектрометрическом анализе. Последнее обстоятельство существенно влияет на результаты тандемной масс-спектрометрии, так как увеличивает вероятность образования многозарядных ионов пептидов, которые обладают повышенной способностью к фрагментации. После модификации был проведен гидролиз модифицированных бромциановых фрагментов трипсином. Полученная после трипсинолиза фракция триптических пептидов получила название «экстрамембранные 2 + трансмембранные пептиды» (Э2Т-пептиды). Э2Т-пептиды обессолили с помощью офВЭЖХ, а затем разделили на фракции с помощью катионобменной хроматографии. Полученные в результате катионобменной хроматографии фракции Э2Т-пептидов были обессолены на картридже для твердофазной экстракции Oasis (Waters, USA) в соответствии с методикой фирмы-производителя, лиофилизованы и растворены в 10 мкл 5 % 16 CH3CN в 0,1 % муравьиной кислоте. После этого был проведен анализ ЖХ/МСМС в варианте «он-лайн». Э1-пептиды анализировали также как Э2Т-пептиды. Идентификацию белков и пептидов проводили с помощью программного комплекса MASCOT. В качестве возможного ферментативного способа расщепления указывали как специфическое расщепление по остаткам лизина и аргинина, так и возможное неспецифическое расщепление. В программе Scaffold устанавливали параметр минимального числа уникальных пептидов, соответствующих белку, – 2 или 1, если этот пептид присутствовал как в Э1пептидах, так и в Э2Т-пептидах. Типичный тандемный масс-спектр пептида фракции «СМЧ» представлен на рис. 9. Рис. 9. Характерный тандемный масс-спектр пептида (R)ILGADTSVDLEETGR(V), по которому в базе данных Swiss-Prot достоверно определен белок ATP synthase subunit alpha, heart isoform - Bos taurus (Bovine) Вначале были получены 4 выборки пептидов: две для фракции Э1-пептидов и две для фракции Э2Т-пептидов: а) пептиды, полученные в результате специфического расщепления по остаткам Lys, Arg; б) пептиды, полученные в результате возможного неспецифического расщепления. По ним идентифицировали 4 набора белков, которые свели к двум ̶ 133 белка для Э1пептидов и 230 для Э2Т-пептидов. Для белков каждой группы были определены индексы гидрофобности, которые приведены на рис. 10 (а и б). Из приведенных данных видно, что белки, соответствующие фракции Э2Т-пептидов, в целом, оказались более гидрофобными по сравнению с белками, соответствующими фракции Э1-пептидов, что указывает 17 на присутствие во фракции Э2Т-пептидов бромциановых фрагментов трансмембранных белков. Полученные данные подтверждали правильность разработанной методики определения белков фракции СМЧ. Определение локализации белков проводили также как и в случае «растворимых белков митохондрий». 45 а Количество белков 40 35 30 25 20 15 10 5 0 > 0,2 0 < 0,2 -0,2 < 0 -0,4 < -0,2 -0,5 < - 0,4 -0,6 < -0,5 -0,8 < -0,6 -1 < -0,8 < -1 Значение индекса гидрофобности Количество белков 70 б 60 50 40 30 20 10 0 > 0,2 0 < 0,2 -0,2 < 0 -0,4 < -0,2 -0,5 < - 0,4 -0,6 < -0,5 -0,8 < -0,6 -1 < -0,8 < -1 Значение индекса гидрофобности Рис. 10. Диаграмма распределения индекса гидрофобности белков, идентифицированных во фракции Э1-пептидов (а) и Э2Т-пептидов (б) Распределение идентифицированных белков по локализации в клетке приведено в таблице 1. Уменьшение общего числа идентифицированных митохондриальных белков в случае фракции Э2Т-пептидов может быть объяснено тем, что часть триптических пептидов, входящих в состав фракции Э1-пептидов, в Э2Т-пептидах была расщеплена бромцианом. Сильное увеличение числа белков с неизвестной локализацией в случае белков, соответствующих фракции Э2Т18 пептидов, возможно связано с тем, что использованные алгоритмы предсказания локализации (Psort, Subloc, Predotar, TargetP) определяют митохондриальную локализацию исследуемого белка только по наличию у него отщепляемой целевой аминокислотной последовательности. Поэтому при определении митохондриального протеома, особенно млекопитающих, практически всегда определяют так называемые «неизвестные белки», то есть белки, не имеющие метки локализации. Таблица 1. Распределение по локализации в клетке белков фракций «Э1пептиды» и «Э2Т- пептиды» Компартмент клетки Количество идентифицированных белков Фракция «Э1- пептиды» Фракция «Э2Т- пептиды» Митохондрии 61,5 %(82 белка) 33,1 % (76 белков) Цитоплазма 12,1 % (16 белков) 12,2 % (28 белков) Ядро 7,2 % (9 белков) 15,8 % (36 белков) ЭПР 1,0 % (1 белок) 1,0 % (3 белка) Аппарат Гольджи 1,0 % (1 белок) ̶ Плазматическая мембрана 2,2 % (3 белка) 4,4 % (10 белков) Внеклеточное пространство 1,0 % (1 белок) 3,9 % (9 белков) Не определено 14,0 % (20 белков) 29,6 % (68 белков) Было достоверно идентифицировано 298 индивидуальных белков фракции СМЧ. На рис. 11 представлена диаграмма распределения всех идентифицированных белков по локализации в клетке. Большая часть белков, для которых удалось определить локализацию (рис. 11), являются белками митохондрий. Среди немитохондриальных белков были обнаружены белки цитоплазмы, плазматической мембраны, ЭПР, ядерные белки. Данные белки, как правило, в тех или иных количествах присутствуют в 19 результатах всех работ по определению митохондриального протеома. Присутствие этих белков можно объяснить тем, что при выделении митохондрий они сорбируются на внешней мембране митохондрий и, следовательно, при получении СМЧ последние оказываются загрязненными данными белками. Кроме того, предполагается, что примерно 15 % митохондриальных белков имеют двойную локализацию [Foster et.al., 2006; Kumar et al., 2002]. 15,4 %; (46 белков) не определено Компартмент клетки микросомы 0,3 %; (1 белок) 1,7 %; (5 белков) внеклеточные белки плазматическая мембрана 1 %; (3 белка) 4,1 %; (12 белков) ядро ЭПР 0,3 %; (1 белок) 10,4 %; (32 белка) цитоплазма 66,8 %; (198 белков) митохондрии 0 50 100 150 200 250 Белки Рис. 11. Диаграмма распределения идентифицированных белков фракции СМЧ по компартментам клетки При анализе фракции белков СМЧ удалось идентифицировать значительно большее количество белков, чем при анализе фракции «растворимых белков митохондрий». Известно, что матрикс содержит примерно 2/3 от общего количества митохондриальных белков, а митохондриальные внешняя и внутренняя мембраны, соответственно, около 4% и 29% от общего количества белков митохондрий [Distler et al., 2008]. В связи с этим можно сделать вывод, что предложенная методика получения двух пулов триптических пептидов фракции «белки СМЧ» двумя способами и независимое исследование каждого из них увеличивает количество идентифицированных белков (133 и 230). Кроме того, компьютерный анализ белков с использованием нескольких возможных сайтов расщепления позволяет увеличить продуктивность идентификации. Применение данной стратегии 20 значительно увеличило количество белков с неустановленной локализацией. Эти белки, скорее всего, потеряли «метку локализации в митохондриях» вследствие того, что использованные нами алгоритмы (Psort, TargetP, Subloc, Predotar) относят анализируемые белки к митохондриальным только при наличии у последних единственного сигнала цели, отщепляемой N-концевой аминокислотной последовательности, и не видят других митохондриальных целевых сигналов. В результате проведенных исследований удалось идентифицировать 407 уникальных белков. На рис. 12 приведены диаграммы распределения всех идентифицированных идентифицированных белков по белков компартментам являются клетки. Большинство митохондриальными. Среди митохондриальных, определенных по базе данных Swiss-Prot, преимущественно были идентифицированы белки внутренней мембраны (60 белков), однако присутствуют также белки матрикса (20 белков) и внешних мембран (1 белок). Поскольку часть пептидов, по которым проводилась идентификация белков, была получена путем обработки СМЧ трипсином, можно предположить, что с истинными белками внутренней мембраны могли быть ассоциированы некоторые белки матрикса и межмембранного пространства, которые также подверглись трипсинолизу. Компартмент клетки не определено микросомы 16,7 %; 68 белков 0,2 %; 1 белок 1,7 %; 7 белков внеклеточные белки крови 0,7 %; 3 белка плазматическая мембрана 0,2 %; 1 белок 3,4 %; 14 белков ядро цитоплазма 65,6 %; 267 белков 11,5 %; 46 белков митохондрии 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 Количество белков Рис. 12. Диаграмма распределения 407 идентифицированных белков по локализации в клетке 21 ВЫВОДЫ 1. Проведен комплексный протеомный анализ белков митохондрий сердечной мышцы Bos taurus и идентифицировано 407 белков по двум и более уникальным пептидам. Для 267 из них доказано, что они входят в состав митохондриального протеома. 2. Предложена методика разделения белков митохондрий сердечной мышцы Bos taurus на фракции белки «растворимые митохондрий» и «белки субмитохондриальных частиц», что позволило провести более полный анализ данного протеома. 3. Проведена идентификация белкового состава фракции «растворимые белки митохондрий» двумя независимыми способами: по общей сумме триптических пептидов фракции и по разработанному в ходе выполнения работы (по двум подмножествам триптических пептидов, содержащих и не содержащих остатков цистеина), что позволило увеличить число идентифицированных белков данной фракции и достоверность их идентификации. 4. Разработана и применена новая субмитохондриальных частиц», «экстрамембранные 1» и методика основанная анализа на фракции получении «белки подфракции «экстрамембранные 2 + трансмембранные» триптические пептиды. Проведена идентификация белков не только по триптическим, но и по пептидам возможных неспецифических расщеплений, что привело к увеличению числа идентифицированных белков, в том числе гидрофобных. 5. Впервые для митохондрий сердца Bos taurus идентифицировано 68 белков с неизвестной клеточной локализацией. С достаточно большой долей вероятности можно предположить, что большинство из них принадлежит к митохондриальным белкам, не содержащим известной отщепляемой Nконцевой целевой аминокислотной последовательности. 22 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1. Е.В. Дайниченко (Громова), А.Н. Болдырев, К.В. Барылюк, Н.Б. Поляков, В.А. Гринкевич. Протеомный анализ митохондрий сердца Bos Taurus II. Идентификация «растворимых белков» митохондрий. // Биоорганическая химия, 2009, Т. 32, № 4, с. 457 ̶ 470 2. Е.В. Громова, Н.Б. Поляков, В.А. Гринкевич. Протеомный анализ митохондрий сердца Bos taurus III. Идентификация белков внутренней мембраны митохондрий. // Биоорганическая химия, 2012, Т. 38, № 1, с. 18 ̶ 30 3. 4. Болдырев А.Н., Дайниченко Е.В., Барылюк К.В., Поляков Н.Б., Гринкевич В.А. Протеом митохондрий миокарда сердца быка: белки матрикса митохондрий // Тезисы докладов и стендовых сообщений. XX зимняя международная молодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», под ред. Т.В. Овчинниковой и Т.И. Сорокиной. Москва, 11-15 февраля 2008. С. 71 Дайниченко Е.В., Болдырев А.Н., Гринкевич В.А. Протеом митохондрий сердца Bos taurus: анализ растворимых белков // Тезисы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», секция «Биология». Москва. 2008. C.147 ̶ 148 5. Дайниченко Е.В,. Болдырев А.Н., Гринкевич В.А. Идентификация растворимых белков митохондрий миокарда сердца быка с помощью протеомных технологий. // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXI Зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва. 2009. C. 147 ̶ 148 6. 7. 8. Болдырев А.Н., Дайниченко Е.В., Гринкевич В.А. Протеомный анализ белков внутренней мембраны митохондрий сердца Bos taurus. // XXI Зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва. 2009. C. 31 Дайниченко Е.В., Болдырев А.Н., Гринкевич В.А. Использование протеомных технологий для идентификации растворимых белков митохондрий сердца Bos taurus. // Тезисы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». Казань. 2009. C. 290 Гринкевич В.А., Дайниченко Е.В., Поляков Н.Б. Изучение протеома митохондрий сердца Bos taurus. // Тезисы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». Казань. 2009. C. 24 23 9. 10. Дайниченко Е.В. Идентификация и анализ белков внутренней мембраны митохондрий сердца Bos taurus масс-спектрометрическими методами. // Тезисы докладов XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2010» .Москва. 2010. C. 198 Громова Е.В. , Поляков Н.Б., Гринкевич В.А. Протеомный анализ митохондрий сердца быка Bos taurus. Анализ белков внутренней мембраны. // Тезисы докладов V Российского симпозиума «Белки и пептиды». Петрозаводск. 2011. C. 274. 24
